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美国肉参岩藻糖基化粘多糖及其用途
    【技术领域】
     本发明涉及一种大分子化合物 -- 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的结构鉴定和用 途， 属于天然高分子领域。背景技术
     研究发现存在于海参体壁的多糖主要分两类 ： 一类为岩藻糖基化的海参硫酸软骨 素 (sea cucumber fucolysated chondroitin sulfate)(38， 39)， 是由 D-N- 乙酰氨基半乳 糖、 D- 葡萄糖醛酸和 L- 岩藻糖组成的分支杂多糖， 相对分子质量为 4 万 -5 万 ； 另一类为海 参岩藻多糖 (Holothurian fucan)(40， 41)， 是由 L- 岩藻糖所构成的直链多糖， 相对分子质 量为 8 万 -10 万。两者的组成糖基虽不同， 但糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化， 并且硫酸 酯基类多糖含量均在 32％左右， 两种海参多糖的特殊结构， 均为海参所特有。
     海参硫酸软骨素多糖是海参两种主要多糖之一， 其结构复杂， 且因海参种类和生 长环境的不同而有差别。近年来， 国内外对海参硫酸软骨及其异构物的药理作用进行了研 究， 证明其具有抗肿瘤， 提高机体免疫力， 抗血栓， 抗凝血， 降低血粘度， 保护神经组织及抑 菌等多种生理活性， 对人体的生理功能调控、 维系生命最佳状态具有极其重要的意义。
     目前， 文献研究报道的海参硫酸软骨素主要有以下两种 ：
     其一为 Paulo A.S. 等从 L.grisea 海参中提取出一种海参多糖， 类似硫酸软骨素 的结构， 糖组成分析表明其含有 Fuc ∶ GalNAc ∶ GlcA ∶ SO4 约为 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 2.7， 采用 1 稀酸酸水解并结合 NMR 技术观察水解过程中核磁共振 H NMR 谱图变化表明， 岩藻糖支链主 要连接在葡萄糖醛酸的 3 位上。采用硫酸软骨素 ABC 酶并对产物进行二糖组成分析， 表明 主链含有硫酸软骨素， 硫酸软骨素 4-S 和的硫酸软骨素 4， 6-S。 而核磁分析表明其支链岩藻 糖以 4-O-SO4 取代为主， 并含有 3， 4 和 2， 4-O-SO4 取代。
     其二为 Kariya 等从日本刺参 (S.japonicus) 体壁中分离纯化出海参糖胺聚糖， 经 2酸解后测定其单糖和硫酸基组成， 发现其为硫酸软骨素 E 型结构， 硫酸基 (SO4 )、 氨基半乳 糖 (GalN)、 葡萄糖醛酸 (GlcUA) 和岩藻糖 (Fuc) 的摩尔比为 3 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 1。进一步的结构 分析表明这种硫酸软骨素的岩藻糖支链以 2， 4-O-SO4 为主， 并且含有 3， 4 和 4-O-SO4 取代。 发明内容
     本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗血栓活性和抗凝血功能的美国肉参 岩藻糖基化粘多糖。
     为了解决上述技术问题， 本发明提供一种美国肉参岩藻糖基化粘多糖， 其结构式 为：
     n ＝ 70。
     作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的改进 ： 美国肉参岩藻糖基化粘多糖主 链为硫酸软骨素 E 结构， 同时带有硫酸岩藻糖构成的支链， 该支链通过糖苷键连接在主链 的 β-D- 葡萄糖醛酸上， 且硫酸基的取代方式以 2， 4-O-SO 4 为主， 为从一种从海参中分离得 到的结构新颖硫酸软骨素多糖。
     作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的进一步改进 ： 支链为 2， 4 位硫酸化的 α-D- 岩藻糖。
     作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的进一步改进 ： 美国肉参岩藻糖基化粘 多糖是一种含有 2， 4 位硫酸化的 α-D- 岩藻糖支链的硫酸软骨素。
     本发明还同时提供了上述美国肉参岩藻糖基化粘多糖的用途 ： 其具有抗血栓活性 或者抗凝血功能 ； 因此能用于制备抗血栓剂或抗凝血剂。
     本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖主链为硫酸软骨素 E 结构， 同时带有硫酸岩 藻糖构成的支链， 该支链通过糖苷键连接在主链的 β-D- 葡萄糖醛酸上， 且硫酸基的取代 方式以 2， 4-O-SO4 取代为主， 为从一种从海参中分离得到的结构新颖硫酸软骨素多糖。美 国肉参岩藻糖基化粘多糖具有包括抗凝血， 抗血栓活性等活性。其用法和用量可参照目前 现有的海参硫酸软骨素的用法和用量。
     综上所述， 本发明发现一种新型的岩藻糖基化粘多糖， 对其的抗凝抗栓活性的研 究具有重要的意义。
     附图说明
     下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 图 1 是本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的红外光谱图 ； 图 2 是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的 1HNMR ； 图 3 是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的 2D 谱图 ； a； TOCSY 谱图 ； b HMQC 谱图 ； c NOESY 谱图 ； 图 4 是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的 13CNMR ； 图 5 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的凝血酶 FIIa 和凝血因子 FXa 的抑制作用 ； a 抗凝血酶 III 介导的对 FIIa 抑制活性 ； b 肝素因子 II 介导对对 FIIa 抑制活性 ； c 抗凝血酶 III 介导的对 FXa 抑制活性。具体实施方式实施例 1、 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的提取方法， 依次进行以下步骤 ：
     1)、 将 50g 美国肉参的干参 ( 含水率低于 10％ ) 磨成粉状物， 加入 1500mL 的混合 缓冲溶液， 并加入 5mg 木瓜蛋白酶， 于 60℃水浴下搅拌反应 24h。
     该混合缓冲溶液的制备方法如下 ： 在每 L 0.1M 乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液 (pH6.0) 中 加入 15mmol 的 EDTA 和 5mmol 的半胱氨酸。
     2)、 将步骤 1) 所得的酶解后产物离心 (2000g， 15min， 20℃ )， 向上清液 ( 即海参酶 解液 ) 中加入 80mL 质量浓度为 10％的氯化十六烷基吡啶 (CPC) 水溶液， 室温下放置 24 小 时后， 离心 (2000g， 15min)， 弃去上清液。
     3)、 将步骤 2) 所得的沉淀溶解于 500mL 的 NaCl 的乙醇水溶液 (NaCl 的浓度为 3mol/L， 乙醇水＝ 100 ∶ 15v/v) 中， 再加入 1000mL 95％ ( 体积浓度 ) 乙醇溶液， 4℃放置 24 小时， 离心 (2000g， 15min)， 沉淀分别用 30mL 80％和 95％ ( 均为体积浓度 ) 乙醇溶液洗 2 次， 最后将沉淀于 60℃干燥 2 小时， 用蒸馏水溶解， 用截流分子量为 6000Da 的中空纤维膜 超滤并脱盐， 浓缩， 冻干 ( 于 -62℃ )， 得海参粗多糖 5g， 提取率约为 10％。
     4)、 将海参粗多糖经过 DEAE-52 阴离子交换柱分离纯化。具体纯化步骤如下 ：
     3g 的 海 参 粗 多 糖 采 用 DEAE 阴 离 子 交 换 树 脂 (4.6*20cm) 分 离 纯 化， 采用 0-1.4mol/LNaCl 的缓冲盐溶液 ( 以 0.1M 乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液 (pH 6.0) 作为溶剂 ) 进行 线性梯度洗脱， 总系统体积为 2000ml， 流速为 0.5mL/min， 每 10min 收集一管， 于 280nm 处测 吸光值检测蛋白含量， 采用改良的苯酚 - 硫酸法检测各管的多糖含量。
     并通过液相 TSK4000 柱子检测组分单一的管， 第 75 ～ 110 管为符合上述要求的 管。收集后经截留分子量为 14000Da 的透析袋透析， 真空冷冻 (0.025MPa， -62℃ ) 干燥， 得 美国肉参岩藻糖基化粘多糖 1.2g。
     所得的多糖采用醋酸纤维膜电泳和高效液相色谱鉴定纯度和分子量。 结果表明该 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的分子量约为 109KDa。纯度为 98.2％。
     实施例 2、 对实施例 1 所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖进行结构分析 ：
     (1) 取上述实施例 1 所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖约 2.0mg 于安培瓶中， 加 -1 入 1mL2mol·L TFA， 充氮气封管， 110 ℃水解 8h。冷却至室温， 50 ℃挥干 TFA， 逐次分别以 -1 -1 2mol·L 、 0.3mol·L NaOH 溶液调至中性， 超纯水定容至 1mL， 取 400μL 并入 50μL 2mM/ L 的内标物乳糖进行 PMP 衍生化。色谱条件 ： 色谱仪 ： Agilent 1100 高效液相色谱仪、 色谱 柱： ZORBAX Eclipse XDB-C18 分离柱 (4.6×150mm， 5μm)、 检测器 ： 紫外检测器， 250nm、 流 -1 速： 1.0mL·min 、 柱温 ： 25℃、 流动相 ： 溶剂 A ： 15％ (V/V) 乙腈 +0.05mol·L-1 磷酸缓冲液 (KH2PO4-NaOH， pH 6.9)， 溶剂 B ： 40％ (V/V) 乙腈 +0.05mol· L-1 磷酸缓冲液 (KH2PO4-NaOH， pH 6.9)、 梯度模式 ： 时间梯度 ： 0 → 10 → 30min， 浓度梯度 ： 0 → 8％→ 20％溶剂 B、 进样体 积： 10μL。 结果表明 ： 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的单糖组成为葡萄糖醛酸 (GlcUA)、 氨基 半乳糖 (GalN) 和岩藻糖 (Fuc)， 其比例约为 1 ∶ 1 ∶ 1.1。
     (2) 取上述实施例 1 所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖 ( 大约 2mg)， 加 5mL 浓 HCl 及 1.5mL 浓 HNO3 消化约 2 小时至微黄为止， 将剩余的少量溶液定容到 50mL， 取 2.5mL 采用 离子色谱法测定硫酸基含量。以硫酸钾作标准品建立标准曲线。结果表明美国肉参岩藻糖 基化粘多糖多糖的硫酸基约为 34.3％。
     (3) 取上述实施例 1 所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖与 KBr 压制成片， 使用Vector22 型傅立叶红外光谱仪， 扫描 4000 ～ 400cm-1 波数范围的光谱吸收值。结果如图 1 所示， 表明美国肉参多糖在 3600-3200cm-1 都出现了一个宽的 O-H 伸缩振动峰， 在 2990cm-1 和 2940cm-1 为岩藻糖甲基的吸收峰， 在 1430cm-1 附近 ( 羧基 C ＝ O 伸缩， -OH 弯曲 ) 处有吸 收， 说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖中含有糖醛酸， 这与单糖组成分析结果相一致。 此外在 -1 -1 1261 ～ 1220cm (S ＝ O 的伸缩振动峰 ) 和 860 ～ 820cm (C-O-S 的伸缩振动峰 ) 处有强烈 吸收， 进一步表明所有样品为富含硫酸基的多糖。其中 827cm-1 处的吸收峰是 C-O-S 的伸缩 振动 ( 轴向配位 )， 是 C-4 位硫酸基取代的岩藻糖， 说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖以 C-2， 4 取代为主 ；
     (4) 上 述 实 施 例 1 所 得 的 美 国 肉 参 岩 藻 糖 基 化 粘 多 糖 各 取 50mg， 以 0.5mL D2O(99.96％ ) 连续交换 2 次， 经 0.5mL D2O(99.96％ ) 溶解后， 用 JNM-ECP 600 核磁共振波 1 13 谱仪测定 H NMR。测定条件 ： 60℃， 600MHz ； 内标 ： 丙酮。 C NMR 和二维谱图 1H-1H COSY， 1 TOCSY 在 20℃下分析得到。 对于糖化合物来说， H NMR 谱中 C-1 上的质子 (H-1) 信号通 常在 δ4.8 ～ 5.6ppm， 较易解析， 其他 C-2 ～ C-6 的质子信号均集中在 δ3.2 ～ 4.8ppm， 互相重叠 交叉， 解析困难。美国肉参岩藻糖基化粘多糖主链为类似于由 β-D-GlcUA 和 β-D-GalNAc 交替构成的硫酸软骨素的结构， 而支链为岩藻糖糖基。5.1 ～ 5.6ppm 处的信号被归属为岩 藻糖的异头氢信号。美国肉参岩藻糖基化粘多糖在 5.56ppm 处显示了一个主要峰和强度较 弱的峰 ( 图 2)， 参考 Mourao 等在海参 L.grisea 中的数据 [7]， 它们被归属为 2， 4-O-SO4。此 外美国肉参岩藻糖基化粘多糖在 5.23ppm 还有一个信号较弱的峰， 参考之前文献数据， 被 归属为 4-O-SO4。在岩藻糖的甲基信号区域 (1.0 ～ 1.3ppm)， 美国肉参岩藻糖基化粘多糖 ( 图 2-4a) 仅显示了 1.19ppm 的甲基信号， 因此可以被归属于 2， 4-O-SO4 的甲基氢信号。美 国肉参岩藻糖基化粘多糖， 只在 1.89-1.93ppm 区域显示了一个甲基信号峰， 表明他们主链 上 GalNAc 的取代类型相似 ( 硫酸软骨素 E， 下文讨论 )。二维 TOCSY( 图 3a) 显示了岩藻糖 异头氢信号 H-1 和 H-2 的相关信号 ( 如图 3a 所示 )， 如 a1/a 是 2， 4 岩藻糖中 H-1 和 H-2 的 相关信号 ( 如图 3a 所示 )。所有岩藻糖基的化学位移如表 1 所示。而 HMQC 和 NEOSY 谱图 则表明了其主链为硫酸软骨素 E 的结构 ( 如图 3b 和 3c 所示 )。
     表 1 美国肉参岩藻糖基化粘多糖岩藻糖基的 1H NMR 化学位移
     “-“表示海参多糖信号未被检测到
     5) 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的 13C-NMR 谱图如图 4 所。它不像氢谱一样直接明 了地得出海参岩藻糖基的硫酸基取代情况。 但是我们可以得出美国肉参岩藻糖基化粘多糖
     的碳谱和标准硫酸软骨素 E 和刺参 S.japonicus 硫酸软骨素 ( 其主链为硫酸软骨素 E 结 构 ) 的碳谱非常相似， 因此我们对其主链首先进行分析。 67.5ppm 的信号可以很明显地归属 于硫酸化的 GalNAc 的 C-6 位， 但是 C-4 的信号由于和其他信号堆叠在一起很难归属。在异 头碳部分， 美国肉参 ( 图 4) 在 97.1、 99.8 和 104.1ppm 显示了三个非常清晰地信号， 分别归 属于其三个单糖单元 Fuc， GalNAc 和 GlcA 的异头碳信号。
     6) 实施例 1 所得美国肉参岩藻糖基化粘多糖的结构式为 ：
     n ～＝ 70。
     实施例 3、 美国肉参的抗凝抗栓活性
     1)、 人静脉取血， 按照 9 ∶ 1( 体积比 ) 比例加至含 0.109mol/L 的构椽酸钠抗凝剂 的塑料管中。轻轻混合均匀， 3000r/min， 15min 离心， 取血浆用于凝血活性实验 ； 对于凝血 酶原时间 (PT) 实验， 72μL 血浆混合 8μL 样品溶液， 37℃孵育 1min。然后给混合液中加入 20μL PT 检测试剂， 37℃孵育 5min， 同时凝血时间由自动血凝仪纪录。对于活化部分凝血 活酶时间 (APTT) 实验， 72μL 血浆混合 8μL 样品溶液， 37℃孵育 1min。然后给混合液中加 入 20μL APTT 检测试剂， 70C 孵育 5min。最后加入预温 (37℃ )10μL， 0.025mol/L 氯化钙 (calciumchloride 溶液， 同时凝血时间由自动血凝仪计时。 对凝血酶时间 (TT) 实验， 45μL 血浆混合 5μL 样品液， 37℃孵育 1min， 最后加入 50μL TT 检测试剂， 同时纪录凝血时间。 所有凝血实验均平行操作 6 次， 取均值。抗凝活性由凝血时间表示。肝素钠作为阳性药物， 待测美国肉参岩藻糖基化粘多糖终浓度分别为 4， 16， 64μg/mL。空白血清作对照。所有样 品包括肝素钠均溶于生理盐水中。实验结果表明， 本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖有 显著地延长 APTT 和 TT 时间的效果， 而没有延长 PT 时间效果， 其活性与标准肝素比对后， 分 别为 183IU/mg 和 157IU/mg。
     2)、 对凝血酶 (FIIa) 和凝血因子 FXa 的抑制。 该实验在 384 孔微孔板进行， 反应体 系终体积 40μL， 包含终浓度为 10nmol/L 抗凝血酶 III(AT III) 或 30nmol/L HC II， 2nmol/ LFIIa 或 FXa， 以及不同浓度的美国肉参岩藻糖基化粘多糖和肝素钠样品 (0.00025μg/ mL-25μg/mL 浓度梯度 )。各样品均溶于 TS/PEG buffer(0.02mol/L Tris/HCl， 0.15mol/ LNaCl 和 1.0mg/mL PEG 8000， pH 7.4) 中。FIIa/FXa 最后加入反应体系启动反应， 37℃孵 育 60s， 然后加入 25μL 0.4mmol/L FIIa 发色底物 /FXa 发色底物， 然后将微孔板置入酶标 仪中， 记录 405nm OD 值 300s。OD 变化率和保留在体系中的 FIIa/FXa 活性成比例， 根据 OD 的变化率来观察体系中的凝血因子活力， 从而计算加入的样品对凝血因子的抑制作用。空 白实验包括 FIIa/FXa 与 AT III/HC II 混合孵育， 但不加入各样品。空白实验中未见任何 凝血因子 的抑制作用。所有实验平行操作 3 次。
     其活性如图 5 所示， 图 5a， 随着美国肉参岩藻糖基化粘多糖的浓度增加， 体系中 FIIa 的活力逐渐降低， 显示其抑制作用逐渐增加， 但是其活性都显著低于肝素的活性。图 5b 相比于图 5a， 凝血辅因子发生变化， 由 ATIII 换为 HC II， 目标蛋白酶仍是 F II a， 图形 趋势基本和图 5a 一致， 随着加入样品剂量的增加， 样品的抑制作用逐渐增强， 和 ATIII 介导 的不同的是， 其活性略高于肝素样品， 这说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖中存在着 HC II 结 合位点， 他与肝素因子 II 结合后进而抑制凝血酶的活性。图 5c 显示了 AT III 介导的抑制 FXa 的效应曲线， 由图中可以看到其活性明显弱于标准肝素。
     3)、 美国肉参岩藻糖基化粘多糖体外抗血栓实验。健康雄性 SD 大鼠， 体重 250 ～ 300g， 按体重随机分为 5 组， 分别为正常对照组、 肝素对照组和低分子量肝素组 ( 剂量分别 为 0.2mg/kg 和 0.5mk/kg)、 海参肉参低和高剂量组 ( 剂量分别为 0.3mg/kg 和 0.5mg/kg)。 各组按 1mL/kg 尾静脉注射药品， 正常对照组注射生理盐水， 1 次 /d， 连续 3d。SD 大鼠给药 后 0.5h， 用 20％的乌拉坦麻醉， 腹主动脉取血。每只取血 4mL， 加入到事先置入 0.38％的枸 橼酸钠溶液 0.5mL， 混匀。取 1mL 抗凝血液加入到血栓管中， 并放入到预热至 37℃的血栓 测定仪中， 转动 10min 后， 取下血栓管， 将其中的血栓及血液一同倾倒在滤纸上， 用游标卡 尺测量血栓长度。再将放有血栓的纸片置恒温烤箱中， 于 60℃烘干 40min 后， 称取血栓干 重。实验结果采用 Tukey’ s test 评价结果的统计学差异， 以 p ＜ 0.05 作为有显著性差异 的标准。所有结果均以 means±SD 表示。所有分析统计检验采用 GraphPad Instat 4.0 软 件 (GraphPad Software， San Diego， CA， USA)。实验表明， 美国肉参岩藻糖基化粘多糖组 ( 高剂量组 (0.5/mg/ml) 和低剂量组 (0.3/mg/ml)) 与正常组相比， 其血栓湿重显减小 (P ＜ 0.01) ； 但是其作用效果与肝素组和低分子量肝素组相比， 其高剂量组 (0.5/mg/ml) 的作 用效果仍低于肝素组 (0.3/mg/ml) 的作用效果， 但是高于低分子量肝素组的作用效果， 而 低剂量组 (0.3/mg/ml) 的作用效果和低分子量肝素组相当。
     表 2 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的体外抗血栓研究
     组别 正常对照组 标准肝素对照组 (0.3/mg/ml) 低分子量肝素组 (0.5/mg/ml) MR-CHS(0.3/mg/ml) MR-CHS(0.5/mg/ml) 血栓长度 cm 2.16±0.52 未形成血栓 1.83±0.74 1.89±0.39 1.81±0.27 血栓干重 mg 110.47±9.49 未形成血栓 35.83±4.73* 35.40±7.15* 32.73±5.35**
     对比实验 1 ： 分离纯化出日本刺参 (S.japonicus) 体壁海参硫酸软骨素， 研究其体 外抗凝效价， 结果其体外延长 APTT 活性为 100IU/mg， TT 活性为 80IU/mg， 明显低于本发明 报道的美国肉参岩藻糖基化粘多糖。体外抗血栓活性分析表明， 其 0.5mg/kg 剂量时， 其体 外形成血栓干重为 38.7±6.75， 其体外抗血栓效果弱于本发明所涉及的多糖。 因此， 与日本 刺参硫酸软骨素相比， 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的明显优于日本刺参， 且在实验过程中 并未发现明显的出血副作用， 同时具有体外抗血栓活性优于日本刺参， 是一种潜在的优良 抗凝血及抗血栓药物。
     对比实验 2 ： 分离纯化出巴西湾海参 (L.grisea) 体壁海参硫酸软骨素， 研究其体 外抗凝效价， 结果其体外延长 APTT 活性为 40IU/mg， TT 活性为 32IU/mg， 明显低于本发明报 道的美国肉参岩藻糖基化粘多糖。体外抗血栓活性分析表明， 其 0.5mg/kg 剂量时， 其体外 形成血栓干重为 42.35±6.75， 其体外抗血栓效果弱于本发明所涉及的多糖。因此， 与巴西湾海参硫酸软骨素相比， 美国肉参岩藻糖基化粘多糖的明显优于日本刺参， 且在实验过程 中并未发现明显的出血副作用， 同时具有体外抗血栓活性优于日本刺参， 是一种潜在的优 良抗凝血及抗血栓药物。
     最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发 明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。