一种山豆根毛状根的诱导方法.pdf

一种山豆根毛状根的诱导方法，包括如下步骤：(1)取山豆根种子进行消毒后接种到MS种子培养基中萌发；(2)萌发的种子根据子叶、下胚轴、叶片、茎段切成1-2cm的小块，用解剖刀划伤，接种到MS外植体培养基中进行预培养；(3)将预培养的材料浸泡到发根农杆菌菌液中进行细菌侵染；(4)将细菌侵染后的材料接种到MS共培养培养基中进行共培养；(5)将共培养材料接种到抑菌培养基中进行抑菌培养脱菌。采用本发明进行毛状根诱导所获得的毛状根生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物的特点，操作简便、快捷、诱导率高，可用于大规模生产工业用山豆根的替代资源。

权利要求书1.  一种山豆根毛状根的诱导方法，其特征在于,该方法包括以下步骤： (1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发培养15天诱导种 子萌发获得小苗，所述MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值 为5.8； (2)外植体预培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶、下胚轴、叶片、茎 段切成1-2cm的小块，用解剖刀划伤，接种到MS外植体培养基中，在培养温度23-27℃，光 照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养1-4天，所述MS外植体培养基中添 加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； (3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601、LBA9402,A4 和15834的培养液中浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度范围为 0.4-1.0； (4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养1-4天，所述MS共培养基中 添加0-200umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8； (5)抑菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天，所述抑菌培养基中添加 300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。

说明书一种山豆根毛状根的诱导方法
技术领域
本发明涉及一种植物生物诱导方法，特别是一种山豆根毛状根的诱导方法。
背景技术
山豆根，也称广豆根、南豆根，为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gapnep.)的 干燥根及根茎，分布于我国南部，以广西产量最大。具有清火解毒、消肿止痛等功效，可以 治疗喉痈、喉风、喉痹、牙龈肿痛、喘满热咳、肝炎、便秘、黄疸、下痢、痔疾、秃疮、疥 癣及蚊、虫、犬咬伤等。医药工业用山豆根作为原料，大量研制开发治疗肝炎的针剂、咽喉 肿痛的片剂以及抗肿瘤的中成药，同时工业上也用于提取苦参碱、氧化苦参碱等成分，广泛 应用于制药和植物源农药的生产。
山豆根生长缓慢，分布零星。由于用药量的增加以及使用途径的拓展，山豆根的市场需 求量不断增大，药材的价格也不断上涨，从而导致山豆根资源的无节制采挖，野生资源濒临 枯竭。因为工业上使用的主要是山豆根的次生代谢产物，其中尤以苦参碱和氧化苦参碱用量 最多。为了不侵占中医用药资源但又不影响工业使用，采用生物技术途径生产中药材的替代 资源已经成为一个重要的途径。通过毛状根培养途径生产此生代谢产物已经在多种植物上获 得了成果，如通过人参毛状根培养生产人参皂苷等。毛状根因具有生长速度快、遗传稳定性 好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物等特点，是生产药用植物次生代谢产 物的理想载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种山豆根毛状根的诱导方法，它能够诱导山豆根种子萌发获得幼 嫩部位产生毛状根，以供后续大规模培养生产工业用山豆根的替代资源。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发培养15天诱导种 子萌发获得小苗，所述MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值 为5.8；
(2)外植体预培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶、下胚轴、叶片、茎 段切成1-2cm的小块，用解剖刀划伤，接种到MS外植体培养基中，在培养温度23-27℃，光 照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养1-4天，所述MS外植体培养基中添 加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601、LBA9402,A4 和15834的培养液中浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度范围为 0.4-1.0；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养1-4天，所述MS共培养基中 添加0-200umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)抑菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天，所述抑菌培养基中添加 300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
本发明的突出优点在于：
(1)采用本方法进行山豆根毛状根诱导，毛状根的生成率高，最高可达70％。同时所需 材料容易获得、操作简便、易行、成本低。
(2)采用本方法进行山豆根毛状根诱导，获得的毛状根在无任何外源激素的培养基中容 易生长，且具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢 产物等特点，是生产次生代谢产物理想的载体。
(3)获得的毛状根易于进行大量繁殖培养，可进行大规模生产以作为工业用山豆根的替 代资源来提取苦参碱、氧化苦参碱等次生代谢产物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例为试验不同预培养时间对山豆根毛状根诱导的影响。
一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发 培养15天诱导种子萌发获得小苗，其中MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.8；
(2)外植体预培养培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶切成1-2cm的小 块，用解剖刀在小块上划出伤口，接种到不添加任何激素的MS外植体培养基中，在培养温度 23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养0-4天，其中MS外植体 培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601的培养液中 浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度为0.6-0.8；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养2天，其中MS共培养基中添 加100umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)脱菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养30天，其中抑菌培养基中添 加300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
试验结果见表1。
表1.不同预处理时间对山豆根毛状根诱导的影响

从表1结果可以看出，短时间的预处理能促进山豆根毛状根的产生，诱导率最高的是预 处理2天的材料，诱导率达到70％。长时间预处理对山豆根毛状根的诱导具有抑制作用，预 处理4天诱导率低于未经预处理的材料，诱导率仅为30％。
实施例2
本实施例为试验不同发根农杆菌对山豆根毛状根诱导的影响。
一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发 培养15天诱导种子萌发获得小苗，其中MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.8；
(2)外植体预培养培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶切成1-2cm左右 的小块，用解剖刀在小块上划出伤口，接种到不添加任何激素的MS外植体培养基中，在培养 温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养1天，其中MS外植 体培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601、LBA9402,A4 和15834的培养液中浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度范围为 0.6-0.8；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养2天，其中MS共培养基中添 加100umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)脱菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养30天，其中抑菌培养基中添 加300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
试验结果见表2。
表2.不同发根农杆菌对山豆根毛状根诱导的影响

从表2结果可以看出，不同菌株对山豆根毛状根的诱导具有不同的影响，其中R1601、 A4、15834能诱导山豆根子叶产生毛状根，诱导率最高的是R1601菌株，其次是15834菌株。 LBA9402不能促进山豆根毛状根的诱导，使用该菌株诱导的材料未产生毛状根。
实施例3
本实施例为试验不同外植体对山豆根毛状根诱导的影响。
一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发 培养15天诱导种子萌发获得小苗，其中MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.8；
(2)外植体预培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶、下胚轴、叶片、茎 段切成1-2cm左右的小块，用解剖刀在小块上划出伤口，接种到不添加任何激素的MS外植 体培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培 养1天，其中MS外植体培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601的培养液中 浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度为0.6-0.8；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养培养基中，在培养温度 23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养2天，其中MS共培养基 中添加100umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)脱菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养30天，其中抑菌培养基中添 加300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
试验结果见表3。
表3.不同外植体对山豆根毛状根诱导的影响

从表3结果可以看出，不同的外植体对R1601诱导毛状根的灵敏度不同，其中子叶、嫩 茎和下胚轴均为R1601菌株敏感，均诱导获得毛状根，其最敏感的是子叶，诱导率为68％。 叶片对R1601菌株不敏感，未发现有毛状根产生。
实施例4
本实施例为试验不同共培养时间对山豆根毛状根诱导的影响。
一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发 培养15天诱导种子萌发获得小苗，其中MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.8；
(2)外植体预培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶切成1-2cm的小块， 用解剖刀在小块上划出伤口，接种到不添加任何激素的MS外植体培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养1天，其中MS外植体培养基 中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601的培养液中 浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度为0.6-0.8；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养0-4天，其中MS共培养基中 添加100umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)脱菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养30天，其中抑菌培养基中添 加300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
试验结果见表4。
表4.不同共培养时间对山豆根毛状根诱导的影响

从表4结果可以看出，不同时间的共培养对毛状根的诱导具有显著影响，短时间的共培 养可以促进毛状根的产生，长时间的共培养对毛状根的诱导具有抑制作用，最佳的共培养时 间为3天，诱导率达到70％。
实施例5
本实施例为试验共培养基中添加不同浓度的乙酰丁香酮对山豆根毛状根诱导的影响。
一种山豆根毛状根的诱导方法，包括以下步骤：
(1)种子萌发：取山豆根种子，使用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗3次，并用消 毒滤纸除去表面水分后接种到不添加任何激素的MS种子培养基中，放置在培养室内进行萌发 培养15天诱导种子萌发获得小苗，其中MS种子培养基中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.8；
(2)外植体预培养：将步骤(1)中种子萌发获得的小苗根据子叶切成1-2cm的小块， 用解剖刀在小块上划出伤口，接种到不添加任何激素的MS外植体培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下预培养1天，其中MS外植体培养基 中添加30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)细菌侵染：将步骤(2)中获得的预培养材料浸泡到发根农杆菌R1601的培养液中 浸泡15分钟进行细菌侵染，其中发根农杆菌菌液的光密度为0.6-0.8；
(4)共培养：将步骤(3)获得的共侵染材料接种到MS共培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养2天，其中MS共培养培养基 中添加0-200umol/L乙酰丁香酮，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)脱菌培养：将步骤(4)获得的共培养材料接种到抑菌培养基中，在培养温度23-27 ℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下共培养30天，其中抑菌培养基中添 加300mg/L头孢噻肟，30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
试验结果见表5。
表5.共培养培养基中添加不同浓度的乙酰丁香酮对山豆根毛状根诱导的影响

从表5结果可以看出，共培养的培养基中添加不同浓度的乙酰丁香酮对山豆根毛状根的 诱导具有显著影响，低浓度的乙酰丁香酮对山豆根毛状根的诱导具有促进作用，但高浓度的 乙酰丁香酮对山豆根毛状根的诱导具有抑制作用，最佳的浓度为100umol/L。