基于体外共培养激活NOTCH1信号通路的方法.pdf

本发明公开了一种基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，属于生物信息学技术领域。该方法将乳腺癌细胞和稳定表达Notch-1配体的间质细胞分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养后用PBS缓冲液清洗并收集稳定表达Notch-1配体的间质细胞；在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养间质细胞，按1:1-2:1将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞中培养而实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。本发明模拟在体内环境中癌细胞中Notch-1与间质细胞表达的Jagged-1相互作用来激活Notch-1信号通路，克服了传统方法中过表达的标准量难以确定、转染的效率难以确定、部分细胞没有被转染的缺陷，避免了过表达方法中过表达无法全面有效的激活Notch-1信号通路、所得生物学结果不客观的情况。

权利要求书
1.  一种基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将乳腺癌细胞和稳定表达Notch-1配体的间质细胞分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养；
（2）待步骤（1）中的两种细胞分别生长到80%的密度，用PBS缓冲液清洗并收集稳定表达Notch-1配体的间质细胞；
（3）在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养间质细胞，按1:1-2:1将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞中；共同培养0.5～48h，实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。

2.  根据权利要求1所述的基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的乳腺癌细胞为三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231。

3.  根据权利要求1所述的基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的稳定表达Notch-1配体的间质细胞为表达Jaddeg-1的小鼠成纤维细胞LTK-JAG细胞。

4.  根据权利要求1所述的基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PBS缓冲清洗并收集的步骤为将稳定表达Notch-1配体的成纤维细胞通过细胞收集刮收集至5ml PBS缓冲液中，离心1000×g，5分钟，弃上清。

5.  根据权利要求1所述的基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的培养的温度为37℃。

6.  根据权利要求1所述的基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的间质细胞为重悬步骤（2）中收集的稳定表达Notch-1配体的间质细胞。

说明书基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法
【技术领域】
本发明属于生物信息学技术领域，特别涉及一种基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法。
【背景技术】
Notch-1是参与乳腺癌的发展和进展的一个重要致癌基因。Notch信号通路在细胞增殖、细胞凋亡、分化、侵袭、血管生成、肿瘤的转移和乳腺癌干细胞自我更新的过程中起着非常关键的作用。它是跨膜蛋白受体家族，通过和配体结合激活其活性。迄今为止，该家族中有四个Notch受体（Notch-1、2、3、4）和5个配位体(Dll-1、Dll-3、Dll-4、Jagged-1和Jagged-2)已被确定。Notch和配体结合后，需要通过两步酶切形成最终的活性Notch（Notch细胞内部分intracellular Notch ICN）。最后执行剪切的酶是gamma-secretase(γ分泌酶)，使用小分子抑制剂GSI（gamma-secretase inhibitor）可以抑制γ分泌酶的活性，阻止最后的酶切反应，进而抑制Notch的信号转导。活化的Notch-1转移到细胞核内,主要通过结合转录因子CBF-1来调控基因表达。乳腺癌中，Notch-1是非常重要的致癌基因和新的药物靶点。但Notch-1如何调控癌细胞生存、生长的机制不清楚。
Notch的抑制剂GSI已经进入乳腺癌临床一/二期研究，（请参见http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=gamma-secretase++breast+cancer&Se arch=Search）。因此，研究Notch-1的致癌机理为临床使用靶向Notch-1的药物提供坚实的转化医学基础。在研究Notch-1的致癌机理的过程中，有效的在体外培养环境中激活Notch-1的信号通路成为成功揭示致癌机理的必备工具。
【发明内容】
为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法。本发明具体是通过将乳腺癌细胞与表达 Jadde-1的成纤维细胞共同培养，通过成纤维细胞分泌Jadde-1及模拟体内细胞接触实现稳定激活乳腺癌细胞中的Notch-1信号通路的目的。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种基于体外共培养激活Notch-1信号通路的方法，包括如下步骤：
（1）将乳腺癌细胞和稳定表达Notch-1配体的间质细胞分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养；
（2）待步骤（1）中的两种细胞分别生长到80%的密度，用PBS缓冲液清洗并收集稳定表达Notch-1配体的间质细胞；
（3）在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养重悬步骤（2）中收集的稳定表达Notch-1配体的间质细胞，按1:1-2:1的将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞中；共同培养0.5～48h，实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。
步骤（1）中：
所述的乳腺癌细胞优选为三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231；
所述的稳定表达Notch-1配体的间质细胞优选为表达Jaddeg-1的小鼠成纤维细胞LTK-JAG细胞；
所述的LTK-JAG细胞的制备方法请见文献：Lindsell C.E.,Shawber C.J.,Boulter J.,Weinmaster G.Jagged:a mammalian ligand that activates Notch1.Cell.1995;80:909-917；
所述的培养的条件优选为于37℃、体积分数5%的CO2中进行培养。
步骤（2）中所述的PBS缓冲清洗并收集的步骤优选为将稳定表达Notch-1配体的成纤维细胞通过细胞收集刮收集至5ml PBS缓冲液中，离心1000×g，5分钟，弃上清；
步骤（3）中所述的培养的条件优选为于37℃、体积分数5%的CO2中进行培养。
本发明的发明机理为：本方法模拟体内激活机制，使用表达Notch配体的Jagged-1小鼠成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养的方法，实现在体外激活Notch-1 的信号通路的目的。Notch传统信号通路如图1所示。Notch从细胞膜释放后，NIC（intracellular Notch）转移至细胞核并结合转录因子CBF-1来调控基因表达。没有Notch的状态下，CBF-1是基因表达抑制因子。它通过在启动子区结合辅抑制因子包括SMRT（silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptors），nCOR（Nuclear corepressor）和组蛋白去乙酰化酶抑制基因（HDAC1）表达。细胞核里的Notch取代这些辅抑制因子并结合辅激活因子包括组蛋白乙酰化酶PCAF、GCN5或p300以及MAML1(mastermindlike1)。Notch靶基因有HES(hairy enhancer of split genes)和HERP(HES-related repressor protein)、HEY家族、cyclin D、c-Myc、以及NF-кB转录因子家族。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
本发明中的基于乳腺癌细胞和表达Notch配体Jagged-1的成纤维细胞共培养的新方法在体外来激活肿瘤细胞Notch-1信号通路，相比于过表达的传统方法，该方法更好模拟在体内环境中癌细胞中Notch-1与间质细胞表达的Jagged-1相互作用来激活Notch-1信号通路，克服了传统方法中过表达的标准量难以确定、转染的效率难以确定、部分细胞根本没有被转染的缺陷；避免了过表达方法中过表达无法全面有效的激活Notch-1信号通路，所得生物学结果不客观的情况。本发明中两种细胞共培养的方法模拟在体内生理条件下跨膜蛋白受体Notch-1家族通过和配体结合激活其活性的特性，更加生物学的激活Notch-1信号通路。
【附图说明】
图1是Notch传统信号通路的示意图。
图2是实施例1中激活Notch信号通路的示意图
【具体实施方式】
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范 围并不限于此。
以下实施例中所用的三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231来源于ＡＴＣＣ，LTK-PAR（小鼠成纤维细胞不表达Jaddeg-1）和LTK-JAG细胞（小鼠成纤维细胞表达Jaddeg-1）由Dr.G.Weinmaster(University of California at Los Angeles,Los Angeles,CA)构建并提供。
实施例1
（1）将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR（小鼠成纤维细胞不表达Jaddeg-1）或LTK-JAG细胞（小鼠成纤维细胞表达Jaddeg-1）分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养，培养的条件为于37℃、体积分数5%的CO2中培养；
（2）传代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR或LTK-JAG细胞到第二天80%的密度，第二天，用PBS洗LTK-PAR或LTK-JAG细胞，用细胞收集刮收集LTK-PAR或LTK-JAG细胞至5ml PBS，离心1000×g，5分钟，弃上清；
（3）用含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养（于37℃、体积分数5%的CO2中培养；）重悬步骤（2）中收集的LTK-PAR或LTK-JAG细胞，按1:1将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞（不需要消化）中；共同培养24h，实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。共培养24h后，使用传统方法CBF-1荧光酶报告基因检测Notch-1信号通路活性，检测发现与LTK-PAR共培养的细胞相比，与LTK-JAG共培养的细胞其Notch信号通路活性提高2-5倍。
实施例2
（1）将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR（小鼠成纤维细胞不表达Jaddeg-1）或LTK-JAG细胞（小鼠成纤维细胞表达Jaddeg-1）分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养，培养的条件为于37℃、体积分数5%的CO2中培养；
（2）传代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR或LTK-JAG细胞到第二天80%的密度，第二天，用PBS洗LTK-PAR或LTK-JAG细胞，用细胞收集 刮收集LTK-PAR或LTK-JAG细胞至5ml PBS，离心1000×g，5分钟，弃上清；
（3）用含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养（于37℃、体积分数5%的CO2中培养；）重悬步骤（2）中收集的LTK-PAR或LTK-JAG细胞，按2:1将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞（不需要消化）中；共同培养48h，实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。共培养48h后，使用传统方法CBF-1荧光酶报告基因检测Notch-1信号通路活性，检测发现与LTK-PAR共培养的细胞相比，与LTK-JAG共培养的细胞其Notch信号通路活性提高3-5倍。
实施例3
（1）将三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR（小鼠成纤维细胞不表达Jaddeg-1）或LTK-JAG细胞（小鼠成纤维细胞表达Jaddeg-1）分别在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养，培养的条件为于37℃、体积分数5%的CO2中培养；
（2）传代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231，LTK-PAR或LTK-JAG细胞到第二天80%的密度，第二天，用PBS洗LTK-PAR或LTK-JAG细胞，用细胞收集刮收集LTK-PAR或LTK-JAG细胞至5ml PBS，离心1000×g，5分钟，弃上清；
（3）用含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养（于37℃、体积分数5%的CO2中培养；）重悬步骤（2）中收集的LTK-PAR或LTK-JAG细胞，按1.5:1将稳定表达Notch-1配体的间质细胞加入到乳腺癌细胞（不需要消化）中；共同培养0.5h，实现激活乳腺癌细胞中Notch-1信号通路。共培养0.5h后，使用传统方法CBF-1荧光酶报告基因检测Notch-1信号通路活性，检测发现与LTK-PAR共培养的细胞相比，与LTK-JAG共培养的细胞其Notch信号通路活性提高2-5倍。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。