说明书一种爱啡肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，尤其涉及一种爱啡肽的制备方法。
背景技术
爱啡肽，又名依非巴特、埃替非巴肽，英文名：Eptifibatide，分子式：C35H49NllO9S2，CAS登录号为148031-34-9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其结构为：
爱啡肽为抗血小板聚集剂，由美国COR Therapeuties公司与美国Schering-Plough公司共同研制开发。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美国首次上市，1999年以商品名Intrifiban在欧洲上市。异名IntrifibanTM，Sch-60936，C68-22，SB-1。
爱啡肽为环形肽，是血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受体拮抗剂，可阻断由各种激活剂引起的血小板聚集反应，是已知最强的特异性血小板聚集抑制剂，主要用于防止心肌供氧动脉闭塞，心脏病发作，不稳定性心绞痛、无Q波心肌梗塞、冠脉介入治疗引起的猝死。其优点在于：①对血小板糖蛋白IIb/IIIa受体的阻滞是可逆的，一旦出现不良反应可立即停药，不良反应轻。②选择性高，作用强。③本身几乎无抗原性，不会引起过敏反应。
临床研究结果显示，病人推注爱啡肽进行治疗，在术后48小时，死亡或严重问题的联合终点发生率（主要终点指标包括：心脏病发作、病死率及需要再次急诊介入或溶栓治疗率）比其他剂组减少了37%。死亡或心肌梗死发生率，爱啡肽组比其他剂组低40%。爱啡肽在急性冠脉综合征病人中呈剂量依赖性地抑制体外血小板的聚集，在健康志愿者和做PCI术的病人中能抑制纤维原与二磷酸腺苷活化的血小板结合。对急性冠脉综合症病人，二磷酸腺苷诱导的血小板聚集早在本品注射后5分钟即受到抑制，其在给药期持续的4～8小时内恢复正常。爱啡肽180μg/kg剂量静注和以每分钟2μg/kg速率静脉输注均能 达到抑制血小板聚焦80%以上，可减少患者围手术期缺血并发症50%～60%，而且，当肝素使用剂量合适时可不明显增加出血事件发生率。利用枸椽酸盐抗凝剂评价，本品抑制血小板聚焦作用较其它非鳌合型抗凝剂强2～4倍。本品可使急性冠脉综合征病人及进行PCI术病人的出血时间延长2～4倍（与其基线值相比），在停止输注本品后1小时内恢复正常。本品经大鼠、兔和猴的安全性评价试验，未见毒性反应的迹象，给猴连续静脉输注28天，每天剂量高达7.2mg/kg也未见毒性表现。
目前，爱啡肽的合成方法很多，有些采用液相合成方法，有些采用固相合成方法；有些采用片段合成的方法，有些采用逐个偶联的方法；但现有的这些方法普遍存在着：合成步骤多、工艺复杂，难以工业化的缺点。并且在固相合成中，Cys极易产生消旋产物杂质；Gly在偶联过程中也容易产生双Gly杂质。因此，目前的爱啡肽产品中往往都含有大量的杂质，严重影响了用药的安全性。研究表明，采用现有方法制备爱啡肽，其收率虽可达到50%以上，但产品中的单杂含量却往往高达0.5%左右。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种杂质含量低而纯度高的爱啡肽的制备方法。
本发明提供的爱啡肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：合成Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin；
步骤2：按照爱啡肽的肽序，采用固相合成法在Fmoc-Cys（x）-Resin依次偶联-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得爱啡肽线性树脂，经裂解制得线性爱啡肽；
步骤3：取线性爱啡肽，经氧化制得爱啡肽粗品，经纯化，即得；
其中，合成的Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin中，x为Cys的侧链保护基，合成Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin的温度为-10℃～10℃；
偶联中，-Gly的偶联反应温度为-10℃～10℃，-Pro、-Trp、-Asp、-Har、-Mpr的偶联反应温度为15℃～30℃；
氧化采用液相氧化，氧化液的pH值为7.0～8.0。
作为优选，合成Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin的温度为-5℃～5℃。
D-Cys杂质与目的肽的性质非常相近，通过纯化手段去除将大大损失收率，本发明通过低温反应减少D-Cys杂质的产生，使其在制备的爱啡肽产品中含量低于0.15%。
作为优选，-Gly的偶联反应温度为-5℃～5℃。
现有爱啡肽制备过程中，极易产生双甘氨酸杂质，此类杂质与目的肽的性质非常相近，通过纯化手段去除将大大损失收率，本发明通过低温反应减少双甘氨酸杂质的产生，使其在制备的爱啡肽产品中含量低于0.15%。
作为优选，氧化液的pH值为7.2～7.5。
优选的，氧化液采用体积分数为30%的双氧水水溶液。
本发明通过液相氧化得到爱啡肽，液相氧化可以减少杂质产生并且减少“废水、废渣、废气”的产生。氧化液的pH值为7.2～7.5，既可以保证氧化速率又可以降低爱啡肽产品在氧化液中的溶解度，避免因大量溶解而产生的回收困难的问题。
作为优选，偶联的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物。
作为优选，裂解的裂解液为三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的混合物。
优选的，裂解液中三氟乙酸、水和三异丙基硅烷的体积比为90:5:5。
作为优选，偶联中，-Trp采用的侧链保护基为Boc、-Asp采用的侧链保护基为OtBu、-Har采用的侧链保护基为Pbf、-Mpr采用的侧链保护基为Trt。
作为优选，Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin中-Cys的侧链保护基为Trt。
作为优选，纯化采用RE-HPLC。
本发明提供的爱啡肽的制备方法，包括以下步骤：合成Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin；按照爱啡肽的肽序，采用固相合成法在Fmoc-Cys（x）-Resin依次偶联-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得爱啡肽线性树脂，经裂解制得线性爱啡肽；取线性爱啡肽，经氧化制得爱啡肽粗品，经纯化，即得；其中，合成Fmoc-Cys（x）-Rink amide Resin的温度为-10℃～10℃；偶联中，-Gly的偶联反应温度为-10℃～10℃，-Pro、-Trp、-Asp、-Har、-Mpr的偶联反应温度为15℃～30℃；氧化采用液相氧化，氧化液的pH值为7.0～8.0。本发明通过低温反应减少双甘氨酸及D-Cys杂质的产生，使单杂含量在制备的爱啡肽产品中含量低于0.15%。通过液相氧化得到爱啡肽，液相氧化可以减少杂质产生并且减少“废水、废渣、废气”的产生。氧化液的pH值为7.2～7.5，既可以保证 氧化速率又可以降低爱啡肽产品在氧化液中的溶解度，避免因大量溶解而产生的回收困难的问题。实验表明，以本发明提供的方法制备爱啡肽，收率可达30%，单杂含量皆低于0.15%，爱啡肽的纯度大于99%。而现有技术中的制备方法皆无法使产品中的单杂含量低于0.5%。
附图说明
图1示本发明实施例17制得的爱啡肽纯品的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种爱啡肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，本发明采用试剂的中英文名称对照如表1所示：
表1本发明采用试剂的中英文名称对照
缩写及英文含义
Fmoc9-芴甲氧羰基
DIC二异丙基碳二亚胺
HOBt1-羟基苯并三唑
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DCM二氯甲烷
TFA三氟乙酸
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DCM二氯甲烷
DICN,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt1-羟基苯并三唑
TIS三异丙基硅烷
MeOH甲醇
Har或HArg高精氨酸
Mpr三-巯基丙酸
Rink amide Resin氨基树脂
Pbf2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
Boc叔丁氧羰基
Trt三苯甲基
OtBu叔丁氧基
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1～3Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin的合成
取Rink amide Resin树脂5kg（sub=0.5mmol/g,合成规模2.5mol），加入到反应柱中，用15L DMF洗涤两次后用15L DMF溶涨30分钟以上，用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次10分钟，脱去Fmoc保护后用15LDMF洗涤六次。称取Fmoc-Cys（Trt）-OH(4.4Kg,7.5mol)和HOBt(1.2kg,9mol)用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入反应中，0±10℃反应2小时。茚三酮检测呈阴性后反应结束。用15L DMF洗涤6次，得Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
表2实施例1～4
Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin的合成温度
实施例10℃
实施例2-10℃
实施例310℃
实施例4～6爱啡肽线型树脂的制备
Fmoc-Pro-OH偶联：取实施例1～3制备的Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Cys（Trt）-Rink amide Resin,然后用15L DMF洗涤6次。将Fmoc-Pro-OH(2.5g,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加 入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用15L DMF洗涤3次，得Fmoc-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Trp(Boc)-OH偶联：取Fmoc-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟得到H-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用15L DMF洗涤6次。将Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.9kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol)，活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用15L DMF洗涤3次，得Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联：取Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.1kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Gly-OH偶联：取Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-Gly-OH(2.2kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L DMF溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，反应温度控制在0±10℃反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH偶联：取Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH(5.0kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Fmoc-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Mpr(Trt)-OH偶联：取Fmoc-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Mpr(Trt)-OH(2.6kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L，9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Mpr(Trt)-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。用20L甲醇缩干线型肽树脂，真空干燥得到爱啡肽线型树脂。
表3实施例4～6
实施例7～9线型爱啡肽的制备
取实施例4～6中制备的爱啡肽线型树脂加入到150L裂解柱中，配置裂解 试剂85L（体积比，TFA:H2O：TIS=90：5:5），冰冻2小时以上，将已冰冻裂解试剂倒入裂解柱，室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至850L冰冻乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到线型爱啡肽。
表4实施例7～9
爱啡肽线型树脂来源爱啡肽线型树脂的质量获得线型爱啡肽的质量
实施例7实施例48.5kg2.2kg
实施例8实施例58.4kg2.1kg
实施例9实施例68.6kg2.3kg
实施例10～12线型爱啡肽的环化
取实施例7～9中得到的线型爱啡肽用44L甲醇和396L水搅拌溶解，调节pH值为7.0～8.0。缓慢加入660mL30%双氧水，室温氧化1个小时以上，采用HPLC监控直至氧化完全。反应完全后过滤，得到环状爱啡肽粗品溶液。
表5实施例12～14
线型爱啡肽来源氧化液pH值
实施例107.0
实施例117.2
实施例128.0
对比例1Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin的合成
合成温度采用25℃，其余条件与实施例1～3提供的方法相同，具体为：
取Rink amide Resin树脂5kg（sub=0.5mmol/g,合成规模2.5mol），加入到反应柱中，用15L DMF洗涤两次后用15L DMF溶涨30分钟以上，用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次10分钟，脱去Fmoc保护后用15LDMF洗涤六次。称取Fmoc-Cys（Trt）-OH(4.4Kg,7.5mol)和HOBt(1.2kg,9mol)用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入反应中，25℃反应2小时，并设置室温反应对照试验。茚三酮检测呈阴性后反应结束。用15L DMF洗涤6 次，得Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
对比例2爱啡肽线型树脂的制备
在Fmoc-Gly-OH的偶联过程中，温度采用25℃，其余条件与实施例4～6所述的方法一致，具体为：
Fmoc-Pro-OH偶联：取比较例1制备的Fmoc-Cys（Trt）-Rink amide Resin用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Cys（Trt）-Rink amide Resin,然后用15L DMF洗涤6次。将Fmoc-Pro-OH(2.5g,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用15L DMF洗涤3次，得Fmoc-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Trp(Boc)-OH偶联：取Fmoc-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用15L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟得到H-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用15L DMF洗涤6次。将Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.9kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol)，活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用15L DMF洗涤3次，得Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联：取Fmoc-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.1kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得 Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-Gly-OH偶联：取Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rinkamide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-Gly-OH(2.2kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L DMF溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，反应温度控制在25℃反应2h，并设置室温反应对照试验。（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH偶联：取Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin，用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH(5.0kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L,9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Fmoc-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。
Mpr(Trt)-OH偶联：取Fmoc-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin用20L20%哌啶/DMF溶液（DBLK）脱Fmoc两次，每次8分钟，得到H-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。然后用20L DMF洗涤6次。将Mpr(Trt)-OH(2.6kg,7.5mol)，HOBt(1.2kg,9mol)，用6.5L的DCM和DMF混合溶液(V/V=1：1)溶解，将混合液降温至0℃后加入活化剂DIC(1.5L，9.75mol),活化5分钟后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束，用20L DMF洗涤3次，得Mpr(Trt)-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys（Trt）-Rink amide Resin。用20L甲醇缩干线型肽树脂，真空干燥得到爱 啡肽线型树脂8.3kg。
对比例3线型爱啡肽的制备
制备方法与实施例7～9中提供的一致，具体为：
取比较例2中制备的爱啡肽线型树脂加入到150L裂解柱中，配置裂解试剂85L（体积比，TFA:H2O：TIS=90:5:5），冰冻2小时以上，将已冰冻裂解试剂倒入裂解柱，室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至850L冰冻乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到线型爱啡肽2.1kg。
对比例4线型爱啡肽的环化
取实施例7～9中得到的线型爱啡肽用44L甲醇和396L水搅拌溶解，调节pH值为8.5。缓慢加入660mL30%双氧水，室温氧化1个小时以上，采用HPLC监控直至氧化完全。反应完全后过滤，得到环状爱啡肽粗品溶液。
实施例15环状爱啡肽粗品的纯化及鉴定
取实施例10～12任一项制备的环状爱啡肽粗品溶液、及对比例4制得的环状爱啡肽粗品溶液，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。采用RE-HPLC进行纯化，转盐、冻干，即得爱啡肽纯品。
RE-HPLC色谱条件为：采用Novasep LC450色谱系统，反相C18柱，流动相A相采用50mmol/L的磷酸二氢钾溶液，流动相B相采用纯乙腈。流速为6L／min。
经预测，爱啡肽的分子量为831.9，经质谱检测，实施例10～12任一项制备的环状爱啡肽粗品及对比例4制得的环状爱啡肽粗品的分子量皆为832，能够符合预期，证明本发明成功制备了爱啡肽。
经色谱检测，本发明制得的爱啡肽纯品的色谱检测结果如表6所示，其中对实施例10制得的爱啡肽纯品的色谱图如图1所示，本发明实施例11～12制得的爱啡肽纯品的色谱图与此相似。
表6本发明提供方法制备的爱啡肽与现有技术制得爱啡肽质量鉴定
实验结果表明：以本发明提供的方法制得的爱啡肽，虽然产率较采用常规方法制备的有所降低，但是其中单杂的含量显著低于采用常规方法制备的产品，且产品纯度要远远高于采用常规方法制备的产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。