还原型谷胱甘肽在制药中的应用 一、技术领域
本发明涉及还原型谷胱甘肽(GSH)的新用途，尢其是涉及在制药中的应用。
二、背景技术
还原型谷胱甘肽，即r-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，是在动植物体内广泛存在的一种三肽，其结构式如下：
还原型谷胱甘肽含有游离的巯基，具有还原性和抗氧化作用，已广泛用于抗衰老作用和抗氧化作用的研究和应用(沈同，王镜岩等。生物化学.高等教育出版社。1990，12)
本发明揭示还原型谷胱甘肽作为全身炎症反应综合征的抑制药物的一种全新药用价值，为全身炎症反应综合征(SIRS)和其后期的多功能器官衰竭综合征(MODS)的治疗寻找到有效的药物。
全身炎症反应综合征(SIRS)由1991年美国胸科医师学会(ACCP)和危重病学会(SCCM)的联席会提出概念并拟定标准，是指感染或非感染等致病因素作用于机体，引发宿主各种炎性介质过渡释放和炎症细胞的过渡激活并产生一系列的连锁反应，出现瀑布样效应的一种全身过渡炎症反应的病理状态。它是不依赖病因的全身炎症过程，激活淋巴细胞，毛细血管内皮细胞和神经胶质细胞等，导致毛细血管通透性增加，血小板黏附，白细胞与内皮细胞粘连，纤维蛋白沉积，微循环障碍，炎性粒细胞浸润组织并脱颗粒，蛋白酶和毒性自由基释放增加，最终导致组织的损伤和器官地衰竭。临床流行病血资料显示全身炎症反应综合征(SIRS)发生率占住院病人的1/3，全身炎症反应综合征(SIRS)的病死率7％-26.5％，其后期的多功能器官衰竭综合征(MODS)的病死率超过50％(BrunBC The epide miology of the systemic inflammatory response.Intens Care Med2000；26(Suppl1)：S64；卢崇亮全身炎症反应综合征华夏医学2001；14(4)：254)目前尚缺乏有效的药物用于抵御全身炎症反应综合征(SIRS)、抑制其后期多功能器官衰竭综合征(MODS)的发生。
三、发明内容
1、发明目的
本发明的目的在于提供还原型谷胱甘肽的新用途，即在制药中的新应用。具体来说是提供一种能抵御全身炎症反应综合症和抑制炎症性多功能器官衰竭综合症的有效药物。
2、技术方案
本发明涉及还原型谷胱甘肽(GSH)在制备治疗全身炎症反应综合征疾病的药中的应用。还涉及还原型谷胱甘肽(GSH)在制备治疗炎症性多功能器官衰竭综合征疾病的药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用还原型谷胱甘肽的药理药效试验的结果来说明其在制药领域中的新用途。
(1)LPS是大肠杆菌内毒素的主要成分，常作为致伤剂，用于诱导动物全身炎症反应综合征。用30只大鼠做试验，当腹腔注射20mg/Kg的LPS，15小时内大鼠死亡率达50％，而预先用40mg/Kg的GSH注射后再注射LPS的大鼠，以及空白对照大鼠，15小时内均无死亡，实验证明GSH非常显著地对抗全身炎症反应综合征(SIRS)的致死作用，大大提高了动物的存活率。
(2)1991年美国胸科医师学会(ACCP)和危重病学会(SCCM)的联席会对全身炎症反应综合征(SIRS)拟定的指标是呼吸、心率、体温和白细胞数(卢崇亮全身炎症反应综合征华夏医学2001；14(4)：254；蔡再同；楼宾城，刘均娥.全身炎症反应综合征患者生命体征的观察，中华护理杂志，2001；36(10)；751)。在发生SIRS时，个体出现呼吸窘迫和呼吸衰竭、心率上升、体温上升或下降以及白细胞数量的增加或减少。但在MODS发生时，会出现体温下降和白细胞数量的减少，提示个体抗炎能力的下降。本实验观察了GSH对LPS所致呼吸、心率、体温和白细胞数改变的抑制作用。实验结果表明GSH可抑制动物炎症反应后期的快速体温下降，这对于机体抗炎，维持生存有着重要意义；GSH能够明显降低全身炎症反应综合征(SIRS)时的呼吸急促和呼吸窘迫，表明其具有抗呼吸衰竭的作用，从而减少和避免机体的缺氧伤害；实验结果表明GSH明显增加大鼠血中的白细胞数，提示可增强动物的抗炎作用，减少动物最后进入全身器官衰竭的可能，提高动物的存活率；GSH还能明显减缓全身炎症反应综合征(SIRS)导致的心率加快的变化。
(3)一氧化氮(NO)含量的增加是全身炎症反应综合征(SIRS)的结果，NO在全身炎症反应中的作用是降低血压、产生氧自由基如ONOO·，ONOO·是NO致细胞毒性的主要物质，过量的氧化自由基导致细胞坏死、组织损伤和器官功能衰竭(邹冈等，基础神经药理学，科学出版社(第二版)1999，5)。
本实验测定LPS刺激15小时后大鼠血中NO的水平。结果表明GSH通过抑制NO含量的增高来抵抗全身炎症反应综合征(SIRS)的发展。
3、有益效果
通过还原型谷胱甘肽(GSH)的药理药效试验结果，可以明显地看出它的积极效果：
(1)具有明显的抗炎作用。表现在GSH将15小时内的全身炎症反应综合征(SIRS)导致的50％的病死率降为零，大大提高了动物的存活率。
(2)具有明显改善动物的呼吸、心率、体温和白细胞数等生理指标。动物患有全身炎症反应综合征后，会出现呼吸窘迫和呼吸衰竭、心率上升，体温上升或下降以及白细胞数量的增加或减少。而GSH可抑制SIRS的动物炎症后期的体温快速下降，能明显降低呼吸急促和呼吸窘迫，表明有抗呼吸衰竭的作用，能明显增加白细胞数，能明显减缓心率加快，通过改善生理指标，减少全身器官的衰竭，从而提高动物的成活率。
(3)具有显著抑制NO升高的作用。NO是致细胞毒性的主要物质，过量的NO会导致细胞致死、组织损伤和器官功能衰竭。GSH能抑制NO的升高，从而抵抗SIRS的发展。
(4)还原型谷胱甘肽(GSH)无毒副作用。
四、附图说明
图1、GSH对LPS所致大鼠体温变化的影响。
图2、GSH对LPS所致大鼠呼吸频率变化的影响。
图3、GSH对LPS所致大鼠白细胞数量变化的影响。。
图4、GSH对LPS所致大鼠心率变化的影响。
图5、注射LPS 15小时后大鼠血中NO的含量变化。
结果由均值±标准差表示，动物样本数＝10，*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01与LPS组比较。
五、具体实施方式
实施例1、对全身炎症反应综合征(SIRS)大鼠病死率的观察
(1)原理：高达50％的全身炎症反应综合征(SIRS)病人是由革兰氏阴性细菌感染所致，细菌细胞壁外膜成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作用于髓样和非髓样的细胞引发各种炎症介质过渡释放和炎症细胞过渡激活，出现瀑布样效应，最终导致机体抗炎和促炎失衡，引发全身炎症反应综合(SIRS)(蒋建新，陈惠孙，刁有芳等.失血性休克后内源性内毒素在组织循环中的分布及其对器官功能的影响。(解放军医学杂志，1998，23(2)：131)，甚至引起身体多功能器官衰竭，最终导致个体死亡。LPS是大肠杆菌内毒素的主要成分，常作为致伤剂，用于诱导动物全身炎症反应综合征。大鼠用量为腹腔注射20mg/kg时，可导致严重的脓毒血症，动物全身脏器衰竭，表现为肛肠温度、呼吸频率、心率、血中白细胞数等生理指标的明显变化，严重时可引起动物死亡(Mercer DW；Smith GS；Cross JM；RussellDH；Chang L；Cacioppo J Effects of lipopolysaccharide on IntestinalInjury：Potential Role of Nitric Oxide and Lipid Peroxidation.J.Sur Res1996；63)。降低死亡率是检测药物治疗全身炎症反应综合征，改善愈后的一项重要内容。本实验用LPS大鼠全身炎症反应综合征(SIRS)的动物模型，应用还原型谷胱甘肽GSH，拟对模型动物的死亡进行抑制。
(2)实验方法：
①实验材料：
清洁级SD雄性大鼠，体重240-260克，购于中科院上海实验动物中心。大肠杆菌内毒素(Lipopolysaccharide from Escherichria Coli O111：B4，LPS)，购于SIGMA，用时以无菌生理盐水配制浓度为2％的溶液。还原型谷胱苷肽(Gluthathione，GSH)购于AMRESCO公司，用时以无菌生理盐水配制浓度为1％的溶液。
②实验步骤：
将30只大鼠随机分为三组：(1)空白对照组、(2)LPS组和(3)GSH+LPS组，每组10只。先经腹腔给第三组大鼠注射40mg/kg的GSH，其余两组注射无菌生理盐水，10分钟后再给第二组和第三组动物腹腔注射20mg/kg的LPS，第一组动物注射无菌生理盐水。观察动物的死亡率。
(3)实验结果：
注射LPS的10只大鼠，15小时内死亡率达50％，而预先用40mg/kg GSH处理后再注射LPS的大鼠以及空白对照大鼠15小时内均无死亡。此实验证
明GSH非常显著地对抗全身炎症反应综合征(SIRS)的致死作用，提高动物的存活率。
实施例2、对全身炎症反应综合征(SIRS)大鼠多项生理指标的测定
1、原理：1991年美国胸科医师学会(ACCP)和危重病学会(SCCM)的联席会对全身炎症反应综合征(SIRS)拟定的指标是呼吸、心率、体温和白细胞数(卢崇亮.全身炎症反应综合征.华夏医学，2001，14(4)：254，蔡再同，楼宾城，刘均娥.全身炎症反应综合征患者生命体征的观察，中华护理杂志，2001，36(10)：751-753.)在发生SIRS时，个体的出现呼吸窘迫和呼吸衰竭、心率上升、体温上升或下降以及白细胞数量的增加或减少。但在MODS发生时，会出现体温下降和白细胞数量的减少，提示个体抗炎能力的下降。本实验观察了GSH对LPS所致呼吸、心率、体温和白细胞数改变的抑制作用，以研究GSH增强机体抗炎能力、抑制炎症发展的效应。
2、实验方法：
(1)仪器与材料：
Powerlab多道生理记录系统(Adinstrument)、
显微镜(400×)、
电脑数字式体温计、
清洁级SD雄性大鼠，体重240克-260克，购于中科院上海实验动物中心。
大肠杆菌内毒素(Lipopolysaccharide from Escherichria Coli 0111：B4，LPS)购于SIGMA，用时以无菌生理盐水配制浓度为2％的溶液。
GSH还原型谷胱苷肽(Gluthathione)购于AMRESCO公司，用时以无菌生理盐水配制浓度为1％的溶液。
白细胞稀释液(冰醋酸1.5ml、1％龙胆紫1ml、蒸馏水加至100ml)
(2)实验步骤：
动物分组同实验1。参照动物全身炎症反应(SIRS)的标准，分别于注射LPS后0.5、1.5、3、6、9和12小时进行肛肠温度、呼吸频率、心率、血中白细胞数的检测。为了防止创伤感染影响实验结果，试验中的呼吸频率和心率测定用Powerlab多道生理记录系统进行体外无创伤检测。经尾静脉取血20ul，加入380ul的白细胞稀释液中，在光学显微镜下进行血细胞记数。应用电脑数字式体温计测定肛肠内2cm处体温。采用ANOVA方法进行统计学处理。
3、实验结果：
(1)对肛肠温度的影响
表1、GSH对LPS所致大鼠体温变化的影响
组别 注射LPS后不同时间的体温(℃)
-0.5小时 1.5小时 3小时 6小时 9小时 12小时 空白对照 36.06 36.37 36.45 37.25 37.41 37.40
±0.26 ±0.30 ±0.20 ±0.12 ±0.12 ±0.10*#
LPS 36.06 36.37 36.65 37.78 38.05 36.41
±0.26 ±0.30 ±0.20 ±0.24* ±0.32* ±0.49*
GSH 36.06 36.37 36.75 38.14 38.38 37.89
+LPS ±0.26 ±0.31 ±0.20 ±0.23* ±0.19* ±0.24
结果由均值±标准差表示，动物样本数＝10，*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01与LPS组比较。
体温在一天中呈节律性变化，由表1和图1可见随时间的推移对照组动物的肛肠温度轻度上升，但6小时后基本稳定在37℃。注射LPS 3小时后三组动物的体温开始发生变化，GSH+LPS组和LPS组动物体温在6小时分别上升至38.14±0.23和37.78±0.24℃，这是机体由于LPS侵入造成的抗炎效应，随后这两组动物的体温保持在高水平，但在12小时，GSH+LPS组体温虽有下降(37.89±0.24℃)却仍比空白对照组高，而LPS组体温明显下降(36.41±0.49℃)明显低于空白对照组。在全身炎症反应综合征(SIRS)后期体温快速下降比上升更加危险，提示机体产生多功能器官衰竭，机体更易死亡。由此可见，GSH可抑制动物炎症反应后期的快速体温下降。这对于机体抗炎，维持生存有重要意义。
(2)对呼吸频率的影响
表2、GSH对LPS所致大鼠呼吸频率变化的影响
组别 注射LPS后不同时间的呼吸频率(次/分)
-0.5小时 1.5小时 3小时 6小时 9小时 12小时
空白对照 89.78 92.22 97.12 103.5 101.2 118.1
±2.88 ±3.69 ±3.75 ±5.16 ±5.16 ±8.29
LPS 89.78 92.23 127.2 149.6 172.3 164.2
±2.88 ±3.60 ±8.60* ±10.2* ±9.25** ±12.8**
GSH 89.78 92.42 113.2 145.2 149.0 148.2
+LPS ±2.88 ±3.31 ±2.25*# ±8.60* ±12.4*# ±10.2*
结果由均值±标准差表示，动物样本数＝10，*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01与LPS组比较。
从表2和图2可以看出注射LPS1.5小时后动物的呼吸频率即开始增加，GSH+LPS组的呼吸频率介于LPS组和空白对照组之间，在注射LPS 6小时后GSH+LPS组呼吸频率一直比较平稳，维持在145-149次/分之间，而LPS组的呼吸频率却在9小时之前一直在增加，在9小时上升为172.3±9.2次/分，与GSH+LPS组的149.0±12.4次/分和对照组的101.2±5.16次/分均有显著差异，出现明显的呼吸窘迫。随后呼吸频率仅略有下降(164.2±12.8次/分)，并在12小时后有部分动物死亡。由此可见GSH能够明显降低全身炎症反应综合征(SIRS)时的呼吸急促和呼吸窘迫，表明其具有抗呼吸衰竭的作用，从而减少和避免机体的缺氧伤害。
(3)对白细胞数量的影响
表3、GSH对LPS所致大鼠白细胞数量变化的影响
组别 注射LPS后不同时间的白细胞数(个/毫升血液/50)
-0.5小时 1.5小时 3小时 6小时 9小时 12小时
空白对照 201.1 249.3 296.9 296.8 265.6 279.3
±16.0 ±27.2 ±27.6 ±26.5 ±17.4 ±25.6
LPS 201.1 250.3 205.8 159.0 212.3 221.2
±16.0 ±26.9 ±32.7* ±19.3** ±30.8 ±31.2
GSH 201.1 248.3 218.0 129.3 209.0 359.2
+LPS ±16.0 ±27.3 ±51.8 ±27.1** ±38.4 ±29.9*#结果由均值±标准差表示，动物样本数＝10，*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01与LPS组比较。
从表3和图3表明注射LPS后，LPS组和GSH+LPS组动物的白细胞数明显下降，提示由于白细胞的迅速浸润，在一定时期内血液中的白细胞数量明显减少，本实验中这一现象持续到注射LPS后6小时，在注射LPS6小时后LPS组和GSH+LPS组动物的白细胞分别下降至7950±965个/毫升血液和6465±1355个/毫升血液，明显低于对照组的14840±1325。6小时后动物的白细胞开始上升，但LPS组和GSH+LPS组动物明显不同，GSH+LPS组动物的白细胞数量迅速上升，到12小时明显且高于对照组(17960±1495比13965±1280个/毫升血液)，而LPS组动物的白细胞数增加较少，仍低于对照组(10060±1060个/毫升血液)。LPS引起全身炎症反应的后期若白细胞的数量持续偏低提示多器官衰竭，此时机体免疫功能收到伤害，大量白细胞聚积在组织中，而外周血中很少。本实验结果表明GSH明显增加大鼠血中的白细胞数，提示可增强动物的抗炎作用，减少动物最后进入全身器官衰竭的可能，提高动物的存活率。
(4)对心率的影响
表4、GSH对LPS所致大鼠心率变化的影响
组别 注射LPS后不同时间的心率(次/分)
-0.5小时 1.5小时 3小时 6小时 9小时 12小时
空白对照 430.0 429.0 438.7 439.0 456.0 442.8
±10.8 ±10.4 ±5.22 ±7.46 ±8.55 ±7.89
LPS 430.0 430.0 439.0 489.5 509.0 507.2
±10.8 ±13.3 ±6.14 ±5.66**±8.50**±13..8**
GSH 430.0 429.6 438.6 454.5 492.5 490.5
±LPS ±10.8 ±12.6 ±6.32 ±10.2## ±10.1*±8.59*
结果由均值±标准差表示，动物样本数＝10，*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较，
#P＜0.05，##P＜0.01与LPS组比较。
心率加快最终会导致心力衰竭，从表4和图4可见注射LPS组动物在注射LPS 3小时后心率开始增加，6小时后已达489.5±5.66次/分，明显高于空白对照组(439.0±7.46次/分)和GSH+LPS组(454.5±10.2次/分)动物，随后一直维持在较高水平(507.2±13.8次/分)。说明GSH能明显减缓全身炎症反应综合征(SIRS)导致的心率加快的变化。
实施例3、LPS刺激大鼠后，对大鼠血液中一氧化氮(NO)含量变化的影响
1、原理：NO含量的增加是全身炎症反应综合征(SIRS)的结果，NO在全身炎症反应中的作用是降低血压、产生氧自由基如ONOO·，ONOO·是NO致细胞毒性的主要物质，过量的氧化自由基导致细胞坏死、组织损伤和器官功能衰竭。本实验测定LPS刺激15小时后大鼠血中NO的水平。
2、实验方法：
(1)仪器与材料：721分光光度计、低温离心机、NO测定试剂盒(南京建成)
(2)实验方法：雄性SD大鼠的分组同上，三组大鼠于15小时取血，3000rpm离心，取上清，按NO测定试剂盒规定的步骤进行操作，用721分光光度计在530nm处测定光吸收值，进行NO含量的检测。
3、实验结果：
LPS刺激15小时后大鼠血中NO的水平的检测显示LPS组大鼠血液中NO水平明显升高，从159.92±133.22升至2815.38±464.68单位/升血清，具非常显著差异，GSH+LPS组大鼠血中NO水平明显比LPS组动物低(2085.65±449.58单位/升血清)。三组动物NO含量在15小时的显著差异说明GSH有显著抑制NO升高的作用。提示GSH通过抑制NO的增高而抵抗全身炎症反应综合征(SIRS)的发展。
上述生物实验表明还原型谷胱甘肽GSH具有明显的抗炎作用，表现在GSH将15小时内的全身炎症反应综合征(SIRS)导致的50％的病死率降为零；使动物的呼吸、心率、体温和白细胞数等生理指标都有明显改善；并且可以抑制内毒素引起的血液中NO的上升，从而减少氧自由基对细胞的损伤。