一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应 用 【技术领域】
本发明属于生物技术领域， 涉及微小核糖核酸 (microRNA， 简称 miRNA) 的应用， 具体涉及一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 组合， 以及包含对应于所述 miRNA 组合的 TaqMan 探针组合的试剂盒。背景技术
食管鳞状细胞癌是一种原发于食管的恶性肿瘤， 占食管癌 90％以上， 进行性吞咽 困难为其典型的临床表现。食管鳞状细胞癌具有高发病率、 高死亡率和低检出率的二高一 低特点。目前， 全球范围内食管鳞状细胞癌发病率居各种肿瘤第八位， 死亡率居第六位。全 球每年新增食管鳞状细胞癌人数 41 万， 死亡约 31 万。我国是食管鳞状细胞癌高发区， 年平 均死亡率为 14.59/10 万， 年平均死亡 15 万人， 占消化系统肿瘤第二位， 仅次于胃癌。 食管鳞 状细胞癌早期症状不明显， 有临床症状而到医院就诊时部分患者已为中晚期。目前外科手 术切除仍是治疗食管鳞状细胞癌的主要方法， 我国食管鳞状细胞癌的外科手术切除率已达 80％～ 90％， 术后 5 年生存率为 25％～ 30％， 而早期食管鳞状细胞癌的 5 年生存率达 90％ 以上。由此可见食管鳞状细胞癌的早期诊断是提高其存活率的关键和重要前提条件。
目前临床使用的诊断方法包括影像学、 内镜检查与组织活检、 食管粘膜脱落细胞 学检查等， 但这些方法在早期诊断上都有一定的缺陷 ： 影像学对早期食管鳞状细胞癌变的 诊断有一定的局限性， 而组织细胞检测有其固有的缺陷， 取材不当或人为经验不足等都将 导致误诊。 尽管已发现一些肿瘤标志物， 如鳞状细胞癌抗原和癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen， CEA) 等， 但对食管鳞状细胞癌诊断的敏感度及特异度远达不到临床要求。目前食 管鳞状细胞癌临床治疗效果和中位生存期都不令人满意， 防治形势异常严峻。 因此， 寻找特 异性高和敏感性好的食管鳞状细胞癌标志物迫在眉睫。
微小核糖核酸 (microRNA， miRNA) 是一类长约 19 至 23 个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子， 其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA 通过与靶 mRNA 3’ 端非 翻译序列完全或部分互补结合， 导致靶 mRNA 降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表 达。miRNA 参与 1/3 人类蛋白编码基因调控， 它与多种生理活动有关， 如生长发育、 细胞增 殖、 细胞凋亡、 细胞分化等 ； 也与许多疾病的发生发展密切相关， 如糖尿病、 心血管疾病、 肿 [1-3] 瘤等。最近的研究显示 ， miRNA 在肿瘤发生、 发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。 已证实， 肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些 miRNA 表达水平发生了变化， 相对于正常组织， 一些 miRNA 表达量显著上升或下降。 许多癌组织如肺癌、 乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特 异性 miRNA 的表达， 提示 miRNA 有肿瘤组织特异性。另外， miRNA 的表达也与肿瘤分化程度 miRNA 可作为新的肿瘤标志物， 且为肿瘤的基因治疗 以及预后有关。大量的研究结果揭示， 提供新靶点。但组织标本取材属创伤性检出， 且无法实现肿瘤的早期诊断和预后判断。最 [4-8] 近报道显示 ， 人血清 / 血浆中也存在丰富、 稳定的 miRNA， 一些肿瘤包括非小细胞肺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 卵巢癌和胰腺癌患者血清中 miRNA 表达谱与正常人有显著差异， 均有各自特异的表达谱， 同时这种变化还可见于早期癌中。
目前尚没有利用无创伤性、 取材方便的血液标本检测判断与食管鳞状细胞癌相关 的特异性 miRNA 组合及检测试剂盒。 发明内容 本发明的目的就在于通过研究食管鳞状细胞癌患者血清 miRNA 的特异性变化， 筛 选出与正常人表达差异显著的一组血清 miRNA， 并利用这些 miRNA 的 TaqMan 探针制备出适 用于临床诊疗用途的试剂盒， 为实现食管鳞状细胞癌早期诊断提供特异性的中间结果以及 迅速的无创伤性检测手段。
本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的 ：
一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 组合， 该 miRNA 组合包括下列 miRNA ： miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223。
所述的 miRNA 组合进一步包括以下 miRNA 中的一种或多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
一种用于检测食管鳞状细胞癌相关的 miRNA 的探针组合， 其特征在于该探针组合 包括权利要求 1 所述 miRNA 的探针的组合。进一步， 该探针组合还包括以下 miRNA 探针中 的一种或多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
所述的探针组合为 ： SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 ； 进 一步， 该探针组合还包括以下 miRNA 探针中的一种或多种 ： SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.7。
上述的任一 miRNA 组合或任一探针组合在制备检测食管鳞状细胞癌的试剂或工 具中的应用。
一种用于检测食管鳞状细胞癌的检测试剂盒， 该试剂盒包含上述任意一项探针 组合 ； 所述试剂盒还可以包括 Taq 酶、 dNTP、 氯化镁和 PCR 缓冲液 (PCR 缓冲液为通用的 2+ 10×PCR 缓冲液， 不含 Mg )。
以下是对本发明的进一步描述 ：
一 种 用 于 检 测 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 miRNA 组 合， 其 包 括 下 列 miRNA ： miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223。该 miRNA 组合可以进一步包括以下 miRNA 中的一种或 多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
上述 miRNA 组合的筛选方法包括以下步骤 ( 见图 1) ：
(1) 收集食管鳞状细胞癌患者混合血清或血浆， 提取总 RNA ；
(2) 采 用 高 灵 敏 度、 高 精 确 性 和 高 重 复 性 的 Solexa 测 序 技 术 (Solexa sequencingtechnology)， 对上述总 RNA 中已知的人成熟 miRNA(miRBase12.0， 共 692 种 ) 进 行检测， 与年龄、 性别匹配的非癌对照组比对后初筛出食管鳞状细胞癌患者血清中表达显 著升高的 miRNA ；
(3) 用实时荧光定量 PCR 方法 (TaqMan 探针法 ) 对一组标本进行逐个检测， 从 Solexa 方法初筛出的 miRNA 中复筛出表达差异显著的 miRNA ；
(4) 进一步用定量 PCR 方法对大批量标本进行逐个验证， 筛选出稳定的表达差异 显著的一组 miRNA。
(Solexa 初筛的目的是筛选出食管鳞癌组和正常组之间有显著差异的 miRNA， 更 侧重于定性和趋势 ； 复筛采用的是准确的荧光定量 PCR， 对单个样本中每个 miRNA 的含量进 行测定， 则侧重于定量 ； 荧光定量 PCR 是对 Solexa 初筛定性的基础上进一步精确定量， 两者 是一致的， 只是侧重点不同 )。
具体来说， 上述筛选方法包括以下步骤 ： (1) 分别收集正常及食管鳞状细胞癌的 混合血清或血浆， 并提取总 RNA ； (2) 根据已知的人 692 种成熟 miRNA， 运用 Solexa 测序技 术对上述 RNA 进行测序和检测， 初筛出食管鳞状细胞癌与非癌对照组表达差异显著的一些 miRNA ； (3) 将抽提的 RNA 逆转录为 cDNA， 采用荧光定量 PCR(TaqMan 探针法 ) 对初筛出的 miRNA 进行复筛和验证， 挑选出稳定、 特异表达的一组 miRNA。
本 发 明 使 用 的 检 测 方 法 可 以 选 自： RT-PCR 方 法、 Solexa 测 序 技 术 (Solexasequencing technology)、 Real-time PCR 方法中的一种或几种。例如， 血清中 miRNA 分子的检测方法包括以下步骤 ：
(1) 使用 Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 ) 提取血清总 RNA ；
(2) 通过 RNA 逆转录反应得到 cDNA ；
(3) 根据人全部六百多个成熟体 miRNA 设计引物进行 PCR 反应 ；
(4) 进行 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 ；
(5)EB 染色后在紫外灯下观察结果。
在所述步骤 (5) 之后还可以包括下列步骤 ： 用 TaqMan 探针法检测并比较病人血清 样本相对于正常血清中 miRNA 的量的变化。
本发明还提供了一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 的探针组合， 其包括下列 miRNA 的 TaqMan 探针的组合 ：
上述 TaqMan 探针组合可以进一步包括以下 miRNA TaqMan 探针中的一种或多种 ：
此外， 本发明提供了上述 miRNA 组合或上述 TaqMan 探针组合在制备检测食管鳞状 细胞癌的试剂或工具中的用途。
本发明还提供一种用于检测食管鳞状细胞癌的试剂盒， 该试剂盒含有下列探针 ：
上述试剂盒可以进一步包括以下 TaqMan 探针中的一种或多种 ：
在 本 发 明 的 一 个 具 体 实 施 方 案 中， 上 述 试 剂 盒 包 括 Taq 酶 和 dNTP， 氯 化 镁、 2+ 10×PCR 缓冲液 ( 不含 Mg ) 和包括正常血清中稳定存在且可检测到的全部 miRNATaqMan 探针 (ABI 公司提供， 专用于 miRNA 荧光定量 )。
本发明所述食管鳞状细胞癌包括各种病理分化程度以及各种临床分期食管鳞状 细胞癌。 具体而言， 所述食管鳞状细胞癌可以是高分化、 中分化和低分化 ； 可以是临床 I 期、 II 期、 III 期和 VI 期。
本发明所述的 miRNA 组合及其对应的探针组合， 以及含有所述探针组合的试剂盒 可应用于食管鳞状细胞癌的检测之中。
本发明的有益效果 ：
首先， 血清相对其它组织较易获得， 与食管组织活检相比， 属于无创性检查， 极大 地方便了医疗人员的使用， 更减轻了患者的痛苦 ；
其次， 血清中的 miRNA 反映的是机体整体的病理、 生理情况， 其检测结果具有精确 而详细的指导意义 ；
第三， 所筛选出的 miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的灵敏度显著高于目前临床 上使用的肿瘤标志物 CEA， 大大提高了诊断的准确性。此外， 血清 miRNA 检测能在分子水 平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态， 并为食管鳞状细胞癌的治疗提供了潜在靶 点；
第四， 本发明所筛选出的食管鳞状细胞癌血清 miRNA 组合与至今已报道 [4-8] 的其 他肿瘤患者血清中特异变化的 miRNA 不尽相同 ；
第五， 本发明的试剂盒所包含的 TaqMan 探针同样是基于 Solexa 技术、 定量 PCR 技 术筛选出的在食管鳞状细胞癌与正常状态下表达差异显著的一组血清 miRNATaqMan 探针， 这样可以增加检测的灵敏度和特异性， 提高检测水平。
综上所述， 本发明提供的特异的 miRNA 组合作为诊断食管鳞状细胞癌的中间结 果， 有助于医师结合临床症状、 病史或其他检查信息进行食管鳞状细胞癌的诊断。 检测血清 中的 miRNA 简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清 miRNA 的试剂盒投入实践使 用， 仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通过最精简的 TaqMan 探针库来检测血清 miRNA 水平能拓展食管鳞状细胞癌的检测指标， 提高检测的灵敏度， 丰富检测食管 鳞状细胞癌的手段， 这些血清 miRNA 有望成为诊断食管鳞状细胞癌的重要标志分子， 具有 极重要的临床应用潜力和价值。 附图说明
图 1 为本发明的主要流程图。
图 2 为 TaqMan 探针定量 PCR 方法的标准曲线。
图 3 为 TaqMan 探针定量 PCR 方法的重复性。
A.miRNA 提取方法的重复性 ； B. 定量 PCR 方法的重复性。
图 4 为筛选出的每种 miRNA(A-G)、 7 种 miRNA 的组合 (H) 以及 CEA(I) 在食管鳞状 细胞癌与非癌对照中的 ROC 曲线。
食管鳞状细胞癌 149 例， 非癌对照者 100 例。 具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。 实施例 1 ： 食管鳞状细胞癌的特异 miRNA 表达谱初筛
(1) 分别收集未转移、 转移食管鳞状细胞癌以及正常者血清标本 86 例、 55 例和 40 例， 三组标本分别混合 ；
(2) 分别提取三组混合血清中的 RNA， 具体方案为 ： 利用 Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 ) 提取总 RNA， 得到的上清液使用酚氯仿三步法进一步去除蛋白等杂质提纯 RNA ；
(3) 对三组混合血清总 RNA 进行 Solexa 测序分析。
具体方案为 ： Solexa 测序法的基础是单分子克隆阵列技术， 能够在整个基因组水 平上区分单个碱基的差别， 从而区分个体间的差异。先将接头连接到小分子 RNA 片段上， 再 经 PCR 扩增后制成库。随后在含有接头的芯片上加入已连接接头的小分子 RNA， 经反应， 将 不同片段扩增。 在下一步反应中， 四种荧光标记的染料用边合成边测序的原理， 在每个循环 过程里， 荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第 一个碱基配对， 通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互 补碱基的配对被延伸， 利用生物发光蛋白， 比如萤火虫的荧光素酶， 可通过碱基加到引物后 端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。 针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的 核苷的标记， 这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特 定的结合到每个片断上的碱基。 通过上述的结合， 检测可以重复几十个循环， 这样就有可能 决定核苷酸片断中的几十个碱基。最后再比对序列， 筛选出所要得到的 miRNA 的拷贝数。
(4)Solexa 分析食管鳞状细胞癌与正常血清中表达差异显著的 miRNA ；
人类 miRNA 数据库 (miRbase 12.0 和 Sanger data 最新版本 ) 中包含的 miRNA 共 有 692 种， 采用 Solexa 技术检测血清中所有 692 种 miRNA 序列和拷贝数值， 拷贝值反映各 种 miRNA 的表达量。 若拷贝数＝ 0 表示血清中没有该 miRNA， 拷贝数值越大， 其相对的 miRNA 的表达量越多。
若 miRNA 在三组中的拷贝数都大于 50， 同时与正常血清的 Solexa 测序结果相比， 未转移及转移食管鳞状细胞癌拷贝数均上升， 变化倍数大于 2.0， 且与对照组绝对值之差大
于 70 时， 被认为显著变化， 否则视为不变化。结果发现， 在检测的 692 种 miRNA 中， 共有 25 种在患者混合血清中显著升高 ( 详见表 1)。
表 1Solexa 测序初筛出的在食管鳞状细胞癌血清中表达上调的 miRNA
实施例 2 ： 血清中 miRNA 的实时荧光定量 PCR 实验 (TaqMan 探针法 )
采用定量 PCR 方法对批量标本逐个验证， 从 Solexa 方法初筛出的 miRNA 中筛选出 表达差异显著 miRNA。
首先将提取的血清总 RNA 反转录成 cDNA。针对每一种 miRNA， 设计一个含相同茎 环结构的基因特异性反向引物， 利用 miRNA 特异性反向引物进行逆转录， 得到含共同茎环 结构但属于特定 miRNA 的 cDNA(ABI 公司产品 )。
仪器使用的是 ABI Prism 7300 荧光定量 PCR 仪。
本实验以不同浓度人工合成的 miR-16 成熟体作标准曲线。人工合成的 miR-16 原 液逆转录成 cDNA， 用 DEPC 水分别稀释成 107、 106、 105、 104 和 103fmol/L 浓度梯度。 miR-16 的
cDNA 需单独逆转， 反应体系为 ： 2μl RNA、 2μl 5×AMV 缓冲液、 1μl10mM 各种 dNTP 混合物 (Takara 公司 )、 0.5μl AMV(Takara 公司 ) 以及 1μl miR-16 逆转录引物 ( 美国 ABI 公司 提供， 专用于 miRNA 逆转录 )， 用 3.5μl DEPC 水补足体积至 10μl。
用 作 标 准 曲 线 的 miR-16 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 ： 1μl cDNA、 0.3μl Taq 酶 (Takara 公司 )、 0.33μl TaqMan 探针 ( 由 ABI 公司提供， 专用于 miRNA 荧光定量 )、 1.2μl 25mMMgCl2、 0.4μl 2.5mM 各种 dNTP 混合物 (Takara 公司产品 )、 2μl 10×PCR 缓冲液以及 14.77μl DEPC 水。
待测标本中的每种 miRNA 检测时所采用的逆转录体系和荧光定量 PCR 反应体系同 用作标准曲线的人工合成的 miR-16， 不过每种 miRNA 用各自特有的逆转录引物和 TaqMan 探 针 ( 由 ABI 公司提供 )。数据处理方法为相对的绝对定量法， 即每次进行荧光定量 PCR 时， 7 6 将所需检测的样本与标准曲线 ( 人工合成 miR-16 的 10 ， 10 ， 105， 104 和 103fmol/L 五个浓 度梯度 ) 同时进行 PCR 扩增， 扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值， 然后根据标准品 miR-16 的浓度及每个浓度对应的 CT 值绘制标准曲线 ( 图 2)( 此标准曲线是以 miR-16 绘制 的标准曲线 ； CT 值的计算是公知的 ； 图中的 R 指代的是 pearson 相关系数， 可以从侧面反映 出所作直线的斜率， 计算方式可以通过 Excel 绘制散点图并添加趋势线得到， 也可通过其 他常用统计软件如 spssl3.0， statistics6.0 等计算 ) 并根据此标准曲线及待测样本的 CT 值计算出该样本所需测定的 miRNA 相对的绝对含量。
评估所采用的定量 PCR 方法的重复性 ： 1.miRNA 提取方法的重复性 ： 取 20 例正常 人血清， 混合后分成相同的两份 ( 每份 500μl)， 分别提取其总 RNA， 然后用定量 PCR 方法测 定表达水平从低到高的 20 种 miRNA( 包括 miR-7， 10a， 21， 22， 23a， 100， 127-3p， 133a， 148b， 185， 223， 320a， 342-5p， 345， 423-5p， 483， 484， 221， 222， 874) 这 20 种 miRNA 是 随 机 选 择 的， 包含表达量由低到高的三类 miRNA， 是为了说明提取各种浓度的 miRNA 都有较好的重复 性 )， 每种 miRNA 重复测定 3 次， 取平均值。 相关性分析显示， 两份标本所测结果的相关系数 2 (pearson’ s 系数 ) 接近 1(R ＝ 0.9897)( 图 3A)， 提示 miRNA 提取方法重复性好。2. 定量 PCR 方法的重复性 ： 另取 20 例正常人血清， 混合后提取总 RNA， 将 RNA 分成相同的两份， 然后 用定量 PCR 方法测定上述 20 种 miRNA。同样， 每种 miRNA 重复 3 次， 取平均值。相关性分析 2 显示， 两份 RNA 所测结果的相关系数接近 1(R ＝ 0.9973)( 图 3B)， 表明本发明所采用的定 量 PCR 方法具有很好的重复性。
实施例 3 ： 定量 PCR 方法对初筛出的血清 miRNA 复筛
用 TaqMan 定量 PCR 方法对一组受试者标本进行逐个检测， 从 Solexa 方法初筛出 的 25 种 miRNA 中筛选出患者组与对照组之间表达差异显著的 miRNA( 具体步骤参见实施例 2)。该组食管鳞状细胞癌患者 36 例， 以年龄、 性别匹配的无癌 33 例作对照 ( 病人详细临床 信息见表 2)。结果发现， 初筛出的 25 种 miRNA 中有 7 种 miRNA 在患者组中表达量显著高 于对照组 ( 含量表示方法为均值 ± 标准差 ； 变化倍数为 1.65 ～ 2.97 倍， p ＜ 0.0001)， 这 7 种 miRNA 是 miR-10a、 miR-22、 miR-100、 miR-148b、 miR-223、 miR-133a 和 miR-127-3p( 见 表 3)。
表 2 受试者的临床信息
表 3 定量 PCR 方法复筛出的 miRNA非参 Mann-Whitney 检验
实施例 4 ： 定量 PCR 方法对复筛出的血清 miRNA 的临床验证
将复筛出的 7 种 miRNA 进一步用定量 PCR 方法在大批量临床标本中进行验证， 筛 选出稳定的、 表达差异显著的 miRNA。临床研究的受试者食管鳞状细胞癌患者 113 例， 以年 龄、 性别匹配的无癌 67 例作对照 ( 两组的详细临床信息见表 4)。验证结果证实， 复筛出的 7 种 miRNA 在大批量患者标本中表达量显著高于对照 ( 含量表示方法为均值 ± 标准差 ； 是
对照组的 1.69 ～ 2.57 倍， p ＜ 0.0001)( 结果见表 5)。
表 4 临床验证受试者的临床信息
表 5 定量 PCR 方法对复筛出的 miRNA 用大批量标本验证结果
非参 Mann-Whitney 检验实施例 4 ： 筛选出的 miRNA 临床价值评估
运用不同的 miRNA 组合对病人与正常人之间进行聚类分析。在验证组中 ( 患者 n ＝ 113， 对照＝ 67)， miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223 等 4 种 miRNA 的组合能将 85.8％ (97/113) 的癌患者与正常对照区分开来， 同时也将 76.1％正常对照 (51/67) 与癌患 者正确区分开。 而 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223、 miR-10、 miR-100 和 miR-133a 等 7 种 miRNA 的组合能将 77.9％癌患者 (88/113) 与正常对照区分开来， 同时也将 80.1％正常 对照 (55/67) 与癌患者正确区分开。将复筛组和验证组血清标本综合起来 ( 患者 n ＝ 149， 对照 n ＝ 100) 对早期癌患者 ( 包括临床 I、 II 期， 共 106 例 ) 和正常对照标本聚类分析发 现， 7 种 miRNA 的组合可将绝大多数早期癌患者 (80.2％， 85/106) 与正常对照区 (80.0％， 80/100) 分开来。说明 miRNA 组合可应用于食管鳞状细胞癌的早期诊断。
将复筛组和验证组血清标本综合起来 ( 患者 n ＝ 149， 对照 n ＝ 100)， 根据每份标 本血清 miRNA 的表达量绘制 ROC 曲线和计算曲线下面积 (AUC) 评估筛选出的 miRNA 对食管 鳞状细胞癌诊断的准确性 ( 图 4A-G)， 并与目前临床上使用的肿瘤标志物 CEA 进行比较 ( 图 4I)。结果发现这 7 种 miRNA 的 AUC 在 0.72 ～ 0.84 之间， 均大于 CEA(AUC ＝ 0.55)( 见表 6)。进一步将 7 种 miRNA 组合在一起， 根据每份标本 ( 包括患者和对照 ) 的危险分数值绘 制 ROC 曲线 ( 图 4H)， 当最适 cut-off 为 2.41 时， miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感 性 (66％ ) 是 CEA(13％ ) 的 5 倍 ( 表 7)。说明 miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感性 远高于目前临床上所使用的肿瘤标志物。
表 6 筛选出的 miRNA 和 CEA 的 AUC
表 7miRNA 组合和 CEA 的 ROC 曲线分析
实施例 5 ： 用于检测血清 miRNA 的试剂盒
用于检测食管癌的血清 miRNA 试剂盒的制作工艺和操作流程是基于 Solexa 技术 和定量 PCR 技术所测结果， 将下述 TaqMan 探针组合 ： SEQ ID NO ： 1 ～ 4 或 SEQ IDNO ： 1～ 4+5 ～ 7 中一种或多种分别收集到 PCR 试剂盒 (RT-PCR 或 Real-time PCR) 中制备特定 TaqMan 探针组合的食管鳞状细胞癌检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成 ( 检测每种 miRNA) 如下 ：
PCR 水 14.77μl
10×buffer 2μl
MgCl2 1.2μl
dNTP 0.4μl
Taq 酶 0.3μl
TaqMan 探针 0.33μl
cDNA 1μl
所制备试剂盒的具体操作流程如下 ：
(1) 收集受试者的血清样本， 提取 RNA 后逆转录制备 cDNA 样品 ；
(2) 按照上述配方加样， 各种 miRNA 分别测定， 在测定时， 使用各自 miRNA 特定的 TaqMan 探针。
(3) 进行 PCR 反应， 条件为 95℃ 5min， 95℃ 15s， 60℃ 1min(60℃ 1min 这一阶段包 含了退火和延伸两个步骤， 该程序是 ABI 公司推荐的程序 )， 40 个循环。
首先通过 Solexa 技术初筛， 然后通过定量 PCR 技术进一步筛选在疾病及正常生理 状态下表达量差异程度大的一组血清 miRNA， 作为检测食管癌的 TaqMan 探针。该试剂盒包 括本发明所提供的血清 miRNA 的 TaqMan 探针， Taq 酶以及 dNTP 等试剂。所述试剂盒的价 值在于以特定的 TaqMan 探针组合检测血清 miRNA 表达量， 可提高食管鳞状细胞癌检测的灵 敏度、 准确性， 有助于该病的早期发现。 因此该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治 疗推上一个新高度。
实施例 6 ： 血清 miRNA 检测试剂盒的临床应用
用制备的血清 miRNA 检测试剂盒对临床标本进行测定。临床研究的受试者食管鳞 状细胞癌患者 30 例， 对照组 30 例 ( 两组的详细临床信息见表 8)。
表 8 临床验证受试者的临床信息
(1) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223 等 4 种 miRNA 的表达量。对临床标本测定结果显示， 该试剂盒所检测 的 4 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001)( 见表 9)。
表 9 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
(2) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223 和 miR-10a 等 5 种 miRNA 的表达量。对临床标本测定结果显示， 该试剂 盒所检测的 5 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001)( 见表 10)。
表 10 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
(3) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223、 miR-10a、 miR-100 和 miR-133a 共 7 种 miRNA 的表达量。对临床标本测 定结果显示， 该试剂盒所检测的 7 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001) ( 见表 11)。
表 11 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
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7.Resnick KE， Alder H， Hagan JP， et al.The detection of differentially expressed microRNAsfrom the serum of ovarian cancer patients using a novel real time PCR platform.GynecolOncol 2009 ； 112 ： 55-59.
本发明属于生物技术领域， 涉及微小核糖核酸 (microRNA， 简称 miRNA) 的应用， 具体涉及一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 组合， 以及包含对应于所述 miRNA 组合的 TaqMan 探针组合的试剂盒。背景技术
食管鳞状细胞癌是一种原发于食管的恶性肿瘤， 占食管癌 90％以上， 进行性吞咽 困难为其典型的临床表现。食管鳞状细胞癌具有高发病率、 高死亡率和低检出率的二高一 低特点。目前， 全球范围内食管鳞状细胞癌发病率居各种肿瘤第八位， 死亡率居第六位。全 球每年新增食管鳞状细胞癌人数 41 万， 死亡约 31 万。我国是食管鳞状细胞癌高发区， 年平 均死亡率为 14.59/10 万， 年平均死亡 15 万人， 占消化系统肿瘤第二位， 仅次于胃癌。 食管鳞 状细胞癌早期症状不明显， 有临床症状而到医院就诊时部分患者已为中晚期。目前外科手 术切除仍是治疗食管鳞状细胞癌的主要方法， 我国食管鳞状细胞癌的外科手术切除率已达 80％～ 90％， 术后 5 年生存率为 25％～ 30％， 而早期食管鳞状细胞癌的 5 年生存率达 90％ 以上。由此可见食管鳞状细胞癌的早期诊断是提高其存活率的关键和重要前提条件。
目前临床使用的诊断方法包括影像学、 内镜检查与组织活检、 食管粘膜脱落细胞 学检查等， 但这些方法在早期诊断上都有一定的缺陷 ： 影像学对早期食管鳞状细胞癌变的 诊断有一定的局限性， 而组织细胞检测有其固有的缺陷， 取材不当或人为经验不足等都将 导致误诊。 尽管已发现一些肿瘤标志物， 如鳞状细胞癌抗原和癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen， CEA) 等， 但对食管鳞状细胞癌诊断的敏感度及特异度远达不到临床要求。目前食 管鳞状细胞癌临床治疗效果和中位生存期都不令人满意， 防治形势异常严峻。 因此， 寻找特 异性高和敏感性好的食管鳞状细胞癌标志物迫在眉睫。
微小核糖核酸 (microRNA， miRNA) 是一类长约 19 至 23 个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子， 其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA 通过与靶 mRNA 3’ 端非 翻译序列完全或部分互补结合， 导致靶 mRNA 降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表 达。miRNA 参与 1/3 人类蛋白编码基因调控， 它与多种生理活动有关， 如生长发育、 细胞增 殖、 细胞凋亡、 细胞分化等 ； 也与许多疾病的发生发展密切相关， 如糖尿病、 心血管疾病、 肿 [1-3] 瘤等。最近的研究显示 ， miRNA 在肿瘤发生、 发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。 已证实， 肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些 miRNA 表达水平发生了变化， 相对于正常组织， 一些 miRNA 表达量显著上升或下降。 许多癌组织如肺癌、 乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特 异性 miRNA 的表达， 提示 miRNA 有肿瘤组织特异性。另外， miRNA 的表达也与肿瘤分化程度 miRNA 可作为新的肿瘤标志物， 且为肿瘤的基因治疗 以及预后有关。大量的研究结果揭示， 提供新靶点。但组织标本取材属创伤性检出， 且无法实现肿瘤的早期诊断和预后判断。最 [4-8] 近报道显示 ， 人血清 / 血浆中也存在丰富、 稳定的 miRNA， 一些肿瘤包括非小细胞肺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 卵巢癌和胰腺癌患者血清中 miRNA 表达谱与正常人有显著差异， 均有各自特异的表达谱， 同时这种变化还可见于早期癌中。
目前尚没有利用无创伤性、 取材方便的血液标本检测判断与食管鳞状细胞癌相关 的特异性 miRNA 组合及检测试剂盒。 发明内容 本发明的目的就在于通过研究食管鳞状细胞癌患者血清 miRNA 的特异性变化， 筛 选出与正常人表达差异显著的一组血清 miRNA， 并利用这些 miRNA 的 TaqMan 探针制备出适 用于临床诊疗用途的试剂盒， 为实现食管鳞状细胞癌早期诊断提供特异性的中间结果以及 迅速的无创伤性检测手段。
本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的 ：
一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 组合， 该 miRNA 组合包括下列 miRNA ： miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223。
所述的 miRNA 组合进一步包括以下 miRNA 中的一种或多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
一种用于检测食管鳞状细胞癌相关的 miRNA 的探针组合， 其特征在于该探针组合 包括权利要求 1 所述 miRNA 的探针的组合。进一步， 该探针组合还包括以下 miRNA 探针中 的一种或多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
所述的探针组合为 ： SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 ； 进 一步， 该探针组合还包括以下 miRNA 探针中的一种或多种 ： SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.7。
上述的任一 miRNA 组合或任一探针组合在制备检测食管鳞状细胞癌的试剂或工 具中的应用。
一种用于检测食管鳞状细胞癌的检测试剂盒， 该试剂盒包含上述任意一项探针 组合 ； 所述试剂盒还可以包括 Taq 酶、 dNTP、 氯化镁和 PCR 缓冲液 (PCR 缓冲液为通用的 2+ 10×PCR 缓冲液， 不含 Mg )。
以下是对本发明的进一步描述 ：
一 种 用 于 检 测 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 miRNA 组 合， 其 包 括 下 列 miRNA ： miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223。该 miRNA 组合可以进一步包括以下 miRNA 中的一种或 多种 ： miR-10a、 miR-100 和 miR-133a。
上述 miRNA 组合的筛选方法包括以下步骤 ( 见图 1) ：
(1) 收集食管鳞状细胞癌患者混合血清或血浆， 提取总 RNA ；
(2) 采 用 高 灵 敏 度、 高 精 确 性 和 高 重 复 性 的 Solexa 测 序 技 术 (Solexa sequencingtechnology)， 对上述总 RNA 中已知的人成熟 miRNA(miRBase12.0， 共 692 种 ) 进 行检测， 与年龄、 性别匹配的非癌对照组比对后初筛出食管鳞状细胞癌患者血清中表达显 著升高的 miRNA ；
(3) 用实时荧光定量 PCR 方法 (TaqMan 探针法 ) 对一组标本进行逐个检测， 从 Solexa 方法初筛出的 miRNA 中复筛出表达差异显著的 miRNA ；
(4) 进一步用定量 PCR 方法对大批量标本进行逐个验证， 筛选出稳定的表达差异 显著的一组 miRNA。
(Solexa 初筛的目的是筛选出食管鳞癌组和正常组之间有显著差异的 miRNA， 更 侧重于定性和趋势 ； 复筛采用的是准确的荧光定量 PCR， 对单个样本中每个 miRNA 的含量进 行测定， 则侧重于定量 ； 荧光定量 PCR 是对 Solexa 初筛定性的基础上进一步精确定量， 两者 是一致的， 只是侧重点不同 )。
具体来说， 上述筛选方法包括以下步骤 ： (1) 分别收集正常及食管鳞状细胞癌的 混合血清或血浆， 并提取总 RNA ； (2) 根据已知的人 692 种成熟 miRNA， 运用 Solexa 测序技 术对上述 RNA 进行测序和检测， 初筛出食管鳞状细胞癌与非癌对照组表达差异显著的一些 miRNA ； (3) 将抽提的 RNA 逆转录为 cDNA， 采用荧光定量 PCR(TaqMan 探针法 ) 对初筛出的 miRNA 进行复筛和验证， 挑选出稳定、 特异表达的一组 miRNA。
本 发 明 使 用 的 检 测 方 法 可 以 选 自： RT-PCR 方 法、 Solexa 测 序 技 术 (Solexasequencing technology)、 Real-time PCR 方法中的一种或几种。例如， 血清中 miRNA 分子的检测方法包括以下步骤 ：
(1) 使用 Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 ) 提取血清总 RNA ；
(2) 通过 RNA 逆转录反应得到 cDNA ；
(3) 根据人全部六百多个成熟体 miRNA 设计引物进行 PCR 反应 ；
(4) 进行 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 ；
(5)EB 染色后在紫外灯下观察结果。
在所述步骤 (5) 之后还可以包括下列步骤 ： 用 TaqMan 探针法检测并比较病人血清 样本相对于正常血清中 miRNA 的量的变化。
本发明还提供了一种用于检测食管鳞状细胞癌的 miRNA 的探针组合， 其包括下列 miRNA 的 TaqMan 探针的组合 ：
上述 TaqMan 探针组合可以进一步包括以下 miRNA TaqMan 探针中的一种或多种 ：
此外， 本发明提供了上述 miRNA 组合或上述 TaqMan 探针组合在制备检测食管鳞状 细胞癌的试剂或工具中的用途。
本发明还提供一种用于检测食管鳞状细胞癌的试剂盒， 该试剂盒含有下列探针 ：
上述试剂盒可以进一步包括以下 TaqMan 探针中的一种或多种 ：
在 本 发 明 的 一 个 具 体 实 施 方 案 中， 上 述 试 剂 盒 包 括 Taq 酶 和 dNTP， 氯 化 镁、 2+ 10×PCR 缓冲液 ( 不含 Mg ) 和包括正常血清中稳定存在且可检测到的全部 miRNATaqMan 探针 (ABI 公司提供， 专用于 miRNA 荧光定量 )。
本发明所述食管鳞状细胞癌包括各种病理分化程度以及各种临床分期食管鳞状 细胞癌。 具体而言， 所述食管鳞状细胞癌可以是高分化、 中分化和低分化 ； 可以是临床 I 期、 II 期、 III 期和 VI 期。
本发明所述的 miRNA 组合及其对应的探针组合， 以及含有所述探针组合的试剂盒 可应用于食管鳞状细胞癌的检测之中。
本发明的有益效果 ：
首先， 血清相对其它组织较易获得， 与食管组织活检相比， 属于无创性检查， 极大 地方便了医疗人员的使用， 更减轻了患者的痛苦 ；
其次， 血清中的 miRNA 反映的是机体整体的病理、 生理情况， 其检测结果具有精确 而详细的指导意义 ；
第三， 所筛选出的 miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的灵敏度显著高于目前临床 上使用的肿瘤标志物 CEA， 大大提高了诊断的准确性。此外， 血清 miRNA 检测能在分子水 平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态， 并为食管鳞状细胞癌的治疗提供了潜在靶 点；
第四， 本发明所筛选出的食管鳞状细胞癌血清 miRNA 组合与至今已报道 [4-8] 的其 他肿瘤患者血清中特异变化的 miRNA 不尽相同 ；
第五， 本发明的试剂盒所包含的 TaqMan 探针同样是基于 Solexa 技术、 定量 PCR 技 术筛选出的在食管鳞状细胞癌与正常状态下表达差异显著的一组血清 miRNATaqMan 探针， 这样可以增加检测的灵敏度和特异性， 提高检测水平。
综上所述， 本发明提供的特异的 miRNA 组合作为诊断食管鳞状细胞癌的中间结 果， 有助于医师结合临床症状、 病史或其他检查信息进行食管鳞状细胞癌的诊断。 检测血清 中的 miRNA 简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清 miRNA 的试剂盒投入实践使 用， 仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通过最精简的 TaqMan 探针库来检测血清 miRNA 水平能拓展食管鳞状细胞癌的检测指标， 提高检测的灵敏度， 丰富检测食管 鳞状细胞癌的手段， 这些血清 miRNA 有望成为诊断食管鳞状细胞癌的重要标志分子， 具有 极重要的临床应用潜力和价值。 附图说明
图 1 为本发明的主要流程图。
图 2 为 TaqMan 探针定量 PCR 方法的标准曲线。
图 3 为 TaqMan 探针定量 PCR 方法的重复性。
A.miRNA 提取方法的重复性 ； B. 定量 PCR 方法的重复性。
图 4 为筛选出的每种 miRNA(A-G)、 7 种 miRNA 的组合 (H) 以及 CEA(I) 在食管鳞状 细胞癌与非癌对照中的 ROC 曲线。
食管鳞状细胞癌 149 例， 非癌对照者 100 例。 具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。 实施例 1 ： 食管鳞状细胞癌的特异 miRNA 表达谱初筛
(1) 分别收集未转移、 转移食管鳞状细胞癌以及正常者血清标本 86 例、 55 例和 40 例， 三组标本分别混合 ；
(2) 分别提取三组混合血清中的 RNA， 具体方案为 ： 利用 Trizol 试剂 (Invitrogen 公司 ) 提取总 RNA， 得到的上清液使用酚氯仿三步法进一步去除蛋白等杂质提纯 RNA ；
(3) 对三组混合血清总 RNA 进行 Solexa 测序分析。
具体方案为 ： Solexa 测序法的基础是单分子克隆阵列技术， 能够在整个基因组水 平上区分单个碱基的差别， 从而区分个体间的差异。先将接头连接到小分子 RNA 片段上， 再 经 PCR 扩增后制成库。随后在含有接头的芯片上加入已连接接头的小分子 RNA， 经反应， 将 不同片段扩增。 在下一步反应中， 四种荧光标记的染料用边合成边测序的原理， 在每个循环 过程里， 荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第 一个碱基配对， 通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互 补碱基的配对被延伸， 利用生物发光蛋白， 比如萤火虫的荧光素酶， 可通过碱基加到引物后 端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。 针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的 核苷的标记， 这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特 定的结合到每个片断上的碱基。 通过上述的结合， 检测可以重复几十个循环， 这样就有可能 决定核苷酸片断中的几十个碱基。最后再比对序列， 筛选出所要得到的 miRNA 的拷贝数。
(4)Solexa 分析食管鳞状细胞癌与正常血清中表达差异显著的 miRNA ；
人类 miRNA 数据库 (miRbase 12.0 和 Sanger data 最新版本 ) 中包含的 miRNA 共 有 692 种， 采用 Solexa 技术检测血清中所有 692 种 miRNA 序列和拷贝数值， 拷贝值反映各 种 miRNA 的表达量。 若拷贝数＝ 0 表示血清中没有该 miRNA， 拷贝数值越大， 其相对的 miRNA 的表达量越多。
若 miRNA 在三组中的拷贝数都大于 50， 同时与正常血清的 Solexa 测序结果相比， 未转移及转移食管鳞状细胞癌拷贝数均上升， 变化倍数大于 2.0， 且与对照组绝对值之差大
于 70 时， 被认为显著变化， 否则视为不变化。结果发现， 在检测的 692 种 miRNA 中， 共有 25 种在患者混合血清中显著升高 ( 详见表 1)。
表 1Solexa 测序初筛出的在食管鳞状细胞癌血清中表达上调的 miRNA
实施例 2 ： 血清中 miRNA 的实时荧光定量 PCR 实验 (TaqMan 探针法 )
采用定量 PCR 方法对批量标本逐个验证， 从 Solexa 方法初筛出的 miRNA 中筛选出 表达差异显著 miRNA。
首先将提取的血清总 RNA 反转录成 cDNA。针对每一种 miRNA， 设计一个含相同茎 环结构的基因特异性反向引物， 利用 miRNA 特异性反向引物进行逆转录， 得到含共同茎环 结构但属于特定 miRNA 的 cDNA(ABI 公司产品 )。
仪器使用的是 ABI Prism 7300 荧光定量 PCR 仪。
本实验以不同浓度人工合成的 miR-16 成熟体作标准曲线。人工合成的 miR-16 原 液逆转录成 cDNA， 用 DEPC 水分别稀释成 107、 106、 105、 104 和 103fmol/L 浓度梯度。 miR-16 的
cDNA 需单独逆转， 反应体系为 ： 2μl RNA、 2μl 5×AMV 缓冲液、 1μl10mM 各种 dNTP 混合物 (Takara 公司 )、 0.5μl AMV(Takara 公司 ) 以及 1μl miR-16 逆转录引物 ( 美国 ABI 公司 提供， 专用于 miRNA 逆转录 )， 用 3.5μl DEPC 水补足体积至 10μl。
用 作 标 准 曲 线 的 miR-16 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 ： 1μl cDNA、 0.3μl Taq 酶 (Takara 公司 )、 0.33μl TaqMan 探针 ( 由 ABI 公司提供， 专用于 miRNA 荧光定量 )、 1.2μl 25mMMgCl2、 0.4μl 2.5mM 各种 dNTP 混合物 (Takara 公司产品 )、 2μl 10×PCR 缓冲液以及 14.77μl DEPC 水。
待测标本中的每种 miRNA 检测时所采用的逆转录体系和荧光定量 PCR 反应体系同 用作标准曲线的人工合成的 miR-16， 不过每种 miRNA 用各自特有的逆转录引物和 TaqMan 探 针 ( 由 ABI 公司提供 )。数据处理方法为相对的绝对定量法， 即每次进行荧光定量 PCR 时， 7 6 将所需检测的样本与标准曲线 ( 人工合成 miR-16 的 10 ， 10 ， 105， 104 和 103fmol/L 五个浓 度梯度 ) 同时进行 PCR 扩增， 扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值， 然后根据标准品 miR-16 的浓度及每个浓度对应的 CT 值绘制标准曲线 ( 图 2)( 此标准曲线是以 miR-16 绘制 的标准曲线 ； CT 值的计算是公知的 ； 图中的 R 指代的是 pearson 相关系数， 可以从侧面反映 出所作直线的斜率， 计算方式可以通过 Excel 绘制散点图并添加趋势线得到， 也可通过其 他常用统计软件如 spssl3.0， statistics6.0 等计算 ) 并根据此标准曲线及待测样本的 CT 值计算出该样本所需测定的 miRNA 相对的绝对含量。
评估所采用的定量 PCR 方法的重复性 ： 1.miRNA 提取方法的重复性 ： 取 20 例正常 人血清， 混合后分成相同的两份 ( 每份 500μl)， 分别提取其总 RNA， 然后用定量 PCR 方法测 定表达水平从低到高的 20 种 miRNA( 包括 miR-7， 10a， 21， 22， 23a， 100， 127-3p， 133a， 148b， 185， 223， 320a， 342-5p， 345， 423-5p， 483， 484， 221， 222， 874) 这 20 种 miRNA 是 随 机 选 择 的， 包含表达量由低到高的三类 miRNA， 是为了说明提取各种浓度的 miRNA 都有较好的重复 性 )， 每种 miRNA 重复测定 3 次， 取平均值。 相关性分析显示， 两份标本所测结果的相关系数 2 (pearson’ s 系数 ) 接近 1(R ＝ 0.9897)( 图 3A)， 提示 miRNA 提取方法重复性好。2. 定量 PCR 方法的重复性 ： 另取 20 例正常人血清， 混合后提取总 RNA， 将 RNA 分成相同的两份， 然后 用定量 PCR 方法测定上述 20 种 miRNA。同样， 每种 miRNA 重复 3 次， 取平均值。相关性分析 2 显示， 两份 RNA 所测结果的相关系数接近 1(R ＝ 0.9973)( 图 3B)， 表明本发明所采用的定 量 PCR 方法具有很好的重复性。
实施例 3 ： 定量 PCR 方法对初筛出的血清 miRNA 复筛
用 TaqMan 定量 PCR 方法对一组受试者标本进行逐个检测， 从 Solexa 方法初筛出 的 25 种 miRNA 中筛选出患者组与对照组之间表达差异显著的 miRNA( 具体步骤参见实施例 2)。该组食管鳞状细胞癌患者 36 例， 以年龄、 性别匹配的无癌 33 例作对照 ( 病人详细临床 信息见表 2)。结果发现， 初筛出的 25 种 miRNA 中有 7 种 miRNA 在患者组中表达量显著高 于对照组 ( 含量表示方法为均值 ± 标准差 ； 变化倍数为 1.65 ～ 2.97 倍， p ＜ 0.0001)， 这 7 种 miRNA 是 miR-10a、 miR-22、 miR-100、 miR-148b、 miR-223、 miR-133a 和 miR-127-3p( 见 表 3)。
表 2 受试者的临床信息
表 3 定量 PCR 方法复筛出的 miRNA非参 Mann-Whitney 检验
实施例 4 ： 定量 PCR 方法对复筛出的血清 miRNA 的临床验证
将复筛出的 7 种 miRNA 进一步用定量 PCR 方法在大批量临床标本中进行验证， 筛 选出稳定的、 表达差异显著的 miRNA。临床研究的受试者食管鳞状细胞癌患者 113 例， 以年 龄、 性别匹配的无癌 67 例作对照 ( 两组的详细临床信息见表 4)。验证结果证实， 复筛出的 7 种 miRNA 在大批量患者标本中表达量显著高于对照 ( 含量表示方法为均值 ± 标准差 ； 是
对照组的 1.69 ～ 2.57 倍， p ＜ 0.0001)( 结果见表 5)。
表 4 临床验证受试者的临床信息
表 5 定量 PCR 方法对复筛出的 miRNA 用大批量标本验证结果
非参 Mann-Whitney 检验实施例 4 ： 筛选出的 miRNA 临床价值评估
运用不同的 miRNA 组合对病人与正常人之间进行聚类分析。在验证组中 ( 患者 n ＝ 113， 对照＝ 67)， miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223 等 4 种 miRNA 的组合能将 85.8％ (97/113) 的癌患者与正常对照区分开来， 同时也将 76.1％正常对照 (51/67) 与癌患 者正确区分开。 而 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223、 miR-10、 miR-100 和 miR-133a 等 7 种 miRNA 的组合能将 77.9％癌患者 (88/113) 与正常对照区分开来， 同时也将 80.1％正常 对照 (55/67) 与癌患者正确区分开。将复筛组和验证组血清标本综合起来 ( 患者 n ＝ 149， 对照 n ＝ 100) 对早期癌患者 ( 包括临床 I、 II 期， 共 106 例 ) 和正常对照标本聚类分析发 现， 7 种 miRNA 的组合可将绝大多数早期癌患者 (80.2％， 85/106) 与正常对照区 (80.0％， 80/100) 分开来。说明 miRNA 组合可应用于食管鳞状细胞癌的早期诊断。
将复筛组和验证组血清标本综合起来 ( 患者 n ＝ 149， 对照 n ＝ 100)， 根据每份标 本血清 miRNA 的表达量绘制 ROC 曲线和计算曲线下面积 (AUC) 评估筛选出的 miRNA 对食管 鳞状细胞癌诊断的准确性 ( 图 4A-G)， 并与目前临床上使用的肿瘤标志物 CEA 进行比较 ( 图 4I)。结果发现这 7 种 miRNA 的 AUC 在 0.72 ～ 0.84 之间， 均大于 CEA(AUC ＝ 0.55)( 见表 6)。进一步将 7 种 miRNA 组合在一起， 根据每份标本 ( 包括患者和对照 ) 的危险分数值绘 制 ROC 曲线 ( 图 4H)， 当最适 cut-off 为 2.41 时， miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感 性 (66％ ) 是 CEA(13％ ) 的 5 倍 ( 表 7)。说明 miRNA 组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感性 远高于目前临床上所使用的肿瘤标志物。
表 6 筛选出的 miRNA 和 CEA 的 AUC
表 7miRNA 组合和 CEA 的 ROC 曲线分析
实施例 5 ： 用于检测血清 miRNA 的试剂盒
用于检测食管癌的血清 miRNA 试剂盒的制作工艺和操作流程是基于 Solexa 技术 和定量 PCR 技术所测结果， 将下述 TaqMan 探针组合 ： SEQ ID NO ： 1 ～ 4 或 SEQ IDNO ： 1～ 4+5 ～ 7 中一种或多种分别收集到 PCR 试剂盒 (RT-PCR 或 Real-time PCR) 中制备特定 TaqMan 探针组合的食管鳞状细胞癌检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成 ( 检测每种 miRNA) 如下 ：
PCR 水 14.77μl
10×buffer 2μl
MgCl2 1.2μl
dNTP 0.4μl
Taq 酶 0.3μl
TaqMan 探针 0.33μl
cDNA 1μl
所制备试剂盒的具体操作流程如下 ：
(1) 收集受试者的血清样本， 提取 RNA 后逆转录制备 cDNA 样品 ；
(2) 按照上述配方加样， 各种 miRNA 分别测定， 在测定时， 使用各自 miRNA 特定的 TaqMan 探针。
(3) 进行 PCR 反应， 条件为 95℃ 5min， 95℃ 15s， 60℃ 1min(60℃ 1min 这一阶段包 含了退火和延伸两个步骤， 该程序是 ABI 公司推荐的程序 )， 40 个循环。
首先通过 Solexa 技术初筛， 然后通过定量 PCR 技术进一步筛选在疾病及正常生理 状态下表达量差异程度大的一组血清 miRNA， 作为检测食管癌的 TaqMan 探针。该试剂盒包 括本发明所提供的血清 miRNA 的 TaqMan 探针， Taq 酶以及 dNTP 等试剂。所述试剂盒的价 值在于以特定的 TaqMan 探针组合检测血清 miRNA 表达量， 可提高食管鳞状细胞癌检测的灵 敏度、 准确性， 有助于该病的早期发现。 因此该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治 疗推上一个新高度。
实施例 6 ： 血清 miRNA 检测试剂盒的临床应用
用制备的血清 miRNA 检测试剂盒对临床标本进行测定。临床研究的受试者食管鳞 状细胞癌患者 30 例， 对照组 30 例 ( 两组的详细临床信息见表 8)。
表 8 临床验证受试者的临床信息
(1) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b 和 miR-223 等 4 种 miRNA 的表达量。对临床标本测定结果显示， 该试剂盒所检测 的 4 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001)( 见表 9)。
表 9 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
(2) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223 和 miR-10a 等 5 种 miRNA 的表达量。对临床标本测定结果显示， 该试剂 盒所检测的 5 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001)( 见表 10)。
表 10 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 5 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
(3) 含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒的临床标本检测结果 ：
含 TaqMan 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒可同时测定 miR-22、 miR-127-3p、 miR-148b、 miR-223、 miR-10a、 miR-100 和 miR-133a 共 7 种 miRNA 的表达量。对临床标本测 定结果显示， 该试剂盒所检测的 7 种 miRNA 在患者中表达量显著高于对照组 (p ＜ 0.0001) ( 见表 11)。
表 11 探针组合 SEQ ID NO ： 1 ～ 7 的试剂盒的测定结果
非参 Mann-Whitney 检验
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