胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法.pdf

本发明公开了一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中消化18～20h后加入胰酶继续消化，然后进行过滤和离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞；将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞进行培养扩增。Ⅰ型胶原酶消化底蜕膜组织块时间较长，能够获取大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多次复制引起的细胞质量下降以及功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间充质干细胞提供了良好的保障。

权利要求书
1.  胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中消化18～20h后加入胰酶继续消化， 然后进行过滤和离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞；
将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞进行培养扩增。

2.  根据权利要求1所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，所述Ⅰ型胶原酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。

3.  根据权利要求1所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，所述胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶消化后总体积的 0.2～0.3倍。

4.  根据权利要求1所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，所述胰酶在37℃下消化20～40min。

5.  根据权利要求1所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，所述底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然 后经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。

6.  根据权利要求5所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，将生理盐水加入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底 蜕膜间充质干细胞。

7.  根据权利要求1所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于培养 瓶中，进行原代细胞培养。

8.  根据权利要求7所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代 细胞培养。

9.  根据权利要求7所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特 征在于，所述原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1：2～1： 5体积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细 胞。

10.  根据权利要求1～9任一项所述的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备 方法，其特征在于，所述培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项 目检测或冻存。

说明书胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及间充质干细胞的制备，特别涉及一种胎盘底蜕膜间充质干 细胞的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中 胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点： 1)造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干/祖细 胞，MSCs与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入；2)免疫调控。 MSCs不表达CD34，CD45，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋 巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主 病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义；3)基因治疗，由于MSCs体外扩 增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤 的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景；4)多向分化潜能。 在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、 神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具 有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。
目前，从胎盘、脐带获得间充质干细胞常用酶消化法，通常是采用胶 原酶消化2～3小时后加入胰酶，这种酶消化方法会因为消化不完全导致获 得间充质干细胞量少，没有分离出的细胞被浪费，增大了细胞扩增的难度， 延长了细胞培养时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，能够 在很大程度上消化胎盘底蜕膜组织块，进而能够获得大量间充质干细胞， 增大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种胎盘底蜕膜间 充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块 中消化18～20h后加入胰酶继续消化，然后进行过滤和离心，获得胎盘底蜕 膜间充质干细胞；将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞进行培养扩增。由此， Ⅰ型胶原酶消化底蜕膜组织块时间较长，能够获取大量间充质干细胞，增 大底蜕膜组织块利用率，缩短细胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多 次复制引起的细胞质量下降以及功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间 充质干细胞提供了良好的保障。
在一些实施方式中，Ⅰ型胶原酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。 由此，Ⅰ型胶原酶在此用量范围内，能够满足较长的消化时间。
在一些实施方式中，胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶消化 后总体积的0.2～0.3倍。由此，胰酶在此用量范围内，能够得到较好的消化 效果。
在一些实施方式中，胰酶在37℃下消化20～40min。由此，在此时间范 围内胰酶对底蜕膜组织块有较好的消化效果。
在一些实施方式中，底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生 理盐水，然后经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。 可获得含杂质较少的细胞。
在一些实施方式中，将生理盐水加入所述沉淀细胞，1500rpm离心 10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。进一步清洗提纯获得基本不含杂质 的胎盘底蜕膜间充质干细胞。
在一些实施方式中，将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于培养瓶中，进行原代细胞培养。对间充质干细胞进行第一次增 殖培养，以上述密度接种，能够具有较好的增殖效果。
在一些实施方式中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。在此环境下进行细胞培养，使细胞具有良好 的增殖速度。
在一些实施方式中，原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时， 用含重量0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物 按1：2～1：5体积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合 时，收集细胞。由此，依照上述步骤转移至新培养瓶中进行细胞培养，能 够使细胞具有良好的增殖速度。
在一些实施方式中，培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项 目检测或冻存。
本发明的有益效果为：本发明的制备方法采用Ⅰ型胶原酶消化底蜕膜 组织块18～20h后，在加入胰酶继续消化。Ⅰ型胶原酶消化底蜕膜组织块时 间较长，能够获取大量间充质干细胞，增大底蜕膜组织块利用率，缩短细 胞培养时间及培养周期，避免了细胞因多次复制引起的细胞质量下降以及 功能形态变化，为临床使用胎盘底蜕膜间充质干细胞提供了良好的保障。
附图说明
图1为A组的组织贴壁法制备间充质干细胞中细胞培养第9天间充质 干细胞形态图；
图2为A组的组织贴壁法制备间充质干细胞中细胞培养第15天间充质 干细胞融合80％～90％形态图；
图3为B组的胰酶消化法制备间充质干细胞中细胞培养第20天间充质 干细胞形态图；
图4为B组的胰酶消化法制备间充质干细胞中细胞培养第28天间充质 干细胞融合80％～90％形态图；
图5为C组的胰酶加胶原酶直接消化法制备间充质干细胞中细胞培养 第10天间充质干细胞形态图；
图6为C组的胰酶加胶原酶直接消化法制备间充质干细胞中细胞培养 第22天间充质干细胞融合80％～90％形态图；
图7为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养第3天间充质 干细胞形态图；
图8为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养第7天间充质 干细胞融合80％～90％形态图；
图9为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养生长曲线及对 应的细胞活率图；
图10为D组本发明的制备间充质干细胞方法中细胞培养P2代间充质 干细胞流式表型图；
图11为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成骨 诱导分化图；
图12为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成软 骨诱导分化图；
图13为D组本发明的制备间充质干细胞方法获得间充质干细胞的成脂 肪诱导分化图。
具体实施方式
以下通过对比几种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，进一步解释 本发明的有益效果。其中几种胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法包括组 织块贴壁法、胰酶消化法、胰酶加胶原酶直接消化法和本发明的制备方法。 其中，Ⅰ型胶原酶、胰酶、DMEM-F12培养基均采购自GIBCO公司。 对比操作包括以下步骤：
S101、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。
S102、尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右，然后平均分成A、B、C、D4组。
S103、将A、B、C、D4组分别采用组织块贴壁法、胰酶消化法、胰 酶加胶原酶直接消化法和本发明的方法制备间充质干细胞。制备过程如下。
1、A组采用组织块贴壁法制备间充质干细胞。
将A组的底蜕膜组织块均匀贴于100mm的培养皿中，组织块之间的距 离在1～2cm，晾干贴壁40min后，每个培养皿中加入10mlDMEM完全培养 基，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。
待细胞爬出后，剔除组织块，继续进行细胞培养，如图1所示，为细 胞培养第9天间充质干细胞形态图。细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，按1：2～1：5接种到新培养瓶中培养。
如图2所示，细胞培养第15天细胞再次培养到80～90％融合。此时收 集细胞，取2×105个用于流式检测；取5×103个/cm2接种于培养孔板中， 进行成骨、成脂肪、成软骨诱导实验；剩余细胞按2×106个/ml永久冻存于 液氮中。
2、B组采用胰酶消化法制备间充质干细胞。
将B组的底蜕膜组织块放入15ml离心管中，且加入组织块体积1/4的 胰酶，混匀，于37℃消化30min，每10min摇晃一次，使消化完全。
取出消化后的混合物，无需加终止液，加入混合物三倍体积量的生理 盐水稀释。将稀释的混合物过200目筛网，收集滤液，1800rpm，10min快 速离心。离心后弃上清，收集沉淀细胞，用生理盐水清洗一遍，1500rpm， 10min离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞按2×104个/cm2密度接种于培养瓶中， 置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。待细胞培养 到80～90％融合时，用含重量0.25％EDTA的胰酶消化，按1：2～1：5接种 到新培养瓶中培养。
如图3所示，为细胞培养第20天间充质干细胞形态图。如图4所示， 细胞培养第28天细胞再次培养到80～90％融合。此时，收集细胞，取2×105个用于流式检测，取5×103个/cm2接种于培养孔板中，进行成骨、成脂肪、 成软骨诱导实验，剩余细胞按2×106个/ml永久冻存于液氮中。
3、C组采用胰酶加胶原酶直接消化法法制备间充质干细胞。
将C组的底蜕膜组织块放入15ml离心管中，且加入底蜕膜组织块两倍 体积的Ⅰ型胶原酶和1/4体积的胰酶37℃消化30min，每10min摇晃一次， 使消化完全。
取出消化后的混合物，无需加终止液，加入混合物三倍体积量的生理 盐水稀释。将稀释的组织样品过200目筛网，收集滤液，1800rpm，10min 快速离心。离心后弃上清，收集沉淀细胞，用生理盐水清洗一遍，1500rpm， 10min离心，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞按2×104个/cm2密度接种于培养瓶中， 置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。待细胞培养 到80～90％融合时，用含重量0.25％EDTA的胰酶消化，按1：2～1：5接种 到新培养瓶中培养。
如图5所示，细胞培养第10天间充质干细胞形态图。如图6所示，细 胞培养第22天细胞再次培养到80～90％融合。此时，收集细胞，取2×105个用于流式检测；取5×103个/cm2接种于培养孔板中，进行成骨、成脂肪、 成软骨诱导实验；剩余细胞按2×106个/ml永久冻存于液氮中。
4、D组采用本发明的方法制备间充质干细胞
将D组的底蜕膜组织块放入15ml离心管中，且加入底蜕膜组织块两倍 体积的Ⅰ型胶原酶37℃消化18～20h，消化完成后加入总体积1/4的胰酶， 混匀，放入37℃消化30min，每10min摇晃一次，使消化完全。
取出消化后的混合物，无需加终止液加入混合物三倍量的生理盐水清 洗，然后过200目筛网，1800rpm，10min快速离心。离心后弃上清，收集 沉淀细胞，用生理盐水清洗一遍，1500rpm，10min离心，获得胎盘底蜕膜 间充质干细胞。
获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞按2×104个/cm2密度接种于培养瓶中， 置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。待细胞培养 到80～90％融合时，用含重量0.25％EDTA的胰酶消化，按1：2～1：5接种 到新培养瓶中培养。
如图7所示，为细胞培养第3天间充质干细胞形态图。如图8所示， 细胞培养第7天细胞再次培养到80～90％融合。此时，收集细胞，取2×105个用于流式检测，实验结果如图9所示，图9a为胎盘底蜕膜来源的P2 代间充质干细胞的生长曲线图，从第4天起进入指数增长期，图9b为 胎盘底蜕膜来源的P2代间充质干细胞1～8天中的细胞活率，显示细胞 状态非常好，超过80％以上。图10显示胎盘底蜕膜来源的P2代间充质 干细胞的流式分析，CD45\HLA-DR\CD14\CD34\CD79a表达阴性， CD105\CD79\CD90表达强阳性，表明具有间充质干细胞特性。取5×103个 /cm2接种于培养孔板中，进行成骨、成脂肪、成软骨诱导实验；剩余细胞 按2×106个/ml永久冻存于液氮中。图11、12和13所示，获得的胎盘底蜕 膜间充质干细胞能够有效分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
综合上述对比，A、B、C、D四组的胎盘底蜕膜间充质干细胞从分离 到细胞培养到80～90％融合的时间依次为15天、28天、22天、7天。由此 可见，采用本发明的制备方法具有最短的制备时间，通过流式检测，得出 获得的间充质干细胞具有较好的质量和纯度。通过成骨、成脂、成软骨诱 导实验可得，获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞具有很好的分化能力。
以下对本发明的方法进行详细解释。
本发明的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，其中，Ⅰ型胶原酶、 胰酶、DMEM-F12培养基均采购自GIBCO公司。包括以下步骤：
S201、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右。
S202、将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中在37℃消化18～20h。Ⅰ型胶 原酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。
S203、加入胰酶在37℃下继续消化20～40min，然后进行过滤和离心， 获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原 酶消化后总体积的0.2～0.3倍。
S204、底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后 经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。将生理盐水加 入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
S205、将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于 培养瓶(采用DMEM-F12培养基)中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿 度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养。原代细胞培养过程中，细胞培 养到80～90％融合时，用含重量0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的 培养基与细胞的混合物按1：2～1：5体积比接种到新培养瓶(采用 DMEM-F12培养基)中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细胞。
S206、培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。 项目检测包括细胞流式检测以及进行成骨、成脂肪、成软骨诱导实验。冻 存条件为：细胞按2×106个/ml永久冻存于液氮中。
以下通过实施例对本发明进一步解释。
实施例1
本实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S201、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右。
S202、将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中在37℃消化18h。Ⅰ型胶原 酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。
S203、加入胰酶在37℃下继续消化20min，然后进行过滤和离心，获 得胎盘底蜕膜间充质干细胞。胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶 消化后总体积的0.2倍。
S204、底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后 经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。将生理盐水加 入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
S205、将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于 培养瓶中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原 代细胞培养。原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1:2体 积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细胞。 胎盘底蜕膜间充质干细胞从分离到细胞培养到80～90％融合的时间为8天。
S206、培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。
实施例2
本实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S201、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右。
S202、将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中在37℃消化18.5h。Ⅰ型胶原 酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。
S203、加入胰酶在37℃下继续消化30min，然后进行过滤和离心，获 得胎盘底蜕膜间充质干细胞。胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶 消化后总体积的0.25倍。
S204、底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后 经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。将生理盐水加 入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
S205、将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于 培养瓶中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原 代细胞培养。原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1:3体 积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细胞。 胎盘底蜕膜间充质干细胞从分离到细胞培养到80～90％融合的时间为7天。
S206、培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。
实施例3
本实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S201、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右。
S202、将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中在37℃消化19h。Ⅰ型胶原 酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。
S203、加入胰酶在37℃下继续消化35min，然后进行过滤和离心，获 得胎盘底蜕膜间充质干细胞。胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶 消化后总体积的0.27倍。
S204、底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后 经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。将生理盐水加 入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
S205、将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于 培养瓶中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原 代细胞培养。原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1:4体 积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细胞。 胎盘底蜕膜间充质干细胞从分离到细胞培养到80～90％融合的时间为7天。
S206、培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。
实施例4
本实施例的胎盘底蜕膜间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S201、从新鲜足月胎盘组织中剥取底蜕膜，用生理盐水对底蜕膜组织 进行清洗。尽量沥干底蜕膜组织表面的生理盐水，在玻璃皿中剪碎为底蜕 膜组织块，组织块的体积为1mm3左右。
S202、将Ⅰ型胶原酶加入底蜕膜组织块中在37℃消化20h。Ⅰ型胶原 酶的加入量是底蜕膜组织块体积的2倍。
S203、加入胰酶在37℃下继续消化40min，然后进行过滤和离心，获 得胎盘底蜕膜间充质干细胞。胰酶的加入量是底蜕膜组织块经Ⅰ型胶原酶 消化后总体积的0.3倍。
S204、底蜕膜组织块经胰酶消化后加入总体积三倍量生理盐水，然后 经过200目筛网过滤，1800rpm离心10min，获得沉淀细胞。将生理盐水加 入所述沉淀细胞，1500rpm离心10min，获得胎盘底蜕膜间充质干细胞。
S205、将获得的胎盘底蜕膜间充质干细胞以2×104个/cm2密度接种于 培养瓶中，将所述培养瓶置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原 代细胞培养。原代细胞培养过程中，细胞培养到80～90％融合时，用含重量 0.25％EDTA的胰酶消化，将原培养瓶中的培养基与细胞的混合物按1:5体 积比接种到新培养瓶中培养，细胞再次培养到80～90％融合时，收集细胞。 胎盘底蜕膜间充质干细胞从分离到细胞培养到80～90％融合的时间为8天。
S206、培养扩增得到的胎盘底蜕膜间充质干细胞用于项目检测或冻存。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护范围。