一株苍白杆菌及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110388563.9	申请日：	2011.11.30
公开号：	CN102433275A	公开日：	2012.05.02
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20111130授权公告日:20130220终止日期:20131130\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20111130\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; A24B15/20; A62D3/02(2007.01)I; C12R1/01(2006.01)N; A62D101/26(2007.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	云南大学
发明人：	杨金奎; 张克勤; 雷丽萍; 麻广慧
地址：	650091 云南省昆明市翠湖北路2号
优先权：
专利代理机构：	昆明今威专利商标代理有限公司 53115	代理人：	杨宏珍
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内容摘要

本发明涉及一株苍白杆菌及其应用，属应用微生物技术领域。本发明的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)4-40，已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5442。苍白杆菌4-40具有尼古丁代谢能力，能在高达4.5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂将纯烟碱完全降解，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能够分解烟草和烟草废弃物中的尼古丁，减少卷烟对人体的危害和尼古丁对环境的污染的优点。

权利要求书

1：一株苍白杆菌，其特征在于该苍白杆菌 (Ochrobactrum sp.)4-40 已于 2011 年 11 月 3 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCCNo.5442。
2：权利要求 1 所述的苍白杆菌，其特征在于该苍白杆菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。

说明书

一株苍白杆菌及其应用
    技术领域：
     本发明涉及一株苍白杆菌及其应用，属应用微生物技术领域。背景技术：
     烟碱是普通烟草中的生物碱，俗称尼古丁 (Nicotine)。是多种烟草的主要生物碱。人类长期保持着吸食烟草的习惯，然而，长期吸烟会导致对尼古丁的依赖性，而过量吸入尼古丁则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚至有致命的危险。
     目前，我国烤烟烟碱含量偏高，尤其上部烤烟更加明显，烟碱达到 3％～ 4％，白肋烟烟碱含量甚至高达 6％，而美国烤烟的烟碱含量在 1.5％～ 3.5％之间，其白肋烟的烟碱含量约 2.9％。一般优质白肋烟的烟碱含量在 1.5％～ 4.0％之间，以 3.0％为佳。国内卷烟企业储存的上部烤烟较多，因其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中，造成巨大的浪费。
     尼古丁有很好的水溶性，能够非常容易的穿过生物膜和血脑屏障。在烟草加工过程中存在大量富含尼古丁等烟碱化合物的固体和液体废弃物，易进入地下水，给人们的生存环境带来了极大威胁。1994 年，美国环保总局将尼古丁定义为 “有毒的危险废弃物” 。因此，从烟草废弃物中去除尼古丁或者将这些废弃物转化成有价值的化合物是十分必要的。烟草科学研究合作中心提出 “处理烟草废物” ，并总结了很多处理方法，微生物处理方法是其中建议的快速处理烟草废物的方法之一。很多微生物能够生长在烟叶及附近土壤中，并利用尼古丁作为唯一碳氮源和能源。在烟草加工过程中这些微生物能改善尼古丁含量，并能提高烟叶的品质，也可分解烟草生产过程制造的废弃物中的尼古丁，减少其对环境的污染等优点具有重要的作用。
     关于利用微生物降解尼古丁的研究已有报道。但经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。发明内容：
     本发明的目的在于提供一种根瘤菌及其应用，能够有效降低烟草中尼古丁的含量。
     本发明从云南省红河州弥勒县多年种植烟草的土壤样品中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌 4-40，对其进行了形态学、生理生化性质和 16S rRNA 分析，鉴定结果表明该细菌属于苍白杆菌属，该菌株命名为苍白杆菌 (Ochrobactrum sp.)4-40。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国 . 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号；保藏日期： 2011 年 11 月 3 日；保藏号为 CGMCC No.5442。
     苍白杆菌 4-40 菌株的主要形态特征和生理生化性质为：
     苍白杆菌 4-40 菌落边缘整齐、呈乳白色、粘稠。在显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色为阴性。硝酸盐还原和苯丙氨基脱氨酶试验为阳性。不能液化吲哚，不能水解淀粉。甲基红 (MR) 实验为阴性，乙酰甲基甲醇 (V-P) 实验为阳性。本菌株对葡萄糖和甘露醇发酵产酸，乳糖和蔗糖发酵不产酸。
     苍白杆菌 4-40 菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物 20F(5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 和 1500R(5’ -GGTTACCTTGTTACGA CT-3’ )，以苍白杆菌 4-40 的基因组 DNA 作为模板扩增得到 1500bp 左右的 PCR 产物，回收测序、校正之后得到的 4-40 菌株的部分 16S rRNA 基因序列 1487bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库 (GenBank)，序列的索引号为： JN700178。
     本发明按常规方法用常规设备制备。即将苍白杆菌 4-40 扩大发酵培养后得到。
     本发明的苍白杆菌 4-40 应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。
     本发明具有能调整烟叶原料中尼古丁的含量，提高烟叶的品质，也能分解烟草生产过程制造的废弃物中的尼古丁，减少其对环境的污染的优点。附图说明：
     图 1 为苍白杆菌 4-40 耐受尼古丁的浓度实验结果。
     图 2 为苍白杆菌 4-40 降解尼古丁的生长曲线。具体实施方式：以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
     本发明是这样实现的：
     1. 苍白杆菌 4-40 菌株的培养方法：
     1) 试管斜面培养
     采用 Luria-Bertani(LB) 培养基，配方为 ( 克 / 升， g/v) ： 10 克蛋白胨， 10 克氯化钠， 5 克酵母提取物， 20 克琼脂，蒸馏水定容到 1000 毫升。 121℃灭菌 25 分钟，摆成斜面。接种苍白杆菌 4-40， 28℃培养 24 小时，获得试管种。
     2) 液体扩大培养
     A. 种子培养 (LB 培养基 )，配方为 ( 克 / 升， g/v) ： 10 克蛋白胨， 10 克氯化钠， 5克酵母提取物，蒸馏水定容到 1000 毫升。121 ℃灭菌 25 分钟。接种苍白杆菌 4-40 试管种， 28℃培养 12 小时，获得液体菌种。
     B. 发酵培养基，配方为 ( 克 / 升， g/v) ： 1 克尼古丁， 0.26 克磷酸氢二钾， 0.8 克磷酸二氢钾， 0.41 克硫酸镁， 0.1 克硫酸钙， 0.0039 克钼酸钠， 0.005 克硫酸亚铁， 0.3 克硫酸铵，蒸馏水定容到 1000 毫升， pH 7.0。培养基初始 pH 7.0，接种量 1％ ( 体积百分比， v/v)，转速 150rpm，温度 28℃。发酵培养 24 小时。
     2. 苍白杆菌 4-40 菌株耐受尼古丁浓度试验
     将培养 12 小时的液体菌种 (OD600 ≈ 0.8) 以 1％ ( 液体菌种体积百分比， v/v) 的接种量接于尼古丁梯度的发酵培养基中，尼古丁的梯度为 0g/L、 0.5g/L、 1.0g/L、 1.5g/L、 2.0g/L、 2.5g/L、 3.0g/L 和 3.5g/L，转速 150rpm，温度 28℃，培养 48 小时离心收集菌体，用 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定 OD600( 图 1)。
     由图所示的试验结果可见：苍白杆菌 4-40 菌株在本试验条件下，最适生长尼古丁浓度为 1.0g/L，最高尼古丁耐受浓度为 4.5g/L。
     3. 苍白杆菌 4-40 菌株降解尼古丁的生长曲线
     将培养 12 小时的液体菌种 (OD600 ≈ 0.8) 以 1％ ( 液体菌种体积百分比， v/v) 的接种量接于发酵培养基中，转速 150rpm，温度 28℃，每隔 2 小时取菌液，离心后上清用高效液相测定尼古丁含量，沉淀用磷酸盐溶解并测定 OD600( 图 2)。
     由图 2 得出如下结果：随着苍白杆菌 4-40 菌株在发酵液的浓度逐渐增加，尼古丁的浓度逐渐下降。当发酵时间为 36 小时，尼古丁基本被完全降解。在本试验条件下，尼古丁减少和菌体浓度的增加保持一致， 0 ～ 11 小时为其延滞期， 11 ～ 36 小时为指数生长期，到 34 小时尼古丁降解完毕细菌生长进入稳定期。
     4. 苍白杆菌 4-40 菌株降解尼古丁菌制剂的制备
     利用发酵培养基制备 1000mL 的发酵液， 8000rpm 离心 15min 收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液 (50mM 磷酸盐缓冲液， pH 7.0) 进行悬浮， 8000rpm 离心 15min 收集菌体，洗涤两次，菌体细胞最后用 50ml 的缓冲液进行悬浮，即能用于降解尼古丁。
     5. 苍白杆菌 4-40 制剂的降解烟叶中尼古丁试验
     分别称取 2g 保山红大 C3F 烟叶，喷洒 5ml 菌制剂，三个重复，反应体系为 30ml 的 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0)，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于 28℃、 150rpm 摇床培养，每隔 4h 小时取样一次， 12000rpm 离心 5min，上清稀释 2 倍后用过滤器 (0.45 微米 ) 过滤，最后用 HPLC 对烟碱进行定量检测 ( 表 1)。
     表1：苍白杆菌 4-40 制剂降解烟叶中尼古丁的结果
     由表 1 可得出结论：在本试验的条件下， 4-40 菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显，可以在 12h 内降解 C3F 烟叶中 51.5％的烟碱。同时，对照组烟碱含量基本保持不变。因此，菌株 4-40 的菌制剂在烟草醇化和降解高浓度烟碱含量的烟草废弃物中都有潜在的应用价值。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102433275 A(43)申请公布日 2012.05.02CN102433275A*CN102433275A*(21)申请号 201110388563.9(22)申请日 2011.11.30CGMCC No.5442 2011.11.03C12N 1/20(2006.01)A24B 15/20(2006.01)A62D 3/02(2007.01)C12R 1/01(2006.01)A62D 101/26(2007.01)(71)申请人云南大学地址 650091 云南省昆明市翠湖北路2号(72)发明人杨金奎张克勤雷丽萍麻广慧(74)专利代理机构昆明今威专利商标。

2、代理有限公司 53115代理人杨宏珍(54) 发明名称一株苍白杆菌及其应用(57) 摘要本发明涉及一株苍白杆菌及其应用，属应用微生物技术领域。本发明的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)4-40，已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5442。苍白杆菌4-40具有尼古丁代谢能力，能在高达4.5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂将纯烟碱完全降解，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能够分解烟草和烟草废弃物中的尼古丁，减少卷烟对人体的危害和尼古丁对环境的污染的优点。(83)生物保藏信。

3、息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页附图 1 页CN 102433279 A 1/1页21.一株苍白杆菌，其特征在于该苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)4-40已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5442。2.权利要求1所述的苍白杆菌，其特征在于该苍白杆菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。权利要求书CN 102433275 ACN 102433279 A 1/3页3一株苍白杆菌及其应用技术领域：0001 本发明涉及一株。

4、苍白杆菌及其应用，属应用微生物技术领域。背景技术：0002 烟碱是普通烟草中的生物碱，俗称尼古丁(Nicotine)。是多种烟草的主要生物碱。人类长期保持着吸食烟草的习惯，然而，长期吸烟会导致对尼古丁的依赖性，而过量吸入尼古丁则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚至有致命的危险。 0003 目前，我国烤烟烟碱含量偏高，尤其上部烤烟更加明显，烟碱达到34，白肋烟烟碱含量甚至高达6，而美国烤烟的烟碱含量在1.53.5之间，其白肋烟的烟碱含量约2.9。一般优质白肋烟的烟碱含量在1.54.0之间，以3.0为佳。国内卷烟企业储存的上部烤烟较多，因其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中，造成巨大的浪费。 00。

5、04 尼古丁有很好的水溶性，能够非常容易的穿过生物膜和血脑屏障。在烟草加工过程中存在大量富含尼古丁等烟碱化合物的固体和液体废弃物，易进入地下水，给人们的生存环境带来了极大威胁。1994年，美国环保总局将尼古丁定义为“有毒的危险废弃物”。因此，从烟草废弃物中去除尼古丁或者将这些废弃物转化成有价值的化合物是十分必要的。烟草科学研究合作中心提出“处理烟草废物”，并总结了很多处理方法，微生物处理方法是其中建议的快速处理烟草废物的方法之一。很多微生物能够生长在烟叶及附近土壤中，并利用尼古丁作为唯一碳氮源和能源。在烟草加工过程中这些微生物能改善尼古丁含量，并能提高烟叶的品质，也可分解烟草生产过程制造的废弃。

6、物中的尼古丁，减少其对环境的污染等优点具有重要的作用。 0005 关于利用微生物降解尼古丁的研究已有报道。但经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。发明内容：0006 本发明的目的在于提供一种根瘤菌及其应用，能够有效降低烟草中尼古丁的含量。 0007 本发明从云南省红河州弥勒县多年种植烟草的土壤样品中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌4-40，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rRNA分析，鉴定结果表明该细菌属于苍白杆菌属，该菌株命名为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)4-40。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北。

7、辰西路1号院3号；保藏日期：2011年11月3日；保藏号为CGMCC No.5442。0008 苍白杆菌4-40菌株的主要形态特征和生理生化性质为： 0009 苍白杆菌4-40菌落边缘整齐、呈乳白色、粘稠。在显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色为阴性。硝酸盐还原和苯丙氨基脱氨酶试验为阳性。不能液化吲哚，不能水解淀粉。甲基红(MR)实验为阴性，乙酰甲基甲醇(V-P)实验为阳性。本菌株对葡萄糖和甘露醇发酵产说明书CN 102433275 ACN 102433279 A 2/3页4酸，乳糖和蔗糖发酵不产酸。 0010 苍白杆菌4-40菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物20F(5-AGAGTTTGAT。

8、CCTGGCTCAG-3)和1500R(5-GGTTACCTTGTTACGA CT-3)，以苍白杆菌4-40的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的4-40菌株的部分16S rRNA基因序列1487bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列的索引号为：JN700178。 0011 本发明按常规方法用常规设备制备。即将苍白杆菌4-40扩大发酵培养后得到。 0012 本发明的苍白杆菌4-40应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。 0013 本发明具有能调整烟叶原料中尼古丁的含量，提高烟叶的品质，也能分解烟草生产过程制造的废弃。

9、物中的尼古丁，减少其对环境的污染的优点。附图说明：0014 图1为苍白杆菌4-40耐受尼古丁的浓度实验结果。 0015 图2为苍白杆菌4-40降解尼古丁的生长曲线。具体实施方式：0016 以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。 0017 本发明是这样实现的： 0018 1.苍白杆菌4-40菌株的培养方法： 0019 1)试管斜面培养 0020 采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为(克/升，g/v)：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，20克琼脂，蒸馏水定容到1000毫升。121灭菌25分钟，摆成斜面。接种苍白杆菌4-40，28培养24小时，获得试管种。

10、。 0021 2)液体扩大培养 0022 A.种子培养(LB培养基)，配方为(克/升，g/v)：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，蒸馏水定容到1000毫升。121灭菌25分钟。接种苍白杆菌4-40试管种， 28培养12小时，获得液体菌种。 0023 B.发酵培养基，配方为(克/升，g/v)：1克尼古丁，0.26克磷酸氢二钾，0.8克磷酸二氢钾，0.41克硫酸镁，0.1克硫酸钙，0.0039克钼酸钠，0.005克硫酸亚铁，0.3克硫酸铵，蒸馏水定容到1000毫升，pH 7.0。培养基初始pH 7.0，接种量1(体积百分比，v/v)，转速150rpm，温度28。发酵培养24小时。 002。

11、4 2.苍白杆菌4-40菌株耐受尼古丁浓度试验 0025 将培养12小时的液体菌种(OD6000.8)以1(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于尼古丁梯度的发酵培养基中，尼古丁的梯度为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L和3.5g/L，转速150rpm，温度28，培养48小时离心收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定OD600(图1)。 0026 由图所示的试验结果可见：苍白杆菌4-40菌株在本试验条件下，最适生长尼古丁浓度为1.0g/L，最高尼古丁耐受浓度为4.5g/L。 0027 3.苍。

12、白杆菌4-40菌株降解尼古丁的生长曲线说明书CN 102433275 ACN 102433279 A 3/3页50028 将培养12小时的液体菌种(OD6000.8)以1(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于发酵培养基中，转速150rpm，温度28，每隔2小时取菌液，离心后上清用高效液相测定尼古丁含量，沉淀用磷酸盐溶解并测定OD600(图2)。 0029 由图2得出如下结果：随着苍白杆菌4-40菌株在发酵液的浓度逐渐增加，尼古丁的浓度逐渐下降。当发酵时间为36小时，尼古丁基本被完全降解。在本试验条件下，尼古丁减少和菌体浓度的增加保持一致，011小时为其延滞期，1136小时为指数生长期。

13、，到34小时尼古丁降解完毕细菌生长进入稳定期。 0030 4.苍白杆菌4-40菌株降解尼古丁菌制剂的制备 0031 利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)进行悬浮，8000rpm离心15min收集菌体，洗涤两次，菌体细胞最后用50ml的缓冲液进行悬浮，即能用于降解尼古丁。 0032 5.苍白杆菌4-40制剂的降解烟叶中尼古丁试验 0033 分别称取2g保山红大C3F烟叶，喷洒5ml菌制剂，三个重复，反应体系为30ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于28、1。

14、50rpm摇床培养，每隔4h小时取样一次，12000rpm离心5min，上清稀释2倍后用过滤器(0.45 微米)过滤，最后用HPLC对烟碱进行定量检测(表1)。 0034 表1：苍白杆菌4-40制剂降解烟叶中尼古丁的结果 0035 0036 由表1可得出结论：在本试验的条件下，4-40菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显，可以在12h内降解C3F烟叶中51.5的烟碱。同时，对照组烟碱含量基本保持不变。因此，菌株4-40的菌制剂在烟草醇化和降解高浓度烟碱含量的烟草废弃物中都有潜在的应用价值。说明书CN 102433275 ACN 102433279 A 1/1页6图1图2说明书附图CN 102433275 A。

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