一种治疗冠心病、心绞痛的双丹提取物和其注射制剂及其制备方法 所属领域
发明属中药制药领域，具体涉及一种治疗冠心病、心绞痛的双丹提取物和其注射制剂及其制备方法。
背景技术
冠心病、心绞痛在临床上是常见病、多发病，近年来随着人们生活水平的提高，冠心病发病年龄有所提前，并且发病率呈逐年上升的趋势。越来越多的临床报道显示，中药在治疗冠心病、心绞痛方面具有良好的应用前景。双丹膏由丹参和丹皮两味中药组成，丹参微寒入心经，能活血化瘀，通痹止痛；牡丹皮性寒亦归心经，善于凉血散瘀。二药相合，可化瘀活血，行血止痛。实验证明，丹参能降低血压，增加冠脉血流量，减慢心率，缩短实验性心肌缺血的时间，还有抗血小板聚集及抗凝作用。牡丹皮则清芳透达，凉血不致成瘀，活血不致妄行。二药相伍，实为治疗冠心病、心绞痛之良药。目前，其临床上应用剂型有膏剂、颗粒剂和口服液，而上述各剂型显效速度显然皆不及注射剂，因此将其改制成注射液，在对冠心病、心绞痛的治疗方面会有较好的临床疗效和应用前景，使冠心病、心绞痛的治疗真正达到速效，强效。
丹参为唇形科植物丹参的根及根茎，具有活血祛瘀、清热凉血的功能。丹参中含有多种化学成分，其有效成分可分为两类，一类是水溶性丹参素类(原儿茶醛)；另一类是脂溶性的丹参酮类(丹参酮IIA)。丹参中的脂溶性有效成分丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮等均具有保护心肌缺血缺氧、抑制血小板聚集的功能。目前，丹参中丹参酮类等脂溶性有效成分的提取方法主要是乙醇回流提取，由于提取受热时间长，大量丹参酮已降解，将其做成制剂后，丹参酮的含量往往较低甚至检测不出，难以起到作用。
丹皮为毛莨科植物牡丹的干燥根皮，具有清热凉血，活血化瘀的作用。牡丹皮主要含有多种酚类(如丹皮酚)，另外还含有多种单萜类成分(如芍药苷)。其中丹皮酚有祛风镇痛、降压、止血、抗炎、抗菌、抑制血小板凝集等多种药理作用。目前，丹皮酚提取主要采用水蒸气蒸馏提取，但采用该法提取损失较多。
超临界流体萃取是一种新型萃取分离技术。它是利用流体(溶剂)在临界点附近的某一区域内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能的特点以及它对溶质溶解能力随压力、温度改变而在相当宽的范围内变动的特性，达到分离溶质的一种方法。超临界二氧化碳流体萃取能够比较完好地保存中药有效成分不被破坏或发生次生化，尤其适合于那些对热敏感性强、容易氧化分解地成分的提取。超临界二氧化碳流体萃取萃取效率高，在有效成分得到富集的同时，无溶剂残留，便于控制产品质量。
因此，采用超临界流体萃取具有价格低、无毒、可循环使用的特点。超临界流体萃取脂溶性成分具有工艺简单、萃取时间短、操作温度接近室温，热敏感成分几乎不发生降解等优点。
环糊精以其特殊的“内疏水、外亲水”的分子结构与许多客体分子形成包结配合物，环糊精在药学上主要用于提高药物在制剂中的稳定性，增加难溶性药物在水中的溶解度等，但β-CD本身的低溶解度限制了它的应用，在众多的环糊精衍生物中羟丙基β环糊精(HP-β-CD)衍生物被认为是最有前途的高级药物载体材料。HP-β-CD在水中的溶解度大于50％，远远大于β-CD1.85％(25℃)，比β-CD的水溶解度提高27倍。动物实验表明，HP-β-CD本身安全性好，无毒副作用。因此，采用HP-β-CD包合双丹注射剂中丹参酮类成分，能很好解决丹参酮类脂溶性成分在水中溶解度小的问题。
结合双丹注射制剂中丹参酮不稳定，容易发生降解以及丹参酮和丹皮酚在水中溶解度小的特点，本发明采用超临界流体萃取法分别提取丹参和丹皮中的脂溶性有效成分，将丹参酮采用羟丙基β-环糊精包合，丹皮酚用硫酸磺化成丹皮酚磺酸钠，再与丹参和丹皮中的水提有效部位一起，制成注射液。专利CN99117379公开了中药丹参中活性成分超临界二氧化碳萃取工艺方法，采用夹带剂提取丹参酮，易提取出极性较大的成分，而本发明的目的是提取出脂溶性成分供HP-β-CD包合，解决脂溶性成分的水溶性问题。利用超临界流体技术对丹皮中的丹皮酚进行萃取也有报道(郭晓玲，孟青，冯毅凡，等.牡丹皮超临界CO2萃取物质量标准研究[J].广东药学院学报，2003，19(3)：204-207)，并且丹皮酚的磺化也有报道(束建清，吴春.运用正交试验法选择丹皮酚最优磺化条件[J].中成药，1995，17(9)：6-8)，但将超临界流体萃取技术、丹参酮羟丙基β-环糊精包合和丹皮酚磺化三者结合应用于双丹复方制剂中却未见报道。专利CN01141436.7报道了水溶性丹参酮的制备方法，采用乙醇提取丹参，然后直接用β环糊精包合，因采用乙醇提取出的成分较多，除有丹参酮类成分外，水溶性成分也会被乙醇提出，这样用β环糊精包合，没有针对性，如只针对脂溶性成分，本发明采用超临界萃取提取出丹参脂溶性成分，采用HP-β-CD针对性地包合脂溶性成分，且采用HP-β-CD包合比采用β-CD包合水溶性提高27倍。目前，双丹制剂的制备工艺均采用水煮醇沉法制备(中药成方制剂部颁标准WS3-B-2669-97)，其脂溶性有效成分含量低；采用超临界流体技术提取丹参中的丹参酮类成分并对其采用羟丙基β-环糊精包合，增加了其稳定性和水溶性；采用超临界流体萃取技术提取丹皮中的酚类成分并将其制成磺酸盐，解决了其在注射液中溶解度小的问题，因此，通过本发明，解决了丹参酮和丹皮酚在注射液中溶解度低、含量少、不稳定的问题，使制剂更稳定，有效成分含量大大提高，从而使制剂成品的质量和临床疗效得到保证。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种有效成分含量高、稳定、制备工艺合理、显效迅速的双丹提取物和其注射制剂及其制备方法。本发明分别采用二氧化碳超临界流体萃取提取丹参和丹皮中的脂溶性有效成分，利用羟丙基β-环糊精(HP-β-CD)包合超临界流体萃取提取的丹参酮类成分，将超临界流体萃取的丹皮酚磺化成可溶性的丹皮酚磺酸盐，从而增进了二者在注射液中的溶解度，解决了脂溶性成分在注射液中溶解难的问题，提高了制剂的质量和临床疗效。对超临界流体萃取后的丹参和丹皮药粉加水煎煮提取，水提液浓缩后，醇沉二次，浓缩至适量，加入丹参酮HP-β-CD包合物及丹皮酚磺酸盐，搅拌均匀，用0.2％的活性炭煮沸15分钟，滤过，调节pH值至7.0，精滤，滤液灌封，灭菌，即得双丹注射液；在注射液的基础上，加入适量冻干赋形剂，冷冻干燥，即得冻干粉针剂。本发明的双丹注射制剂，有效成分含量高，疗效显著。
本发明通过以下技术方案实现：
一、药材的前处理
取重量比为2∶1的丹参、丹皮药材分别拣选、用去离子水洗净、烘干，粉碎成粗粉。
二、提取制备工艺
1、取原料丹参∶丹皮＝2∶1依重量比按下述方法提取，分别将丹参和丹皮采用超临界流体技术进行萃取，得丹参超临界萃取物丹参酮类和丹皮超临界萃取物，将萃取出的丹参超临界萃取物丹参酮类用适量50％乙醇溶解，加入到饱和的羟丙基β-环糊精溶液中，恒温搅拌，置冰箱中冷藏过夜，抽滤，低温干燥，得丹参酮类羟丙基β-环糊精包合物粉末；将萃取出的丹皮超临界萃取物，搅拌下缓缓加入到装有浓硫酸和发烟硫酸(比例为10-15∶8-12)的烧瓶中，50-80℃搅拌30-90分钟，将反应液溶入到适量水中，所得酸水液用醋酸乙酯萃取三次，除去未反应物，酸水液用0.5％的活性炭脱色，滤过，滤液在加热搅拌下加入氯化钠使其浓度达23％，放冷，置冰箱中冷藏过夜，即有针状结晶析出，过滤，得丹皮酚磺酸钠；再用水提醇沉法提取、纯化经超临界萃取后的丹参、丹皮药粉，以去离子水煎煮提取三次，提取液合并，减压浓缩至相对密度为1.10-1.15(50℃)，放冷，缓缓加入乙醇使含醇量达60-70％，冷藏静置，滤过；上清液减压回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.15-1.20(50℃)，放冷，加入乙醇使含醇量达70-80％，冷藏静置，滤过，滤液减压回收乙醇至干，得丹皮和丹参水提取物；将上述丹参酮类羟丙基β-环糊精包合物、丹皮酚磺酸盐以及丹参和丹皮的水提取物用适量注射用水溶解，用0.2％的活性炭脱色，滤过，灭菌，精滤，滤液真空低温和/或冷冻干燥，即得双丹提取物。
取双丹提取物，直接无菌分装，即得双丹无菌粉针剂。
取双丹提取物，用适量注射用水溶解，搅匀，滤过，调节pH值至7.0，灌封，灭菌，即得双丹注射液。
取双丹提取物，加适量注射用水溶解，加入冻干赋形剂适量，搅匀，滤过，调节pH值至7.0，灭菌，灌装，冻冷干燥，即得注射用双丹冻干粉针剂。
2、本发明的双丹注射制剂主要由丹皮酚磺酸盐、丹参酮类羟丙基β-环糊精包合物、丹参和丹皮水提取物组成。
3、丹参酮类羟丙基β-环糊精包合物采用超临界萃取丹参中的丹参酮，以羟丙基β-环糊精利用搅拌法进行包合。
4、本发明的双丹提取物的制备方法，其特征在于分别将丹皮和丹参采用超临界萃取，将萃取出的丹参酮类成分采用羟丙基β-环糊精包合，将萃取出的丹皮酚采用浓硫酸磺化，再用水提醇沉法提取、纯化丹参和丹皮中的水溶性成分，将上述丹参酮类羟丙基β-环糊精包合物、丹皮酚磺酸盐以及丹参和丹皮的水提取物用适量注射用水溶解，用0.2％的活性炭脱色，滤过，灭菌，真空低温和/或冷冻干燥，即得。
5、本发明中所用冻干赋形剂可以是任何常规的冻干用赋形剂，包括甘露醇、乳糖或者是二者的混合物。
注射用双丹制剂对大鼠急性心肌缺血的影响
实验仪器与材料
1、药品与试剂
1.1、丹参注射液(正大青春宝药业有限公司，批号：030102)，垂体后叶素注射液(Pit)(上海第一医药公司批号：030312)。
1.2、仪器olympus-Au-600型全自动生化分析仪(日本olympus公司)；LD4-2A型医用离心机(北京医用离心机厂制造)。
1.3、动物Wistar大鼠，体重(220±20)g，♀♂各半，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.4、实验方法
1.4.1模型制备：(1)急性心肌缺血模型：垂体后叶素注射液(Pit)20 IU/kg腹腔注射(ip)造模。
1.4.2分组及给药 60只大鼠随机均分为6组：(1)正常对照组ip生理盐水4ml/(kg·d)，连续7d；(2)模型组ip生理盐水4ml/(kg·d)，连续7d；(3)阳性对照组ip丹参注射液2g/(kg·d)，连续7d；(4)双丹注射液组2g/(kgd)。
1.5、指标测定
急性心肌缺血实验：除正常对照组外，各组动物均于d8造模，1h后腹主动脉采血测以下指标。(1)心肌酶4项：所取血液离心，取上清液，在olympus-Au-600型全自动生化仪上检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)；(2)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量测定：取血清，依试剂盒方法测定，(3)心肌梗塞面积测定：实验结束后，迅速剪下心脏，自心尖至心底将左心室切成约1mm厚的心肌片，置于N-BT染色液中，在37℃恒温水浴中染色15min，梗塞区不着色，其余区域呈蓝色。剪取各区心脏称重，计算梗塞区与左心室的百分比。实验结果以均数±标准差(x±s)表示，组间两两比较用q检验。
2、实验结果
2.1、心肌酶指标
各组心肌酶检测结果详见表1。
表1双丹注射液对急性心肌缺血大鼠心肌酶的影响(n＝10，x±s)
组别 AST(IU/L) LDH(IU/L) CK(IU/L) CK-MB(IU/L)
正常组 143.50±16.52 690.92±296.32 1138.23±435.83 815.38±244.89
模型组 206.50±35.42** 1295.62±335.24** 1662.71±565.37* 1118.46±278.51
丹参注射液组 164.30±25.36** 1029.30±467.85 1096.45±198.56* 845.95±135.28
双丹注射剂组 158.21±28.67** 1055.42328368± 995.49±365.76 748.36±198.54
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明，与模型组比较，双丹注射液组可使CK、AST显著下降，对CK-MB、LDH也有下降作用。
2.2、对血清SOD及MDA活性
各组血清SOD及MDA活性检测结果见表2
表2 双丹注射液对血清SOD及MDA活性的影响
组别 SOD(IU/ml) MDA(nmol/ml)
正常组 175.46±6.02 6.46±1.32
模型组 152.43±6.38 9.62±2.21
丹参注射液组 165.63±8.43* 6.69±1.31*
双丹注射液组 168.35±7.31* 6.54±1.21*
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
具体实施形式
实施例1
1、处方 丹参1000g 丹皮500g
2、提取：取上述处方量药材，拣选、用去离子水洗净、烘干，粉碎成粗粉。取丹参粗粉，置超临界流体萃取器中，以22Mpa的萃取压力，45℃的萃取温度萃取2小时，得丹参超临界萃取物；将丹皮粗粉，装入超临界萃取罐中，以压力为25MPa、温度为35℃、流量为22L/h的条件萃取4h，得丹皮超临界萃取物。取丹参超临界萃取物，用适量50％乙醇溶解，加入到饱和的HP-β-CD溶液中，50℃恒温搅拌至出现浑浊，继续搅拌1.5h，置冰箱中冷藏过夜，抽滤，低温干燥，得HP-β-CD包合物粉末；取丹皮超临界萃取物，搅拌下缓缓加入到装有浓硫酸和发烟硫酸(12.5∶10)的烧瓶中，75℃搅拌下反应30分钟，将反应液缓缓倾入到适量水中，所得酸水液用醋酸乙酯萃取三次，除去未反应物，酸水液用0.5％(W/V)的活性炭脱色，过滤，滤液在加热搅拌下加入氯化钠使其浓度达23％，放冷，置冰箱中冷藏过夜，即有针状结晶析出，过滤，得丹皮酚磺酸钠。取超临界萃取后的丹参、丹皮药粉，以去离子水煎煮提取三次，提取液合并，减压浓缩至相对密度为1.10-1.15(50℃)，放冷，缓缓加入乙醇使含醇量达60-70％，冷藏静置，滤过；上清液减压回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.15-1.20(50℃)，放冷，加入乙醇使含醇量达70-80％，冷藏静置，滤过，滤液减压回收乙醇至干，得丹皮、丹参水提取物，备用。将丹参酮HP-β-CD包合物，丹皮酚磺酸钠盐以及丹参和丹皮水提取物用适量注射用水溶解，以0.2％的活性炭脱色，滤过，真空低温和/或冷冻干燥，得双丹提取物。
3、制备
(1)双丹注射液的制备：取双丹提取物，用适量注射用水溶解，搅匀，滤过，加注射用水至1000ml，调节pH值至7.0，滤过，灌封，灭菌，即得双丹注射液。
(2)双丹冻干粉针剂的制备：取双丹提取物，加适量注射用水溶解，同时加冻干赋形剂甘露醇50g，搅匀，滤过，调节pH值至7.0，灭菌，灌装，冻冷干燥，压盖，即得注射用双丹冻干粉针。
实施例2
1、处方 丹参1000g 丹皮500g
2、提取：取上述处方量药材，拣选、用去离子水洗净、烘干，粉碎成粗粉。取丹参粗粉，置超临界流体萃取器中，以22Mpa的萃取压力，45℃的萃取温度萃取2小时，得丹参超临界萃取物；将丹皮粗粉，装入超临界萃取罐中，以压力为25MPa、温度为35℃、流量为22L/h的条件萃取4h，得丹皮超临界萃取物。取丹参超临界萃取物，用适量乙醇溶解，加入到饱和的HP-β-CD溶液中，50℃恒温搅拌至出现浑浊，继续搅拌1.5h，置冰箱中冷藏过夜，抽滤，低温干燥，得HP-β-CD包合物粉末；取丹皮超临界萃取物，搅拌下缓缓加入到装有浓硫酸和发烟硫酸(12.5∶10)的烧瓶中，75℃搅拌下反应30分钟，将反应液缓缓倾入到适量水中，所得酸水液用醋酸乙酯萃取三次，除去未反应物，酸水液用0.5％(W/V)的活性炭脱色，过滤，滤液在加热搅拌下加入氯化钠使其浓度达23％，放冷，置冰箱中冷藏过夜，即有针状结晶析出，过滤，得丹皮酚磺酸钠。取超临界萃取后的丹参、丹皮药粉，以去离子水煎煮提取三次，提取液合并，减压浓缩至相对密度为1.10-1.15(50℃)，放冷，缓缓加入乙醇使含醇量达60-70％，冷藏静置，滤过；上清液减压回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.15-1.20(50℃)，放冷，加入乙醇使含醇量达70-80％，冷藏静置，滤过，滤液减压回收乙醇至干，得丹皮、丹参水提取物，备用。将丹参酮HP-β-CD包合物，丹皮酚磺酸钠盐以及丹参和丹皮水提取物用适量注射用水溶解，以0.2％的活性炭脱色，滤过，低温和/或冷冻干燥，得双丹提取物。
3、制备
(1)双丹注射液的制备：取双丹提取物，用适量注射用水溶解，搅匀，滤过，加注射用水至1000ml，调节pH值至7.0，滤过，灌封，灭菌，即得双丹注射液。
(2)双丹冻干粉针剂的制备：取双丹提取物，加适量注射用水溶解，同时加冻干赋形剂乳糖50g，搅匀，滤过，调节pH值至7.0，灭菌，灌装，冻冷干燥，压盖，即得注射用双丹冻干粉针。
实施例3
1、处方 丹参1000g 丹皮500g
2、提取：取上述处方量药材，拣选、用去离子水洗净、烘干，粉碎成粗粉。取丹参粗粉，置超临界流体萃取器中，以22Mpa的萃取压力，45℃的萃取温度萃取2小时，得丹参超临界萃取物；将丹皮粗粉，装入超临界萃取罐中，以压力为25MPa、温度为35℃、流量为22L/h的条件萃取4h，得丹皮超临界萃取物。取丹参超临界萃取物，用适量乙醇溶解，加入到饱和的HP-β-CD溶液中，50℃恒温搅拌至出现浑浊，继续搅拌1.5h，置冰箱中冷藏过夜，抽滤，低温干燥，得HP-β-CD包合物粉末；取丹皮超临界萃取物，搅拌下缓缓加入到装有浓硫酸和发烟硫酸(12.5∶10)的烧瓶中，75℃搅拌下反应30分钟，将反应液缓缓倾入到适量水中，所得酸水液用醋酸乙酯萃取三次，除去未反应物，酸水液用0.5％(W/V)的活性炭脱色，过滤，滤液在加热搅拌下加入氯化钠使其浓度达23％，放冷，置冰箱中冷藏过夜，即有针状结晶析出，过滤，得丹皮酚磺酸钠。取超临界萃取后的丹参、丹皮药粉，以去离子水煎煮提取三次，提取液合并，减压浓缩至相对密度为1.10-1.15(50℃)，放冷，缓缓加入乙醇使含醇量达60-70％，冷藏静置，滤过；上清液减压回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.15-1.20(50℃)，放冷，加入乙醇使含醇量达70-80％，冷藏静置，滤过，滤液减压回收乙醇至干，得丹皮、丹参水提取物，备用。将丹参酮HP-β-CD包合物，丹皮酚磺酸钠盐以及丹参和丹皮水提取物用适量注射用水溶解，以0.2％的活性炭脱色，滤过，低温和/或冷冻干燥，得双丹提取物。
3、制备
(1)双丹注射液的制备：取双丹提取物，用适量注射用水溶解，搅匀，滤过，加注射用水至1000ml，调节pH值至7.0，滤过，灌封，灭菌，即得双丹注射液。
(2)双丹冻干粉针剂的制备：取双丹提取物，加适量注射用水溶解，同时加冻干赋形剂甘露醇30g，乳糖20g，搅匀，滤过，调节pH值至7.0，灭菌，灌装，冻冷干燥，压盖，即得注射用双丹冻干粉针。