一株根瘤菌及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110389039.3	申请日：	2011.11.30
公开号：	CN102433276A	公开日：	2012.05.02
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20111130授权公告日:20130403终止日期:20131130\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20111130\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; A24B15/20; B01D53/84; B01D53/54; C12R1/41(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	云南大学
发明人：	杨金奎; 雷丽萍; 张克勤; 陈晨; 麻广慧
地址：	650091 云南省昆明市翠湖北路2号
优先权：
专利代理机构：	昆明今威专利商标代理有限公司 53115	代理人：	杨宏珍
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内容摘要

本发明涉及一株根瘤菌及其应用，属应用微生物技术领域。本发明由生产菌株液体发酵培养后得到。生产菌株为根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5-28，该菌株已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5443该菌株具有较强的尼古丁降解能力和尼古丁毒性抗性能力，能在高达2.5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂将纯烟碱完全降解，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，也能分解烟草废弃物中的尼古丁，减少卷烟对人体的危害和尼古丁对环境的污染的优点。

权利要求书

1：一株根瘤菌，其特征在于根瘤菌 (Sinorhizobium sp.)5-28 已于 2011 年 11 月 3 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCCNo.5443。
2：权利要求 1 所述的根瘤菌，其特征在于该根瘤菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。

说明书

一株根瘤菌及其应用
    技术领域：
     本发明涉及一株根瘤菌及其应用，属应用微生物技术领域。背景技术：
     尼古丁 (Nicotine)，俗称烟碱，是多种烟草的主要生物碱，是影响烟叶品质的重要因素之一，也是烟草工业废水和烟草废弃物中的主要有害成分。
     烟碱对人的中枢神经有强烈的刺激和麻痹作用，进入人体内 90％被肺部吸收，进入血液后 6s 即可到达大脑，它对人体最显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制，因此少量的烟碱可以使人兴奋，大量则会引起眩晕、呕吐甚至中毒死亡。适量吸烟可以使人记忆力增强；但过度吸烟则对人的神经系统产生抑制作用。烟碱还有使人精神安定和抗忧郁作用，对人的紧张情绪有一定的镇静作用。
     烟碱也是一种环境有毒物质，烟气环境中就含有大量的烟碱，同时烟草加工过程也会产生许多含高浓度尼古丁等生物碱的废物，这种废物被认为是 “有毒的危险废物” ，烟碱能溶于水，因此极易渗入到地下水中造成污染。因此有效地控制卷烟和环境中尼古丁的含量，对于维护人类健康有着深远的意义。
     国内卷烟企业目前贮存的上部烟叶较多，一般因其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中。这个问题已引起有关方面的重视，如何降低这些烟叶中的烟碱含量是各卷烟企业所面临的一个现实问题，而当前国内研究较多的是如何从农业田间管理方面考虑降低烟碱以及通过化学途径来综合调节卷烟的烟碱。因此，在工业上开展利用微生物对烟草进行降解烟碱处理研究具有实际应用价值，可以提高烟叶资源的利用率，具有较高的经济效益和社会效益。
     目前，已有不少文献报道过微生物在烟草工业上的研究和应用情况，例如通过微生物的作用来降低烟碱的含量、制备天然香料和改善烟叶、再造烟叶及烟梗的内在品质等。而且，在未来的很长一段时间内，它仍将是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。发明内容：
     本发明的目的在于提供一株根瘤菌及其应用，能够有效降低烟草中尼古丁的含量。
     本发明从云南省红河州弥勒县多年种植烟草的土壤样品中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌 5-28，对其进行了形态学、生理生化性质和 16S rRNA 基因序列分析，鉴定结果表明该细菌属于根瘤菌属，该菌株命名为根瘤菌 (Sinorhizobium sp.)5-28。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国 . 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号；保藏日期： 2011 年 11 月 3 日；保藏号为 CGMCC No.5443。
     根瘤菌 5-28 菌株的主要形态特征和生理生化性质为：
     根瘤菌 5-28 菌落边缘整齐、呈乳白色、较粘稠。在显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色阴性，硝酸盐还原为阴性，接触酶试验为阳性，能液化吲哚，不能液化明胶，不能水解淀粉，甲基红 (MR) 实验阴性，苯丙氨基酸脱氨酶和乙酰甲基甲醇 (V-P) 实验均为阴性，柠檬酸盐利用实验为阳性，苯丙氨基酸脱氨酶实验为阴性。本菌株对葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露醇发酵不产酸。
     根瘤菌 5-28 菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物 20F(5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ) 和 1500R(5’ -GGTTACCTTGTTACGA CT-3’ )，以根瘤菌 5-28 的基因组 DNA 作为模板扩增得到 1500bp 左右的 PCR 产物，回收测序、校正之后得到的 5-28 菌株的部分 16S rRNA 基因序列 1446bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库 (GenBank)，序列的索引号为： JN700177。
     本发明按常规方法用常规设备制备。即将根瘤菌 5-28 扩大发酵培养后得到。
     本发明的根瘤菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。
     本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，提高烟叶可用性，及能分解烟尘中的尼古丁，减少其对环境的污染的优点。附图说明：
     图 1 为根瘤菌 5-28 耐受尼古丁的浓度实验结果。
     图 2 为根瘤菌 5-28 降解尼古丁的生长曲线。具体实施方式：
     以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
     本发明是这样实现的：
     1. 根瘤菌 5-28 菌株的培养方法：
     1) 试管斜面培养
     采用 Luria-Bertani(LB) 培养基，重量百分比配方为： 1 ％蛋白胨， 1 ％氯化钠， 0.5 ％酵母提取物， 2 ％琼脂粉。121 ℃ 灭菌 25 分钟，摆成斜面。接种 Sinorhizobium sp.5-28， 28℃培养 24 小时，获得试管种。
     2) 液体扩大培养
     A. 种子培养，重量百分比配方为： 1 ％蛋白胨， 1 ％氯化钠， 0.5 ％酵母提取物。 121℃灭菌 25 分钟。接种 Sinorhizobium sp.5-28 试管种， 28℃培养 12 小时，获得液体菌种。
     B. 发酵培养基， 1g 尼古丁， 0.26g K2HPO4.3H2O， 0.8g KH2PO4， 0.41g MgSO4.7H2O， 0.1g CaSO4·H2O， 0.0039g NaMoO4， 0.005g FeSO4·7H2O， 0.3g(NH4)2SO4，加水至 1000mL， pH7.0。培养基初始 pH7.0，接种量 ( 体积百分比， v/v)2％，转速 150rpm，温度 28℃。发酵培养 24 小时。
     2. 根瘤菌 5-28 菌株耐受尼古丁浓度试验
     将培养 12 小时的液体菌种 (OD600 ≈ 0.8) 以 1％ ( 液体菌种体积百分比， v/v) 的接种量接于尼古丁浓度梯度的发酵培养基中，尼古丁的浓度梯度为 0g/L、 0.5g/L、 1.0g/L、 1.5g/L、 2.0g/L、 2.5g/L、 3.0g/L、 3.5g/L、 4.0g/L 和 4.5g/L，转速 150rpm，温度 28℃，培养 48 小时离心收集菌体，用 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定 OD600( 图 1)。由图 1 的试验结果知：根瘤菌 5-28 菌株在本试验条件下，最适生长的尼古丁浓度为 1.5g/L，最高尼古丁耐受浓度为 2.5g/L。
     3. 根瘤菌 5-28 菌株降解尼古丁的生长曲线
     将培养 12 小时的液体菌种 (OD600 ≈ 0.8) 以 1％ ( 液体菌种体积百分比， v/v) 的接种量接于发酵培养基中，接种量 1％，转速 150rpm，温度 28℃，每隔 2 小时取菌液，用高效液相测定尼古丁含量，并测定 OD600( 图 2)。
     由图 2 的试验结果知：随着根瘤菌 5-28 菌株在培养液中的 OD600 值增加，尼古丁的浓度也逐渐下降。
     4. 根瘤菌 5-28 菌株降解尼古丁菌制剂的制备
     利用发酵培养基制备 1000mL 的发酵液， 8000rpm 离心 15min 收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液 (50mM 磷酸盐缓冲液， pH 7.0) 进行悬浮， 8000rpm 离心 15min 收集菌体，重复两次，菌体细胞最后用 50ml 的缓冲液进行悬浮，即能用于降解尼古丁。
     5. 根瘤菌 5-28 制剂的降解烟叶中尼古丁试验
     分别称取 2g 保山红大 C3F 烟叶，喷洒 5ml 菌制剂，三个重复，反应体系为 30ml 的 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0)，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于 28℃、 150rpm 摇床培养，每隔 2h 小时取样一次， 12000rpm 离心 5min，上清稀释 2 倍后用过滤器 (0.45 微米 ) 过滤，最后用 HPLC 对烟碱进行定量检测 ( 表 1)。
     表1：根瘤菌 5-28 制剂降解烟叶中尼古丁的结果
     在本试验的条件下， 5-28 菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显，在 12h 内在液体反应液中降解 C3F 烟叶中 72.5％的烟碱。同时，对照组烟碱含量基本保持不变。因此，菌株 5-28 菌剂在烟草醇化和降解高浓度烟碱含量的烟草废弃物中都有潜在的应用价值。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102433276 A(43)申请公布日 2012.05.02CN102433276A*CN102433276A*(21)申请号 201110389039.3(22)申请日 2011.11.30CGMCC No.5443 2011.11.03C12N 1/20(2006.01)A24B 15/20(2006.01)B01D 53/84(2006.01)B01D 53/54(2006.01)C12R 1/41(2006.01)(71)申请人云南大学地址 650091 云南省昆明市翠湖北路2号(72)发明人杨金奎雷丽萍张克勤陈晨麻广慧(74)专利代理机构昆明今威专利。

2、商标代理有限公司 53115代理人杨宏珍(54) 发明名称一株根瘤菌及其应用(57) 摘要本发明涉及一株根瘤菌及其应用，属应用微生物技术领域。本发明由生产菌株液体发酵培养后得到。生产菌株为根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5-28，该菌株已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5443该菌株具有较强的尼古丁降解能力和尼古丁毒性抗性能力，能在高达2.5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂将纯烟碱完全降解，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，也能分解烟草废弃。

3、物中的尼古丁，减少卷烟对人体的危害和尼古丁对环境的污染的优点。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 3 页附图 1 页CN 102433280 A 1/1页21.一株根瘤菌，其特征在于根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5-28已于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.5443。2.权利要求1所述的根瘤菌，其特征在于该根瘤菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。权利要求书CN 102433276 ACN 102433280 。

4、A 1/3页3一株根瘤菌及其应用技术领域：0001 本发明涉及一株根瘤菌及其应用，属应用微生物技术领域。背景技术：0002 尼古丁(Nicotine)，俗称烟碱，是多种烟草的主要生物碱，是影响烟叶品质的重要因素之一，也是烟草工业废水和烟草废弃物中的主要有害成分。 0003 烟碱对人的中枢神经有强烈的刺激和麻痹作用，进入人体内90被肺部吸收，进入血液后6s即可到达大脑，它对人体最显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制，因此少量的烟碱可以使人兴奋，大量则会引起眩晕、呕吐甚至中毒死亡。适量吸烟可以使人记忆力增强；但过度吸烟则对人的神经系统产生抑制作用。烟碱还有使。

5、人精神安定和抗忧郁作用，对人的紧张情绪有一定的镇静作用。 0004 烟碱也是一种环境有毒物质，烟气环境中就含有大量的烟碱，同时烟草加工过程也会产生许多含高浓度尼古丁等生物碱的废物，这种废物被认为是“有毒的危险废物”，烟碱能溶于水，因此极易渗入到地下水中造成污染。因此有效地控制卷烟和环境中尼古丁的含量，对于维护人类健康有着深远的意义。 0005 国内卷烟企业目前贮存的上部烟叶较多，一般因其烟碱含量较高而难以较多用于叶组配方中。这个问题已引起有关方面的重视，如何降低这些烟叶中的烟碱含量是各卷烟企业所面临的一个现实问题，而当前国内研究较多的是如何从农业田间管理方面考虑降低烟碱以及通过化学途径来综合调。

6、节卷烟的烟碱。因此，在工业上开展利用微生物对烟草进行降解烟碱处理研究具有实际应用价值，可以提高烟叶资源的利用率，具有较高的经济效益和社会效益。 0006 目前，已有不少文献报道过微生物在烟草工业上的研究和应用情况，例如通过微生物的作用来降低烟碱的含量、制备天然香料和改善烟叶、再造烟叶及烟梗的内在品质等。而且，在未来的很长一段时间内，它仍将是烟草行业的一个热门研究课题和研究方向。发明内容：0007 本发明的目的在于提供一株根瘤菌及其应用，能够有效降低烟草中尼古丁的含量。 0008 本发明从云南省红河州弥勒县多年种植烟草的土壤样品中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌5-28，对其进行了形态学、。

7、生理生化性质和16S rRNA基因序列分析，鉴定结果表明该细菌属于根瘤菌属，该菌株命名为根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5-28。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2011年11月3日；保藏号为CGMCC No.5443。 0009 根瘤菌5-28菌株的主要形态特征和生理生化性质为： 0010 根瘤菌5-28菌落边缘整齐、呈乳白色、较粘稠。在显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色阴性，硝酸盐还原为阴性，接触酶试验为阳性，能液化吲哚，不能液化明胶，不能水解淀说明书CN 102433276 ACN 1024。

8、33280 A 2/3页4粉，甲基红(MR)实验阴性，苯丙氨基酸脱氨酶和乙酰甲基甲醇(V-P)实验均为阴性，柠檬酸盐利用实验为阳性，苯丙氨基酸脱氨酶实验为阴性。本菌株对葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露醇发酵不产酸。 0011 根瘤菌5-28菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物20F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1500R(5-GGTTACCTTGTTACGA CT-3)，以根瘤菌5-28的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的5-28菌株的部分16S rRNA基因序列1446bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序。

9、列的索引号为：JN700177。 0012 本发明按常规方法用常规设备制备。即将根瘤菌5-28扩大发酵培养后得到。 0013 本发明的根瘤菌应用于制备降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂中。 0014 本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，提高烟叶可用性，及能分解烟尘中的尼古丁，减少其对环境的污染的优点。附图说明：0015 图1为根瘤菌5-28耐受尼古丁的浓度实验结果。 0016 图2为根瘤菌5-28降解尼古丁的生长曲线。具体实施方式：0017 以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。 0018 本发明是这样实现的： 0019 1.根瘤菌5-28菌株的培养方法： 0020 1)试。

10、管斜面培养 0021 采用Luria-Bertani(LB)培养基，重量百分比配方为：1蛋白胨，1氯化钠，0.5酵母提取物，2琼脂粉。121灭菌25分钟，摆成斜面。接种Sinorhizobium sp.5-28，28培养24小时，获得试管种。 0022 2)液体扩大培养 0023 A.种子培养，重量百分比配方为：1蛋白胨，1氯化钠，0.5酵母提取物。121灭菌25分钟。接种Sinorhizobium sp.5-28试管种，28培养12小时，获得液体菌种。 0024 B.发酵培养基，1g尼古丁，0.26g K2HPO4.3H2O，0.8g KH2PO4，0.41g MgSO4.7H2O，0.1g。

11、 CaSO4H2O，0.0039g NaMoO4，0.005g FeSO47H2O，0.3g(NH4)2SO4，加水至1000mL，pH7.0。培养基初始pH7.0，接种量(体积百分比，v/v)2，转速150rpm，温度28。发酵培养24小时。 0025 2.根瘤菌5-28菌株耐受尼古丁浓度试验 0026 将培养12小时的液体菌种(OD6000.8)以1(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于尼古丁浓度梯度的发酵培养基中，尼古丁的浓度梯度为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L和4.5g/L，转速150rpm，。

12、温度28，培养48小时离心收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定OD600(图1)。说明书CN 102433276 ACN 102433280 A 3/3页50027 由图1的试验结果知：根瘤菌5-28菌株在本试验条件下，最适生长的尼古丁浓度为1.5g/L，最高尼古丁耐受浓度为2.5g/L。 0028 3.根瘤菌5-28菌株降解尼古丁的生长曲线 0029 将培养12小时的液体菌种(OD6000.8)以1(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于发酵培养基中，接种量1，转速150rpm，温度28，每隔2小时取菌液，用高效液相测定尼古丁含量，并测定。

13、OD600(图2)。 0030 由图2的试验结果知：随着根瘤菌5-28菌株在培养液中的OD600值增加，尼古丁的浓度也逐渐下降。 0031 4.根瘤菌5-28菌株降解尼古丁菌制剂的制备 0032 利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)进行悬浮，8000rpm离心15min收集菌体，重复两次，菌体细胞最后用50ml的缓冲液进行悬浮，即能用于降解尼古丁。 0033 5.根瘤菌5-28制剂的降解烟叶中尼古丁试验 0034 分别称取2g保山红大C3F烟叶，喷洒5ml菌制剂，三个重复，反应体系为30ml的5。

14、0mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于28、150rpm 摇床培养，每隔2h小时取样一次，12000rpm离心5min，上清稀释2倍后用过滤器(0.45微米)过滤，最后用HPLC对烟碱进行定量检测(表1)。 0035 表1：根瘤菌5-28制剂降解烟叶中尼古丁的结果 0036 0037 在本试验的条件下，5-28菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显，在12h内在液体反应液中降解C3F烟叶中72.5的烟碱。同时，对照组烟碱含量基本保持不变。因此，菌株5-28菌剂在烟草醇化和降解高浓度烟碱含量的烟草废弃物中都有潜在的应用价值。说明书CN 102433276 ACN 102433280 A 1/1页6图1图2说明书附图CN 102433276 A。

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