一种复合多糖免疫制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明具体涉及一种复合多糖免疫制剂及其制备方法。背景技术 人们生活的外界环境中有为数众多的致病因子， 但是多数人并不发生疾病， 其主 要原因是由于人们有免疫力， 免疫力是人体的一种保护性反应， 是在进化过程中与各种引 起感染的病原生物作斗争时获得的， 免疫不仅使人们抵抗外界的各种致病因子， 同时对体 内有时出现的衰老细胞和肿瘤细胞也有监视作用， 免疫能清除体内的衰老细胞， 杀伤肿瘤 细胞， 从而保持人体的稳定。 但是随着当今社会生活节奏的加快， 竞争加剧， 生活压力大， 不 正常的生活饮食习惯等等因素使许多人的自身免疫力出现了下降。
由于机体免疫力降低而引起的恶性肿瘤是一种高病痛且死亡率极高的病症。 据统 计恶性肿瘤已经成为人类死亡的第一位或者第二位原因， 每年全世界约有 700 万人死于癌 症。 尽管与发达国家相比， 如美国， 英国， 法国等， 我国恶性肿瘤死亡率及占总死亡的比率相 对较低， 但在全世界范围内恶性肿瘤在各种死因中也排到第二位， 在大城市则已排到首位。 目前世界上仍然没有可以完全治愈的药物， 现用于治疗的药物多为化学药物， 虽然可以缓 解症状， 但是仍存在很多问题 ； 如不能彻底清除体内病毒， 停药反弹， 易产生不良反应， 副作 用大且治疗费用昂贵等等， 使得这些药物的应用受到了很大的限制。
病毒病是病毒从外界传染人人体后产生的疾病。 我们常说的病毒病或流感性病毒 病是现代医学的病名， 如 “非典” 、 脑膜炎、 鼠疫、 甲型 H1N1 流感、 禽流感。近几年来病毒病接 连发生， 对人类的正常生活和身体健康造成了严重的影响， 引起了大家的恐慌。 如自从最早 的人禽流感病例出现在 1997 年的香港后， 到目前为止全球共有 15 个国家和地区的 393 人 感染， 其中 248 人死亡， 死亡率 63％。中国从 2003 年至今有 31 人感染禽流感， 其中 21 人死 亡。2003 年爆发的非典造成了全球近千人的死亡， 此病病死率约在 15％左右， 主要是冬春 季发病。其发病机制与机体免疫系统受损有关。病毒在侵入机体后， 进行复制， 可引起机体 的异常免疫反应， 由于机体免疫系统受破坏， 导致患者的免疫缺陷。同时 SARS 病毒可以直 接损伤免疫系统特别是淋巴细胞。自从 2009 年 H1N1 流感爆发以来， 已造成全球六千多人 死亡， 其中美国就有大约 3900 人死亡， 引起了全世界的恐慌。产生病毒病的主要决定因素 是人体的免疫功能， 不是病毒的作用。 就是人的周围或内部有了病毒， 正常运作的免疫系统 就像正常运作的机器一样能抵抗或灭掉所有妨害机能运作的病毒。免疫系统运作正常， 体 内的病毒必然被正常运作的免疫系统消灭 ； 免疫系统失常， 就会产生生理性的病变， 体内产 生病毒， 外界病毒也可以乘虚而人。因此提高人类机体的免疫力是非常必要的。
提高人体的免疫力对于罹患多种疾病， 尤其是肿瘤的病人是非常重要的， 各种原 因引起的免疫功能降低不仅常见于亚健康状态下对细菌和病毒感染的抵抗力下降， 也是导 致癌症以及一些慢性疾病并发感染性疾病的重要原因。 因此， 纠正失调的免疫功能， 对于防 病， 治病， 提高人们生活质量具有重大意义。
在如何充分调动、 增强自身的免疫力， 从而更有效的对抗、 预防疾病这个问题上，
已有了经过实践证明的有效手段。医学上经过反复研究表明， 各种疾病几乎都与糖类和相 关的糖链结构变化有关， 都有可能通过调整和补充细胞表面的糖链而得到改善， 特别是针 对于作为现代医学难题的慢性疾病， 多糖及以其为主要成分的多糖类产品， 针对这类慢性 疾病有着显著的使用效果， 美国 FDA( 食品药品管理局 ) 也公开宣布 ： 多糖能够减少人类疾 病的发病率。 发明内容
本发明旨在提供一种提高人体免疫力， 且能够抑制肿瘤和抗病毒病的复合多糖免 疫制剂。
为实现上述目的， 本发明所涉及的一种复合多糖制剂， 其特征在于 ： 该制剂是由胞 外多糖和牛蒡水提物共同组成， 其配比按重量百分数为 ：
A、 胞外多糖 20 ～ 40 份
B、 牛蒡水提物 60 ～ 80 份
将上述配料溶水混合为复合多糖免疫制剂成品。
所述的胞外多糖为拟康氏木霉胞外多糖。
所述的牛蒡水提物为牛蒡低聚寡糖。 按照上述的一种复合多糖免疫制剂的制备方法， 其特征是采用以下工艺 ： (1)、 胞外多糖的制备 ： a、 将拟康氏木霉孢子悬液接种于液体 PDA 培养基中， 28 ℃、 120rpm 振荡培养 10天； b、 用 4 层纱布过滤除去菌丝和孢子， 将滤液 60℃减压浓缩至原体积的 1/3 ；
c、 用 4 倍体积的 95％乙醇进行沉淀， 静置过夜后离心， 将沉淀物依次用无水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 然后将沉淀充分溶解后离心， 取上清液 ；
d、 将上清液经 D301-R 型树脂柱脱色， 通过柱的流出液， 浓缩后采用木瓜蛋白 酶 -Sevage 法脱蛋白， 重复 5 次左右直至液面交界处无胶状物 ；
c、 除去残留有机溶剂， 透析、 冷冻、 干燥。
(2)、 牛蒡水提物的制备 ：
a、 将牛蒡洗净切成片状， 加水煮沸 30 分钟， 4 层纱布过滤得滤液 ；
b、 将滤液 60℃减压浓缩至原体积的 1/3 ；
c、 用 4 倍体积的 95％乙醇进行滤液沉淀， 静置过夜后离心 ；
d、 将沉淀物依次用无水乙醇、 丙酮、 乙醚洗涤， 然后将沉淀充分溶解后 12000rpm， 离心 10 分钟， 取上清液 ；
e、 将上清液经 D301-R 型树脂柱脱色， 通过柱的流出液， 浓缩后采用木瓜蛋白 酶 -Sevage 法脱蛋白， 重复 5 次左右直至液面交界处无胶状物 ；
f、 除去残留有机溶剂， 透析、 冷冻。
将上述经过制备过程处理过的胞外多糖和牛蒡水提物， 按比例溶水混合为复合多 糖免疫制剂。
所述胞外多糖制备工艺 a 步骤中所述的液体 PDA 培养基为马铃薯 200g/L， 葡萄糖 10g/L。
所述胞外多糖制备工艺 d 步骤中和牛蒡水提物制备工艺 e 步骤中所述的木瓜蛋白 酶 -Sevage 法中氯仿与正丁醇的比为 4 ∶ 1。
本发明与已有技术相比具有提高免疫、 抑制肿瘤、 抗病毒等优点。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做详细地说明。
实施例 1 本发明复合多糖制剂抑制肿瘤细胞活性实验
1、 材料
1.1 实验动物
昆明种小鼠， 清洁级， 雌性， 4-8 周龄， 体重 20±2g， 由山东大学实验动物中心提 供。
1.2 主要药品和试剂
小鼠 S180 瘤株， 由山东省医学科学院药物所提供。
2、 方法
2.1 动物模型的建立
取经多次传代的 S180 肉瘤腹水小鼠， 于传代第 6-9 天后无菌抽取腹水。用无菌生 7 理盐水洗涤肿瘤细胞 2-3 次， 并制备成 1×10 个 /ml 的细胞悬液， 台盼蓝染色检查肿瘤细 胞活力在 95％以上。于小鼠右上肢腋下皮下接种肿瘤细胞悬液 0.2ml， 建立 S180 肿瘤小鼠 模型。
2.2 动物分组及给药方法
接种后给药组 ： 小鼠接种 24 小时后， 随机分组， 每组 8 只， 分为对照组和给药组 ( 给予已配制的复合多糖免疫制剂 250、 500 和 1000mg/kg/day)。小鼠灌胃给药， 每日一次， 连续 9 天。给药组给予不同剂量的复合多糖制剂的水溶液， 对照组给予相同体积的蒸馏水。
预给药组 ： 小鼠接种前 7 天随机分组， 每组 8 只， 分为对照组和给药组 ( 给予免疫 制剂 250、 500 和 1000mg/kg/day). 小鼠灌胃给药， 每日一次， 连续 7 天。给药组给予不同剂 量的复合多糖制剂水溶液， 对照组给予相同体积的蒸馏水 . 第 8 天建立 S180 肿瘤模型， 继 续给药 9 天。
3、 抑癌率
末次给药 24 小时后， 称重， 放血处死小鼠， 剥离肿瘤组织和脾组织， 分别称重， 按 以下公式计算抑癌率。
抑癌率 (％ ) ＝ ( 对照组组瘤重一用药组瘤重 )/ 对照组组瘤重 ×100％
4、 结果
表 1 复合多糖制剂接种后给药对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用
表 2 复合多糖制剂预给药对小鼠 S180 肉瘤的抑制作用实验结果显示， 给与本发明的免疫制剂后， 低剂量组 (250 和 500mg/kg/day) 无明 显的抑瘤作用， 高剂量组 (1000mg/， kg/day) 初步显示出肿瘤活性， 抑瘤率约为 19％， 但与 对照组相比， 无显著差异。本免疫制剂预给药， 不同剂量组抑瘤率明显均增高， 低剂量组 (250 和 500mg/kg/day) 的抑瘤率为 25％左右， 而高剂量组达到 39％， 与对照组相比， 有显著 差异。说明此发明的复合多糖免疫制剂对肿瘤的发生有一定的预防作用， 可能是由于此复 合多糖免疫制剂对机体的免疫反应的诱导需要一个时间过程。
实施例 2 本发明复合多糖制剂对免疫功能的影响
1、 实验材料
昆明种小鼠， 清洁级， 雌雄各半、 4-8 周龄、 体重 20±2g、 豚鼠补体、 绵羊红细胞 (sRBc)、 注射用环磷酰胺、 pNPP 溶液、 RPMI 1640 培养液、 硫乙醇酸盐培养基、 PBS 溶液、 复合 多糖制剂。
2、 动物分组及给药方法
昆明种小鼠， 随机分组， 雌雄各半， 每组 10 只， 共 5 组， 分为对照组， 环磷酰胺模型 对照组， 复合多糖低、 中、 高剂量组， 除正常对照组， 其余小鼠均注射环磷酰胺 60mg/kg 制备 免疫低下小鼠模型， 每周两次， 小鼠灌胃给药， 每日一次， 连续 7 天， 给药组给予不同剂量的 复合多糖制剂 (250、 500 和 1000mg/kg/day)， 正常对照组和模型对照组给予相同体积的蒸 馏水。
3、 血清溶血素生成的测定
实验第 4 天开始腹腔注射 20％ sRBc0.2ml 致敏小鼠， 第 8 天眼球取血， 分离血清，
用生理盐水 1 ∶ 100 稀释后， 取 1ml 稀释后的血清与 5％的 SRBC 0.5ml、 1 ∶ 10 豚鼠补体 0.5ml 混合， 另设不加补体的空白对照， 于 37 ℃条件下恒温水浴 10min， 冰浴终止反应， 用 2000rpm/min 离心 10min， 取上清液， 于 540nm 波长下测定吸光度。
注： 与同期模型对照组比较 *P ＜ 0.05、 **P ＜ 0.01
由以上实验结果可得环磷酰胺对照组小鼠的血清溶血素的生成量显著降低， 与正 常对照组有显著差异， 给予复合多糖后， 各组小鼠的血清溶血素的生成量有不同程度的提 高， 其中 500mg/kg/day 给药组与对照组比较有显著性差异， 洗明复合多糖制剂可以抵抗由 环磷酰胺所致的小鼠血清溶血素的生成量的降低。
4、 巨噬细胞酸性磷酸酶活性的测定
制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液 ： 小鼠腹腔注射 3％液体硫乙醇酸盐培养基 2ml， 3天 后颈椎脱臼处死， 打开腹部， 于腹腔注射 PBS 溶液 5ml， 按摩腹壁， 抽取腹部渗出液， 反复冲 洗， 收集渗出液 . 洗涤两次， 离心 (200g×6min). 放入玻璃平皿中于 37 度、 5％ CO2 条件下置 于 CO2 培养箱中培养 2 小时， 取出， 用 RPMI 1640 培养液冲洗 3 次， 除去非粘附细胞， 用橡皮 棒轻轻刮取， 即得到纯化的小鼠腹腔巨噬细胞。细胞计数， 用含 10％胎牛血清的 RPMI 1640 6 培养液制成 1×10 /ml 的细胞悬液。在 96 孔板上每孔加入细胞悬液 20μl 和 RPMI-1640 培 养液 80μl， 各设三复孔， 于 37 度、 5％ CO2 条件下置于 CO2 培养箱中培养 24 小时， 取出， 去 上清， 每孔加 pNPP 溶液 100μl， 混匀， 于 37 度放置 30min， 取出， 立即加入 1.0mol/LNaOH 溶 液 10μl 终止反应。在酶标仪 405nm 波长处读取每孔 OD 值。
注： 与同期模型对照组比较 *P ＜ 0.05、 **P ＜ 0.01
据上面的实验结果可知复合多糖制剂可以显著影响巨噬细胞酸性磷酸酶的活性。 其中 500 和 1000mg/kg/day 给药组与对照组比较有极其显著的差异。可得出此复合多糖制 剂能够较好的增强巨噬细胞酸性磷酸酶的活性。
5、 巨噬细胞吞噬活性的测定
制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液， 方法同上。在 96 孔板上每孔加入细胞悬液 100μl， 各设三复孔， 于 37 度、 5％ CO2 条件下置于 CO2 培养箱中培养 24 小时， 取出， 去上清， 每孔加入 1％中性红生理盐水溶液， 于 37 度放置 30min， 取出， 去上清， 用磷酸盐缓冲溶液洗涤 3 次， 除 去未吞噬的中性红染料 . 加入无水乙醇∶冰醋酸 (1 ∶ 1) 混合液 100μl， 室温放置 20min 后， 在酶标仪 490nm 波长处读取每孔 OD 值。
注： 与同期模型对照组比较 *P ＜ 0.05、 **P ＜ 0.01
由实验结果可知， 复合多糖免疫制剂可提高小鼠巨噬细胞吞噬中性红的活性， 其 中 1000mg/kg/day 给药组与对照组比较有显著差异。说明复合多糖免疫制剂可对抗由环磷 酰胺所致的小鼠巨噬细胞吞噬能力的低下。
实施例 3 本发明复合多糖制剂对流感病毒的抑制作用
1、 实验材料
甲型流感病毒干粉、 狗肾传代细胞 (MDCK)、 利巴韦林注射液、 细胞培养液、 细胞维 持液、 PBS 液、 复合多糖制剂。
2、 方法及结果
利巴韦林是广谱强效的抗病毒药物， 目前广泛应用于病毒性疾病的防治。可抑制 呼吸道合胞病毒、 流感病毒、 甲肝病毒、 腺病毒等多种病毒的生长， 故本实验使用利巴韦林 作为对照。复合多糖制剂设高 (50mg/L)、 中 (20mg/L)、 低 (5mg/L)3 个剂量组， 同时设细胞 8 对照组、 病毒对照组和利巴韦林组。MDCK 细胞 1×10 /L， 按 0.1ml/ 孔加入 96 孔加入培养 板中， 置于 37℃， 5％ CO2 ： 温箱内培养， 细胞长成单层后， 倾去培养液， 用 PBS 液洗 2 次。正 常细胞对照组加入细胞维持液， 其余各组加入含流感病毒的细胞维持液于 MDCK 细胞孔中， 0.1ml/ 孔， 37℃吸附 2h 后倾去上清， 用 PBS 液洗两次， 之后正常细胞对照组和病毒对照组加 入细胞维持液， 其余各组加入含不同剂量复合多糖制剂和利巴韦林的细胞维持液于上述已 感染细胞孔内， 0.1ml/ 孔。每个剂量组设 4 个平行组。继续培养 3 天后测定血凝滴度， 并计 算抑制倍数。
由上表的实验结果可以看出复合多糖免疫制剂能够明显的抑制病毒的增殖。
实施例 4 复合多糖制剂对流感病毒性肺炎的影响
将体重为 20±2g 的小白鼠随机分组， 设药物组， 细胞对照组、 病毒对照组和利巴 韦林组， 药物组分不同的浓度于感染前 1 天开始滴鼻给药， 0.05ml/ 次， 2 次 / 天， 连续 5 天， 利巴韦林组处理方法与此相同。 对照组给予同容积蒸馏水滴鼻， 除正常组外， 其它各组在乙 醚轻度麻醉下流感病毒以 LD50 量感染鼠肺， 感染后 96h 处死， 称体重后取肺称重， 逐个算出 肺指数值 ( 每 100g 体重的肺质量， 即肺指数＝肺质量 / 体重 ×100) 和肺指数抑制率 [( 病 毒对照组平均肺指数 - 实验组平均肺指数 )/ 病毒对照组平均肺指数 ×100％ ]， 与对照组 比较进行组问 t 检验。
由此可以看出复合多糖免疫制剂对流感病毒性肺炎具有显著的治疗作用， 其疗效 优于 5g/L 的利巴韦林组。
据本实验室的研究发现， 本发明所涉及的一种复合多糖免疫制剂对多种病毒病都
有一定的抵抗作用， 如鼠疫、 甲型 H1N1 流感、 禽流感等， 并且效果明显。10