一种改良的PK-15细胞传代培养方法及其应用技术领域
本发明属于细胞培养工程技术领域，具体涉及一种改良的PK-15
细胞传代方法及其应用。
背景技术
PK-15细胞由猪肾细胞驯化而来的传代细胞系，可用于多种动物
病毒的培养，猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病
病毒等。目前，PK-15细胞最大的应用即用于猪圆环病毒2型培养，
灭活后制备疫苗。
研究发现，PK-15培养时，尤其大规模培养时，容易聚团，导致
细胞生长不均匀，且猪圆环病毒2型培养时大多采用同步方式接种，
即将细胞消化分散的细胞分装后直接接种猪圆环病毒2型病毒悬液，
然后共同培养，同步接种方式较分步接种产毒量高，更适合于大生产，
但同步接种更容易导致细胞聚团，从而影响细胞的生产及病毒的增殖
效率。培养操作过程中发现，细胞传代时产生的泡沫是导致细胞聚团
的主要原因，尤其利用滚瓶大规模培养细胞时，泡沫粘附于瓶壁，培
养时，细胞不断聚集于此，最终成团。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能减少
细胞聚团，细胞分散均匀,生产效率高的改良的PK-15细胞传代培养
方法。
本发明的另一目的在于将上述改良的PK-15细胞传代培养方法
应用于猪圆环病毒2型的繁殖中。
本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
根据本发明所提供的一种改良的PK-15细胞传代培养方法，包括
以下步骤:
1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液
体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104
个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200
mL，混匀后于37℃、6r/h转瓶机中培养，至融合状态达到80％以上。
本发明中，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，
所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15
细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液
悬浮，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细
胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁
的PK-15细胞。
其中，PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中
快速解冻，然后1000rpm离心5min。
本发明中，所述消泡剂购买于Sigma公司，其型号为Antifoam
204(A8311)。优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200
mL。
本发明的另一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，包括以下步骤：
1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体
积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104个
/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200
mL；按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀
后于37℃、6r/h转瓶机培养24h；
3)弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃
去液体，加含2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融
收获病毒液。
其中，步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁
的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏
后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置
于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，
用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15
细胞。
其中，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃
水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。
优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。
本发明所提供的技术方案可以包括以下技术效果：
(1)在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效
消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且
能有效减少细胞聚团。
(2)采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，有效消除
细胞传代操作过程中产生的泡沫，有利于猪圆环病毒2型(JM株)的
增殖。
附图说明
图1为PK-15细胞扩繁培养后的状态图；
图2为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞
状态图(肉眼观察)；
图3为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞
状态图(显微镜观察)；
图4为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)
培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；
图5为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)
培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)。
此处的附图并列入说明书并构成说明书的一部分，示出了符合本
发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
1.试剂与材料
细胞：PK-15细胞(肇庆大华农生物药品有限公司保存)；
病毒：猪圆环病毒2型(JM株)，由肇庆大华农生物药品有限公
司保存；
培养基与血清：DMEM培养基(Gibco公司)，血清(Hyclone公
司)；
消泡剂：型号Antifoam204(A8311)，购买于Sigma公司；
其它试剂：青链霉素(广州美津生物技术有限公司)，胰蛋白酶
(Gibco公司)，猪圆环病毒2型多克隆抗体(VMRD公司)，FITC
标记的羊抗猪二抗(KPL公司)。
2、PK-15细胞传代培养方法的改良
2.1改良方法具体操作步骤
2.2.1PK-15细胞的扩繁
从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42℃水浴中快速解冻，
1000rpm离心5min，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM
生长液悬浮，置37℃、5％CO2的培养箱中，培养至融合状态为100％
的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
2.2.2消泡剂工作浓度确定
2.2.2.1在2000mL滚瓶中培养PK-15细胞
将2.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装
至7个2000ml的滚瓶中，然后添加培养液至200ml，细胞浓度为5
×104个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素。接着，
分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶中的浓度分别
为0.5μL/200mL、1μL/200mL、1.5μL/200mL、2μL/200mL、2.5μ
L/200mL、3μL/200mL，另外一个滚瓶作为对照例，不添加消泡剂；
加入消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7个滚瓶置于37℃、6r/h滚瓶机
中培养，培养至融合状态到达80％以上。分别用肉眼和在显微镜下观
察细胞聚集状态。如此重复三次，以确定消泡剂的最佳浓度。
2.2.2.2在15000mL滚瓶中培养PK-15细胞
将2.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装
至7个15000mL滚瓶中，然后添加培养液至15000ml，细胞浓度为1
×104个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素。接着，
分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶中的浓度分别
为0.5μL/200mL、1μL/200mL、1.5μL/200mL、2μL/200mL、2.5μ
L/200mL、3μL/200mL，另外一个作为对照例，不添加消泡剂，加入
消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7个滚瓶置于37℃、6r/h滚瓶机中培
养，培养至融合状态到达80％以上。分别用肉眼和在显微镜下观察细
胞聚集状态。如此重复三次，以确定消泡剂的最佳浓度。
2.2结果与讨论
如图1所示，为PK-15细胞扩繁培养后的状态图。从图中可得，
从液氮中复苏的PK-15细胞生长良好，在处于静止状态的方瓶中传代
培养，PK-15细胞出现部分聚集现象。
如图2所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15
细胞状态图(肉眼观察)；如图3所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶
(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)。从图2、图3
中可得，将在方瓶中扩繁后的PK-15细胞消化分散后，分装至滚瓶中
培养，在操作过程中产生的泡沫未及时消除，粘附于瓶壁，导致细胞
在泡沫附着位置大量聚集，最终导致细胞大量聚集成团。
如图4所示，为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶
(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；如图5所示，为
使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)培养的
PK-15细胞状态图(显微镜观察)。从图4、图5中可得，PK-15细胞
在滚瓶传代培养时加入消泡剂处理后，细胞生长状态良好，且能有效
减少细胞聚团。
表1所示，为在使用消泡剂和不使用消泡剂的情况下，PK-15细
胞分别在2000ml和15000ml滚瓶中的生长状况。
表1.PK-15细胞在滚瓶中的生长状况
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从表1中可以看出，本发明实施例在0.5-3.0μL/200mL的范围
内进行试验，当消泡剂浓度为0.5-1μL/200mL时，细胞的生长状态
欠佳，细胞出现团聚现象；当消泡剂浓度为1.5-3μL/200mL时，细胞
生长状态良好，无团聚现象。因此，确定1.5-3μL/200mL为消泡剂
的最佳浓度。消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，但
消泡剂为去污剂，对细胞具有毒性。当消泡剂的浓度高时，毒性较大，
容易导致细胞死亡；而浓度低时，虽然毒性降低，但消泡效果较差，
不能有效地在短时间内消除泡沫。研究表明，当消泡剂浓度为1.5-3.0
μL/200mL时，消泡效果佳，细胞团聚少，且生长状态良好，为最
佳浓度。
3、改良的PK-15细胞传代培养方法的应用
3.2方法与操作步骤
3.2.1PK-15细胞的扩繁
从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42℃水浴中快速解冻，
1000rpm离心5min，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM
生长液悬浮，置37℃、5％CO2的培养箱中，培养至融合状态为100％
的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
3.2.2猪圆环病毒2型(JM株)的增殖
将3.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装
至15000mL的滚瓶中，添加培养液至1500ml，细胞浓度为1×104
个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素；加入2μ
L/200mL消泡剂，同时设非处理对照组，分别按滚瓶内培养液体积的
5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h滚瓶机中培
养24h，弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃
去液体，加2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获
病毒液。按此方法重复3批。
3.2.3猪圆环病毒2型(JM株)的病毒滴度测定
将3.2.1获取的单层PK-15细胞消化分散，用含10wt％胎牛血
清的DMEM培养液制成浓度约为2×105个/ml的细胞悬液，按每孔200
μl加入到48孔细胞培养板。取3.2.2中收获的病毒液，用DMEM培
养液做10倍系列稀释至10-7，每个稀释度病毒液以每孔200μl接种,
分别接种4孔至分装在48孔培养板中的PK-15细胞，非处理对照组
执行相同的操作；置37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，弃去培养
液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加2wt％
胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48h。
弃细胞维持液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH值7.4)
洗涤3次，每次2-3min，用200μl80％冷丙酮固定30min，弃去
固定液，再用PBS洗2次，每次5min，每孔加入200μl的PCV2多
克隆抗体，其中PCV2多克隆抗体用PBS作1∶200稀释，置37℃作
用1h，PBS洗涤5次，每次5min。最后每孔加入200μlFITC标
记的羊抗猪二抗，其中FITC标记的羊抗猪二抗用PBS作1∶100稀释，
37℃作用1h，PBS洗涤5次，每次5min。
在倒置显微镜下观察结果，如果出现绿色荧光信号，判为PCV2
阳性；否则判为阴性。按Reed-Muench法计算其TCID50。
3.2结果与讨论
采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，增殖猪圆环病
毒2型(JM株)的病毒含量情况如表2所示。从表2可看出，经过消
泡剂处理后，细胞增殖病毒的病毒含量显著高于对照组，表明消泡剂
处理后细胞均匀生长，有利于病毒增殖。
表2猪圆环病毒2型(JM株)病毒含量
第一批
第二批
第三批
|
对照组
105.5
105.1
104.7
消泡剂处理组
106.3
106.4
106.7
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构
思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变
都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。