一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法.pdf

本发明涉及玉米杂交领域，特别涉及一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，包括以下步骤：以核质互作雄性不育细胞质基因S、细胞核基因带有不定配子体基因ig以及筛选标记基因的诱导系为母本，以细胞质基因为N、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体或优异低世代材料为父本，进行杂交，筛选得到细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rf单倍体的后代；将后代与父本回交，得到细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体的核质互作雄性不育系。该方法显著提高了核质互作雄性不育系的改良效率，有利于优良种质的快速应用于不育化制种，可以大大提高制种纯度和节约劳动成本。

权利要求书1.  一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、以核质互作雄性不育细胞质基因S、细胞核基因带有不定配子体基因ig以及与不定配子体基因ig紧密连锁的筛选标记基因的诱导系为母本，以细胞质基因为N、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体或优异低世代材料为父本，进行杂交，筛选得到细胞质基因为S、细胞核基因为rf单倍体的后代；(b)、将所述后代与所述父本回交，得到细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体的核质互作雄性不育系；其中，当优异低世代材料作为父本时，回交的父本为优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导成的双单倍体。2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为rfrf。3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为RfRf。4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为Rfrf。5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导系通过含有核质互作雄性不育细胞质基因S的品系与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系杂交获得。6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导系通过以下方式获得：将含有核质互作雄性不育细胞质基因S的品系与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系杂交，得到F1代；将所述F1代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，得到F2代；将F2代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，得到F3代；这样依次将得到的子代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，并依次得到Fn代，n为自然数；每次回交得到的子代均可作为所述诱导系。7.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导系为Fn代中的任一种，其中，n≧7。8.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导系为F7代。9.  根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述筛选根据筛选标记基因的性状进行，所述筛选标记基因的性状为玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色或油分性状。10.  根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述筛选进一步包括：将筛选得到的玉米粒种植，选择种植后植株矮小，雄穗不散粉的后代，即得到所述细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rf单倍体的后代。

说明书一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法
技术领域
本发明涉及玉米杂交领域，具体而言，涉及一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法。
背景技术
不同细胞质基因和不同细胞核基因可育性不同，具体如表1所示。
表1可育性

获得不同细胞质基因和不同细胞核基因的杂交结果如图1所示。
不同类型的细胞质基因和细胞核基因的系别如下所示：
不育系S(rfrf)，保持系N(rfrf)，恢复系S(RfRf)或N(RfRf)。
通过以下方式可获得F1表现正常可育后代，具体如下所示：
S(rfrf)×N(RfRf)
               →S(Rfrf)F1表现正常可育
S(rfrf)×S(RfRf)
现有的技术是通过核质互作雄性不育系的回交转育获得与亲本相似的不育系。具体技术路线和方法如下：
不育系S(rr)×自交系S1，S2…Sn
         ↓
F1利用不散粉的自交系N(rfrf)进行回交转育
          ┇利用不散粉的自交系N(rfrf)进行回交转育
F7获得株型与轮回亲本相似的不育系
该方法存在以下缺点：
(1)时间较长，需要回交7代及以上，才可以实现基因位点的基本纯合；
(2)可利用的不育系改良材料比较狭窄，目前核质互作不育系的改良主要利用比较稳定的自交系作为回交转育的材料，不稳定的材料往往不能利用；
(3)无法实现所有位点的完全纯合和全部置换，影响不育系的质量。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，所述的方法缩短了育种周期，只需要2代就实现了被诱导系的雄性不育化以及雄性不育系核基因的纯合。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，包括以下步骤：
(a)、以核质互作雄性不育细胞质基因S、细胞核基因带有不定配子体基因ig以及与不定配子体基因ig紧密连锁的筛选标记基因 的诱导系为母本，以细胞质基因为N、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体或优异低世代材料为父本，进行杂交，筛选得到细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rf单倍体的后代；
(b)、将所述后代与所述父本回交，得到细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系或双单倍体的核质互作雄性不育系；
其中，当优异低世代材料作为父本时，回交的父本为优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导成的双单倍体。
本发明提供的玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，以带不定配子体基因ig、筛选标记基因Marker的诱导系作为母本，对优良双单倍体N(rfrf-DH)或优良自交系(N(rfrf-IB))或优异低世代材料(N(rfrf-BM))进行诱导杂交，获得具有雄性不育细胞质的该优良自交系的孤雄生殖单倍体S(rf-Haploid)植株；同时，将优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导成双单倍体。得到的子代通过与纯合父本N(DH/IB)回交，以及以优异低世代材料进行诱导杂交得到的单倍体与优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导成的双单倍体进行杂交，仅需两代即可实现核质互作不育系的纯合，即可育成雄性不育系S(rfrf-DH/IB),显著提高了核质互作雄性不育系的改良效率，有利于优良种质的快速应用于不育化制种，可以大大提高制种纯度和节约劳动成本。并且，与基因ig紧密连锁的遗传标记在杂交后代中辅助鉴别单倍体，增强了整个过程的准确度。
其中的自交系是指自交7代以上得到的材料；低世代是指不稳定的材料，一般指自交7世代以下的材料；双单倍体是孤雌或孤雄诱导得到单倍体并加倍得到的所有基因位点纯合的品系。同时，优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导并加倍得到双单倍体。
另外，带不定配子体基因ig、筛选标记基因Marker的诱导系、优良双单倍体N(rfrf-DH)的保持系和细胞核育性恢复基因为rfrf的自交系以及优异低世代材料均为现有种子品系，普遍存在的种质资源，可引进及购买得到。
带不定配子体基因ig的诱导系是根据以下的介绍发展而来，具体为：Kermicle(1994)，于1969年从美国玉米自交系W23中发现了带不定配子体基因ig的突变系W23ig,以其作母本与其它玉米材料杂交，其后代中可出现0.3％-2.0％的孤雄生殖的单倍体植株。R-nj显性遗传标记可使籽粒顶端糊粉层呈紫色，胚芽也呈紫色，美国育种家将R-nj导入W23ig为选择标记，在诱导杂交后代中根据籽粒标记，结合田间性状可方便地鉴定出单倍体(张铭堂，1996)。
进一步地，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为rfrf。
进一步地，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为RfRf。
进一步地，在步骤(a)中，所述母本的细胞核育性恢复基因型为Rfrf。
父本和母本之间的杂交进行孤雄诱导，是为了得到含有母本细胞质基因和父本细胞核基因的后代，母本细胞核内的基因类型并不影响最终的后代，因此，母本的细胞核基因除含有具有诱导作用的ig基因、筛选标记基因Marker外，其细胞核内的育性恢复基因型为rfrf、RfRf、Rfrf中的任一种。
具体地，所述诱导系通过含有核质互作雄性不育细胞质基因S的品系与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系杂交获得。
进一步地，所述诱导系通过以下方式获得：
将含有核质互作雄性不育细胞质基因S的品系与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系杂交，得到F1代；
将所述F1代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，得到F2代；
将F2代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，得到F3代；
这样依次将得到的子代与含有不定配子体基因ig和筛选标记基因的孤雄诱导系回交，并依次得到Fn代，n为自然数；
每次回交得到的子代均可作为所述诱导系。
具体步骤如下所示：
含有核质互作雄性不育细胞质不育基因S(RfRf/Rfrf/rfrf)品系×孤雄诱导系(ig-Marker)
↓
F1×孤雄诱导系(ig-Marker)进行回交转育
↓
F2×孤雄诱导系(ig-Marker)进行回交转育
┇
Fn
其中，n为任意自然数。
F1…Fn的每个后代均可以作为诱导系对相应的材料进行诱导，一般而言不纯合的早世代诱导系的诱导率会低一些。
优选地，所述诱导系为Fn代中的任一种，其中，n≧7。经验证，F7代以后的世代获得的株型与轮回亲本(诱导系)相似的孤雄诱导系S(RfRf/rfrf/Rfrf-ig-Marker)，稳定性好。
为了节约杂交的代数，并具有优异的性能，更优选地，所述诱导系为F7代。
优选地，在步骤(a)中，所述筛选根据筛选标记基因的性状进行，所述筛选标记基因的性状为玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色或油分性状。经验证，这两种筛选标记基因与不定配子体基因ig紧密连锁，准确提高了后代的鉴别效率。
进一步地，在步骤(a)中，所述筛选进一步包括：将筛选得到的玉米粒种植，选择种植后植株矮小，雄穗不散粉的后代，即得到所述细胞质基因为S、细胞核育性恢复基因为rf单倍体的后代。
以带不定配子体基因ig以及与不定配子体基因ig紧密连锁的筛选标记基因Marker的诱导系作为母本，对优良自交系(N(rfrf-IB))或双单倍体(N(rfrf-DH)或优异低世代材料进行诱导杂交，获得具有雄性不育细胞质的该优良自交系的孤雄生殖单倍体S(rf-Haploid)植株。同时，优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导并加倍得到双单倍体，以利于后续与单倍体进行杂交。筛选标记基因的性状为玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色，根据筛选标记基因Marker的性状显示，该植株上的种子有3种类型。第一类：顶部糊粉层和胚芽均为紫色，由母本诱导系发育而来；第二类：顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色，胚乳由母本卵细胞和父本极核结合发育而来(胚乳直感表现为紫色)，幼胚可能由父本精子发育而来，即为单倍体，均表现为父本的颜色；第三类：顶部糊粉层和胚芽均为绿色，由父本被诱导系发育而来。第二类可能为孤雄生殖的结果，即可选择玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色的玉米粒备用。为了进一步进行确认，将该玉米粒种植，观察田间长势，矮小、雄穗不散粉的则判断为单 倍体，利用纯合父本(DH/IB)给其授粉，即得到目标玉米雄性不育系。
此外，筛选标记基因还可以选用油分性状以及与不定配子体基因ig紧密连锁的性状标记基因。根据筛选标记基因的性状筛选得到孤雄生殖单倍体S(rf-Haploid)植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，以带不定配子体基因ig、筛选标记基因Marker的诱导系作为母本，对优良自交系(N(rfrf-IB))或双单倍体N(rfrf-DH)或优异低世代材料(N(rfrf-BM))进行诱导杂交，获得具有雄性不育细胞质的孤雄生殖单倍体S(rf-Haploid)植株，同时，优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导并加倍得到双单倍体(DH)。得到的子代通过与纯合父本(DH/IB)回交，即可育成雄性不育系S(rfrf-DH/IB)，仅需两代即可实现核质互作不育系的纯合，得到玉米雄性不育系，显著提高了核质互作雄性不育系的改良效率，有利于优良种质的快速应用于不育化制种，可以大大提高制种纯度和节约劳动成本；
(2)本发明提供的利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，被诱导的材料通过孤雄生殖，实现了对诱导系核基因的全部置换，特别是诱导双单倍体，经过诱导加倍产生的新不育系的所有基因位点也是完全纯合；
(3)本发明提供的利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，母本的细胞核基因除含有具有诱导作用的ig基因外，其细胞核内的育性恢复基因型为RfRf、Rfrf、rfrf中的任一种，减少了对细胞核内基因型的限制，利于施行；
(4)诱导系通过含有核质互作雄性不育细胞质基因S的品系/材料与含有不定配子体基因ig筛选标记基因Marker的孤雄诱导系杂交获得，普遍存在的种质资源，可引进及购买得到；
(5)不定配子体基因ig具有诱导作用，与其紧密连锁的筛选标记基因Marker具有辅助鉴别的作用，得到的子代玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色或者其他与不定配子体基因ig紧密连锁的性状，易于鉴别，增加了可操作性；并且通过进一步地观察后代种植后植株的形状，如植株矮小，雄穗不散粉，进一步鉴别目标株系，增加了可靠性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明背景技术中不同细胞质基因和不同细胞核基因的杂交结果的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，步骤如下：
诱导系S(rfrf-ig-Marker)×被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)
      ↓
S(rf-Haploid)×保持系N(rfrf-DH)
         ↓
S(rfrf-DH)
具体来说，先将诱导系S(rfrf-ig-Marker)与被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)杂交，选择后代中玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色的玉米粒，将该玉米粒种植，选择植株矮小，雄穗不散粉的植株的基因型即为S(rf-Haploid)；
将得到的S(rf-Haploid)与保持系N(rfrf-DH/IB)再杂交，通过筛选即可得到rf加倍的基因型为S(rfrf-DH/IB)的目标株系，该目标株系不能散粉，与纯合父本(DH/IB)回交可以正常繁殖。
实施例2
一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，步骤如下：
诱导系S(RfRf-ig-Marker)×被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)
          ↓
S(rf-Haploid)×保持系N(rfrf-DH/IB)
            ↓
S(rfrf-DH/IB)
具体来说，先将诱导系S(RfRf-ig-Marker)与被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)杂交，选择后代中玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色的玉米粒，将该玉米粒种植，选择植株矮小，雄穗不散粉的植株的基因型即为S(rf-Haploid)；
将得到的S(rf-Haploid)与保持系N(rfrf-DH/IB)再杂交，通过筛选即可得到rf加倍的基因型为S(rfrf-DH/IB)的目标株 系，该目标株系不能散粉，与纯合父本(DH/IB)回交可以正常繁殖。
实施例3
一种利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，步骤如下：
诱导系S(Rfrf-ig-Marker)×被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)
            ↓
S(rf-Haploid)×保持系N(rfrf-DH/IB)
            ↓
S(rfrf-DH/IB)
具体来说，先将诱导系S(RfRf/rfrf-ig-Marker)与被诱导材料N(rfrf-DH/IB/BM)杂交，选择后代中玉米粒顶部糊粉层为紫色，胚芽为绿色的玉米粒，将该玉米粒种植，选择植株矮小，雄穗不散粉的植株的基因型即为S(rf-Haploid)；
将得到的S(rf-Haploid)与保持系N(rfrf-DH/IB)再杂交，通过筛选即可得到rf加倍的基因型为S(rfrf-DH/IB)的目标株系，该目标株系不能散粉，与纯合父本(DH/IB)回交可以正常繁殖。
实施例1-3中的诱导系可引进及购买得到，也可采用以下方法得到：
含有核质互作雄性不育细胞质不育基因S(RfRf/Rfrf/rfrf)品系×孤雄诱导系(ig-Marker)
↓
F1×孤雄诱导系(ig-Marker)进行回交转育
↓
F2×孤雄诱导系(ig-Marker)进行回交转育
┇
Fn
杂交后的每个后代均可以作为诱导系对相应的材料进行诱导，一般而言不纯合的早世代诱导系的诱导率会低一些。
实施例1-3中的保持系N(rfrf-DH/IB)中的IB为Inbred lines的缩写，是现有的具有一定育种价值的成型自交系；BM为Breeding Materials的缩写，为表现优异的低世代材料。
本发明提供的利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，具有以下优点：
1、缩短了育种周期：传统核质互作不育系的转育至少需要7代，本发明提供的玉米单倍体诱导核质互作雄性不育系的培育方法，以带不定配子体基因ig的诱导系作为母本，对优良自交系(N(rfrf-IB))或双单倍体N(rfrf-DH)的或优异低世代材料进行诱导杂交，获得具有雄性不育细胞质的该优良自交系的孤雄生殖单倍体S(rf-Haploid)植株，同时，将优异低世代材料进行孤雌或孤雄诱导成双单倍体(DH)，得到的子代通过与纯合父本(DH/IB)回交，即可育成雄性不育系S(rfrf-DH/IB)，只需要2代就可以实现核质互作不育系的纯合；
2、确保了被诱导系核基因的纯正：传统核质互作不育系的转育，通过轮回选择，基因纯合效率为：(1/2+(1/2)2+…(1/2)n，n为回交代数)，无法实现基因位点的完全置换和纯合；本发明提供的玉米单倍体诱导核质互作雄性不育系的培育方法，被诱导的材料通过孤雄生殖，实现了对诱导系核基因的全部置换，特别是诱导双单倍体，经过诱导加倍产生的新不育系的所有基因位点也是完全纯合；
3、拓宽了不育系改良的种质基础：传统核质互作不育系的转育是以稳定的自交系作为轮回亲本，力争转育后代的基因位点的纯合；本发明提供的利用玉米单倍体诱导培育核质互作雄性不育系的方法，任何世代的材料均可以优先进行诱导，同时对诱导材料进行单倍体诱导及加倍，进而回交获得纯合的不育系。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。