一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法.pdf

本发明提供了一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法，采用大孔树脂与HSCCC联用的技术，以黄芩干燥根为原料，经乙醇回流提取，HPD100大孔树脂、HSCCC分离纯化得到高纯度的黄芩苷。本发明方法设计合理，操作简单，生产流程安全易操作，生产周期短；HSCCC技术无固态载体，在样品纯化过程中无吸附、损失，纯化产物回收率高，纯度高；相比于传统制备方法如酸沉等方法，避免产生大量酸水，对环境友好，安全性好。本发明方法纯化产物回收率高，纯度高，最终得到的黄芩苷纯度≥92％。

权利要求书1.  一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)黄芩提取物粗膏的制备：取干燥的黄芩根粉末，用乙醇回流提取1-3次，滤过，合并滤液，浓缩干燥得提取物粗膏；2)HPD100大孔树脂纯化：将步骤1)得到的粗膏溶于水中，上样HPD100大孔树脂，上样后的HPD100大孔树脂先用5倍柱体积水洗脱，然后用4倍柱体积的50％乙醇洗脱黄芩苷，收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂得大孔树脂粗提物；3)HSCCC分离纯化黄芩苷：按比例3～5:0.5～2:0～1:4～7配制乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂体系，剧烈振荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相，分别用超声脱气，上相为固定相，下相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节高速逆流色谱仪转速，同时将流动相泵入高速逆流色谱仪，待流出液分层后上样大孔树脂粗提物溶液，所述粗提物溶液为步骤2)得到的大孔树脂粗提物按10～100mg：5～20ml比例溶于流动相而制成；根据HSCCC图谱收集出峰处各组分，并对各组分进行HPLC检测，合并含有单一黄芩苷的组分，减压回收溶剂即得到黄芩苷。2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)提取步骤中，所述乙醇的体积浓度为50～95％。3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乙醇的体积浓度为70％。4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)回流提取温度为60～90℃，提取次数为2次，每次提取的时间为1～2小时。5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，黄芩提取物粗膏的上样速度为3BV/h；洗脱流速为2～6BV/h。6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱流速为3BV/h。7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂体系的比例为4：1：0.5：6。8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述大孔树脂粗提物与流动相的用量比为20mg：10ml。9.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述固定相的流速为10～40ml/min，所述流动相流速为2～4ml/min。10.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述高速逆流色谱仪转速为600～950rpm。

说明书一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法
技术领域
本发明涉及中药有效成分分离纯化技术，具体属于一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法。
背景技术
黄芩苷(baicalin)，别名黄芩甙，分子式：C21H18O11，分子量：446.5，CAS号：21967-41-9，是一种含有葡萄糖醛酸结构的黄酮类化合物。黄芩苷存在于唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georg的干燥根中。黄芩苷的结构式如下：

近年来研究表明，黄芩苷抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能。在临床医学已占有重要地位。黄芩苷还能吸收紫外线，清除氧自由基，又能抑制黑色素的生成，因此既可用于医药，也可用于化妆品，是一种很好的功能性美容化妆品原料。目前，黄芩苷已成功开发成黄芩苷片、黄芩苷胶囊用于治疗急慢性肝炎；此外，将黄芩苷与穿心莲内酯联用，也已成功开发成感咳双清胶囊，用于治疗急性上呼吸道感染和急性支气管炎。由于黄芩苷具有较高的开发利用前景，因此对提取和纯化黄芩苷的方法进行研究很有现实意义。
传统的黄芩苷制备工艺包括：水煎煮、浓缩、二次酸沉和重结晶等步骤，它存在着以下不足：1.污染环境：在制备过程中产生大量酸水，排放进环境中，对环境污染大，安全性差；2.步骤复杂，操作繁琐，生产周期长3.产品损失大，产品品质不高，最终产品黄芩苷含量只能达到85％。
高速逆流色谱(HSCCC)是一种新型液相色谱技术，由于HSCCC不需固相载体作固定相，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点，在天然活性成分的分 离中具有纯度高、损失少等优点，并可以在短时间内实现高效制备性分离。近年来，高速逆流色谱技术分离纯化高纯度天然产物已在很多方面取得成功，但采用大孔树脂和高速逆流色谱联用技术从黄芩中纯化获得高纯度黄芩苷的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从黄芩中制备高纯度黄芩苷的方法。
本发明提供的制备黄芩苷的方法，包括如下步骤：
1)黄芩提取物粗膏的制备：取干燥的黄芩根粉末，用乙醇回流提取1-3次，滤过，合并滤液，浓缩干燥得提取物粗膏；
2)HPD100大孔树脂纯化：将步骤1)得到的粗膏溶于水中，上样HPD100大孔树脂，上样后的HPD100大孔树脂先用5倍柱体积水洗脱，然后用4倍柱体积的50％乙醇洗脱黄芩苷，收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂得大孔树脂粗提物；
3)HSCCC分离纯化黄芩苷：按比例3～5:0.5～2:0～1:4～7配制乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂体系，剧烈振荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相，分别用超声脱气，上相为固定相，下相为流动相；将固定相泵入高速逆流色谱仪，稳定后，调节高速逆流色谱仪转速，同时将流动相泵入高速逆流色谱仪，待流出液分层后上样大孔树脂粗提物溶液，所述粗提物溶液为步骤2)得到的大孔树脂粗提物按10～100mg：5～20ml比例溶于流动相而制成；根据HSCCC图谱收集出峰处各组分，并对各组分进行HPLC检测，合并含有单一黄芩苷的组分，减压回收溶剂即得到黄芩苷。通过HPLC-UV方法对产品进行了定性、定量分析，所得产品为黄芩苷，纯度≥92％。
所述步骤1)中乙醇的体积浓度为50～95％，优选为70％。
所述步骤1)中回流提取温度为60～90℃，提取次数为2次，每次提取的时间为1～2小时。
所述步骤2)中，黄芩提取物粗膏的上样速度为3BV/h；洗脱流速为2～6BV/h，优选为3BV/h。
所述步骤3)中乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂体系的优选比例为4：1：0.5：6。
所述步骤3)中大孔树脂粗提物与流动相的用量比优选为20mg：10ml。
所述步骤3)中固定相的流速为10～40ml/min，流动相流速为2～4ml/min。
所述步骤3)中高速逆流色谱仪转速为600～950rpm。
本发明采用乙醇回流提取、大孔树脂和HSCCC的联用技术，以黄芩干燥根为原料分离纯化得到高纯度的黄芩苷。本发明相对于现有的工艺有如下优点：(1)生产流程安全易操作；(2)生产周期短，重复性高，可操作性强；(3)HSCCC技术无固态载体，在样品纯化过程 中无吸附、损失，纯化产物回收率高，纯度高；(4)整个纯化过程通过HPLC进行精确定性定量，准确度高；(5)采用大孔树脂与HSCCC联用技术制备黄芩苷，所用溶剂可回收重复利用，避免了传统制备方法如酸沉等产生的废水，对环境友好，安全性好。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为黄芩苷标准品的HPLC色谱图。
图3为黄芩提取物粗膏的HPLC色谱图。
图4为HPD100大孔树脂纯化过程中不同洗脱溶剂浓度对黄芩苷的洗脱效果图，横坐标为各梯度累计的柱体积数，每4个柱体积对应一个梯度，即1～4、5～8、9～12、13～16、17～20、21～24分别对应水、10％、30％、50％、70％、95％的乙醇。
图5为HPD100大孔树脂纯化过程中乙醇不同洗脱柱体积对黄芩苷的洗脱效果。
图6为HPD100大孔树脂纯化所得粗提物的HPLC色谱图。
图7为黄芩HPD100粗提物的HSCCC分离纯化谱图。
图8为HSCCC纯化后得到产品的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中均采用HPLC对各步骤产品进行纯度检测，HPLC流动相包括甲醇(A)和水：磷酸(53：0.2，v/v)(B)，采用0～10min：47～75％A，10～15min：75～100％A，15～20min：100％A，20～22min：100～47％A，22～27min：47％A，梯度洗脱，流速为1ml/min，色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18柱(5μm,4.6×250mm)，柱温25±5℃，检测波长280nm。
实施例1
1、黄芩提取物粗膏的制备
取干燥的黄芩根粉末10g，用70％乙醇回流提取2次，每次1.5h，滤过，合并两次滤液，浓缩干燥得提取物粗膏，HPLC测定其中成分及黄芩苷含量(图3)，测得出膏率为50.05％，黄芩苷含量为22.90％。
2、大孔树脂纯化黄芩提取物粗膏
a.大孔树脂型号的选择
采用静态吸附法，以吸附残液和解吸液中黄芩苷浓度为指标筛选最适树脂。精确称取5g黄芩提取物粗膏于4个250ml具塞锥形瓶中，超声使充分溶解，吸取少量溶液，测定黄芩苷 含量(C1)；量取4种不同型号的大孔树脂各10.0g置于4个250ml的锥形瓶中，在摇床上振荡24h(200rpm，40℃)，吸取吸附残液，测定其中黄芩苷浓度(C2)，并计算其吸附率(X1)；将已吸附黄芩苷的树脂用蒸馏水淋洗，至洗掉表面未吸附溶液为止，用吸水纸去表面水，加入100ml 95％乙醇，继续摇床振荡24h(200rpm，40℃)，使树脂充分解吸附，测定解吸液中黄芩苷的总量(C3)，计算其解吸率(X2)。由吸附率(X1)与解吸率(X2)综合评价最适树脂。公式:X1(％)＝[(C1－C2)÷C1]×100(1)，X2(％)＝[C3÷(C1－C2)]×100(2)。不同大孔树脂的静态吸附与解吸效果见表1。由表1可以看出，4种型号的大孔树脂均能较好的吸附黄芩苷，但HPD100型树脂对黄芩苷解吸率均高于其它型号树脂，故本发明选择HPD100型树脂进行黄芩苷的分离纯化。
表1 不同型号大孔树脂静态吸附与解吸效果

b.上样比的确定 
将不同质量的提取物粗膏(1.3、1、0.8、0.6g)溶解于适当体积蒸馏水中，分别通过装柱量为40g的D101树脂柱，以3BV/h的流速进行动态吸附,吸附完全后用蒸馏水冲洗除杂，辅以HPLC检测收集流分，结果显示上样量为1.3、1g时除杂液中均出现黄芩苷，吸附超载；上样量为0.8、0.6g时除杂液中均未检测到黄芩苷。不同上样量对应的洗脱结果如表2所示。由表2可知，上样量为0.8g时黄芩苷含量及收率均最高，故确定1/50(上样量/树脂量)为最佳上样比。
表2 不同上样量在D101大孔树脂柱的洗脱效果

c.乙醇洗脱浓度的选择
取经筛选出的D101大孔树脂40g，预处理后湿法装柱(柱内径约22cm，柱体积(BV)约为50mL)。加入0.8g黄芩提取物粗膏配制的上样液，以3BV/h流速通过树脂柱吸附，用4 BV水洗除杂。再分别用10％、30％、50％、70％、95％的乙醇各4BV进行梯度洗脱。每1BV收集一管，共收集24管，测定每管中黄芩苷的浓度，绘制洗脱曲线。如图4所示，第16个柱体积已基本把黄芩苷全部洗脱下来，第17个柱体积中黄芩苷含量接近为0，即50％乙醇可以把黄芩苷完全洗脱下来，70％乙醇中几乎不再有黄芩苷，而10％、30％乙醇中亦含大量黄芩苷，表明D-101型树脂对黄芩苷有较大的富集纯化效果。故选择50％乙醇为用于解吸黄芩苷的最适乙醇浓度。
d.洗脱柱体积考查
取D101大孔树脂40g，预处理后湿法装柱(柱内径约22cm，柱体积(BV)约为50mL)。加入0.8g黄芩提取物粗膏配制的上样液，以3BV/h流速通过树脂柱吸附，用4BV水洗除杂。再用50％的乙醇6BV洗脱，分别收集各个柱体积流分，HPLC测定其中黄芩苷含量，绘制洗脱曲线图。如图5所示，4BV的50％乙醇可以把大部分黄芩苷洗脱下来，继续增加洗脱柱体积，流分中含极少量或几乎不含黄芩苷，故本发明选择4BV为最适洗脱柱体积。
取0.8g黄芩粗提物粗膏，溶于5ml dH2O中，上样HPD100大孔树脂(40g)，分别用5BV水、4BV 50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱流分，旋转蒸发仪50℃浓缩，60℃水浴烘干，得到粉末0.40g，黄芩苷含量为39.72％。(图6)
3、HSCCC纯化大孔树脂粗提物
a.两相体系的选择
通过测定目标化合物的分配系数(K)及比较实际分离效果来确定溶剂体系。称取适量(约10mg)黄芩大孔树脂粗提物置于10mL离心管中，分别加入已经达到平衡的上、下相溶剂各3mL，涡旋使样品充分溶解，静置平衡，分取上、下层溶液，用HPLC法测定溶剂体系上、下层所含黄芩苷的浓度，求得黄芩苷在该溶剂系统中的分配系数(K)，以K值小者为优。本发明分别采用低极性的溶剂系统(氯仿-甲醇-水)、中极性的溶剂系统(正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水)、极性的溶剂系统(乙酸乙酯-正丁醇-水、正丁醇-水)进行了系统的溶剂体系摸索。结果如表3所示，黄芩苷在极性的溶剂系统(乙酸乙酯-正丁醇-水＝4：1：5，V/V/V)中K值最小，并且通过上机分离发现，乙酸乙酯-正丁醇-水体系可以较好的分离得到黄芩苷，与其他的成分分离度较好，故本发明选择乙酸乙酯-正丁醇-水体系作为分离体系，但黄芩苷出峰时间较长，故该体系各组分比例仍有待优化。
表3 不同两相体系K值测定表


b.两相溶剂体系比例的确定
在相同条件下，分别对乙酸乙酯-正丁醇-水体系的4种比例进行了分离效果的比较。不同比例设定见表4.乙酸乙酯-正丁醇-水体系比例为4：1：5、3：2：5时，黄芩苷都能得到较好的分离，但分离时间均过长；考虑加入少量甲醇调节两相分配比例，乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水比例为4：1：0.5：6时，黄芩苷出峰时间明显缩短，且与相邻峰有较好的分离度；当乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水比例为4：1：1：6时，黄芩苷与相邻峰的分离度减小，不能实现很好的分离，故选择乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(4：1：0.5：6，V/V/V)为最终分离体系比例。
表4 EA:n-BuOH:H2O两相体系不同比例设定

配制乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(4∶1∶0.5∶6，v/v/v/v)溶剂体系，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相，使用前分别用超声脱气30min。取约19.4mg黄芩大孔树脂粗提物，溶于10mL流动相中，振荡使之完全溶解，以备HSCCC进样。上相(固定相)首先以30.0ml/min的流速泵入HSCCC螺旋管。待螺旋管完全充满后，调整螺旋管转速为865.7r/min，同时以3.0mL/min的流速泵入下相(流动相)。动力学平衡后，将样品通过进样阀注入分离螺旋管。根据色谱仪检测器采集的图谱收集各组分，用HPLC测各组分的纯度，该步纯化所得黄芩苷纯度为92.13％ (图7，图8) 。