甜高粱育种方法.pdf

本发明属于农业技术领域，涉及一种甜高粱育种方法，尤其涉及一种利用重离子诱变育种技术进行甜高粱育种的方法。一种甜高粱育种方法，其主要特点在于以下步骤(1)重离子束辐照：利用重离子加速器提供碳或氧或氩的重离子束，在能量为80-100MeV/μ，辐照剂量为80-120Gy，剂量率20-30Gy/min,在垂直辐照终端对甜高粱种子进行辐照处理，辐照时间为4-6min；(2)突变体筛选：(3)突变体检测：(4)杂交组合优化。本发明育种方法经重离子辐照后，可得到早熟、高糖、高产、抗逆的突变种植资源，种植M3－M4代，突变体就可稳定下来，而且从突变体筛选、突变体检测及杂交组合选配，均比单一的杂交育种手段效率提高10％以上。

权利要求书1.  一种甜高粱育种方法，其特征在于以下步骤：(1)重离子束辐照：利用重离子加速器提供碳或氧或氩的重离子束，在能量为80-100MeV/μ，辐照剂量为80-120Gy，剂量率20-30Gy/min,在垂直辐照终端对甜高粱种子进行辐照处理，辐照时间为4-6min；(2)突变体筛选：根据早熟、高产、高糖量或抗盐或抗寒育种目标，选择气候及土壤条件，以获得不同需求的突变体，从而得到满足育种目标的辐照种子；(3)突变体检测：在辐照半致死剂量80-120Gy条件下，变异朝着各个方向，在田间选择正突变，即符合育种目标的辐照种子，这些辐照种子和对照在田间种植时表型上存在明显的差异，发生提前抽穗、叶片变大、株高变高等性状；利用RAPD、ISSR分子标记技术确定突变体和对照之间的差异特征；(4)杂交组合优化：选育出符合育种目标要求的品种或利用重离子诱变选育的突变种质材料为父本、以引进的不育系为母本进行配合力测定试验，得到了农艺性状和经济性状比较优良的杂交组合。2.  如权利要求1所述的甜高粱育种方法，其特征在于所述的筛选抗盐碱突变体选择盐碱地种植辐照种子；筛选抗寒突变体选择海拔为2300米以上种植辐照种子；气候寒冷选择最高气温为20-25℃的地区种植辐照种子；筛选早熟、高产、高糖量种子，生育期提前10-20天。3.  如权利要求1所述的甜高粱育种方法，其特征在于还包括有通过差异基因表达筛选候选基因，RNA-Seq转录组测序，得到重离子辐照引起变异的候选基因。

说明书甜高粱育种方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，涉及一种甜高粱育种方法，尤其涉及一种利用重离子诱变育种技术进行甜高粱育种的方法。
背景技术
国家“十二五”规划提到把非粮作物甜高粱的应用开发作为优先发展的方向；以甜高粱为原料开发酒精及酵母系列产品，符合循环经济、清洁生产、保护环境的生物产业发展思路；在甜高粱产业化整个产业链中，要解决好优质原料的稳定供应，甜高粱秆的产量和品质的稳定是种植和加工两个焦点的生命线。发展甜高粱循环经济产业，对拉动农村经济、促进农民增收、推进新农村建设具有重大的战略意义。
甜高粱是一种C4作物，光合效率高，为大豆、甜菜、小麦等C3作物的2～6倍；甜高粱具有适应性强、抗旱、耐涝、耐盐碱的优点，是一种高效节水型作物。然而，我国自育的品种糖锤度略低，而且育种环节薄弱，间歇性太大，有断档现象；要改变这种局面，必须加大育种手段和方法的研究力度，使育种水平有较大的突破；为了提高效率，缩短育种年限，育种学家们不断探索着新的方法；联合重离子诱变育种和杂交育种的方法，是一种先进而高效的育种技术，是育种方法学的重要创新。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种甜高粱育种方法。以解决单一的杂交育种方法周期长、成本高的缺点，加速育种进程。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种甜高粱育种方法，其主要特点在于以下步骤：
(1)重离子束辐照：
利用重离子加速器提供碳或氧或氩的重离子束，在能量为80-100MeV/μ，辐照剂量 为80-120Gy，剂量率20-30Gy/min,在垂直辐照终端对甜高粱种子进行辐照处理，辐照时间为4-6min；辐照后即可进行对照种子和辐照种子的发芽测试和田间小区试验。
(2)突变体筛选： 
根据早熟、高产、高糖量或抗盐或抗寒育种目标，选择不同的气候(不同海拔高度)及土壤条件(沙荒、盐碱)，以获得不同需求的突变体，从而得到满足育种目标的辐照种子(种质资源)；
经发芽测试，辐照种子和发芽率低于50％，说明该辐照剂量达半致死剂量的要求，半致死剂量为80-120Gy；利用重离子辐照诱变技术进行育种时，首先要找到半致死剂量，因为半致死及以下剂量辐照条件下产生突变体的机率最大，变异率可达10％以上；
(3)突变体检测： 
将表型分析和分子检测手段结合起来，既可以快速确定突变体的遗传稳定性，准确地判断突变体的类别，而且可迅速得到引起变异的候选基因。在辐照半致死剂量80-120Gy条件下，变异朝着各个方向，有些是正突变，有些是负突变，在田间选择正突变，即符合育种目标的辐照种子(突变体)，这些辐照种子(突变体)和对照在田间种植时表型上存在明显的差异，发生提前抽穗、叶片变大、株高变高等性状；利用RAPD、ISSR分子标记技术确定突变体和对照之间的差异特征；
(4)杂交组合优化：
选育出符合育种目标要求的品种或利用重离子诱变选育的突变种质材料为父本、以引进的不育系为母本进行配合力测定试验，得到了农艺性状和经济性状比较优良的杂交组合。
所述的甜高粱育种方法，所述的筛选抗盐碱突变体选择盐碱地，低度PH7.1－8.5，中度盐碱地PH8.5－9.5种植辐照种子；筛选抗寒突变体选择海拔为2300米以上种植辐照种子；气候寒冷选择最高气温为20-25℃的地区种植辐照种子；筛选早熟、高产、高糖量种子，生育期提前10-20天。
所述的甜高粱育种方法，还包括有通过差异基因表达筛选候选基因，RNA-Seq转录组测序，得到重离子辐照引起变异的候选基因。
本发明的有益效果：本发明的目的是结合杂交育种手段，通过重离子辐照处理、突变体筛选、突变体检测、杂交育种技术，高效选育出优良的甜高粱品种，该育种方法与现有技术相比具有以下优点：
1、突变谱宽：经重离子辐照后，可得到早熟、高糖、高产、抗逆等方面的突变 种植资源。
2、育种周期缩短：一般种植M3－M4代，突变体就可稳定下来。
3、效率显著提高：从突变体筛选、检测及杂交组合选配，均比单一的杂交育种手段效率提高10％以上。
附图说明：
图1利用重离子辐照育种技术选育的早熟突变株，生育期提前20天以上；
图2早熟突变体(左)和野生型植株的田间表型，突变体进入了孕穗期，而野生型植株没有进入孕穗期；
图3早熟突变体和野生型植株的RAPD图谱(1、2、3为野生型，4、5、6为早熟突变体)；
图4早熟突变体和野生型植株的脯氨酸含量测定，突变体脯氨酸含量提高意味着抗逆能力增强；
图5以早熟突变体为父本的杂交组合筛选。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
实施例1：一种甜高粱育种方法，其主要特点在于以下步骤：
(1)重离子束辐照：
利用重离子加速器提供碳或氧或氩的重离子束，在能量为80-100MeV/μ，辐照剂量为80-120Gy，剂量率20-30Gy/min,在垂直辐照终端对甜高粱种子进行辐照处理，辐照时间为4-6min；辐照后即可进行对照种子和辐照种子的发芽测试和田间小区试验。
(2)突变体筛选： 
根据早熟、高产、高糖量或抗盐或抗寒育种目标，选择不同的气候或不同海拔高度及土壤条件，沙荒或盐碱，以获得不同需求的突变体，从而得到满足育种目标的辐照种子(种质资源)；
经发芽测试，辐照种子和发芽率低于50％，说明该辐照剂量达半致死剂量的要求，半致死剂量为80-120Gy；利用重离子辐照诱变技术进行育种时，首先要找到半致死剂量，因为半致死及以下剂量辐照条件下产生突变体的机率最大，变异率可达10％以上；
(3)突变体检测： 
将表型分析和分子检测手段结合起来，既可以快速确定突变体的遗传稳定性，准确地判断突变体的类别，而且可迅速得到引起变异的候选基因。在辐照半致死剂量80-120Gy条件下，变异朝着各个方向，有些是正突变，有些是负突变，在田间选择正突变，即符合育种目标的辐照种子(突变体)，这些辐照种子(突变体)和对照在田间种植时表型上存在明显的差异，发生提前抽穗、叶片变大、株高变高等性状；利用RAPD、ISSR分子标记技术确定突变体和对照之间的差异特征；
(4)杂交组合优化：
选育出符合育种目标要求的品种或利用重离子诱变选育的突变种质材料为父本、以引进的不育系为母本进行配合力测定试验，得到了农艺性状和经济性状比较优良的杂交组合。
实施例2：一种抗盐碱甜高粱育种方法，在步骤(2)突变体筛选中所述的筛选抗盐碱突变体选择盐碱地，低度PH7.1－8.5，中度盐碱地PH8.5－9.5种植辐照种子。
其余步骤与实施例1相同。
实施例3：一种抗寒甜高粱育种方法，在步骤(2)突变体筛选中抗寒突变体选择海拔为2300米以上种植辐照种子。
其余步骤与实施例1相同。
实施例4：一种抗寒甜高粱育种方法，在步骤(2)突变体筛选中气候寒冷选择最高气温为20-25℃的地区种植辐照种子。
其余步骤与实施例1相同。
实施例5：一种甜高粱育种方法，还包括有通过差异基因表达筛选候选基因，RNA-Seq转录组测序，得到重离子辐照引起变异的候选基因。光周期通路开花时间相关候选基因的筛选。
试验例：见图2、图3、图4、图5，以重离子诱变选育的“近甜1号”品种为实施例，选育方法如下：
1、重离子辐照：选择大小均匀、籽粒饱满的甜高粱种子，利用能量80-100MeV/μ，辐照剂量为80-100Gy的重离子，剂量率为20-30Gy/min，在垂直辐照终端进行辐照处理。辐照时间4-6min经实验室测试，辐照种子的发芽率为40％，低于半致死剂量50％，达到了预期的生物学辐射效应。
2、突变体筛选：利用随机区组设计的方法进行辐照种子小区试验，每个辐照剂量处理 的种子重复3次，在苗期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期等关键生育期记录观察田间农艺性状等表型特征，进行突变体筛选。突变朝着不同的方向变化，在80-120Gy辐照剂量条件下，不仅得到了生育期提前的一个突变株KFJT-1，而且出现了叶片皱缩、扭曲、黄化、枯死等负突变株。对突变株KFJT-1进行2-3代的稳定性测试及生理生化指标的分析。通过测定分析突变体和对照之间脯氨酸的含量，可判断突变体的抗逆能力。
结果表明：突变体的脯氨酸含量为7.64ug/g，而对照为6.88ug/g，说明通过重离子辐照诱变选育的甜高粱突变体抗逆能力优于对照。一般情况下，种植M3-M4代突变性状能稳定的话，就基本上可稳定下来。而单一的杂交育种，周期长、效率低，育成一个品种至少需12年时间。
3、突变体检测：通过田间表型测定，该突变体的主要特点是生育期提前29天，株高变矮，茎秆结构致密。茎秆亩产量为5363.6公斤，含糖量为22％，分别比对照品种增加0.7％和8.4％。经过随机多态性扩增技术分析，多态性百分率为5.26％，说明同源程度相当高，达94.7％。以突变体幼苗期的根、茎、叶为研究对象，利用RNA测序技术分析了二者的差异基因，筛选出和不同代谢途径相关的候选基因。其中和光周期通路开花时间相关的候选基因如下：根上调基因PHYA,PHYB,TOC1,APR3,GI，LHY,CCA1 and WNK，茎下调基因PHYA,PHYB,ARP7,CHS,TOC1,CCA1，叶上调基因PHYA,TOC1 and APR3。进一步分析表明，正是因为这些候选基因的调节，导致了突变体生育期提前。上述基因在突变体中存在，而在对照中没有检测到。
4、杂交组合优化：
以突变体KFJT-1为父本、不育系L53A、623A、F4A和7050A为母本进行了配合力测定，筛选出农艺性状和经济性状比较优良的杂交组合。最后经区域试验、生产试验及抗病性测定后即可进行品种登记工作。
生育期提前10-20天；产量和含糖量提高10％以上。
需要指出的是，上面所述只是利用重离子诱变育种技术进行甜高粱育种的方法的详细说明，由于对相同技术领域的普通技术人员来说是很容易在此基础上进行若干修改和改动的，因此本说明书并非是要将利用重离子诱变育种技术进行甜高粱育种的方法局限在所示和所述的范围内，故凡是所有可能被利用的相应修改以及等同物(辐照离子、剂量等)，均属于本发明所申请的专利范围。