对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸 【技术领域】
本发明涉及大肠杆菌O156型(Escherichia coli O156)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O156型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O156型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中地O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O156 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identtification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]
【发明内容】
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因；甘露糖水解酶基因gmm或与gmm有相似功能的基因；pyruvyl转移酶基因orf2或与orf2有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf3、orf5、orf6，orf11基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O156型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O156型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O156型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O156型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O156型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15390个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸，其由12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因；甘露糖水解酶基因gmm或与gmm有相似功能的基因；pyruvyl转移酶基因orf2或与orf2有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因；其中所述的基因：wzx是SEQID NO：1中的1366至2505碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的4783至5988碱基的核苷酸；manBC，gmd.fcl分别是SEQ ID NO：1中的12459至13883，10301至11707，7744至8862，8866至9831；orf2是SEQ ID NO：1中的8866至9831碱基的核苷酸；gmm是SEQ ID NO：1中的9834至10295碱基的核苷酸；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因分别是SEQ ID NO：1中的3532至4773，5960至6667，6664至7743，11707至12453碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因、岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因；甘露糖水解酶基因gmm或与gmm有相似功能的基因；pyruvyl转移酶基因orf2或与orf2有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1512至1532碱基的核苷酸和1846至1864碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1851至1869碱基的核苷酸和2229至2247碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5209至5227碱基的核苷酸和5840至5858碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5594至5614碱基的核苷酸和5865至5885碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O156型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O156型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O156型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O156型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O156型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O156型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O156型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15390个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；岩藻糖合成酶基因(manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因)；甘露糖水解酶基因(gmm或与gmm有相似功能的基因)；pyruvyl转移酶基因(orf2或与orf2有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，(包括orf3、orf5、orf6，orf11基因或与orf3、orf5、orf6，orf11有相似功能的基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O156型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因、岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl或与manBC，gmd.fcl有相似功能的基因；甘露糖水解酶基因gmm或与gmm有相似功能的基因；pyruvyl转移酶基因orf2或与orf2有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因；它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O156型的O-抗原都是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O156型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O156型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的1366至2505碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4783至5988碱基的核苷酸)；岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl(分别是SEQ ID NO：1中的12459至13883，10301至11707，7744至8862，8866至9831碱基的核苷酸)；甘露糖水解酶基因gmm(是SEQ ID NO：1中的9834至10295碱基的核苷酸)；orf2(是SEQ ID NO：1中的8866至9831碱基的核苷酸)；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf11基因(分别是SEQ ID NO：1中的3532至4773，5960至6667，6664至7743，11707至12453碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O156型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O156型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O156型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O156型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O156型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O156型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取：
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O156型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O156型中的O-抗原基因簇：
以大肠杆菌O156型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O156型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O156型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf7，8，10，12编码的蛋白与大肠杆菌-抗原基因簇中岩藻糖合成酶基因manBC，gmd.fcl基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，manBC，gmd.fcl基因负责岩藻糖的合成，岩藻糖是O-抗原中的一种稀有单糖，其它单糖负责其合成的酶由基因组其他位置的基因编码，因此在O-抗原基因簇中这些基因不重复出现。我们将orf7，8，9，12分别命名为gmd.fcl和manBC，并推测大肠杆菌O156的O-抗原中有岩藻糖的存在，其O-抗原中有岩藻糖的存在，基因簇的分析结果能与其结构对应。
Orfl和orf4是大肠杆菌O156种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf1编码的蛋白与Yersinia pestis菌的O-抗原转移酶有47％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf1为wzx。Orf4编码的蛋白与大肠杆菌O-抗原聚合酶有28％的一致性，45％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf4为wzy。
Orf3，5，6，11四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e-12至5×e-17，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O156的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf3，orf5，orf6，orf11。
实施例6：特异基因的筛选：
针对大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了大肠杆菌O156型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O156型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：I中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O156型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O156型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O156型中筛选到对大肠杆菌O156型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O156型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O156型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O156型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O156型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>对大肠杆菌O156型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O156型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15390
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcatt gtggctgcag ggattaaaga aatcattgtg 60
gctgcaggga tcaaagaaat cctcctggta actcacgcgt ccaagaacgc ggtcgaaaac 120
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gttaatcatt tgcatggtgc tgattttaaa tattttagaa atgagcaatg ttatataatt 7020
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acagaacgtg ttgatcatat ttatcaagat cgccacaacc aaaatccaaa tttctttctt 7920
cattatggtg acttaacaga tacatcaaac ctgatacgtc taatcaaaga aatccaacca 7980
gacgaagttt ataaccttgg cgctcaatct catgtagcgg tttcattcga atcacctgaa 8040
tatactgctg acgtagatgc gatggggact ttacgtctgc tggaagcgat tcgtatttgt 8100
gggctagaga aaaaaacacg tttttatcag gcatcaactt ctgaactctt cggcttagtt 8160
caggaaatcc cgcagcgaga aacaacacca ttctaccctc gttcgcctta tgctgttgcg 8220
aagatgtatg catactggat tactgtaaac tatcgtgaat cctatggaat gtatgcctgt 8280
aacggtattc tcttcaacca tgaatccccg cgtcgtggtg aaacattcgt aacacgtaaa 8340
atcactcgtg ctattgcaaa tatttcgcag ggaatcgaaa aatgtctcta tcttggcaat 8400
atggattcac tgcgcgactg ggggacatgc gaaagattac gtgcgtatgc agtgatgatg 8460
ttgcagcaag atcacccaga ggattttgtt attgcaacag gcaaacaaat ttccgtacgt 8520
gaatttgttc gtatgtcagc taaagaagtc ggtctggagt tagaattctc cggacaaggt 8580
gttgatgaaa tagcaactgt tgtgaataaa acatctgact gtgctattgg tgttagtatt 8640
ggggatgtga tcgttcgtgt tgatcctcgt tatttccgtc ctgcagaggt tgaaactctt 8700
cttggtgatc cagcaaaagc gaaaagagta ttgggttggg aaccagagat tacagttgaa 8760
gagatgtgtg cagaaatggt tgccagtgat ctggcgaaag caaaacagca tgcactactg 8820
aaaagccatg gttacgatgt tgcagtttct ctggagcggt aaggtatgaa aaaaaaacgt 8880
atctacgttg ctggtcaccg aggcatggtt ggctctgcta tttgccgtca attatcactg 8940
cgtgatgata tcgaattagt ggtcaaaaca cacaaagaac tcgatctaac cgtacagaag 9000
gatgttgatg cattttttgc gcaagagaaa attgatcagg tttatcttgc tgcggctaaa 9060
gttggtggca tttatgccaa caatacattt ccggctgaat tcatctatca gaatctcatg 9120
attgagagta atattattca ttcagctcac aaggccggaa ttcaaaaatt acttttttta 9180
ggctcaagct gtatttatcc taaattcgca gagcagccga tgaacgagtc tgcgctttta 9240
acgggcatac ttgagccaac taatgagcca tacgcaattg ctaaaattgc gggcataaaa 9300
ttatgtgaat cttataaccg tcaatatggc cgtgattatc gcagtgtaat gcctactaat 9360
ctttatggca taaatgataa tttccacccc gaaaactctc atgttattcc ggcactcatg 9420
cgtagattcc atgaggcaaa agagagtggt gcaccagaag ttattgtctg gggaacagga 9480
acaccgatgc gtgagttttt atatgttgat gatatggctg ccgcatctgt tcatgtaatg 9540
gaacttgacg aagcaattta tcaacaaaat tcacagccta tgttatctca tattaatgtt 9600
ggtacgggtg tagattgttc catacgtgaa atggctgaaa caatggcctc tgtggtgggt 9660
tatcaaggta aaattgtttt tgatgttact aaacctgatg gcactccgcg taaacttatg 9720
gacgttaccc ggctcaaaaa cttgggctgg caatatcaat ataatttaca tgaaggctta 9780
tcattaacat ataaatggtt tattgagaat attaattctt ttcggggata gttatgaata 9840
agagattgga acgtgagcta tttaaaacaa tagttgagca tactcctcta atctcgattg 9900
atctcataat tagaaacgat aaaggagagg cgctgctggg gcagcgcctg aatcgcccag 9960
cacaaaatta ttggtttgtg ccaggagggc gaatttataa ggatgagtca ttcgagattg 10020
catttaagcg gataacattt gaagaggtgg gcgttcaaat tagtcttgat gatgccttat 10080
ttctaggggt gtatgaacat ttttacaatg ataatttttc tgaagcagaa ttttctacac 10140
actatgtagt gcatggatat gaaatccaac ttaaacctca gcaacttcac ctaccaacgg 10200
tccagcataa ttcctacaag tggtttgatg tagtaacgtt gcttaatagc actacagttc 10260
atcaatatac caaaaattat tttataccaa ggtaatagat atgctacttc ccgttgtcat 10320
ggccggtggt tctggtacca gattatggcc tctttcacgt acactttatc cgaaacaatt 10380
tctatcttta aatagtcgtt taaccatgtt gcaagagaca ttgcggcggc ttgacaaggt 10440
agaacataaa cccgctttgg tcatttgtaa cgaatcacat cgctttatcg ttgctgaaca 10500
attgcgtaaa gagggtttaa agcatagcgg tattttgctt gagcctgttg gccgtaatac 10560
tgcgcctgct gtagcactcg cagcacttca ggctatggta actggagatg atcctattct 10620
gttggttctt gctgctgatc atgaaattca gaatgaggat aatttcattg atgcagttct 10680
tgcagccaag aattttgcag aacagggtaa gcttgttacg tttggtattg ttccaacatc 10740
cccagagact ggctatggtt acattaagtc aggtgagtat ctggatggaa aaggttacaa 10800
agttgcggct tttgttgaaa aaccagagct tcacgtagct cagcagtata tatcagatgg 10860
cggttatctt tggaatagtg ggatgtttat gttcagagca tctgtattta tcaatgaact 10920
gaaaaaattc cgaccagata ttttagccag ttgccaacgc tccttgtcct cttcgataca 10980
agatttagat tttatccgtc tggataatgc ttcattttct tgctgtcctg aagagtctat 11040
tgactatgca gttatggaaa aaacagccga agctgtcgtc gttcccttaa atgcacaatg 11100
gagtgatgtt gggtcatggt ctgcattgtg ggaaataagt tcaaaagatc aaagcggtaa 11160
tgccattcgt ggtgatgtat tggttgaaga tgctacagat agttatcttt attcgcagca 11220
tagacttatt ggtgctgtgg gcataaagga tttggttgtt gttgaaacga aagatgccgt 11280
attagttgct cataaagata aagttcagca agttaaaaac atcgtcgctc aacttaaaaa 11340
gaataatcgc acagaatatt tacagcatcg ggaaatattt cggccttggg gcagtcatga 11400
tactatagct gaagggccgc gctttcaagt gaaacatgtg attgtattac ctggccacat 11460
taccgctaag cagattcatt accatcgtac tgagcattgg attgttgtct cggggacagc 11520
taaagtccat cttgaagata agacttacct tgtttctgaa aatgaatcaa catatatacc 11580
tgttggtgtt ccacatgcca ttgaaaatcc tggcaagatc ccgcttgaaa taatcgaggt 11640
tagatcagga gtctacctgg aagaggatga tgttataaga gtttcttctt ctggagtagg 11700
atactaatgc gaatttctat tatcacagct acttataata gtgaaaaaac tctccttgat 11760
acattacttt ctctagaaaa acaaacgtat ccagatatcg aatatatagt tgtagatgga 11820
gcatcgaacg ataatacaat taagctgatc aagggtaatt gtacaaaagt ttcaaaaatc 11880
atttgcgaac ccgataaggg catttatgat gctctgaata aaggtattca agcagcttcg 11940
ggtgatgtta ttggtttttt acattctgat gatttattac cctatgatga tgctattgca 12000
gatatagcaa aaacatttga aattacaggg tgtgatgcta tttatggcga tttggagtat 12060
gttgcccaaa atgatacgac taaacgtatt agattatgga aaagtggttc atttagtcgt 12120
ttcaagatga aagtgggttg gatgccgcca cacccatcat tttatatgaa acgcaaatgt 12180
tataggcagt ttggttgttt ttctttagat tatcgaatat ctgctgatta tgactcatta 12240
ttacgatata ttttaaaaca acgtatttca acagaatatt taccaaaagt cttagtgaag 12300
atgcgtgttg gtggaattag caatcgttca gtatcttcaa tggtaaagaa gtcaatggaa 12360
gacattcgtg ttatgaacca gaatggtatt atctggccaa tagctttagt gtataaaaat 12420
atatccaaac ttcctcaatt tattaaaaag taatcatcat gttaaatgtt aaaaaaatca 12480
ttaacgatag taatattgcg ttcggtacta gtggtgctcg cggtttagtg atcgattttt 12540
cccatgatgt ttgtgctgcg ttcactcatg cgtttctttc tgttattgat gacaaataca 12600
attttaataa agttgcctta gcaattgata accgcccaag cagttacgaa atcgctcagg 12660
catgcgcctt cgctatcaaa caacatgggt tcactgtcga atatcatggt gtaattccga 12720
ctcccgcatt agctcattat tcgatgcaga aaaacattcc ctgcataatg gtcacaggga 12780
gtcatatccc ttttgatcgt aatggcttaa aattctacag acctgatggt gaaatcacta 12840
aagaggatga gctcgcaatt ataaatagtg agtatacatt ttcgcctgta ggtgtattac 12900
ctcatcttga aacaagcact gaaggtgcag actactacct tgagcgttat gtttctcttt 12960
ttaatcctga tattttaaag gggaaaagaa tagggctata tgaacattct agtgcaggac 13020
gcgatttata tgctcctgtt tttaatcaat tgggtgcaga ggtcatttcc ttaggtagaa 13080
gtgatgagtt cgttcctatt gatacggaag cagtaagcga tgaagatcgc atacttgcaa 13140
gagagtggtc taaaaaatat aatcttgatg ctattttctc aacagatggc gatggtgatc 13200
gtcctttagt tgccgatgaa aatggtgaat ggctaagagg cgatattctg ggattactta 13260
ctgctattga acttaatatc aaggcgttgg ctattccagt gagttgtaat acagcaattg 13320
aacagtctaa taaatttgca agtatacaac gaacgaaaat aggttctcct tatgtaattg 13380
cagcgtttac agatcttgct aagcaattta attcagtcgc tggttttgaa gctaatggtg 13440
gctttctcct tgcctccgat ttacaaatta atggcaagga attaaaatcg ttacctacac 13500
gagatgctgt gttaccagca ttaatgctct taatagcttc tcgcaatagt actatttctc 13560
aactgattaa taatcttcct cagcgattca cttggtcaga tagagttaaa aacttccctt 13620
cagattcaag tcaacaaatt ataaaaaatg ccatatcgtc acccaataat ttctttaata 13680
gtttaggtta tgaatcatta tcctgttccg ctattgatga aacggatggt gcaagattta 13740
ctttaaataa tggtgatatt atacatctcc gtccttccgg taatgctcca gaactccgtt 13800
gttatgctga ggccagtgat gaaaatcagg ctaagcaata tgttacgaat gtgctgggaa 13860
atattacctc tttgatttct tgatgttata ggtttatcta cgcttatacg tgtgcgtagg 13920
tttgattaca cgtagatgcc ggtatacaga attgaagaac ggtatttgtt gcattaatga 13980
aattcagcac tacacacatt cgtgcaactt gagataacat ctcaatcata tccaagtcgc 14040
gcatacatcg cggtgaacac cccctgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagattggt 14100
gtcgtcggta tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat 14160
accgtctcta ttttcaaccg ttcccgtgag aagacggaag aagtgattgc cgaaaatcca 14220
ggcaaaaaat tggttcctta ctttacggtg aaagggtttg ttgaatctct ggaaacgcct 14280
cgtcgcatcc tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgcaat tgattccctc 14340
aaaccatatc tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaatacctt cttccaggac 14400
accattcgtc gtaaccgtga gctttctgct gaaggcttta acttcattgg taccggtgtt 14460
tccggtggtg aagagggcgc gctgaaaggg ccttccatca tgcctggtgg ccagaaagaa 14520
gcctatgaac tggttgcgcc gatcctgacc aaaatcgccg ccgttgctga agatggcgaa 14580
ccgtgcgtta catatattgg tgccgatggt gcgggtcact atgtgaaaat ggttcacaac 14640
ggtattgaat acggtgatat gcaactgatt gctgaagcct attctctgct taaaggcggc 14700
ctgaatctct ctaacgaaga actggcacag acctttaccg agtggaataa cggtgaactg 14760
agcagctacc tgatcgacat caccaaagat atcttcacca aaaaagatga agacggtaac 14820
tatctggttg atgtgatcct ggatgaagcg gctaacaaag gtaccggtaa atggaccagc 14880
cagagcgcgc tggatctcgg cgaaccgctg tcgttgatta ctgagtctgt gtttgcacgt 14940
tatatctcgt ctctgaaaga tcagcgcgtg gccgcatcta aagttctctc tggcccgcaa 15000
gcacagccag caggcgacaa ggctgagttc atcgaaaaag ttcgccgtgc gctgtatctg 15060
ggcaaaatcg tttcttacgc tcagggcttt tctcagctgc gtgctgcgtc tgaagagtac 15120
aactgggatc tgaactacgg cgaaatcgca aagattttcc gtgctggctg catcatccgt 15180
gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgca tatgccgaaa atccgcagat cgctaacctg 15240
ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc gatgactacc agcaggcgct gcgcgatgtc 15300
gtcgctcatg cagtacagaa cggtatcccg gttccgacct tcgccgctgc ggttgcctat 15360
tacgatagct accgtgccgc tgttctgcct 15390
表1 大肠杆菌O156型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据 基因 功能基因的碱基 位置 正向引物 反向引物 PCR产物 的长度产生正确大小电泳带的组数 PCR的退 火温度 (℃) Wzx O-抗原转运酶1366-2505 1512-1532 1846-1864 353bp 0* 56 1851-1869 2229-2247 397bp 0* 55 Wzy O-抗原聚合酶4783-5988 5209-5227 5840-5858 650bp 0* 60 5594-5614 5865-5885 292bp 0* 56
*只在大肠杆菌O156型中得到正确的一条带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号 该组中含有的菌株 来源
1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20， IMVSa
O21，O22，O23，O24，O59
2、野生型大肠杆菌 O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37， IMVSa
O38，O40，O41，O42，O43
3、野生型大肠杆菌 O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSa
O57，O58，O60，O61，O62
4、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSa
O79，O80，O81，O82，O83
5、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101， IMVSa
O102，O103，O104，O106
6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSa
O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128
7、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSa
O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145
8、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O154，O155，O157，O158， IMVSa
O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166 b
9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c
D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12 d
10、野生型大肠杆菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d
B16，B17，B18
11、野生型大肠杆菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，FX变，FY变，DS，DR， d
12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151， IMVSa
O155，O124
13、第8组菌株加上大肠杆菌标准菌株O156 IMVS
*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组
a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS
d.d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3 大肠杆菌O156型O抗原基因结构图
E.coli O156 O-antigen gene cluster
#orf galF wzx orf2 orf3 wzy orf5 orf6 gmd fcl gmm manC orf11 manB gnd
％G+C 30 34 31 28 29 28 43 39 38 41 33 38
表4大肠杆菌O156型O抗原基因簇基因位置
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCATT GTGGCTGCAG GGATTAAAGA AATCATTGTG 60
GCTGCAGGGA TCAAAGAAAT CCTCCTGGTA ACTCACGCGT CCAAGAACGC GGTCGAAAAC 120
CACTTCGACA CCTCTTATGA ATTAGAATCT CTCCTTGAGC AGCGCGCAAA GCGTCAACTA 180
CTGGCGGAAG TACAGTCCAT TTGCCCGCCG GGCGTGACCA TTATGAACGT GCGTCAGGGC 240
GAACCCTTAG GTTTAGGCCA CTCCATTTTG TGTGCACGAC CCGCCATTGG TGACAACCCA 300
TTTGTCGTGG TATTGCCAGA CGTTGTGATC GACGACGCCA GCGCCGACCC GCTGCGCTAC 360
AACCTTGCTG CCATGATTGC GCGTTTCAAT GAAACGGGCC GTAGCCAGGT GCTGGCAAAA 420
CGTATGCCGG GTGACCTCTC TGAATACTCC GTTATTCAGA CCAAAGAACC ACTGGATCGT 480
GAAGGTAAAG TCAGCCGCAT TGTTGAATTT ATCGAAAAAC CGGATCAGCC GCAGACGCTG 540
GACTCAGACA TCATGGCCGT TGGTCGCTAT GTGCTTTCTG CAGATATTTG GCCGGAACTA 600
GAACGCACTC AGCCTGGTGC ATGGGGGCGT ATTCAGCTGA CAGATGCCAT CGCTGAACTG 660
GCGAAAAAAC AGTCCGTTGA TGCCATGCTG ATGACAGGTG ACAGCTACGA CTGCGGTAAA 720
AAAATGGGTT ATATGCAGGC ATTTGTGAAG TATGGACTAC GCAACCTGAA AGAAGGGGCG 780
AAGTTCCGTA AAGGGATTGA GAATCTGTTA AGGGATTAAT GAAAATCTGA CCGGATGTAA 840
CGGTTGATAA GAAAATTATA ACGGCAGTGA AGATTCGTGG CGAAAGTAAT TTGTTGCGAA 900
TATTCCTGCC GTTGTTTTAT ATAAACAATC AGAATAACAA CGAGTTAGCA ATAGGATTTT 960
AGTCAAAGTT TTCCAGGATT TTCCTTGTTT CCAGAGCGGA TTGGTAAGAC AATTAGCGTT 1020
TGAATTTTTC GGGTTTAGCG CGAGTGGGTA ACGCTCGTCA CATCGTAGGC ATGCATGCAG 1080
TGCTCTGGTA GCTGTAAAGC CAGGTGCGGT AGCGTGGGTA ATGTTTACTA CCTATATAGT 1140
TACGTGCAAT GAAAAATAAG AATAAGTGCT GAATGATTTT GATTATGAAT ATTTTAGATT 1200
TTTTATAAGG AGGATATTAT AAATATAGGA ACTAAAATCT CTATTTATGC GGCATTATCT 1260
AGAGGTCTTA AAATATTAAG TGGACCCATA ATAATTCTTG TTGTTTCAAA GACATTAAGT 1320
orf1起始
TCAGAGGAAA TTGGATTTTA TTATACTTTT TTCAGCTTAG TAACTATGCA GCAGTTAGCT 1380
GAATTAGGTT TAGGGCAAAC ATTAAGATTG CATATTGCTC ATGCGTTTAA AATGGACGAG 1440
TCGGGATGGT GTTTTAACTC AAAAAAAGAA ATTAAGCAAT ACTATTCTCT AAGTGTAAAA 1500
TGGTTCTTGG TCGTTGCGTT ATGTACTATC ATTATTATTG GTCCTGCGGG TATTTATTAT 1560
TATCATTCTT ACCAAGGGGA TATTATTTGG GAAGGCCCAT GGGTATCATT AGTATTGGTT 1620
ACAGCACTAA CAATTATAAT AACGCCTATA CAAATCACAA TTGAATCTCT ACAACATCAA 1680
ATTTCAGTAT TTAAAGCACA GACATATGCA TCAATTATCA ATAGTATATC ATFATGTCTG 1740
TTATTGTTTT CTGGATTTGG TCTATATGCA ATTGCTTTAA GCCTATTTAT CAGTAACTTA 1800
ACAGTCTTAA TATTTTTATG GGGGAAAATA AAATGGCTGA GAAATAACCT GATGCCTGTT 1860
CTTGTTGATA CAAATTTTTT TGTTGTTTTT AAAGAGATCT GGCCGCTGTT TTCTCGTGTA 1920
GCTGTTGTAT CTGTATTTGG TTTCCTTTTT TGGAATGGAT TTAATCTAAT TGCATTTAAA 1980
GTATATGAGC CCTCATATGC AGGACAAGTA ATTTTATCCA TAACCTTAGC GAGAGCTGGC 2040
TATGGATTTT CTGAGTCAAT TTTATATGGG CAAATAACAT ACATATCTAA TTTGATTTCG 2100
AACAAAAAAT ATAATGAGGC TATGATAGTT TATAAAAAAA ATACATATAT AGCACTAACG 2160
ATTTTGTTAA TAGGATATGT GTTTTTTTTA CTTCTTATGT ATCTTTTCCC AGAATTCTAC 2220
TTATTTAAAA AAATAGTAGG CTCAAGCTAT TTAATTAGTA TATTTGTATT TTTTATAATA 2280
GTTCTTTTTT TAACCTCAGG AAATAACTAT GTCAGATGCT TTAAAACAGA ACCATTTGTA 2340
AAAGTGTCCA TCTTTCACGG GGTCATGGTA CCAACATTAT TTTATTTATC ATCAGTTTTT 2400
TATGAGGGTT ATTATTTATA TCCATGTTCA TTGGTGTTGA TTGTTTCTCT AATTTTATCA 2460
orf1终止 orf2起始
AAAAGAATAT CAAGCAAGTA TTTTAGAATG TCCGGCATTA ATTAATAATA GGTGAAAAGT 2520
GAATAAGAAA GATAACTTTG TGAATATTTT TGACACAAGT ATTGCATCAT TGAATGTTGG 2580
TGATTACATT ATTATGGATG CTGTGACCAA ACAGTTATCT ACAATAAGTA ATTTACCGCA 2640
GACTGTTACA TTACCAACGC ATGACCATTT TGGTAGAGAA GGGCGACGTT TACTTAGCTT 2700
GGCTAAATAT TCTATTGTTG GCGGCACTAA TTTATTATCA TCGCATGTTA CACAATATCG 2760
CCAATGGCGG TTTCGTATGA CAGATCTTTT ATTTTTAAAA AAATGCATAT TAATGGGAGT 2820
TGGTTGGTGG CAATATCAAG ATAAACCAGA CAGAGTTACA AAATTTATTT TGAAGCATAT 2880
ATTACACAAT GAAATGTTAC ACTCAGTTCG TGATTCATTT ACATTGAAAC AACTTCATTC 2940
CATTGGCATT ACTAATGTCA TAAATACCGG TTGTCCGACA ATGTGGGATT TGACACCAGA 3000
GCACTGTTGC AATATTCCAA GAGAAAAGGG AAGACGTGTA TTATTTACAT TAACAGATTA 3060
TAATCAAGAC TTATCAGCGG ATGCATTATT AATCAATACT CTTAAAAGAC ATTATGATGA 3120
GGTATTGTTT TGGCCACAGG GGAGTGAAGA TATTCACTAT ATGAATACAT TCAGTACAGA 3180
TATTAGAAAT GGGCTTAAAA TTTTACGACC ATCATTATCT GAACTTAATG CAAATTTAAT 3240
GCTTAAGGAA ACTGATTATG TTGGGACACG ATTACATGCG GGGATTCGTG CATTGCAACT 3300
TCGCGCAAGA ACTATAATTA TAGGTGTTGA CAATAGAGCA ATAGAGAAAG CGAAAGACTT 3360
TAATCTTCCT GTATTAAAAC GAGATGCTAT TTTGGAGCTG GAAAATATGA TAGTTGAACC 3420
orf2终止
ACTTATTACT CAAATTAATA TGCCGTGGGG AAATATTGAA AAGTGGAAAG ATCAATTTTA 3480
orf3起始
ATATTATTCT TTTTTGTTCA GTAGAGTTTT TTAAGATAAT TTAGGGACCG GATGAAAATA 3540
TTAATATTGA ATCATTCAGA CAATGTTGGC GGGGCTGCTA GGGCAGCCTA CCGATTGCAT 3600
ATGCTATTTA AGCAAAAATT TGCTAATAGT GAGATGTTTG TTAGAGTAAA AAAAAGTGAT 3660
AGCTCAAGTG TATTTACCCC AAAGGGCATT TATTCTTTTT TATCAAAGAT ACGATACCCA 3720
CTTAGCAAGT TTATTTTGAA AAAATTATTA CATATCTGGA AGCAGGATTT AATTAGTTTA 3780
AATATGATCC CATCTTCTTT GTCAAGAATA ATTAATGAAT CCGATGCGGA TATTGTAAAT 3840
ATTCATTGGA TTGCTGGAGA AACAATATCA TTTAAAGACC TATCACGAAT AAAAAAACCT 3900
TTAGTCTGGA CCATGCATGA TATGTGGCCA TTCATTGGCG CTGAACATTA CATAGACGAG 3960
TCAAGAACTG ATTGGTTGTG TGGGTATAAA AACCTATTCG GAAAGTTTGG TATAATAAAT 4020
AGGTACTTGT GGAGAAAAAA ACTAAAAACT TACAGTCGAC TAAATATATG TTTCGTATCT 4080
CCAAGCAAAT GGCTTGCAGA AAAAGCTAAG CTGAGCGGTC TATTACAAGG TATGCGAATT 4140
GAAGTAATTC CTAATCCTAT AAATTTCGAC ATATTTAAGC CTCTAGATAA AGAGTTTTCG 4200
AGAAAAGCAT TAAATCTATC TCTATCATCA AAGATAATTT TATTTGGTGC TGTAGGAGGT 4260
GTTAATGATC AGCGTAAAGG TTACACTCTA CTATATGAAT CCTTGATGCA CCTTTCGGAT 4320
AAAATAAGTA ATAAAGAAAA TATTGAGTGT GTTTTTTTTG GACAGAGTGA ACAGCCAAAA 4380
GAGTTTGCTC CACTTCCATT TAAATGTACC TGGTTCGGTG TGGTCAACGA TGATGTTTCA 4440
TTATCGTTGT TATACAACGC TGCTGATATT ACTGTTGTGC CATCACGAAT GGAGAACTTG 4500
CCACAGATAT GTACAGAAGC ACAATCGTGT GGATGCCCTG TCGTTGCATT CAACACTACT 4560
GGAATAAGTG AAACAATTGA ACACAATAAA ACAGGTTATT TGGCAAATGC ATTTGATACA 4620
TTAGACTTAT CTAAAGCAAT GTATACACTC CTTTTTAATA ATGATTTGAA CAAAATGTTT 4680
TCTGCAAATG CAAGCGAAAG AGCGCGTTTT CTTTGGAATG GTGATAGTAT TGCCAAAAAA 4740
orf3终止 orf4起始
TATGAATCCA TTTTCTCAAG TTTAAAGGAG TGATCTGAGT AAGTGGAAAA TCAACACGTT 4800
TATTTTTATA AGAAATCAAA TAAAGCAAAT GTTTCAATTG TTGCCTTGAT TTTTACATAT 4860
ATCTCAATTA TTGGTTGGAG CCCTTTTTTT AGTGGATATT TAGCTGTACC ATTATTTCTA 4920
ACATATCATA TACCCTTTTT ATTATTGCTT GCTTACTTTA TGTTAACACA AAAAATAAGT 4980
AGTGCTTTAA TTTCATTATC GATAATAATG ATTATACTTA TTTCTGCACT AACATTGTTA 5040
ACAGAATCAT TAATTAATTT TAATCGTTAT ATTTTTGAAC CGCTGACCTT TTTGCTTTGC 5100
TATTATTGTA CAGTAAGTAG AAAACTTGCC GAAAAAATAT GCACATATGC ATCATGTGTT 5160
GTAATCATAG GCATTGTGCT ATCAGTAATT TCTTTTTGTT ATGCGTATGC AGGAGGTAAC 5220
GAAATATTAA CTTTTCATAA TGTCGATGGA CGATTGAATA GTTTATATCT AACTTCATTT 5280
AGTAATTTTA AAATAGGAAA TATTATCCGA CCATCATTTA TATATGATGA ACCCGGGGCA 5340
TTCAGTTTTG TCATATGTTT TGTCGTTATT TTAAGGGAGG TTTTGGGAAG AAAATATAAT 5400
TGGGTTTACC TTCTTGGAGG CATGATTACA TTAAGTTTAA CTCAATTTAT CATATTATCA 5460
CTATATATTA TAGTTAAAAA TTGGAAAAAT ATTAAACAAA TCCTTGTGTT GTGTTTTGCA 5520
TTATTCGGGT TGATAATGTT TACATATAAT AATAATGAAT TCGATTTTTT CTATAATAGA 5580
TTCAATACGG AAAATGGAAC ATTTAGCGGT GATAATAGAA GCATGCAGAT CTCAAATTAT 5640
TTAAATGTTG TCAATGAGAA TATGTTTCTT CTGGGGGACT ATAAGTGTCA TGATAACATA 5700
AATCAGAGAT GTGAAAGTCA TGGTGATATT TCATCAAGTA TAGTAACTCC AATATACAAA 5760
GGCGGTATTC TACAACTATT ACTACAAATT ATTACTCATG CAATAATATT TTGGTTGGCA 5820
CTCCGAGAAA GAAAACTCAT ATTCCCAGCC TTAGTATTAA CAATACTACT GCTTCAAAGA 5880
CCCTTTTTTG ATGTAGTGGG ATATTCAGTT ATGATCTATT ATTCTATTTT TTTAATGTTT 5940
orf5起始 orf4终止
AATTTTAAAG TGTTTAAAGA TGATTATTAT CACAGTCGTA AAAAATGATC CAGATGGACT 6000
TTTAAAGACC TATAATTCTG TAATATCTGA AATTGGGAGT GGATTAAAGT GCAGTCGGTG 6060
GATTATTAAA CTAAGCAGCG ATGCAGATGT CTCTTTAAAA AAGATTATCA ATCTGCCTGA 6120
TTATTGCCAT GTATATACTG ATTATGATAA AGGTATTTAC TCAGCTTTTA ACCAAGCAAT 6180
TTCAAAAATT CCATCATCGC ATGAAAATGA ATATGTAATG TTTTTAAATG CTGGTGATGA 6240
AATTATAAAT GGACAAGAGA TAAATAAGCT TCTTGATCTG CAAAGAGATA ACATCGATAT 6300
TTTTATTGCT TGTGCTAAAA TACCAGGTAA AGAAAAAATA ATATATCCAA TCTCATCTTT 6360
AATCGGCGTT GGAGGATTAA ATTTTTGTCA CCAGTCTATT TTATACCGAG TAAAAATATT 6420
GAAAGAGATT CCTTTTCCAG AAAAATATAA AATAGCAGGA GATTATGCGC ATTATTTAAA 6480
AATACAAGAC CGAGATAAGA TTATATGTAC TTTGATTATT TCTACTTTTT CTCTAGATGG 6540
TTTATCAGGG CGTAGTGTTT ATAAAACTCG GCTAGAAAAT TTCAAAGCTG GTTTCGAGCA 6600
TAATGGTATA AGAGAAATAT TTAATTTTGT CAAAATGATT ATTATAAGAG TATTGGATAA 6660
orf6起始 orf5终止
AATATGATTG CTTTTTTTAT TGGACCATCA ACTGGAAAAG TTACAGGTCA ATCAATAGCC 6720
TTCAATATAA TATATGATAA CTATTCAGGT AAAAAATATC TTATAAATTA TCCAGATCCA 6780
GATGAAGGGT TTTTATCTTT ATTTAAAGGA TATATTCAAT CGTTTTTTGT TTTCATTTTC 6840
ATAAATTTGT TATTTTTTTT TAAAAAAAAG ACTGTTTATA TAACAAGCAG TCGAACTCTG 6900
ATTGGTTTTT TTCGTGATGC TATTTATATT ATAGTCGGGA AGTTATTTTT TGCAAAAGTT 6960
GTTAATCATT TGCATGGTGC TGATTTTAAA TATTTTAGAA ATGAGCAATG TTATATAATT 7020
AAAAAAATAA TTGATTATGT TTATAATAAG ATAGATGTTT CAATTGTTCT CACTGCAAGG 7080
ATGAAGGAAC AATATAACAT ATATCGGAAG ATGAAAATCA AAGTAATAGG TAACTGTTAT 7140
TTTGGTCTTA GTTACAGGCA AGAGAAGAAA ATTTTTAATA ATGAAACGCT AAAACTAGTT 7200
TTTCTTTCTA ATTTATTATA CTCCAAAGGG ATCGTACATC TAATAAATGT GGTAAAAAGA 7260
ATAAATAATG AAGGTATAAA GGTAAGTCTC GAAATTGCGG GAAAAATATT GAGTGATGAA 7320
TATGTTGATT CGTGTAAATT GAAAGAAATA TTAGAGGCTA AAATTGAAAA TTGTCCATAT 7380
ATTAAATATC ATGGACCCCT GAATTCTGAA AAGAAAAGTG CTTTACTAAA CAGATCTGAT 7440
GTGTTTGTGT TGCCAACATT CTATCGCTCT GAAGCTCAGC CTATTTCTGT TCTTGAAGCA 7500
ATGTATTTTG GTTGTGTGAT TGTAACGACG GCTCATAATT ATATGCCGGA TTTTGTTACG 7560
GCGAAGAATG GTATCATTAT TAATCCTGAT GATGAGGACG ATTTATACGA AGCTTTATTA 7620
AAAATCAATA ATATGAAGAG TATATTTTCT GATGTTGCAG CATATAATGC CTGCTATGTT 7680
AAAAAAAATT TTTCTCCAGA AAATTATATA AACAAAATTA CTTCAGTAAT AATAGAGGAT 7740
orf6终止 orf7起始
TAAATGAAAA AAGCATTTAT TACAGGCATC ACCGGGCAAG ATGGCTCTTA TTTGGCTGAA 7800
TTTCTTCTTG ACAAAGGCTA TGAAGTGCAT GGCATTAAGC GTCGAGCATC TTCGTTTAAC 7860
ACAGAACGTG TTGATCATAT TTATCAAGAT CGCCACAACC AAAATCCAAA TTTCTTTCTT 7920
CATTATGGTG ACTTAACAGA TACATCAAAC CTGATACGTC TAATCAAAGA AATCCAACCA 7980
GACGAAGTTT ATAACCTTGG CGCTCAATCT CATGTAGCGG TTTCATTCGA ATCACCTGAA 8040
TATACTGCTG ACGTAGATGC GATGGGGACT TTACGTCTGC TGGAAGCGAT TCGTATTTGT 8100
GGGCTAGAGA AAAAAACACG TTTTTATCAG GCATCAACTT CTGAACTCTT CGGCTTAGTT 8160
CAGGAAATCC CGCAGCGAGA AACAACACCA TTCTACCCTC GTTCGCCTTA TGCTGTTGCG 8220
AAGATGTATG CATACTGGAT TACTGTAAAC TATCGTGAAT CCTATGGAAT GTATGCCTGT 8280
AACGGTATTC TCTTCAACCA TGAATCCCCG CGTCGTGGTG AAACATTCGT AACACGTAAA 8340
ATCACTCGTG CTATTGCAAA TATTTCGCAG GGAATCGAAA AATGTCTCTA TCTTGGCAAT 8400
ATGGATTCAC TGCGCGACTG GGGGACATGC GAAAGATTAC GTGCGTATGC AGTGATGATG 8460
TTGCAGCAAG ATCACCCAGA GGATTTTGTT ATTGCAACAG GCAAACAAAT TTCCGTACGT 8520
GAATTTGTTC GTATGTCAGC TAAAGAAGTC GGTCTGGAGT TAGAATTCTC CGGACAAGGT 8580
GTTGATGAAA TAGCAACTGT TGTGAATAAA ACATCTGACT GTGCTATTGG TGTTAGTATT 8640
GGGGATGTGA TCGTTCGTGT TGATCCTCGT TATTTCCGTC CTGCAGAGGT TGAAACTCTT 8700
CTTGGTGATC CAGCAAAAGC GAAAAGAGTA TTGGGTTGGG AACCAGAGAT TACAGTTGAA 8760
GAGATGTGTG CAGAAATGGT TGCCAGTGAT CTGGCGAAAG CAAAACAGCA TGCACTACTG 8820
orf7终止 orf8起始
AAAAGCCATG GTTACGATGT TGCAGTTTCT CTGGAGCGGT AAGGTATGAA AAAAAAACGT 8880
ATCTACGTTG CTGGTCACCG AGGCATGGTT GGCTCTGCTA TTTGCCGTCA ATTATCACTG 8940
CGTGATGATA TCGAATTAGT GGTCAAAACA CACAAAGAAC TCGATCTAAC CGTACAGAAG 9000
GATGTTGATG CATTTTTTGC GCAAGAGAAA ATTGATCAGG TTTATCTTGC TGCGGCTAAA 9060
GTTGGTGGCA TTTATGCCAA CAATACATTT CCGGCTGAAT TCATCTATCA GAATCTCATG 9120
ATTGAGAGTA ATATTATTCA TTCAGCTCAC AAGGCCGGAA TTCAAAAATT ACTTTTTTTA 9180
GGCTCAAGCT GTATTTATCC TAAATTCGCA GAGCAGCCGA TGAACGAGTC TGCGCTTTTA 9240
ACGGGCATAC TTGAGCCAAC TAATGAGCCA TACGCAATTG CTAAAATTGC GGGCATAAAA 9300
TTATGTGAAT CTTATAACCG TCAATATGGC CGTGATTATC GCAGTGTAAT GCCTACTAAT 9360
CTTTATGGCA TAAATGATAA TTTCCACCCC GAAAACTCTC ATGTTATTCC GGCACTCATG 9420
CGTAGATTCC ATGAGGCAAA AGAGAGTGGT GCACCAGAAG TTATTGTCTG GGGAACAGGA 9480
ACACCGATGC GTGAGTTTTT ATATGTTGAT GATATGGCTG CCGCATCTGT TCATGTAATG 9540
GAACTTGACG AAGCAATTTA TCAACAAAAT TCACAGCCTA TGTTATCTCA TATTAATGTT 9600
GGTACGGGTG TAGATTGTTC CATACGTGAA ATGGCTGAAA CAATGGCCTC TGTGGTGGGT 9660
TATCAAGGTA AAATTGTTTT TGATGTTACT AAACCTGATG GCACTCCGCG TAAACTTATG 9720
GACGTTACCC GGCTCAAAAA CTTGGGCTGG CAATATCAAT ATAATTTACA TGAAGGCTTA 9780
orf8终止 orf9起始
TCATTAACAT ATAAATGGTT TATTGAGAAT ATTAATTCTT TTCGGGGATA GTTATGAATA 9840
AGAGATTGGA ACGTGAGCTA TTTAAAACAA TAGTTGAGCA TACTCCTCTA ATCTCGATTG 9900
ATCTCATAAT TAGAAACGAT AAAGGAGAGG CGCTGCTGGG GCAGCGCCTG AATCGCCCAG 9960
CACAAAATTA TTGGTTTGTG CCAGGAGGGC GAATTTATAA GGATGAGTCA TTCGAGATTG 10020
CATTTAAGCG GATAACATTT GAAGAGGTGG GCGTTCAAAT TAGTCTTGAT GATGCCTTAT 10080
TTCTAGGGGT GTATGAACAT TTTTACAATG ATAATTTTTC TGAAGCAGAA TTTTCTACAC 10140
ACTATGTAGT GCATGGATAT GAAATCCAAC TTAAACCTCA GCAACTTCAC CTACCAACGG 10200
TCCAGCATAA TTCCTACAAG TGGTTTGATG TAGTAACGTT GCTTAATAGC ACTACAGTTC 10260
orf9终止 orf10起始
ATCAATATAC CAAAAATTAT TTTATACCAA GGTAATAGAT ATGCTACTTC CCGTTGTCAT 10320
GGCCGGTGGT TCTGGTACCA GATTATGGCC TCTTTCACGT ACACTTTATC CGAAACAATT 10380
TCTATCTTTA AATAGTCGTT TAACCATGTT GCAAGAGACA TTGCGGCGGC TTGACAAGGT 10440
AGAACATAAA CCCGCTTTGG TCATTTGTAA CGAATCACAT CGCTTTATCG TTGCTGAACA 10500
ATTGCGTAAA GAGGGTTTAA AGCATAGCGG TATTTTGCTT GAGCCTGTTG GCCGTAATAC 10560
TGCGCCTGCT GTAGCACTCG CAGCACTTCA GGCTATGGTA ACTGGAGATG ATCCTATTCT 10620
GTTGGTTCTT GCTGCTGATC ATGAAATTCA GAATGAGGAT AATTTCATTG ATGCAGTTCT 10680
TGCAGCCAAG AATTTTGCAG AACAGGGTAA GCTTGTTACG TTTGGTATTG TTCCAACATC 10740
CCCAGAGACT GGCTATGGTT ACATTAAGTC AGGTGAGTAT CTGGATGGAA AAGGTTACAA 10800
AGTTGCGGCT TTTGTTGAAA AACCAGAGCT TCACGTAGCT CAGCAGTATA TATCAGATGG 10860
CGGTTATCTT TGGAATAGTG GGATGTTTAT GTTCAGAGCA TCTGTATTTA TCAATGAACT 10920
GAAAAAATTC CGACCAGATA TTTTAGCCAG TTGCCAACGC TCCTTGTCCT CTTCGATACA 10980
AGATTTAGAT TTTATCCGTC TGGATAATGC TTCATTTTCT TGCTGTCCTG AAGAGTCTAT 11040
TGACTATGCA GTTATGGAAA AAACAGCCGA AGCTGTCGTC GTTCCCTTAA ATGCACAATG 11100
GAGTGATGTT GGGTCATGGT CTGCATTGTG GGAAATAAGT TCAAAAGATC AAAGCGGTAA 11160
TGCCATTCGT GGTGATGTAT TGGTTGAAGA TGCTACAGAT AGTTATCTTT ATTCGCAGCA 11220
TAGACTTATT GGTGCTGTGG GCATAAAGGA TTTGGTTGTT GTTGAAACGA AAGATGCCGT 11280
ATTAGTTGCT CATAAAGATA AAGTTCAGCA AGTTAAAAAC ATCGTCGCTC AACTTAAAAA 11340
GAATAATCGC ACAGAATATT TACAGCATCG GGAAATATTT CGGCCTTGGG GCAGTCATGA 11400
TACTATAGCT GAAGGGCCGC GCTTTCAAGT GAAACATGTG ATTGTATTAC CTGGCCACAT 11460
TACCGCTAAG CAGATTCATT ACCATCGTAC TGAGCATTGG ATTGTTGTCT CGGGGACAGC 11520
TAAAGTCCAT CTTGAAGATA AGACTTACCT TGTTTCTGAA AATGAATCAA CATATATACC 11580
TGTTGGTGTT CCACATGCCA TTGAAAATCC TGGCAAGATC CCGCTTGAAA TAATCGAGGT 11640
TAGATCAGGA GTCTACCTGG AAGAGGATGA TGTTATAAGA GTTTCTTCTT CTGGAGTAGG 11700
orf10终止 orf11起始
ATACTAATGC GAATTTCTAT TATCACAGCT ACTTATAATA GTGAAAAAAC TCTCCTTGAT 11760
ACATTACTTT CTCTAGAAAA ACAAACGTAT CCAGATATCG AATATATAGT TGTAGATGGA 11820
GCATCGAACG ATAATACAAT TAAGCTGATC AAGGGTAATT GTACAAAAGT TTCAAAAATC 11880
ATTTGCGAAC CCGATAAGGG CATTTATGAT GCTCTGAATA AAGGTATTCA AGCAGCTTCG 11940
GGTGATGTTA TTGGTTTTTT ACATTCTGAT GATTTATTAC CCTATGATGA TGCTATTGCA 12000
GATATAGCAA AAACATTTGA AATTACAGGG TGTGATGCTA TTTATGGCGA TTTGGAGTAT 12060
GTTGCCCAAA ATGATACGAC TAAACGTATT AGATTATGGA AAAGTGGTTC ATTTAGTCGT 12120
TTCAAGATGA AAGTGGGTTG GATGCCGCCA CACCCATCAT TTTATATGAA ACGCAAATGT 12180
TATAGGCAGT TTGGTTGTTT TTCTTTAGAT TATCGAATAT CTGCTGATTA TGACTCATTA 12240
TTACGATATA TTTTAAAACA ACGTATTTCA ACAGAATATT TACCAAAAGT CTTAGTGAAG 12300
ATGCGTGTTG GTGGAATTAG CAATCGTTCA GTATCTTCAA TGGTAAAGAA GTCAATGGAA 12360
GACATTCGTG TTATGAACCA GAATGGTATT ATCTGGCCAA TAGCTTTAGT GTATAAAAAT 12420
orf11终止 orf12起始
ATATCCAAAC TTCCTCAATT TATTAAAAAG TAATCATCAT GTTAAATGTT AAAAAAATCA 12480
TTAACGATAG TAATATTGCG TTCGGTACTA GTGGTGCTCG CGGTTTAGTG ATCGATTTTT 12540
CCCATGATGT TTGTGCTGCG TTCACTCATG CGTTTCTTTC TGTTATTGAT GACAAATACA 12600
ATTTTAATAA AGTTGCCTTA GCAATTGATA ACCGCCCAAG CAGTTACGAA ATCGCTCAGG 12660
CATGCGCCTT CGCTATCAAA CAACATGGGT TCACTGTCGA ATATCATGGT GTAATTCCGA 12720
CTCCCGCATT AGCTCATTAT TCGATGCAGA AAAACATTCC CTGCATAATG GTCACAGGGA 12780
GTCATATCCC TTTTGATCGT AATGGCTTAA AATTCTACAG ACCTGATGGT GAAATCACTA 12840
AAGAGGATGA GCTCGCAATT ATAAATAGTG AGTATACATT TTCGCCTGTA GGTGTATTAC 12900
CTCATCTTGA AACAAGCACT GAAGGTGCAG ACTACTACCT TGAGCGTTAT GTTTCTCTTT 12960
TTAATCCTGA TATTTTAAAG GGGAAAAGAA TAGGGCTATA TGAACATTCT AGTGCAGGAC 13020
GCGATTTATA TGCTCCTGTT TTTAATCAAT TGGGTGCAGA GGTCATTTCC TTAGGTAGAA 13080
GTGATGAGTT CGTTCCTATT GATACGGAAG CAGTAAGCGA TGAAGATCGC ATACTTGCAA 13140
GAGAGTGGTC TAAAAAATAT AATCTTGATG CTATTTTCTC AACAGATGGC GATGGTGATC 13200
GTCCTTTAGT TGCCGATGAA AATGGTGAAT GGCTAAGAGG CGATATTCTG GGATTACTTA 13260
CTGCTATTGA ACTTAATATC AAGGCGTTGG CTATTCCAGT GAGTTGTAAT ACAGCAATTG 13320
AACAGTCTAA TAAATTTGCA AGTATACAAC GAACGAAAAT AGGTTCTCCT TATGTAATTG 13380
CAGCGTTTAC AGATCTTGCT AAGCAATTTA ATTCAGTCGC TGGTTTTGAA GCTAATGGTG 13440
GCTTTCTCCT TGCCTCCGAT TTACAAATTA ATGGCAAGGA ATTAAAATCG TTACCTACAC 13500
GAGATGCTGT GTTACCAGCA TTAATGCTCT TAATAGCTTC TCGCAATAGT ACTATTTCTC 13560
AACTGATTAA TAATCTTCCT CAGCGATTCA CTTGGTCAGA TAGAGTTAAA AACTTCCCTT 13620
CAGATTCAAG TCAACAAATT ATAAAAAATG CCATATCGTC ACCCAATAAT TTCTTTAATA 13680
GTTTAGGTTA TGAATCATTA TCCTGTTCCG CTATTGATGA AACGGATGGT GCAAGATTTA 13740
CTTTAAATAA TGGTGATATT ATACATCTCC GTCCTTCCGG TAATGCTCCA GAACTCCGTT 13800
GTTATGCTGA GGCCAGTGAT GAAAATCAGG CTAAGCAATA TGTTACGAAT GTGCTGGGAA 13860
orf12终止
ATATTACCTC TTTGATTTCT TGATGTTATA GGTTTATCTA CGCTTATACG TGTGCGTAGG 13920
TTTGATTACA CGTAGATGCC GGTATACAGA ATTGAAGAAC GGTATTTGTT GCATTAATGA 13980
AATTCAGCAC TACACACATT CGTGCAACTT GAGATAACAT CTCAATCATA TCCAAGTCGC 14040
GCATACATCG CGGTGAACAC CCCCTGACAG GAGTAAACAA TGTCAAAGCA ACAGATTGGT 14100
GTCGTCGGTA TGGCAGTGAT GGGGCGCAAC CTTGCGCTCA ACATCGAAAG CCGTGGTTAT 14160
ACCGTCTCTA TTTTCAACCG TTCCCGTGAG AAGACGGAAG AAGTGATTGC CGAAAATCCA 14220
GGCAAAAAAT TGGTTCCTTA CTTTACGGTG AAAGGGTTTG TTGAATCTCT GGAAACGCCT 14280
CGTCGCATCC TGTTAATGGT GAAAGCAGGT GCAGGCACGG ATGCTGCAAT TGATTCCCTC 14340
AAACCATATC TCGATAAAGG TGACATCATC ATTGATGGTG GTAATACCTT CTTCCAGGAC 14400
ACCATTCGTC GTAACCGTGA GCTTTCTGCT GAAGGCTTTA ACTTCATTGG TACCGGTGTT 14460
TCCGGTGGTG AAGAGGGCGC GCTGAAAGGG CCTTCCATCA TGCCTGGTGG CCAGAAAGAA 14520
GCCTATGAAC TGGTTGCGCC GATCCTGACC AAAATCGCCG CCGTTGCTGA AGATGGCGAA 14580
CCGTGCGTTA CATATATTGG TGCCGATGGT GCGGGTCACT ATGTGAAAAT GGTTCACAAC 14640
GGTATTGAAT ACGGTGATAT GCAACTGATT GCTGAAGCCT ATTCTCTGCT TAAAGGCGGC 14700
CTGAATCTCT CTAACGAAGA ACTGGCACAG ACCTTTACCG AGTGGAATAA CGGTGAACTG 14760
AGCAGCTACC TGATCGACAT CACCAAAGAT ATCTTCACCA AAAAAGATGA AGACGGTAAC 14820
TATCTGGTTG ATGTGATCCT GGATGAAGCG GCTAACAAAG GTACCGGTAA ATGGACCAGC 14880
CAGAGCGCGC TGGATCTCGG CGAACCGCTG TCGTTGATTA CTGAGTCTGT GTTTGCACGT 14940
TATATCTCGT CTCTGAAAGA TCAGCGCGTG GCCGCATCTA AAGTTCTCTC TGGCCCGCAA 15000
GCACAGCCAG CAGGCGACAA GGCTGAGTTC ATCGAAAAAG TTCGCCGTGC GCTGTATCTG 15060
GGCAAAATCG TTTCTTACGC TCAGGGCTTT TCTCAGCTGC GTGCTGCGTC TGAAGAGTAC 15120
AACTGGGATC TGAACTACGG CGAAATCGCA AAGATTTTCC GTGCTGGCTG CATCATCCGT 15180
GCGCAGTTCC TGCAGAAAAT CACCGATGCA TATGCCGAAA ATCCGCAGAT CGCTAACCTG 15240
CTGCTGGCTC CGTACTTCAA GCAAATTGCC GATGACTACC AGCAGGCGCT GCGCGATGTC 15300
GTCGCTCATG CAGTACAGAA CGGTATCCCG GTTCCGACCT TCGCCGCTGC GGTTGCCTAT 15360
TACGATAGCT ACCGTGCCGC TGTTCTGCCT 15390
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。