用病毒载体稳定转导细胞的方法 【技术领域】
本发明涉及用病毒载体稳定转导细胞的方法和组合物。该方法通过让待转导细胞与一个或多个细胞表面结合性分子接触来提高转导率。所述接触步骤可在病毒载体导入细胞之前、之后或期间进行。本发明还涉及这种稳定转导的细胞在其他领域中的应用，包括载体所载核酸的表达或活生物体的治疗。
背景技术
“转染”总指将遗传物质导入细胞的技术，它对于生物学领域内分子和重组技术革命具有重大贡献。用于高等真核细胞的转染技术包括例如磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖处理，电穿孔，显微注射，脂质转染、病毒转染，以及多种科学书籍和杂志中的其他方法。
其中，病毒转染的独特性在于利用了病毒将其遗传物质导入细胞的天然机制将目的核酸分子转移到细胞内。修饰后用于此类技术的病毒包括例如：腺病毒，腺-相关病毒，单纯性疱疹病毒和逆病毒。通常，将感兴趣的核酸分子克隆到病毒基因组中。当病毒基因组复制和包装后，所得的病毒粒子就能够通过病毒的进入机制将目的核酸传递到细胞内。
通常，在加载目的核酸之前需要通过核酸操作造成病毒基因组的复制缺陷。所得的病毒基因组或病毒载体需要辅助病毒或包装系统来完成病毒粒子的组装和从细胞内释放。当用病毒载体或病毒粒子将遗传物质转移到细胞内时，这样的技术称之为“转导”。因此，细胞“转导”一般指用病毒载体或病毒粒子将遗传物质转移到细胞内。
在转导技术中，用逆病毒进行哺乳动物细胞的基因改造已为人所关注。尤其受到关注的是用修饰逆病毒将遗传物质导入细胞来治疗基因缺陷等疾病。这种方法地一个例子可见于造血系统细胞，其中，逆病毒和慢病毒已成为众多研究的的主题。
Movassagh等结合活化T细胞生命周期的研究结果论述了他们试图提高逆病毒介导的转导率的研究。因此，他们的结论依赖于转导过程中活性细胞的分裂(division)。而且，他们的研究仅限于使用小鼠致癌逆病毒，并且，在转导前必须对细胞进行大量预激。
June等(WO96/34970)用T细胞刺激来提高T细胞转染率。用活化细胞或激活细胞进行的T细胞转导还包括Douglas等，Hooijberg等，Onodera等，Klebba等，Barry等和Unutmaz等的研究。不幸的是，这些工作都没有证明实现了约65％以上的转导率。
Costello等用人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)进行了激活和非激活T细胞的转导。据其观察，激活的原始T细胞的转导率最高为17％左右，低于非激活T细胞的19％。他们还发现，当存在HIV-1辅助蛋白时，激活T细胞内的转导率可获得有限的提高，即不超过36％。
Chinnasamy等发现，在HIV-1辅助蛋白存在下，非激活和用分裂素激活的T细胞的转导率都有所提高。和Movassagh等一样，Chinnasamy等在用慢病毒载体进行转导前对血淋巴细胞进行了长时间的预激。虽然Chinnasamy等在转导后3天发现最初转导率超过96％，但两周后，稳定转导细胞的百分比降至71.2％。Haas等也在用能表达标记物基因(绿荧光蛋白)的慢病毒载体转导的细胞内观察到了瞬时转导和“假转导”现象。根据标记物基因在接受转导的原代CD34+脐带血细胞内的非整合性表达，转导后3天仍检测到明显(10％以上)的瞬时转导。转导后7天，仍可观察到5％左右的此类瞬时转导引起的表达。直到10天后，瞬时转导引起的表达情况才与用无标记物载体转导的细胞内的相仿。
所以，Chinnasamy等虽然采用细胞因子进行了细胞预激，仍没能实现原代淋巴细胞71.2％(两周后转导率)以上的稳定转导，所谓稳定转导即病毒载体整合到被转导细胞的染色体DNA内。而且，根据Chinnasamy等的描述，他们没能实现用不表达辅助蛋白(Vif，Vpr，Vpu和Nef)的HIV载体向非激活淋巴细胞内的明显转导(转导后14天的效率仅为3.6％)，虽然这些细胞在转导后接受了PHA分裂素和IL-2细胞因子的刺激。虽然，用非激活细胞和含辅助蛋白的载体使转导率有所提高，但是，不论是否将刺激与载体联用，激活或非激活细胞在转导后第14天的稳定转导率都不超过75％。
Hass等也观察到了慢病毒载体稳定转导率低的现象，他们用原代CD34阳性脐带血细胞获得的转导7天后最大稳定转导率不到25％。出人意料的是，即使采用极高感染复数或载体浓度，例如高达9000的感染复数(MOI)和高达108感染单位/ml的载体浓度，也未能提高该25％的转导率上限。
Follenzi等也在白介素-3(IL-3)，白介素-6(IL-6)和干细胞因子(SCF)三种细胞因子混合物存在下用非常高的MOI 500来转导细胞。值得注意的是，这种混合物的使用将使这些细胞不适合用于人类临床移植。
因此，目前仍然需要更有效的方法来实现载体向细胞内的高频稳定转导。此外，还需要更有效的方法转导非激活细胞，使之既可用作研究工具又可用作治疗剂。
以上对参考文献的引用并不表示承认它们即相关现有技术。所有对日期或主要内容的引用都是基于申请人尽其所能获得的信息，当并不担保它们的准确性。
【发明内容】
本发明提供用病毒载体和病毒粒子对细胞进行稳定转导的高效方法和组合物。“稳定转导”指病毒载体整合到受转导细胞的染色体DNA内。本发明方法包括使待转导细胞与至少一种细胞表面结合性分子接触。该接触步骤可在该细胞与病毒载体或病毒粒子接触之前、之后或期间进行。“病毒载体”指用于通过转导将遗传物质转移到细胞内的，由病毒获得的各种形式的核酸，这包括病毒的核酸，例如DNA和RNA，这些核酸的被包裹形式，其中包有病毒核酸的病毒粒子。
本发明还包括转导细胞在其他领域的应用，例如通过表达载体内的核酸来生产有用的基因产物和蛋白质，或用于治疗疾病患者或疾病的危发个体，尤其是人。
与待转导细胞表面结合的至少一种分子包括各种可与细胞表面受体、标记或其他可识别部分发生物理相互作用的分子。原则上，任何可结合于细胞表面的分子都可用于高效转导。在一般理论之外，本发明认为，细胞表面结合性分子可使宿主细胞的染色质更易接受DNA整合；更易使病毒载体优先整合到一个利于载体基因表达的位点；促进含核酸的衣壳进入细胞质；促进病毒穿越细胞膜或内含体之类胞内膜结构；或使细胞更易接受病毒载体带入的遗传物质进入细胞核。本发明方法包括一种以上的上述可能性。此外，从以上可能性的数量和多样性可以看出，本发明不局限于任何单一理论。相反，鉴于本发明100％稳定转导和被转导细胞用于人类疾病治疗无副作用的惊人超过，应将本发明视为开辟了人类细胞治疗的新领域。
然而，并非所有细胞表面结合性分子都能实现病毒载体的有效稳定转导。例如，如果与细胞表面分子的结合诱导的是细胞凋亡，则结果不是有效的细胞转导而是细胞死亡。虽然细胞死亡是有意杀死细胞(例如肿瘤细胞)所期望的结果，但并非用含有酬载基因或核酸序列的载体稳定地转导细胞所期望的。较好的细胞表面结合性分子应使得细胞更易接受病毒载体的转导。此类分子的例子包括特定细胞表面受体或其部分的抗体以及该受体的配体或结合性结构域。此外，抗体的抗原结合性片段，例如Fab和Fv片段，也可用于本发明。所述特定细胞表面受体的结合性结构域可包含一个或多个表位。
本发明优选的细胞表面结合性分子是抗CD3和抗CD28，它们结合T细胞从而使之更易为载体所转导。其他优选的细胞表面结合性分子是FLT-3配体，TPO和Kit配体之受体的抗体或配体，它们可使表达此类受体的细胞，例如造血干细胞更易为载体所转导。其他优选细胞表面结合性分子还包括GM-CSF和IL-4受体的抗体或配体，它们可使树状细胞或其前体，例如单核细胞，CD34阳性干细胞，或已分化的树状细胞系后代细胞更易为载体所转导。其他细胞表面结合性分子还包括位于一细胞表面上结合另一细胞表面的分子。
细胞表面结合性分子的其他例子还包括多肽，核酸，糖，脂类和离子，它们都可以是与其他物质相络合的状态。较好的是，此类分子结合血细胞表面上的因子，例如CD1a，CD1b，CD1c，CD1d，CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CDw12，CD13，CD14，CD15，CD15s，CD16a，CD16b，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD32，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD39，CD40，CD41，CD42a，CD42b，CD42c，CD42d，CD43，CD44，CD45，CD45R，CD46，CD47，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD51，CD52，CD53，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64，CD65，CD66a，CD66b，CD66c，CD66d，CD66e，CD66f，CD67，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CD79α，CD79β，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD87，CD88，CD89，CD90，CD91，CDw92，CD93，CD94，CD95，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD102，CD103，CD104，CD105，CD106，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD114，CD115，CD116，CD117，CD118，CD119，CD120a，CD120b，CD121a，CD121b，CD122，CD123，CDw124，CD125，CD126，CDw127，CDw128a，CDw128b，CDw130，CDw131，CD132，CD133，CD134，CD135，CD136，CDw137，CD138，CD139，CD140a，CD140b，CD141，CD142，CD143，CD144，CDw145，CD146，CD147，CD148，CDw149，CD150，CD151，CD152，CD153，CD154，CD155，CD156，CD157，CD158a，CD158b，CD161，CD162，CD163，CD164，CD165，CD166和TCRζ。小写字母(例如a或b)表示由多基因产物构成的复合CD分子或表示属于结构相关蛋白家族。“w”表示还未被完全确认的推定CD分子。更完全的CD分子列表可见于Kishimoto，T.(编辑)。当前有关CD分子还可参见Shaw，S.(编辑)蛋白质网站：http：//www.bsi.vt.edu/immunology上的全球WWW资源/杂志。
更好的是结合淋巴细胞、T细胞和白细胞表面因子的分子，所述表面因子例如CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD11a，CD18，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD37，CD38，CD39，CD43，CD44，CD45R，CD46，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD53，CD54，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD62L，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD73，CDw75，CDw76，CD84，CD85，CD86，CD87，CD89，CD90，CD94，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD103，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD118，CD119，CD120b，CD121a，CD122，CDw124，CDw127，CDw128a，CDw130，CD132，CD134，CDw137，CD140a，CD140b，CD143，CD146，CD148，CD152，CD153，CD154，CD155，CD161，CD162，CD165，CD166和TCRζ。
适用于本发明的其他细胞表面结合性抗体和分子可参见Linscott的《免疫上生物试剂的发现》(第11版)，2000年1月，W.D.Linscott，Petaluma，CA。本发明部分实施例中，细胞表面结合性分子不是细胞因子。
虽然本发明可采用可溶性细胞表面结合性分子来促进载体转导，但也有其他优选实施方式采用固定化的细胞表面结合性分子。较好的是固定化的抗体。或者，可利用表达该细胞表面结合性分子的其他细胞来进行固定化。有效转导造血干细胞的优选方法是采用骨髓基质细胞，在它们的表面表达能在转导期间促进干细胞维持但不分化的配体。刺激细胞不限于天然细胞，任何细胞都可以经基因改造而表达合适的细胞表面结合性分子从而提高转导所需的适当刺激。
还可以采用提高或增强所述至少一种细胞表面结合性分子结合能力的其他分子。例如，可将某特定细胞表面受体的(第一)抗体可溶形式与第二抗体联用，该第二抗体与已结合于细胞表面的第一抗体交连。
当然，任何细胞都可用于本发明。较好的是，受转导细胞是真核细胞，更好的是，原初细胞(primary cell)。然而，细胞系也可用本发明方法来转导，有时还更易转导。一优选实施方式中，受转导细胞是原初淋巴细胞(例如T淋巴细胞)或巨噬细胞(例如单核巨噬细胞)或它们各自的前体细胞，例如造血干细胞。其他优选受转导细胞一般说来是造血系统细胞，即通过造血过程形成的细胞，它们的前体细胞，以及与血细胞功能相关的细胞。此类细胞包括造血形成的粒细胞和淋巴细胞以及祖代多能细胞，淋巴样细胞和髓样干细胞。与血细胞功能相关的细胞包括协助免疫系统细胞行使功能的细胞，例如树状细胞之类抗原呈递细胞，内皮细胞，单核细胞和郎格汉斯细胞。优选实施方式中，所述细胞是T淋巴细胞(即T细胞)，例如表达CD4和CD8标记的T细胞。
特别优选的实施方式中，所述细胞是原初CD4+T淋巴细胞或原初CD34+造血干细胞。然而，既然本发明所用的病毒载体可以是水疱性口炎病毒被膜G蛋白(见后文)制成的假型，所以，各种细胞都可用本发明方法转导。这样的细胞包括但不限于星形细胞、皮肤成纤维细胞，表皮细胞、神经元、树状细胞、淋巴细胞、免疫反应相关细胞、囊状内皮细胞、肿瘤细胞、肿瘤囊状内皮细胞、肝细胞、肺细胞、骨髓细胞、抗原呈递细胞、基质细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、肾细胞、卵细胞或精子细胞(例如用于制造转基因动物)，参与种系发生的细胞，胚胎多能干细胞或其祖细胞，包括血小板和红细胞之类无核的血细胞等。较好的是，所述细胞来自真核多细胞物种(例如与单核酵母细胞相反的细胞)，更好的是，哺乳动物细胞，例如人细胞。
受转导细胞可以单独存在，也可以包括在一大群细胞内。此类“大细胞群”可以包含例如(混合或纯)细胞培养物，组织(例如表皮、基质或其他组织)，器官(例如心脏、肺、肝、胆囊、膀胱、眼睛及其他器官)，器官系统(例如循环系统，呼吸系统，泌尿系统，神经系统，皮肤系统或其他器官系统)，胚泡，来自胚胎的胚胎干细胞(例如用于治疗遗传缺陷/疾病，或用于制造转基因动物)，病患组织，例如肿瘤或感染部位，或生物体(例如禽类，哺乳动物，海洋生物，鱼类，植物等)。较好的是，作为转导靶的器官/组织/细胞来自循环系统(包括但不限于心脏、血管和血液)，呼吸系统(例如鼻，咽，喉，气管，支气管，肺等)，胃肠系统(例如口，口腔组织，咽，食道，胃，小肠，唾液腺，胰腺，肝，胆囊等)乳房系统(例如乳房上皮细胞和组织内的支持细胞)，泌尿系统(例如肾，子宫，膀胱，尿道等)，神经系统(包括但不限于脑，脊索和特殊的感受器官，例如眼睛)和外皮系统(例如皮肤)。
更好的是，受转导细胞选自以下来源：心脏，血管，包括肿瘤血管和与感染或病患组织相关的血管，骨髓，血液，脑，淋巴组织，淋巴结，脾脏，肺，肝，胆囊，膀胱和眼睛。本发明一具体实施方式中，受转导细胞与最终所用的宿主细胞自体同源，但是，与宿主细胞同种异体、部分错配、完全错配、甚至异种的细胞也可使用。而且，受转导的可以是适用于任何宿主，包括人类相关物种，的通用供体细胞，与物种例如人相关组群。后一种实施方式在细胞、组织或器官移植中尤其重要，此类应用中，受转导细胞的来源可能成为移植成败的关键。
适合用本发明方法转导的另一类优选细胞是肿瘤细胞，病患细胞，或因其遗传特性或同生物体内其他细胞的遗传特性而易随时间发生变异的细胞。后一种实施方式允许将本发明的转导细胞用于疾病的预防。乳房癌是此类疾病的一个例子，其预后指标指示可用本发明转导细胞进行治疗从而在病发前及早给予基因干涉。然而，本发明方法也可用于乳房癌被测出后的治疗。本发明在癌症治疗领域还有许多其他用途，本领域熟练技术人员无需过多试验即可将本发明方法用于多种癌症的治疗。
作为例子而非局限，本发明用途之一是用于雌激素依赖性乳房癌。将结合雌激素受体的抗体或配体与治疗用病毒载体联合可使雌激素依赖性乳房癌中的癌细胞被优先转导。所述载体可包含，例如，抑肿瘤基因，例如疱疹病毒腺苷激酶基因。这样，可通过添加9-(1，3-二羟基-2-丙氧甲基)鸟嘌呤—一种可被疱疹胸苷激酶激活的前药—来选择性地杀死转导细胞。抑肿瘤基因和相应前药的例子还有许多，并且是本领域所熟知的，本领域技术人员无需过多试验即可做出适当选择。将可活化前药与本发明转导方法联用可广泛用于其他类型的肿瘤，以上举例并非将本发明局限于激素依赖型，可溶性生长因子或增殖因子依赖型肿瘤。
例如，Her-2/neu阳性肿瘤细胞没有雌激素依赖性，而且不是好的预后指标，因为包含此类细胞的非雌激素依赖性肿瘤对于紫衫酚—一种雌激素拮抗剂—之类的药物治疗具有很强的抗性。本发明的优选实施方式之一是在例如骨髓移植方案中，病毒载体制剂中包含结合Her-2/neu或heregulin的抗体或其他分子来用于转导染上肿瘤的细胞。或者，可用能减弱肿瘤发生的载体直接对肿瘤部位转导或向血管内转导。
本发明的另一实施方式仅针对肿瘤脉管系统，或同时针对肿瘤细胞。St Croix等已用SAGE分析法确定了与正常内皮细胞相比在肿瘤内皮细胞内特异性过量表达的基因。许多此类基因编码Thy-1细胞表面抗原或Endo180凝集素之类细胞表面分子。被上调的细胞表面因子都可能被本发明所述细胞表面结合性分子所结合，从而刺激有效且稳定的基因转导。因此，肿瘤治疗的方法之一可以是在选择性结合肿瘤脉管而不结合正常内皮细胞的细胞表面结合性分子存在下，用治疗性病毒载体转导肿瘤内皮细胞，由此杀死这些内皮细胞，继而破坏肿瘤脉管系统。
本发明另一实施方式是在病毒载体内包含选择性地在肿瘤而非正常脉管内皮细胞内促进抗肿瘤基因表达的元件(例如作用于mRNA的启动子或顺式作用稳化/降解元件)，从而选择性地在肿瘤脉管系统内引起该抗肿瘤基因的表达。此类方法可体外(ex vivo或in vitro)或体内(in vivo)进行。如果是针对肿瘤脉管内皮，则优选体内治疗方式。或者，如果目标是清除骨髓内污染性肿瘤细胞以利骨髓移植，则优选体外(ex vivo或in vitro)治疗方式。
此外，体内应用不局限于疾病状态，它们还可用于转导正常细胞。例如，本发明可用于体内转导骨髓内的造血干细胞。在将载体直接注入骨髓时，可加入抗体或其他细胞表面结合性分子—例如FLT-3配体、TPO和Kit配体或它们的功能性类似物，或表达所述细胞表面结合性分子的基质细胞的各种组合物，用于实现高效的骨髓转导。“功能性类似物”指各种保留了本发明细胞表面结合性分子的细胞表面结合活性的分子。此类功能性类似物包括FLT-3配体、TPO和Kit配体的片段；含有一处或多处氨基酸取代、插入或缺失的FLT-3配体、TPO和Kit配体分子；和可模拟细胞表面结合性分子的细胞表面结合活性的抗体。
实现上述目的的另一种方式是采用骨髓基质细胞作为病毒载体的生产者细胞，这样，通过细胞治疗而非载体制备来提供载体和细胞表面结合性分子。另一个例子是通过在载体之外添加CD3或CD28抗体或GM-CSF和IL-4各自的功能性类似物，通过皮下注射进行的T细胞或树状细胞转导。皮下组织内的淋巴液会将载体和刺激物排入淋巴结，从而实现靶细胞的有效转导。
本发明的优点包括不一定需要纯化待转导细胞。通过选择待结合细胞的表面结构可实现对基本上同类型细胞的转导。这样，在一群混合血细胞中，用CD3特异性抗体与细胞相互作用可增强CD3表达细胞—例如某些T细胞—的转导，并在该细胞群中表现为相对于不表达CD3的其他类型细胞—例如粒细胞和单核细胞—的优先转导。
本发明还包括转导根据需要已预先纯化或分离的细胞类型。采用纯化或分离后细胞类型的优点包括例如转导率更高，因为载体相对于待转导细胞的比例提高了。
欲转导纯化T细胞时，最好至少有一种分子与T细胞的表面分子结合。此类细胞表面分子的例子包括CD3，CD28，CD25，CD71和CD69。结合这些细胞表面分子的分子的例子包括识别这些分子的抗体和单克隆抗体，其中许多可以买到，或可按照标准方法方便地制得。在一转导CD4+或CD8+细胞的优选实施方式中，可采用识别CD3和/或CD28的单克隆抗体。可买到的此类抗体包括例如识别CD3的OKT3和识别CD28的CD28.2。这些抗体可以可溶形式使用，此后可能会与其他分子交连，也可以固定化形式—例如固定于微珠或其他固体表面上—使用。在本发明一特别优选的实施方式中，抗体被固定在用于病毒介导转导的容器的表面上，例如组织培养管的管、板或袋的壁上。抛开理论所述，使用固定于细胞与之粘附或接触的表面的抗体可提高细胞表面上细胞表面相互作用的局部浓度。
欲转导造血干细胞时，可采用FLT-3配体，TPO(血小板生成素或巨核细胞生长及发育因子)或Kit配体的造血干细胞受体的特异性抗体，也可采用干细胞阳性细胞标记(包括但不限于CD34或AC133)的抗体。采用含配体化合物或组合物作为细胞表面结合性分子时，可采用完整的天然含配体蛋白质、配体或与异源蛋白质结合的配体，既可使用其可溶形式，也可使用其固定化形式。固定化形式包括利用亲和素/生物素等直接或间接结合在微珠上。
或者，可在病毒载体的被膜内表达配体，其形式可以是嵌合或融合蛋白和/或与一种或多种其他蛋白质(共价或非共价)复合。此类实施方式中，细胞表面结合性分子与病毒载体共同构成单一组合物用于转导细胞。可在病毒被膜内表达的细胞表面结合性分子还包括例如前述各种表面因子。
其他优选的细胞表面结合性分子—例如抗体或其片段—是与Nortch或Delta的造血干细胞受体结合的分子，或是Notch或Delta蛋白质本身，或是与异源蛋白结合着的Notch或Delta的配体。Notch和Delta编码的细胞表面蛋白在果蝇发育过程中影响着众多的细胞决定。脊椎动物的Notch和Delta同源体对于正常的胚胎发育至关重要。Delta同源体是参与造血调节的重要因素。Delta-Serrate-lag2(DSL)是一种同源体的可溶形式，它可增强原初造血细胞前体的扩增。DSL与造血细胞生长因子—例如白介素-3(IL-3)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)—一起能促进原初造血祖细胞的扩增，同时，抑制原始前体分化为仅响应IL-3的更成熟的前体细胞(参考Han等所述)。DSL的作用机制很可能是：激活造血细胞内表达的Notch受体，通过选择性地阻抑细胞分化来调节细胞感受态以对周围的造血细胞生长因子而非扩增因子作出反应(参考Han和Moore，《血液》，1999)。所以，Delta和Notch同源体和作为它们功能性类似物的抗体也是优选的细胞表面结合性分子，载体转导细胞的效率可达75％以上，尤其是对造血干细胞的转导。
本发明包括用于所述方法的病毒载体和包含所述病毒载体的组合物。所述载体优选逆转录病毒(逆转录病毒科)载体，尤其是慢病毒载体。也可采用其他逆转录病毒，例如瘤病毒和鼠逆转录病毒载体。还可以是来自其他DNA病毒或可在生命周期某时刻将其基因组转为DNA的病毒的载体。较好的是所述病毒属于腺病毒科，微小病毒科，肝DNA病毒科(包括肝炎δ病毒和一般不归为肝DNA病毒的戊肝病毒)，乳多孔病毒科(包括多瘤病毒和乳头瘤病毒)，疱疹病毒科和痘病毒科。
逆转录病毒科的其他病毒属于以下属或亚科：瘤病毒，泡沫病毒和慢病毒。瘤病毒亚科的RNA病毒最好是人1型或2型T-嗜淋巴病毒(即HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)，鸟类造白细胞组织增生-肉瘤病毒(例如Rous肉瘤病毒(RSV)，鸟类成髓细胞血症病毒(AMV)，鸟类成红细胞增多症病毒(AEV)和Rous相关病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)，哺乳动物C型病毒(例如莫洛尼小鼠白血病病毒(MuLV)，Harvey小鼠肉瘤病毒(HaMSV)，Abelson小鼠白血病病毒(A-MuLV)，AKR-MuLV，猫白血病病毒(FeLV)，猿肉瘤病毒，网状内皮组织增生病毒(REV)，脾坏疽病毒(SNV)，B型病毒(例如小鼠乳房瘤病毒(MMTV))和D型病毒(例如Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。
慢病毒亚科的RNA病毒最好是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2，其中HIV-1过去又称淋巴结病相关病毒3(HTLV-III)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关病毒(ARV))或其他已知与AIDS或AIDS样疾病相关的与HIV-1或HIV-2有关联的病毒。首字母缩写“HIV”或“AIDS病毒”或“人免疫缺陷病毒”在此都指HIV病毒，HIV相关病毒。而且，慢病毒亚科的RNA病毒最好是绵羊脱髓鞘性脑白质炎/病毒性羊进行性肺病病毒(例如感染绵羊)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，牛慢病毒，猿免疫缺陷病毒(SIV)，马传染性贫血病毒(EIAV)和公羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。
尤其好的慢病毒载体是HIV类载体，尤其是HIV-1或HIV-2类或其组合。当然，逆转录病毒(尤其是HIV)的不同血清型可单独或混合用来制备用于本发明的载体。本发明优选的载体含有存在于野生型病毒但不存在于“基本”慢病毒载体中的顺式作用元件。“基本”慢病毒载体只含有最基本的LTRs和位于5′前导序列中的包装序列和gag编码序列，但可以可选性地包含可促进载体RNA以Rev依赖性方式向核外转移的RRE元件。优选载体还包含增强细胞转导率的核苷酸序列。
此类载体的一个例子是pN2cGFP，它含有完整的gag和pol。另一个例子是含有pol内4551-5096位(pNL4-3中的位序号，编号M19921，HIVNL43 9709bp，由C.E.Bucher提供，NIAID，NIH，Bethesda，MD)序列的载体。然而，能够提高载体转导效率的任何野生型(wt)HIV来源的顺式作用元件都可采用。能够通过本发明方法进行有效转导的载体的其他例子是美国专利5,885,806的cr2HIV构建体。
此前认为尚不足以显著提高转导率的一段序列，即Zennou等(2000)记载的中央DNA翼(central DNA flap)(pLAI3内4793-4971位片段，相对于pNL4-3内的4757-4935位)能够提高转导率。本发明包括以下发现：虽然以上小片段不足以提高转导率，但一段更大545pb片段(pNL4-3内4551-5096位)或包含该片段的更大片段能够提高转导率。
可用于本发明的其他病毒载体构建体可参考美国专利5,885,806。该专利中的构建体只是举例，可有效转导细胞的载体并不仅限于此。相反，这些构建体给予本领域技术人员的其他启示是，可用于本发明的病毒载体既可包含来自野生型病毒的基本序列，也可包含大到野生型病毒完整基因组的序列，但不包含复制和/或致病必需序列。准确确定有效转导必需序列的方法属于本领域众所周知的常规方法。例如，可系统性地将病毒序列返回到“基本”载体中，或从包含近完整HIV基因组的载体(例如cr2HIV)中制造连续缺失，这些都是本领域所熟知的。
此外，将其他病毒骨架中的序列放入目标载体(例如巨细胞病毒(CMV))中也是本领域的已知技术。不论使用的究竟是何病毒载体，如果该病毒遗传物质所编码的各种辅助蛋白以及所含的序列能够提高在某些类型细胞内的转导率，则可以留在载体或辅助者(helper)基因组中。本领域已有多种常规筛选方法可通过将序列插入载体或辅助者的基因组中来确定该遗传物质是否可提高转导率。本发明的优选实施方式之一在载体或辅助者的基因组内都未包含辅助蛋白。但这一优选实施方式并不排除本发明在载体或辅助者基因组内保留辅助蛋白或其他序列以提高转导率的实施方式。
本发明所用病毒载体还可以通过“假型(pseudotype)”形成来获得，其中，用不同的病毒共转染细胞，产生的后代病毒粒子含有一个病毒的基因组但包裹在含有一种或多种其他病毒外膜蛋白的外层内。这种现象已被用来将目标病毒载体包装成“假型”病毒粒子，即用目标病毒载体和编码至少一种其他病毒外膜蛋白或细胞表面分子的遗传物质共转染或共传染包装细胞。参考美国专利5,512,421。这样的混合病毒可用所用异源外膜蛋白之一或多种的抗血清来中和。常用于假型形成的一种常用病毒是水泡性胃炎病毒(VSV)，它属于棒状病毒科。假型化引入了异源病毒的进入机制，因而拓宽了病毒的宿主细胞范围。
对本发明所用病毒载体和VSV进行假型化可得到这样的病毒粒子，其病毒载体核酸包裹在核衣壳内，核衣壳则被含有VSV G蛋白的膜包围。所述的核衣壳宜包含通常与病毒载体相关的蛋白。含VSV G蛋白的外围膜当病毒载体从用来包装的细胞内转移出来后即成为病毒粒子的一部分。包装细胞的例子可参考美国专利5,739,018。本发明优选实施方式之一中，所述病毒颗粒来自HIV，并用VSV G蛋白假型化。含VSV G蛋白的假型病毒颗粒可感染多种细胞类型，其效率高于两亲病毒载体。宿主细胞的范围包括哺乳动物和非哺乳动物细胞，例如人、鼠、鱼、爬行动物和昆虫的细胞。
用于本发明转导方法的病毒载体还可以在该病毒的启动子或异源启动子下包含和表达一种或多种核酸序列。所述启动子还可以包含隔离元件，例如红细胞系DAN酶超敏位点，使之与操纵子侧接，以实现密切调控下的基因表达。优选启动子包括HIV-LTR，CMV启动子，PGK，U1，E-B病毒的EBER转录单元，tRNA，U6和U7。虽然Pol II启动子是优选，但Pol III启动子也可用。组织特异性启动子也是优选的。例如，β珠蛋白基因座调控区增强子和α与β珠蛋白启动子可实现在红细胞和红细胞系细胞内的组织特异性表达。另一优选实施方式是使用与启动子相关的顺式作用序列。例如，可用U1基因来增强反义基因的表达，其中的非启动子序列用于将反义序列或核酶定向于已剪切的目标RNA，参见美国专利5,814,500。
当然，可在本发明病毒载体中引入任何病毒顺式作用核苷酸序列，尤其优选逆转录病毒基因组内的顺式作用序列。例如，可将自gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat或rev基因衍生的顺式作用核苷酸序列引入本发明病毒载体以进一步提高转导率。较好的是，顺式作用序列不编码表达多肽；不会表达成为多肽或其部分，因为存在基因缺失，例如翻译起始位点缺失；只编码一个大多肽的一部分或片段；或相对天然序列含有一处或多处取代、插入或缺失的突变序列。顺式作用序列的一个例子是在HIV pol内的cPPT(中央聚嘌呤段)序列。
所述本发明病毒载体内的一段或多段序列可以是该载体源病毒内的，也可以是异源序列。所述序列最好是(编码)目标基因产物的全长或部分序列。此类序列和基因产物最好是能够在细胞内产生某种生物学效应的生物活性物质。此类物质的例子包括蛋白质、核糖核酸、酶、转运蛋白或其他生物活性分子。
优选实施方式之一中，所述生物活性物质是蛋白质，例如毒素、转录因子、生长因子或细胞因子、结构蛋白或细胞表面分子。所述蛋白质可包含一个或多个功能未知的结构域并可以转导细胞的同源蛋白。此外，所述蛋白也可以是待转导细胞内没有、缺乏或改变了的。或者，所述蛋白可以是转显性(transdominant)阴性突变蛋白或饵蛋白，用来阻止某天然蛋白在转导细胞内表现其正常活性。
例如，所述核酸序列可编码核酶，该酶在转导细胞内结合、剪切并破坏已表达或待表达的RNA。或者，所述核酸序列编码特定核酸序列的反义分子，造成其变性。载体所含序列可以在转导细胞内过表达，诱导性表达或在细胞或病毒调控性转录调控下表达。根据目标用途，异源序列可编码任何所需蛋白，例如转导细胞的标记。此类标记包括可选标记，例如特定的抗性表型(例如新霉素抗性)，MDR-1(P-糖蛋白)，O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，乙醛脱氢酶(ALDH)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，超氧化物歧化酶(SOD)和胞嘧啶脱氨酶。参考Koc等所述。
在本发明方法中，待转导细胞在用病毒载体转导之前、之后或同时与至少一种细胞表面结合性分子接触。例如，可在加入转导所用病毒载体之前、之后或同时将细胞培养在含有CD3和CD28抗体(包被在培养皿的表面，或固定在培养基内的微珠上)的培养基内。较好的是，细胞只在初次接触病毒载体之后或当时与固定化的CD3和/或CD28接触。此类情况下，在用病毒载体进行实际转导之前，细胞不与细胞表面结合性分子接触。在细胞经病毒载体转导后与细胞表面结合性分子接触的实施方式中，所述接触最好发生在转导后3天内，1、2天内更好。
细胞与病毒载体共培养的时间可以不同，这取决于所用的条件和材料。影响培养时间的因素包括所用细胞、载体和MOI(感染复数)，用来细胞表面结合性分子及其数量，这些分子是固定化的还是溶解形式的，如何固定化和溶解的，所需的转导率。较好的是培养约8-72小时，以12-48小时为佳。尤其好的一种实施方式中，培养时间为24小时，并可以重复一次。
待转导细胞与病毒载体至少接触一次，但可以多于一次，这取决于细胞类型。例如，已经通过多次载体转导实现了对CD34阳性干细胞的高效率转导。本发明的优选方法之一同时加入病毒载体和细胞表面结合性分子(例如CD3和/或CD28抗体或FLT-3配体，TPO或Kit配体)，并在转导后约1-8天内不更换培养基。更好的是，转导后3天内不更换培养基。转导过程的时间尽可以长，只要条件允许，且过程本身对细胞或细胞所在生物体没有明显影响。适合此类用途的细胞表面结合性蛋白的例子还包括前文所述的那些。
同理，采用的MOI约为1-400，以低于500为宜。通常，MOI优选约2-50，更好的是10-30，但是，也可考虑采用约1至10、20、30或40。最好的MOI是20。而且，每细胞内的病毒载体拷贝数至少为1。然而，以上所述方法也可采用每细胞内多拷贝数。优选的拷贝数为每细胞内约1-100份。更好的是拷贝数是病毒转导后提供治疗、预防或生物学效应所需或实现最高效转导所需的最少拷贝数。
就治疗或预防用途而言，更好的拷贝数是细胞能够耐受，即对细胞或其所在生物没有明显副作用的最大拷贝数。每细胞内的最低和最高拷贝数取决于待转导细胞和可能存在的其他细胞。本领域技术人员通过常规技术即可方便的确定最适拷贝数。例如，逐渐提高转导细胞浓度和感染复数，然后分析拷贝数、疗效或生物学效应，以及对转导细胞或其所在宿主的副作用(例如安全性和毒性)。
体外与病毒载体共培养后，细胞可在细胞表面结合性分子存在下培养不同的时间，然后进行转导率分析，或另作他用。或者，可将细胞培养在适合其发育和扩增的条件下，例如用白介素-2(IL-2)培养或先用细胞表面结合性分子再用IL-2培养。转导后培养的时间是任何的，但以1至7到10天为宜。也可培养更长时间，例如14天，但不宜过长，以免损害细胞。在本发明细胞先与细胞表面结合性分子共培养然后才与病毒载体共培养的实施方式中，培养时间约为24-72小时，以24小时为最佳。
可将以上转导前培养与现有技术中用细胞因子和/或分裂素刺激细胞相比较。本发明具有避免采用此类刺激的优点，例如，刺激通过扩增来增加细胞数量，使之远多于刺激前。对扩增后如此多的细胞进行转导需要多得多的病毒载体和相关转导材料(例如容器、培养基、细胞因子等)，因而会提高成本。而且，刺激细胞会影响其未来用途的质量。据Movassagh等记载，用为期3天的转导前刺激降低了转导后及此后培养中T细胞库的多样性。此外，转导前刺激不具备转导分裂不活跃的细胞这样的优点。
本发明的转导率约为75-100％。较好的是至少75-90％，更好的是至少90-100％，最好的是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
此外，转导细胞可用于研究或治疗和预防活体内的病患。研究性用途的例子是Unutmaz等所述的结构-功能研究。转导细胞之治疗性用途的例子包括将细胞导入活生物体。例如，先用本发明方法将例如美国专利5,885,806所述的载体转导入HIV感染者或危发个体的未激活的原初T细胞内，然后将转导细胞回输给患者。或者，可用转导细胞直接表达含于病毒载体内的异源序列。
在参与HIV治疗或预防时，所述载体可编码已被认可用于抗HIV的毒素或其他抗病毒剂。或者，所述载体可编码定向于HIV的物质，例如tat，rev，nef，vpu或vpr基因的转显性阴性突变体。其他用途中，转导细胞可经校正而表达合适的珠蛋白以治疗镰形细胞贫血症或地中海贫血症。还可以对免疫细胞进行转导，以调整它们的免疫功能，对抗原的应答，或与其他细胞的相互作用。以上及其他用途都是本领域技术人员所知道的。
【附图说明】
图1A和1B分别是pN2cGFP和pN1GFP(cPT)的图谱。图中标明了各限制酶位点以及来自HIV的部分。pN2cGFP构建体含有GFP编码序列，该序列与CMV(巨细胞病毒)启动子操作性连接，从而使GFP表达受其调控。pN1GFP(cPT)构建体后文又称pN1(cpt)CGFP，含有来自HIV pol基因的cPPT。这些构建体被用于后文实施例。
图2显示用包被有固定化CD3和CD28抗体的微珠转导原初T细胞的结果。细胞先与载体接触然后与微珠接触(分图A)，先与微珠接触然后与载体接触(分图B)，同时与载体和微珠接触(分图C)。基于转导载体所编码GFP荧光的流式细胞计数结果显示，分图A-C的转导率分别为90.70％，87.19％和79.14％。
图3是与病毒载体接触前用IL-2和PHA-P或用固定于微珠的CD3和CD28抗体刺激CD4+细胞的转导率比较。使用固定化抗体，每次的转导率都高于95％。使用IL-2和PHA的则只有70.2-84.5％。
图4显示用本发明方法所得人CD4+细胞转导频率。转导后15天，通过流式细胞计数比较对照细胞与用能表达绿荧光蛋白(GFP)的载体以20MOI转导的细胞，结果显示，约93％的转导细胞也发出绿荧光。
图4显示使用IL-2和PHA-P或用固定化CD3和CD28抗体转导CD4+和GFP+细胞14天后的FACS分析结果比较。约93％抗体处理细胞14天后仍保持稳定转导，而IL-2和PHA处理的细胞仅有约75％保持稳定转导。
图5显示不同病毒载体的转导结果。
图6显示不同MOI对转导率的影响。
图7证明，在细胞表面结合性分子存在下，用病毒载体多次转导后，实现了对自脐带血制得的CD34+细胞的稳定转导。转导后6周，88％以上的细胞保持阳性。
图8分图A-D显示移植到SCID(重度联合免疫缺陷)小鼠后的长期转导率。约8周后，平均91％以上的转导细胞(仍在继续成熟)保持转导所得GFP标记表达阳性。
图9分图A和B显示树状细胞的7天后转导效率。
本发明实施方式
本发明涉及用病毒载体实现效率达75％以上的稳定转导细胞的方法及组合物。转导后7-10天或14天可将稳定转导的细胞与瞬时转导或假转导细胞区分开来。本发明方法与以下事实有关：待转导细胞与至少一种细胞表面结合性分子接触提高了稳定转导率。出人意料的是，所述接触步骤可在转导步骤之后进行。更出人意料的是，最高稳定转导率出现在先转导然后与固定化细胞表面结合性分子接触的情形下。
本发明方法包括用病毒载体进行的转导与接触细胞表面结合性分子相结合。如前所述，所述接触可在载体转导之前、之后或同时进行。本发明适用于多种细胞，并可采用任何细胞表面结合性分子。可用于本发明方法的细胞包括未激活的原初细胞—即新鲜分离自活体来源的细胞—以及细胞系，它们可以在使其保持于扩增状态的因子存在下预先培养不同的时间。如果采用细胞系，可在用本发明转导前将它们培养在无刺激因子的条件下。
如果是原初细胞，可在自活体来源获得后进行特定细胞类型的选择。例如，如果要用的是CD4+和/或CD8+细胞，首先获得外周血(PB)或脐带血(来自脐带的CB)样品，然后富集CD4+和/或CD8+细胞。将CD4+和/或CD8+细胞与其他PB杂细胞分离可采用标准的磁珠阳性选择法，塑料粘附阴性选择法和/或其他本领域认可的标准技术。测定分离所得细胞类型的纯度可采用标准的免疫表型分选法和流式细胞计数法。
分离后，即可将所得原初细胞用于效率为75％以上的本发明病毒载体转导。本发明最好用原初淋巴细胞进行，例如T细胞，用能够表达目标异源遗传物质的HIV-1衍生载体转导。另外优选的是采用原初造血干细胞，例如CD34+细胞。如果异源遗传物质是或编码用于体内治疗或预防疾病的治疗性或预防性产物，则可将转导后的原初细胞回输到(例如)患者的体内。这样，本发明的转导细胞可用于基因疗法，用于通过弥补遗传缺陷或定向于病毒感染来治疗或预防疾病。
本发明还可用于有效转导细胞以确定某基因的功能，在哺乳动物细胞内有效表达基因，表达基因库(cDNA库和反义基因或核糖核酸酶库)用于功能性筛选目标基因，用于蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸双链杂交体检测，基因捕获，用微阵或蛋白质阵列进行的高通量基因筛选，或用SAGE、拟蛋白质进行的研究，以及其他功能分析方法。
若要转导混合细胞群内的原初细胞则不采用上述分离/纯化步骤，而是通过选择至少一种存在于目标细胞类型上的细胞表面分子或成分和制备能够结合这些成分的一种或多种分子来定向于待转导细胞。所述细胞表面成分可以是靶细胞表面的受体、标记或其他可识别表位。一旦选定，即可制备与所选成分相互作用的分子，例如特异性抗体，以用于本发明。
例如，可以先纯化CD4+和/或CD28+细胞，然后联用固定化CD3和CD28抗体用本发明方法转导，也可以用同样的抗体在混合细胞群中(例如外周血细胞(PBC)或外周血单核细胞(PBMNC))实现CD4+和/或CD28+细胞的转导。由于整个白细胞群中的造血干细胞很难纯化或分离，可以用固定化CD34抗体在混合细胞群中实现造血干细胞的转导。
本发明细胞表面结合性分子可定向于并结合待转导细胞表面上的成分。较好的是，所述成分是受体、标记或细胞表面其他蛋白质类或非蛋白质类因子的组成部分。所述成分包括可被细胞表面结合性分子识别的表位。这些表位包括含有多肽序列、糖、脂类、核酸、离子或其组合的表位。
细胞表面结合性分子的例子包括抗体或其抗原结合性片段以及细胞表面受体的配体或结合域。细胞表面结合性分子本身可以是多肽、核酸、糖、脂类或离子。较好的是，所述分子是抗体或其片段，例如Fab或Fv片段。更好的是，所述分子不以可溶形式使用而是固定在固体介质—例如可与待转导细胞一起培养的微珠或组织培养皿、袋或板的表面—上使用。转导CD4+或CD8+细胞的优选实施方式中，可在病毒载体存在下，将识别CD3和/或CD28的单克隆抗体加在细胞培养袋中。
本发明包括含有本发明方法所用细胞表面结合性分子的组合物，例如包含所述分子和转导所用病毒载体以及可选性存在的待转导细胞的组合物。所述病毒载体可以是任何来源的，但优选逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体。尤其好的慢病毒载体是人免疫缺陷病毒(HIV)，最好是HIV-1、HIV-2或其嵌合体的衍生载体。当然，可用本发明方法将不同病毒载体转导到同一细胞内。例如，一种载体可能是复制缺陷型或条件复制性逆转录病毒载体，另一种载体则可能是能令第一载体复制/包装并扩增的包装构建体。当病毒载体编码各种病毒辅助蛋白时，这些蛋白可包含于任一待转导入细胞的载体内。或者，病毒辅助蛋白可通过包含在转导所用病毒颗粒内而存在于转导过程中。此类病毒颗粒可共包装有效量的辅助蛋白以提高转导率。在优选实施方式之一中，病毒载体不编码辅助蛋白。
用于本发明转导方法的病毒载体还可以包含并表达处于启动子调控下的—段或多段核酸序列。本发明实施方式之一中，一段核酸序列编码的基因产物表达后可缓解或校正待转导细胞内的遗传缺陷。另一实施方式中，所述核酸序列编码或构成可预防或治疗病毒性感染的遗传抗病毒剂。“遗传抗病毒剂”在此指由遗传物质编码或构成的物质。此类物质的例子可参考美国专利5,885,806。它们包括通过抑制病毒蛋白起效的物质，例如逆转录酶和蛋白酶；通过与病毒因子竞争靶位点起效的物质；或定向于病毒目标直接造成其变性的物质，例如核糖核酸酶和反义构建体。遗传抗病毒剂还包括例如反义分子，RNA饵基因，转显性突变体，干扰素，毒素，调节或改变RNA剪接的核酸，免疫原和核糖核酸酶例如“锤头状”核糖核酸酶及其胞外引导序列(EGS)介导的形式。
或者，病毒载体可编码受转导细胞的标记。在附图所示和后文所述实施例中，绿荧光蛋白(GFP)是转导到CD4+细胞内的病毒载体所编码的标记。其他标记还包括前文所列的那些。检测GFP可确定功能性转导细胞的数量，即此类细胞不仅被载体所转导，而且能够表达GFP，且表达水平可通过FACS分析测知。必需指出的是，检测不一定反映转导细胞的实际数量，因为有些细胞可能虽被载体所转导，但其GFP表达水平低于FACS检测的下限。
测定转染率的另一种方法是聚合酶链反应(PCR)。例如，可用TaqMan PCR来测定稳定整合到转导细胞内的病毒载体实际拷贝数。
待转导细胞可在接触细胞表面结合性分子之前、之后或同时与病毒载体接触。因此，细胞可先与载体接触—段时间，然后加入细胞表面结合性分子。此类细胞可以是新鲜分离或制备的尚未激活而进入细胞周期的原初细胞。或者，细胞可以先与细胞表面结合性分子接触—段时间，然后接触病毒载体。与载体接触后，最好去除过量载体，并在诱导细胞发育和/或扩增的条件下培养细胞。此类条件可以是：有细胞表面结合性分子或其他刺激/活化因子—例如细胞因子和淋巴因子(如果是T细胞)存在。或者，可以在载体与细胞接触之后，进一步培养之前去除过量载体。
本发明另一实施方式是在病毒载体和细胞表面结合性分子同时存在下培养细胞。此类细胞以未预先激活的细胞为宜。在诱导生长或扩增的条件下培养细胞一段时间，此类条件例如持续存在细胞表面结合性分子或其他刺激/活化因子。或者，可在进一步培养前去除过量载体。
在任一以上所述病毒载体与细胞表面结合性分子的联用中，与载体的共培养都可以至少重复一次，也可以重复一次以上，例如两次、三次、四次或更多次。
待转导细胞与病毒载体共培养的时间根据所用条件和材料而不同。影响培养时间的因素包括所用细胞、载体和MOI(感染复数)，用来细胞表面结合性分子及其数量，所述分子是否固定化及如何固定化，以及所需转导率。本发明优选实施方式之一中，所用细胞是T淋巴细胞，载体是HIV衍生载体，MOI约为20，细胞表面结合性分子是固定在微珠上的CD3和CD28抗体，所得转导率为93％以上。本领域技术人员将会看到，以上因素中，有些具有正关联的，有些则是反关联的。例如，MOI降低会降低转导率，但是如果提高细胞表面结合性分子的数量则可保持转导率。
病毒载体与待转导细胞共培养的时间以24小时为佳，对淋巴细胞可重复一次，对造血干细胞则可重复多达4次。类似的，在细胞先与细胞表面结合性分子共培养然后与病毒载体共培养的实施方式中，培养时间约为12-96小时。较好的是，与细胞表面结合性分子的共培养与接触病毒载体同时进行。此时，可在引入病毒时让细胞表面结合性分子仍与细胞接触。或者，在向细胞内加入载体前先去除细胞表面结合性分子。
与载体接触后，在诱导生长或扩增的条件下培养细胞。较好的是，所述条件为仍在细胞表面结合性分子存在下培养。或者，细胞先与细胞表面结合性分子共培养，然后换以含有诱导细胞生长的其他因子例如白介素-2的培养基继续培养。另一实施方式是先去除过量细胞表面结合性分子和过量载体，然后在诱导细胞生长或扩增以及进一步增强载体转导的因子存在下进行培养。此类因子包括植物血凝素(PHA)之类分裂素和细胞因子，生长因子，活化剂，细胞表面受体，细胞表面分子，可溶性因子或其组合，还包括这些分子的活性片段，或与其他蛋白质和/或因子联合。
其他因子包括，例如：表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGF-α)，血管紧张素，转化生长因子β(TGF-β)，GDF，骨成形蛋白(BMP)，成纤维细胞生成因子(酸性和碱性FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，PIGF，人生长激素(HGH)，牛生长激素(BGH)，heregulins，两栖调节素，Ach受体诱导活性(ARIA)，RANTES(活化、T细胞表达和分泌调节)，血管生长因子，肿瘤坏死因子β(TNF-β)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，血管形成素1或2，胰岛素，胰岛素生长因子I或II(IGF-1或IGF-2)，ephrins，leptins，白介素1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15(IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14或IL-15)，G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)，LIF(白血病抑制因子)，血管抑制素，制瘤素，红细胞生成素(EPO)，α干扰素(包括其亚型)，β、γ、ω干扰素，趋化因子，巨噬细胞炎性蛋白-1α或β(MIP-1α或β)，单细胞趋化蛋白-1或-2(MCP-1或2)，GROβ，MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)，MGSA(黑素瘤生长刺激活性)，α抑制素HGF，PD-ECGF，bFGF，淋巴毒素，Mullerian抑制物，FAS配体，成骨蛋白，多效素/midkine，睫嗜中性因子，雄激素诱导的生长因子，自分泌自力因子，刺猬蛋白，雌激素，孕酮，雄激素，糖皮质受体，RAR/RXR，甲状腺受体，TRAP/CD40，EDF(红细胞系分化因子)，Fic(生长因子可诱导趋化因子)，IL-1RA，SDF，NGR或RGD配体，NGF，胸苷-α1，OSM，趋化因子受体，干细胞因子(SCF)，或它们的组合。本领域技术人员可以看出，培养条件的选择取决于本领域有关转导细胞及其未来用途的已知信息。例如，不可选择IL-3，IL-6和干细胞因子联用来培养有待用于人移植的转导细胞。类似的，培养条件的选择不应有损细胞活度和转导率。
较好的是，转导后培养时间约为4小时，或1至7到10天。更好的是16-20小时或4、5、6天。也可进行14天的转导后培养。
本发明的转导率约为75-100％。较好的是约75-90％，更好的是约90-95％，最好的是91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。
此外，转导细胞可用于研究或活体内疾病的治疗。本发明的一项优选内容是转导细胞的治疗性用途，亦即用转导细胞生产基因产物或直接导入活体，从而作为基因疗法的一部分。例如后文所例举的，可分离原初T细胞并用病毒载体转导。以载体所编码基因产物的产生或过量产生或以载体所赋予的表型作为转导成功的表征。例如，可用含有并能表达所需或有用核酸序列的载体先转导原初T细胞，然后返回(活体)体内。较好的是，所述活体是已受HIV-1感染或有此危险的个体。
另一实施方式中，用能够在导入宿主后条件性杀死T细胞的基因或核酸转导T细胞。这可用于同种异体骨髓移植，通过用前药方式杀死T细胞来预防移植物抗宿主疾病。
或者，原初细胞可以是某基因产物缺陷型的，然后由转导所用病毒载体来弥补该缺陷。此类细胞可在以载体转导后返回给活体。
这样，本发明既具有体外用途，又具有体内用途。就向活体内输送而言，转导细胞最好包含在生物学认可的溶液或药学认可的制剂中。所述输送可通过已知的静脉、腹膜内或其他输注方法以及非输注方法进行。给药剂量根据各种因素而不同，但对本领域技术人员来说不难确定。结合病毒载体内已知或精心设计的有效负载，本发明有许多用途，转导遗传物质所带来的益处将远远大于可能存在的副作用风险。
起初，输送的转导细胞总量约为104-1010。例如，可采用105，106，107，108或109个细胞。实际数量取决于被转导细胞。如果需要，进行转导细胞的多次输送也是一种优选实施方式。此外，宜根据需要调整宿主以适应转导细胞的输入。调整方法是本领域所已知的，例子之一是骨髓移植中的调整。
以上概括描述了本发明，以下说明性实施例将更有助于对本发明的理解。除非特别说明，实施例不限定本发明的范围。
实施例1
原初CD4+T细胞的制备
对标准方法略加修改，分离外周血CD4+T细胞。具体地说，用粘附法去除混杂的单核细胞。将非粘附细胞与包被有抗CD4+抗体的磁性微珠接触以选择CD4+细胞。取出磁珠，分离得到CD4+细胞。
经流式细胞计数检验，高度纯化的CD4+细胞纯度高达90％以上。
实施例2
用细胞表面结合性分子以不同接触时间转导原初CD4+T细胞。
在细胞表面结合前进行转导
原初CD4+细胞(约500,000个)按MOI 20与pN2cGFP共培养24小时，然后加入以αCD3和αCD28包被的微珠，再培养7天。图1显示pN2cGFP的图谱。在细胞表面结合后进行转导
原初CD4+细胞(约500,000个)与αCD3和αCD28包被的微珠共培养24小时，然后按MOI 20向培养物中加入pN2cGFP，继续共培养24小时。然后，在含有微珠但无载体的培养基中培养7天以洗去过量载体。
细胞表面结合与转导同时进行
在以αCD3和αCD28包被的微珠存在下，原初CD4+细胞(约500,000个)按MOI 20与pN2cGFP共培养24小时。然后，在含有微珠但无载体的培养基中培养7天以洗去过量载体。
方案中可选的替换
可用其他病毒载体代替pN2cGFP。此外，在去除过量载体前，转导过程可重复，即总共2次。而且，转导和去除过量载体后，αCD3和αCD28包被的微珠可以白介素-2(10ng/ml)和PHA-P(3mg/ml)替代。7天后，可将培养基换成含白介素-2(10ng/ml)的无PHA-P培养基，并继续培养7天。
或者，在转导后与αCD3和αCD28包被的微珠共培养7天后，可洗涤细胞，然后在白介素-2(10ng/ml)存在下继续培养。
实施例III
转导后分析
转导后，并在培养7或14天后，用流式细胞计数法分析细胞的CD4+和/或绿荧光蛋白(GFP)情况。
以上3种转导方案的比较可见图2。按MOI 20以pN2cGFP转导后与固定于微珠上的αCD3和αCD28接触，转导率约为91％。先与微珠接触然后转导的效率约为89％，同时进行的转导率约为80％。本实验中，用单核细胞粘附去除法、CD14MACS去除法和CD4 MACS富集法选出CD4+T细胞。抗体的固定如下所述。与载体的接触在37℃和5％CO2条件下进行。培养条件为500,000个CD4+T细胞/ml，含2％人血清白蛋白的Yssel′s培养基。FACS分析在选择后第7天进行。MF表示平均荧光度。
图3所示为7天后不同刺激条件的实验结果比较。用IL-2和PHA或固定于微珠的CD3和CD28抗体处理CD4+细胞24小时，然后按MOI 20进行一次pN2cGFP转导。在并列比较中，使用固定化抗体的转导率每次都在95％以上(体现为CD4和GFP双阳性)。相比之下，以IL-2和PHA刺激所得的转导率仅为70.2-84.5％。FACS分析在选择后第7天进行。
图4显示选择后第15天一次类似实验的结果。用IL-2和PHA或固定于微珠上的CD3和CD28抗体处理细胞24小时，然后按MOI20进行一次pN2cGFP转导，7天后去除PHA-P和微珠，在仅含IL-2的条件下培养(500,000/ml)细胞，至选择后第15天。使用固定化抗体后，约93％的细胞CD4和GFP均呈阳性。用IL-2和PHA处理后，仅75％的细胞保持CD4和GFP双阳性。以上结果表明7天后检测到的部分阳性细胞(图3)可能是“假转染”所致。
实施例IV
不同载体对细胞的高效稳定转导
该实施例是转导所用载体之间的比较。pN2cGFP含有完整的gag和pol编码序列，pN1(cpt)cGFP含pol的4551-5096位部分(非编码)序列。图5所示结果表明，同时用固定于微珠上的CD3和CD28抗体刺激，载体数量为MOI 20的条件下，两种载体对原初CD4细胞的转导率都很高。FACS在选择后第10天进行。
实施例V
MOI对转染率的影响
图6显示不同MIO的影响，所用2-20 MOI所得的转导率为72.7-83.8％。细胞先与固定于微珠上的CD3和CD28抗体接触24小时，然后按不同MOI以pN1(cpt)cGFP转导。
实施例VI
CD34+细胞的转导
制备脐带血CD34+细胞，在FLT-3配体，TPO和Kit配体(各100ng/ml)存在下进行4次pN1(cpt)cGFP转导。细胞在长期培养基(LTC-IC)中培养5周，然后在甲基纤维素中培养10天，然后接受分析(结果为培养6周以上的结果)。图7所示为由CD34幼稚细胞所得成熟CD45+细胞的分析结果。对照细胞显示无明显转导，以载体转导的细胞则有88％显示CD45和GFP阳性。
实施例VII
CD34+细胞的长期转导
如上所述以pN1(cpt)cGFP转导CD34+细胞，将其移植到经部分辐照的SCID小鼠的骨髓内。8周后，分离细胞，用FACS分析带CD45的成熟人细胞和GFP表达。结果显示在图7的分图A-D中。
分图A显示接受非转导人细胞移植对照鼠的结果。
分图B显示接受以下转导细胞移植的小鼠的结果：在100ng/ml FLT-3配体，TPO和Kit配体存在下，按MOI 50以pN1(cpt)cGFP载体对细胞进行连续4天的转导。转导后8周，该小鼠显示转导人细胞的转导率(CD45+阳性)为令人惊奇的96.3％。该小鼠的人细胞移植水平为11.1％，与此前所报道的结果相当。
分图C和D显示接受分图B所述处理的另两个小鼠的结果。结果显示以CD45+和GFP双阳性表征的转导率为87.8％和89.6％，证明高转导率具有再现性。
平均转导率为91.2％，反映了稳定的长期转导。
实施例VIII
细胞表面结合性分子的固定化
本实施例描述如何将CD3(B-B11)抗体和CD28(B-T3)抗体与环氧dynal微珠直接连接，以用于后面是实施例。
1.将0.618g硼酸溶于95ml组织培养级水中，制备成0.1硼酸盐溶液。充分混合，用高质量NaOH调节至pH9.5。将最终体积调定为100ml，用0.2μm过滤器消毒。密封容器，于4℃保存。
2.向以上硼酸盐溶液中加入抗体至150μg/ml。对B-B11和B-T3抗体来说，每毫升硼酸盐溶液中加入75μg。将总体积调定为1ml。加入抗体后的硼酸盐浓度应低于0.05M。每1ml硼酸盐/抗体溶液加入4×108个环氧微珠。
3.在转轮上37℃培养24小时。
4.用洗珠培养基于20℃洗涤微珠3次，每次10分钟，洗珠培养基：不含Ca和Mg的磷酸盐缓冲液，含3％人血清白蛋白，5mM EDTA和0.1叠氮钠。
5.22℃洗珠30分钟。
6.4℃洗珠过夜。
7.换以新鲜洗珠培养基，重悬微珠至2×108/ml。IgG包被微珠在4℃至少可稳定存放6个月。
实施例IX
树状细胞的转导
分离外周血单核细胞，然后用两种刺激性细胞因子条件，按MOI 50以pNcGFP进行连续3天的转导，所述两种条件为：GM-CSF(800单位/ml)，IL-4(500单位/ml)和TNF-α(100单位/ml)或GM-CSF(500单位/ml)和α干扰素(800单位/ml)。图9分图A显示转导后7天的结果，其中，第一种细胞因子条件下的转导率为90.2％。7天后，第二种细胞因子条件下的转导率为92.9％(分图B)。CD86是树状细胞唯一的可用标记，但需要指出的是，CD86-细胞也可能是树状细胞。
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不论是否特别指出，本发明对所列参考文献均就其全文进行了参考。
根据以上对本发明的全面论述，本领域技术人员可以看出，无需过多实验即可在本发明范围内，在较宽的范围内用与本文所述相当的参数、浓度和条件来实施本发明。
虽然以上结合具体实施例对本发明进行了描述，但显然还可进行其他修改。本发明的范围意在包涵符合本发明总旨的各种变更、用途或修改，还包括虽未在此公开但为本领域所已知且符合权利要求所述必要特征的实施方式。