检测人类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒.pdf

本发明公开了一种检测人类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒。该试剂盒包括TERT C228T反应混合液和/或TERT C250T反应混合液，还包括TERT内标反应混合液。该方法包括以下步骤：1)在TERT C228T反应混合液和/或TERT C250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，还在内标反应体系中加入与上述体系中相同的人类基因组DNA，进行荧光定量PCR扩增；2)对Ct值进行分析。本发明中的检测方法和试剂盒可以克服TERT基因启动子序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对C228T和C250T位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1％。

1.  一种检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C228T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在TERT内标反应混合液中加入与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述TERTC228T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERTC228T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERTC250T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERTC250T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的TERTC250T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERT内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的TERT内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的TERT内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
(2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。

2.  根据权利要求1所述的检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，
所述在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLTERTC228T反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物、TERTC228T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物和TERTC228T反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在TERTC250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLTERTC250T反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在TERTC250T反应混合液中TERTC250T前向引物、TERTC250T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在TERTC250T反应混合液中TERTC250T前向引物和TERTC250T反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在TERT内标反应混合液中加入与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA为：在14μLTERT内标反应混合液中加入1μL、浓度为10ng/μL、与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA，其中：每14μLTERT内标反应混合液中有TERT内标前向引物0.3-0.5μL、TERT内标反向引物0.3-0.5μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7-8μL，不足14μL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14μLTERT内标反应混合液中有TERT内标前向引物0.3125μL、TERT内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL；在TERT内标反应混合液中TERT内标前向引物和TERT内标反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。

3.  根据权利要求1或2所述的检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法的扩增过程为：(1)95℃、3min、循环数为1；(2)95℃、15s，68℃、20s，循环数为18；(3)95℃、15s，57.6℃、20s，循环数为24；(4)升温至95℃。

4.  根据权利要求3所述的检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述对Ct值进行分析的步骤为：
当样品在C228T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值17时，则该样品的C228T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C250T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值22时，则该样品的C250T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C228T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值17时，按照以下标准进行判断：当该样品在C228T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值13时，则该样品的C228T突变为阳性，即强阳；当该样品在C228T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值13时，则计算C228T反应体系的△Ct，ΔCt值＝C228T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值,若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值11，则该样品的C228T突变也为阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值11，则该样品的C228T突变则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值，
当C250T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值22时，按照以下标准进行判断：当该样品在C250T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值19时，则该样品的C250T突变为阳性，即强阳；当该样品在C250T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值19时，则计算该反应体系的△Ct，ΔCt值＝C250T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值15，则该样品的C250T突变也为阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值15，则该样品的C250T突变则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。

5.  一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，包括TERTC228T反应混合液和/或TERTC250T反应混合液，还包括TERT内标反应混合液，其中：
所述TERTC228T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERTC228T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERTC250T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERTC250T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的TERTC250T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERT内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的TERT内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的TERT内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液。

6.  根据权利要求5所述的检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，
所述TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物、TERTC228T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比均为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；TERTC228T前向引物和TERTC228T反向引物在TERTC228T反应混合液中的浓度为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述TERTC250T反应混合液中的TERTC250T前向引物、TERTC250T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比均为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；TERTC250T前向引物和TERTC250T反向引物在TERTC250T反应混合液中的浓度为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。

7.  根据权利要求5或6所述的检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，TERT内标前向引物、TERT内标反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在TERT内标反应混合液中的体积比为(0.3-0.5)：(0.3-0.5)：(7-8)，优选为0.3125：0.3125：7.5；TERT内标前向引物和TERT内标反向引物在TERT内标反应混合液中的终浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。

8.  根据权利要求5或6所述的检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，SYBRGreen荧光燃料，Mg2+，dNTPs和稳定剂。

9.  根据权利要求5或6所述的检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品、阴性对照品和/或野生型质控品。

10.  根据权利要求9所述的检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，阳性质控品1为发生50％TERTC228T突变和1％TERTC250T突变的基因组DNA，阳性质控品2为发生50％TERTC250T突变和1％TERTC2228T突变的基因组DNA；野生型质控品为无TERTC228T和C250T突变的野生型样品基因组DNA，所述阴性对照品为TE缓冲液；各阳性质控品、野生型质控品和阴性对照品的浓度都为5-15ng/μL，优选10ng/μL。

检测人类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒。
背景技术
端粒酶(telomerase)是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶，与端粒的调控机理密切相关，起着维持细胞永生化和致癌的关键作用。端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的重要催化部分，TERT基因位于人类第5号染色体，其中该基因的两个启动子突变位点，1,295,228C>T和1,295,250C>T(分别称为C228T和C250T)尤为常见，这两种突变已被证实能够增强TERT启动子转录活性。TERT启动子区突变不存在于正常的人类受试者及公共基因数据库，而表现为恶性肿瘤特异性体细胞的遗传改变，因此对于这两种突变的检测在监测人类肿瘤发生的过程中发挥重要作用。
TERT突变是原发性胶质母细胞瘤中出现频率较高(约为74.2％)的基因突变之一，在黑色素瘤、脂肪瘤、肝细胞癌、神经胶质瘤、膀胱癌等恶性肿瘤中都存在较高程度的TERT启动子突变，最新研究显示：只携带TERT突变的III-IV级胶质瘤患者，其病理诊断结果多为原发性胶母细胞瘤，且预后不良。因此，TERT突变为上述恶性肿瘤的发生和诊断提供了一个生物标记，能帮助早期诊断肿瘤并帮助进行分子病理分类和预测脑瘤中枢神经系统肿瘤的发生。目前，尚无对于TERT基因特定点突变的检测方法。现有TERT基因的检测仅有通过原位杂交技术对TERT基因的表达进行分析的，该方法必须基于细胞形态学，且不包含对TERT基因特定区域的扩增，因此只有当TERT基因总表达量显著升高或降低时，才能用肉眼的方式观测到。
荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的方法。染料法是荧光定量PCR中的常见方法，利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体 系中加入了SYBRGreen染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结合并在497nm下激发。染料法的优点：1、无需设计、合成探针，实验成本低；2、使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。染料法的缺点：由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增，因此有必要通过多个手段和方法来保证荧光信号的特异性。另外TERT基因启动子区域为非编码区，序列中GC含量很高，因此片段扩增的难度很大。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺陷，同时实现对人类TERT基因启动子突变的检测并计算样本的突变率，从而为肿瘤预后判断、靶向用药提供参考，本发明提供了一种检测人类TERT基因启动子突变的方法及其试剂盒，该检测方法和应用该方法的试剂盒将特异性引物用于荧光定量PCR方法中可以克服TERT基因启动子序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对C228T和C250T位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1％。
一种检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
(1)在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C228T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在TERT内标反应混合液中加入与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述TERTC228T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERTC228T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERTC250T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERTC250T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的TERTC250T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERT内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的TERT 内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的TERT内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
(2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。
一种检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其中：
所述在TERTC228T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLTERTC228T反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物、TERTC228T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在TERTC228T反应混合液中TERTC228T前向引物和TERTC228T反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在TERTC250T反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLTERTC250T反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在TERTC250T反应混合液中TERTC250T前向引物、TERTC250T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在TERTC250T反应混合液中TERTC250T前向引物和TERTC250T反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在TERT内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在14μLTERT内标反应混合液中加入1μL、浓度为10ng/μL、与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的人类基因组DNA，其中：每14μLTERT内标反应混合液中有TERT内标前向引物0.3-0.5μL、TERT内标反向引物0.3-0.5μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7-8μL，不足14μL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14μLTERT内标反应混合液中有TERT内标前向引物0.3125μL、TERT内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL；在TERT内标反应混合液中TERT内标前向引物和TERT内标反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
一种检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，其中所述荧光定量PCR方法的扩增过程为：(1)95℃、3min、循环数为1；(2)95℃、15s，68℃、20s，循环数为18；(3)95℃、15s，57.6℃、20s，循环数为24；(4)升温至95℃。
一种检测人类TERT基因启动子突变的荧光定量PCR方法，所述对Ct值进行分析的 步骤为：
当样品在C228T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值17时，则该样品的C228T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C250T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值22时，则该样品的C250T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C228T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值17时，按照以下标准进行判断：当该样品在C228T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值13时，则该样品的C228T突变为阳性，即强阳；当该样品在C228T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值13时，则计算C228T反应体系的△Ct，ΔCt值＝C228T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值11，则该样品的C228T突变也为阳性，即弱阳，反之则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值，
当C250T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值22时，按照以下标准进行判断：当该样品在C250T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值19时，则该样品的C250T突变为阳性，即强阳；当该样品在C250T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值19时，则计算该反应体系的△Ct，ΔCt值＝C250T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值15，则该样品的C250T突变也为阳性，即弱阳，反之则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
表1结果判定标准

*ΔCt值的计算：ΔCt值＝C228T反应体系或C250T反应体系突变Ct值(A)-该样本在内标反应体系的Ct值。
一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，包括TERTC228T反应混合液和/或TERTC250T反应混合液，还包括TERT内标反应混合液，其中：
所述TERTC228T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERT C228T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERTC228T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERTC250T反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERTC250T前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的TERTC250T反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述TERT内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的TERT内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的TERT内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液。
TERT基因启动子突变上、下游引物序列表

一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其中所述TERTC228T反应混合液或TERTC250T反应混合液中的相应前向引物、相应反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比均为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；相应前向引物和相应反向引物在TERTC228T反应混合液或TERTC250T反应混合液中的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其中TERT内标前向引物、TERT内标反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在TERT内标反应混合液中的体积比为(0.3-0.5)：(0.3-0.5)：(7-8)，优选为0.3125：0.3125：7.5；TERT内标前向引物和TERT内标反向引物在TERT内标反应混合液中的终浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，SYBRGreen荧光染料，Mg²⁺，dNTPs和稳定剂。如：KAPABIOSYSTEMS厂家 的KAPASYBRFASTqPCRKitMasterMix(2×)Universal试剂盒。
一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，还包括阳性质控品、阴性对照品和/或野生型质控品。
一种检测人类TERT基因启动子突变的试剂盒，其中所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，阳性质控品1为发生50％TERTC228T突变和1％TERTC250T突变的基因组DNA，阳性质控品2为发生50％TERTC250T突变和1％TERTC2228T突变的基因组DNA；所述阴性对照品为TE缓冲液；所述野生型质控品为无TERTC228T和C250T突变的野生型样品基因组DNA。各阳性质控品、野生型质控品和阴性对照品的浓度都为5-15ng/μL，优选10ng/μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将申请人从大量引物中筛选获得的、基于等位基因ARMS法的2对分别针对TERT基因C228T位点突变和C250T位点突变进行扩增的引物用于荧光定量PCR技术中即可达到对TERT基因启动子C228T和C250T位点突变的检测，从而达到癌症基因筛查、指导靶向用药、提供预后参考信息的目的；同时，对C228T和C250T位点突变检测的灵敏度达到1％，比基于Sanger测序的传统方案提高了20倍以上，此灵敏度已经接近或达到了BEAMing等昂贵、费时、专门检测低频突变的检测技术的水平；
2、本发明克服TERT基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，通过不断摸索反应条件和参数，建立荧光定量PCR扩增反应体系。
附图说明
图1是本发明荧光定量PCR扩增过程示意图；
图2是本发明试剂盒C228T反应体系中检测灵敏度的荧光定量PCR扩增示意图；
图3是本发明试剂盒C250T反应体系中检测灵敏度的荧光定量PCR扩增示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1试剂盒检测步骤
1、参照如下PCR96孔板布局表：


在96孔板1-4列每个反应空位分别加入10μLC228T反应混合液(TERTC228T前向引物、TERTC228T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在TERTC228T反应混合液中的体积比为1.25：1.25：7.5，TERTC228T前向引物和TERTC228T反向引物在TERTC228T反应混合液中的浓度均为4.8μM)，5-8列每个反应空位分别加入10μLC250T反应混合液(TERTC250T前向引物、TERTC250T反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在TERTC250T反应混合液中的体积比为1.25：1.25：7.5，TERTC250T前向引物和TERTC250T反向引物在TERTC250T反应混合液中的浓度均为4.8μM)，9-12列每个反应空为分别加入14μL内标反应混合液(每14μLTERT内标反应混合液中有TERT内标前向引物 0.3125μL、TERT内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL，不足14μL的体积用水补足，在TERT内标反应混合液中TERT内标前向引物和TERT内标反向引物的终浓度均为4.8μM)，然后快速离心15秒；
2、临床患者离体肿瘤组织样本基因组DNA提取：参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行操作；
3、加样：参照上述PCR96孔板布局表，在96孔板1-8列每个反应空位中按照96孔板1-8布局表的文字指示加入5μL、10ng/μl待测样本基因组DNA或5μL、10ng/μl阳性质控品1或5μL、10ng/μl阳性质控品2或5μL、10ng/μl野生型质控品或5μL、10ng/μl阴性对照品；在96孔板9-12列每个反应空位中按照96孔板9-12列布局表的文字指示加入1μL、10ng/μl、与C228T反应体系和/或C250T反应体系中相同的基因组DNA或1μL、10ng/μl阳性质控品1或1μL、10ng/μl阳性质控品2或1μL、10ng/μl野生型质控品或1μL、10ng/μl阴性对照品；其中阳性质控品1为发生50％TERTC228T突变和1％TERTC250T突变的基因组DNA，阳性质控品2为发生50％TERTC250T突变和1％TERTC2228T突变的基因组DNA；所述阴性对照品为TE缓冲液；所述野生型质控品为无TERTC228T和C250T突变的野生型样品基因组DNA。
推荐使用TEbuffer(pH8.0)稀释DNA；
4、将加好样的PCR96孔板放入QPCR仪样品槽，开启连接QPCR仪的计算机，并打开QPCR控制程序，参照以下扩增程序和图1进行设置；

5、信号收集阶段：步骤4中第2阶段68℃时收集SYBRGreen信号，第3阶段57.6℃收集SYBRGreen信号，第四阶段反应体系温度每上升0.5℃收集一次SYBRGreen荧光信号。运行上述PCR程序直至结束，并保存检测结果电子版原始文件。
实施例2结果判断与分析方法
1、突变结果的确定：首先确定各个C228T反应体系或C250T反应体系突变Ct值(简写为A)，然后确定该样本在内标反应体系的Ct值和阳性质控品的Ct值。内标反应体系的Ct值在后期计算突变比例中发挥了至关重要的作用，具体作用请见后续步骤，阳性质控品1和阳性质控品2的Ct值可以直接判断此次结果的有效性，属于反应体系中的质控点。不同的Ct值代表不同的突变程度，可根据结果判定标准(表1)，对检测结果进行分析：
表1结果判定标准

*ΔCt值的计算：ΔCt值＝C228T反应体系或C250T反应体系突变Ct值(A)-该样本在内标反应体系的Ct值。
2、突变结果的分析：
当样品在C228T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值17时，则该样品的C228T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C250T反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值22时，则该样品的C250T突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在C228T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值17时，按照以下标准进行判断：当该样品在C228T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值13时，则该样品的C228T突变为阳性，即强阳；当该样品在C228T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值13时，则计算C228T反应体系的△Ct，ΔCt值＝C228T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值11，则该样品的C228T突变也为阳性，即弱阳，反之则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值，
当C250T反应体系的突变Ct值小于阴性临界值22时，按照以下标准进行判断：当该样品在C250T反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值19时，则该样品的C250T突变为阳性，即强阳；当该样品在C250T反应体系的突变Ct值大于阳性临界值19时，则计算该反应体系的△Ct，ΔCt值＝C250T反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct 值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值15，则该样品的C250T突变也为阳性，即弱阳，反之则为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
实施例3反应体系的优化
1、待测样本基因组DNA加入量确认：将实施例1中10ng/μl的样品人类基因组DNA，分别设置1ng、5ng、10ng、50ng4个加入量梯度加入R132H反应体系，最终确认以50ng(5μl浓度为10ng//μl的模板)作为C228T反应体系和C250T反应体系的最终加入量，此加入量可以排除人为操作因素的影响。
2、循环数摸索：A代表实施例1步骤4中第2阶段的循环数；B代表实施例1步骤4中第3阶段的循环数，按照以下组合搭配，最终验证结果显示A为18与B为24的搭配为最佳反应过程。
A:18repeats(19total)B:24(23total)
A:16repeats(17total)B:26(26total)
A:14repeats(15total)B:28(29total)
A:12repeats(13total)B:30(31total)
A:10repeats(11total)B:32(33total)
实施例4灵敏度检测
按照实施例1的方法对不同突变率的样品基因组DNA进行荧光定量PCR以检测本发明试剂盒荧光的灵敏度，C228T反应体系中荧光定量PCR扩增图见图2，C250T反应体系中荧光定量PCR扩增图见图3。
图2中：
A表示5000突变拷贝：5000野生型拷贝＝50％突变，
该样本在C228T反应体系的突变Ct值远小于阳性临界值13，Ct值为6.2，则可以判断为强阳样本。
B表示5000突变拷贝：45000野生型拷贝＝10％突变
该样本在C228T反应体系的突变Ct值小于阳性临界值13，Ct值为8.4，可以判断为强阳样本。
C表示5000突变拷贝：95000野生型拷贝＝5％突变，
该样本在C228T反应体系的突变Ct值小于阳性临界值13，Ct值为10.2，则可以判断为强阳样本。
D表示5000突变拷贝：495000野生型拷贝＝1％突变，
该样本在C228T反应体系的突变Ct值小于阳性临界值13，Ct值为12.2，则可以判断为强阳样本。
E表示0突变拷贝：100000野生型拷贝＝0％突变，
该样本E为野生型样本，在C228T反应体系的突变Ct值大于阴性临界值17，Ct值为18，则可以判断为阴性样本。
F表示0突变拷贝，
该样本为阴性对照TE，在R132H反应体系的突变Ct值远大于阴性临界值17，Ct值为21.9，则该样本的R132H突变为阴性。
图3中：
A表示5000突变拷贝：5000野生型拷贝＝50％突变，
该样本在C250T反应体系的突变Ct-值远小于阳性临界值19，Ct-值为12.2，则可以判断为强阳样本。
B表示5000突变拷贝：45000野生型拷贝＝10％突变，
该样本在C250T反应体系的突变Ct-值小于阳性临界值19，Ct值为15.2，可以判断为强阳样本。
C表示5000突变拷贝：95000野生型拷贝＝5％突变，
该样本在C250T反应体系的突变Ct-值远小于阳性临界值19，Ct值为16.3，则可以判断为强阳样本。
D表示5000突变拷贝：495000野生型拷贝＝1％突变，
该样本在C250T反应体系突变Ct值为19.1，大于阳性临界值19，则计算该反应体系的△Ct，ΔCt值＝C250T反应体系突变Ct值(19.1)-该样本在内标反应体系的Ct值(5.1)，反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值15，则该样品的C250T突变也为阳性，即弱阳；该样本在内标反应体系的Ct值见曲线G，为5.1；
E表示0突变拷贝：100000野生型拷贝＝0％突变，
样本E为野生型样本，在C250T反应体系的突变Ct值大于或者等于阴性临界值22，Ct值为23.8，则可以判断为阴性样本。
F表示0突变拷贝，样本F为阴性对照品，在C250T反应体系的突变Ct值远大于阴性临界值22，没有起峰，则可以判断为阴性样本。
在C228T反应体系和C250T反应体系中，D曲线都代表相应突变率为1％的样本，二者的检测结果均为阳性，因此可以很明确判断，该试剂盒检测灵敏度可达到1％。
实施例5荧光PCR方法对比Sanger的方法学验证
按照实施例1中的步骤进行荧光PCR检测，并同时开展Sanger验证，验证数据与结果如下：通过对比方法学对人类TERT基因启动子突变检测试剂盒的方法确认进行评估，采用与Sanger方法学对比研究的方式进行，计划采用盲法对不少于500例脑胶质瘤患者冰冻组织样本平行开展qPCR与Sanger方法学对比，得到qPCR与参考方法符合率的验证结果。从目前已获得的脑胶质瘤患者的临床样本研究结果显示，共获得426例有效检测数据，与Sanger检测方法学对比验证结果显示，qPCR检测与Sanger验证一致率分别达到C228T94.84％，C250T98.83％，两种方法学具有较高的一致性。
用于盲法对比的样本来源于脑胶质瘤样本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
验证分析结果
表2C228T位点统计数据

1.备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
2.从上表可知，在总共426例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，总体阳性符合率为100％，95％置信区间范围为96.92％-100％。阴性符合率为92.79％，95％置信区间范围为89.32％-95.19％。总体符合率为94.84％，95％置信区间范围为92.30％-96.57％。
表3C250T位点统计数据


1.备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
2.从上表可知，在总共426例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，C250T位点总体阳性符合率为97.37％，95％置信区间范围为85.51％-99.54％。阴性符合率为98.97％，95％置信区间范围为97.38％-99.60％。总体符合率为98.83％，95％置信区间范围为97.28％-99.50％。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。