抗反馈抑制发酵方法及其在生产抗生素中的应用.pdf

发明内容

因此，本发明的目的是提供抗反馈抑制发酵方法，该方法
包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的
树脂。

本发明更尤其提供了抗生素的制备方法，该方法包括在分
泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所
述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗
生素产生量下降的反馈抑制。

有效量例如是0.05-20％(树脂体积/发酵体积)，优选
0.1-5％(树脂体积/发酵体积)，更优选约1-3％(树脂体
积/发酵体积)。该量可以分一次或多次添加。

所述生物包括所有可发酵的微生物，例如青霉菌，绛红小
单孢菌，头孢菌，链霉菌，链丝菌，枯草杆菌，小单孢菌，地
中海拟无枝酸菌等。

所述发酵末端产物例如包括抗感染的青霉素，红霉素，头
孢菌素，庆大霉素，万古霉素，链霉素，氯霉素，卡那霉素，
林可霉素，利福霉素等，以及抗肿瘤的正定霉素，争光霉素等。

所述发酵过程包括在发酵的初期和/或中期和/或后期。

所述树脂是抗反馈抑制载体，它是能够吸附目的抗生素或
生物制品的树脂。吸附树脂包括强酸性阳离子树脂(如带磺酸
基的苯乙烯阳离子树脂)，弱酸性阳离子树脂(如羧酸型弱酸性
树脂)，强碱性阴离子树脂(如带有季铵基团的酚醛树脂)，弱
碱性阴离子树脂(如环氧型树脂)。这些树脂是已知的，并且可
以从市场上购买到。

例如，聚苯乙烯阳离子吸附树商品有Dowex-50，
Amberlite，DiaionSK-1，732树脂等。

强酸性阳离子树脂如苯乙烯阳离子交换树脂可用于庆大霉
素，卡那霉素，新霉素，万古霉素等，弱酸性阳离子交换树脂
如羧酸型树脂可用于链霉素、利福霉素等。强碱性阴离子交换
树脂例如可用于头霉素，弱碱性阴离子树脂如环氧型树脂例如
可用于头孢菌素C。

特定抗生素选择何种树脂一般根据其酸碱性及强弱来决
定，这对本领域的技术人员来说是容易决定的。但是所用树脂
必须是物理和化学性安定的，并不对发酵本身产生负面作用。

吸附树脂可以分一次或多次(例如2-10次，优选3-5
次)在发酵的初期和/或中期和/或后期添加。每次的添加量可
以是任选的。添加的具体时间取决于具体的微生物，发酵条件
(温度、pH、总发酵时间等)等因素。例如和优选在总发酵时
间进行到2/10-4/10时，添加吸附树脂总量的1/4-1/2，
在总发酵时间进行到4/10-6/10时，添加吸附树脂总量的另
外1/4-1/2，在总反应时间进行到6/10-8/10时，添加吸
附树脂总量的最后1/4-1/2。

本发明的方法适用于所有微生物分泌的生物活性物质的制
备。

为了简便起见，以下以庆大霉素为例来说明本发明的具体
实施方式，应该指出的是，其它抗生素的生产可以类似地进行。

庆大霉素是一个控制感染的有效药物，尤其对绿脓杆菌，
肠道杆菌和金葡菌感染的疗效显著。庆大霉素是由绛红小单孢
菌生产的抗生素。它是一个多组分的氨基苷类抗生素，带有很
强的正电荷。本发明中发现了庆大霉素和绛红小单孢菌的结合
速度极快并形成物理性的反馈抑制。本发明首次展示对该种反
馈抑制的解决办法。

本发明的目的在于提高庆大霉素的产量，具体地讲是通过
采用新的发酵工艺排除物理性反馈抑制提高庆大霉素的发酵单
位。

本发明目的通过如下措施来实现：

1、庆大霉素效价测量

测量庆大霉素的生物效价的标准菌种为短小芽孢杆菌。将
已知效价的庆大霉素标准溶液和被检品溶液，在短小芽孢杆菌
生长的培养基上进行对照培养，产生透明的抑菌圈。比较标品
和被检品抑菌圈的大小，利用两剂量法计算，求出庆大霉素抗
菌效价。

2、反馈抑制的表现

(1)庆大霉素的生产累积量和发酵时间的关系

本发明中使用的菌种是绛红小单孢菌(Micromonospora
purpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，该菌保藏在美
国典型培养物保藏中心(American Type Culture
Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。
将绛红小单孢菌在如下的培养基中生长：玉米粉11克/升，
淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸
钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴
15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。从24小时后没隔12
小时取发酵液测量庆大霉素的发酵单位，全部发酵时间为90
小时。

图1显示庆大霉素的发酵单位和时间的对数成直线关系，
即随着发酵时间的延续，庆大霉素的积累速度在减小。该结果
说明庆大霉素的生产随着发酵时间的增加而受到抑制。

(2)庆大霉素的反馈抑制

为了分析是否是庆大霉素本身抑制了庆大霉素的生产速
度，在发酵途中(24小时)向培养液中添加庆大霉素(最终浓
度750单位/毫升)，观测庆大霉素的生产速度是否有变化。结
果展示添加组的庆大霉素积累和无添加组形成非平行关系(图
1)。

以上结果明确地说明在庆大霉素发酵过程中存在生产抑制
现象，而这种抑制是来源于庆大霉素本身，即庆大霉素的反馈
抑制。

3、抗反馈抑制发酵

综合上述结果，庆大霉素在绛红小单孢菌周围的积累，对
绛红小单孢菌形成了一个不利于向体外分泌新合成的庆大霉素
的物理性环境。

针对这一物理性质的反馈抑制，采取了物理方法加以排除。
抗反馈抑制发酵如下。绛红小单孢菌的培养基组成可以为：玉
米粉5-15克/升，淀粉10-50克/升，酵母粉或黄豆粉25-40
克/升，硝酸钾0.01-0.45克/升，碳酸钙2.5-7.5克/升，
硫酸铵0.1-3.5克/升，蛋白胨3.5-7.5克/升，氯化钴5-50
毫克/升，pH6.8-7.6。培养温度35-37℃。在发酵进行到24，
36，72小时的时候，分别加入0.05-5％(树脂体积/发酵体
积)可吸附庆大霉素的苯乙烯阳离子交换树脂(商品名
Dowex-50)。在不同的树脂加入量中，0.5％(树脂体积/发酵
体积)的效果为佳，如图2所示，增加了20％左右的发酵效率。
同类树脂，商品名Amberlite，DiaionSK-1和732树脂发
挥了同样的效果。

4、庆大霉素的纯化

常规的庆大霉素纯化方式是向发酵液中加入硫酸使pH降
为.5进行酸化处理，溶解绛红小单孢菌以便释放出庆大霉
素。在1小时后用氢氧化钠中和到pH6，8，加入1.5％(树脂
体积/发酵体积)苯乙烯阳离子交换树脂吸附庆大霉素，然后
过滤分离出树脂。因本发明在庆大霉素发酵过程中，已经使树
脂(商品名Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1和732
树脂)和庆大霉素结合，不需用硫酸对发酵液进行pH1.5的强
酸化处理，在庆大霉素的纯化过程中节省了大量的酸和碱，有
利于环保和降低成本。本发明可直接从发酵液中过滤分离出吸
附了庆大霉素的树脂，或者只需加入少量的硫酸调节pH为3.5
至7.0使发酵液的粘度降低以利于过滤分离树脂。得到的树脂
经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后
用高浓度氨水(1摩尔)解离。

本发明之抗反馈抑制发酵法可以在其他抗生素或分泌型生
物制品的制造中应用。其改变处为添加能够吸附目的抗生素或
生物制品的树脂。但是所用树脂必须是物理和化学性安定的，
不对发酵本身产生负面作用。