通过环状变换得到的新的蛋白变异体 本发明涉及通过环状变换(circular permutation)回收新的蛋白变异体的方法，并涉及通过该方法回收的新的蛋白变异体。
为了优化已知的洗涤剂酶的性质，通常使用的突变方法中，以定向方式或随机产生突变，或通过插入或缺失来导入或移除氨基酸。
常规突变方法的替代方案以所谓的环状变换方法为代表。在现有技术中，环状变换方法从原理上已经描述了一段时间了。例如，Graf和Schachmann(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，11591-11596)，提供了已经用来进行过环状变换方法的酶和其他蛋白的概述。
在环状变换方法中，通过遗传工程对突变的蛋白的N-和C-末端进行了重新定义。基本的假设是，只有在其中N-和C-末端位置彼此接近的蛋白中才能进行环状变换方法，以便环状变换产生的蛋白的总体结构基本上未改变。
到目前为止，已经用来进行过交替变换方法的已知酶和蛋白的另一个共同特点是，蛋白直接表达为活性形式。但是，也存在一些类型的蛋白，特别是酶，表达为无活性形式的前蛋白(preprotein)、蛋白原(proprotein)或前蛋白原(preproprotein)，并只有在表达后通过酶解才转变成活性形式。蛋白的“前(pre)”部分是信号肽，负责引导表达的蛋白进入正确的目标细胞区室，而蛋白的“原(pro)”部分将蛋白保持在无活性状态，直到在适合的位置和时间，通过在靶位置处活化，它才转换成活性形式。
迄今为止，已经假定只有对一方面具有位置彼此接近的N-和C-末端，另一方面被天然表达为成熟的氨基酸序列、即没有前肽、肽原或前肽原的蛋白，才能成功地执行环状变换方法，因为对于成熟蛋白来说，前肽、肽原或前肽原的定位被认为是正确加工和折叠所必需的。
现在，已经意外并出乎所有预期地发现，即使在天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原的那些蛋白以及特别是酶的情况下，如果在成熟蛋白的DNA上执行环状变换方法，并且如果将相应的信号肽、肽原和/或前肽原的DNA附加在通过交替变换获得的DNA上，那么也可以在环状变换方法的帮助下获得新的蛋白变异体。
这是出人意料的，因为一方面没有预料到人工构建物可以成功地被信号肽引导到意向的靶细胞区室中，另一方面没有预料到尽管信号肽和肽原的位置位于蛋白上的“错误”位点处，但蛋白的折叠也能成功进行，并且蛋白的活化也能够按照需要发生。
特别是，根据本发明意外地发现，通过在洗涤剂酶上进行环状变换方法，可以发现与起始分子相比表现出改进性质的新的洗涤剂酶。
因此，本发明的第一个目标是蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体的编码DNA的制造方法，所述蛋白特别是酶，被天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原，其中对成熟蛋白的编码DNA实施了环状变换方法。
因此，本发明的目标也是选自下列的多核苷酸：
a)蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体的编码多核苷酸，所述蛋白特别是酶，被天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原、，
b)(a)的多核苷酸的突变体，与(a)的多核苷酸相比具有至少80，优选至少85或90％，特别优选至少95、98或99％的序列同源性和/或序列同一性，其中序列比较在一个实施方案中参照不带有桥接接头的编码多核苷酸的环状变换多核苷酸，在另一个实施方案中参照包含桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，
c)(a)的多核苷酸的突变体，与(a)的多核苷酸的多核苷酸序列相比，具有多达50、40或30个，优选多达25、20或15个，特别优选多达10、9、8、7或6个，特别是多达5、4、3、或2个核苷酸的取代、插入、缺失或倒位，特别是具有正好一个核苷酸的插入或缺失，其中序列比较在一个实施方案中参照不带有桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，在另一个实施方案中参照包含桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，
d)包含有(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸，
e)编码本发明的环状变换变异体的多核苷酸，
f)含有与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸互补的序列的多核苷酸。
在本发明的优选实施方案中，本发明的多核苷酸编码BLAP的环状变换变异体，所述变异体选自与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80，优选至少85或90％，特别优选至少95、98或99％的序列同源性和/或序列同一性的多肽，和/或选自与具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多肽序列的多肽相比，具有多达30、25或20个，优选多达18、16、14或12个，特别优选多达10、9、8、7或6个，特别是多达5、4、3、或2个氨基酸的插入、缺失或倒位，尤其是具有正好一个氨基酸的插入或缺失的多肽。
多核苷酸可以作为单个链或作为双链存在。本发明的目标，除了脱氧核糖核酸之外，还包括同源和互补的核糖核酸。
此外，本发明的目标还包括，特别是考虑到用于表达的宿主生物体的不同密码子使用，而将其中某些区域用其他区域取代，以便能够表达本发明的多肽的那些多核苷酸。
本发明的另一个目标是用于制造蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体的方法，所述蛋白特别是酶，被天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原，所述方法包括下列步骤：
b)使用成熟蛋白的DNA执行环状变换方法，
c)将依照(a)的方法获得的DNA，以相对于编码信号肽和/或前肽原的DNA来说3’的方向整合到适合的载体中，
d)将载体导入用于表达DNA的适合的宿主中，以及
e)如果可行，纯化所获得的蛋白。
因此，本发明的另一个目标还包括选自下列的多肽：
a)使用本发明的方法获得的环状变换变异体，即天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原的蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体，
b)(a)的环状变换变异体的变异体，与(a)的环状变换变异体的序列相比，具有至少80％，优选至少85或90％，特别优选至少95、98或99％的序列同源性和/或序列同一性，其中序列比较在一个实施方案中参照不含接头序列的环状变换变异体的多肽序列，在另一个实施方案中参照包含接头序列的环状变换变异体的多肽序列，
c)(a)的环状变换变异体的变异体，与不含接头序列的(a)的多肽的多肽序列相比，具有多达30、25或20个，优选多达18、16、14或12个，特别优选多达10、9、8、7或6个，特别是多达5、4、3、或2个氨基酸的取代、插入、缺失或倒位，特别是具有正好一个氨基酸的插入或缺失，其中序列比较在一个实施方案中参照不含接头序列的环状变换变异体的多肽序列，在另一个实施方案中参照包含接头序列的环状变换变异体的多肽序列，
d)包含(a)、(b)或(c)的蛋白变异体的多肽。
根据本发明，“成熟蛋白”将被理解为不考虑信号肽和肽原的蛋白。
可以在原则上想象，环状变换与其他突变方法一样，可能对蛋白的各种不同性质具有影响，例如对蛋白的稳定性或者对(在酶的情况下)活性或选择性。
根据本发明，意外地发现，通过环状变换，可以相当大地改进洗涤剂酶对特定污渍的洗涤性能。
因此，本发明的环状变换变异体优选为酶、特别优选为蛋白酶、尤其是枯草溶菌素类型的碱性蛋白酶的环状变换变异体。
枯草溶菌素类型的碱性蛋白酶的例子是来自缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶(BLAP)，以及枯草溶菌素BPN′和Carlsberg，以及蛋白酶PB92，枯草溶菌素147和309，枯草溶菌素DY，以及酶(但是在严格意义上被分类为枯草杆菌酶(subtilase)而不再是枯草溶菌素(subtilisin))嗜热蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶TW3和TW7。枯草溶菌素Carlsberg的进一步开发的形式可以在商标名下从Novozymes A/S，，Denmark获得。枯草溶菌素147和309由Novozymes公司分别在商标名和下销售。在名称下销售的变异体源自于来自缓慢芽孢杆菌DSM 5483的蛋白酶(WO 91/02792A1)，具体描述在WO 92/21760A1、WO 95/23221A1、WO 02/088340A2和WO 03/038082A2中。其他可用的来自芽孢杆菌(Bacillus)物种和吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)的各种不同菌株的蛋白酶，显示在专利申请WO 03/054185、WO 03/056017、WO 03/055974和WO 03/054184中。
其他可用的蛋白酶是例如可以从Novozymes公司在商标名Nafizym、和下，从Genencor公司在商标名OxP和下，从Advanced Biochemicals Ltd.，Thane，India在商标名下，从Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.，China在商标名下，从Amano Pharmaceuticals Ltd.，Nagoya，Japan在商标名和下，以及从Kao Corp.，Tokyo，Japan在名称蛋白酶K-16下获得的酶。
这些酶的环状变换变异体，及其优选具有前面指出的同源性和同一性值的同源物，优选是本发明的目标。
特别优选，环状变换的枯草溶菌素是具有SEQ ID NO：1的初始序列的环状变换的BLAP蛋白酶，具有SEQ ID NO：2的初始序列的环状变换的BPN′蛋白酶，或具有SEQ ID NO：3的初始序列的环状变换的枯草溶菌素Carlsberg，及其类似物。
在本发明的环状变换变异体中，成熟的初始酶的原始末端，优选通过长度为1到40、特别优选为5到30、特别是10到20个氨基酸的任意接头彼此相连。优选使用长度为10到20个氨基酸的接头，特别优选具有12到16个氨基酸的接头，特别是具有13、14或15个氨基酸的接头，具体来说是接头GAATSGKLNGSTAG(SEQ ID NO：4)，来制造环状变换的枯草溶菌素。
接头原则上可以是具有任何序列的寡肽或多肽。如果可行的话，必须留意接头的序列，以便接头具有足够的柔性，能够将初始蛋白的两个原始末端彼此相连。例如，上述的具有序列GAATSGKLNGSTAG的接头，已被证明适合用于桥接BLAP蛋白酶。但是，原则上说，任何其他所需的接头当然也可以用于连接原始末端。接头的序列对于酶的功能来说是次要的，因为它的位置远离酶的活性中心。
优选，环状变换变异体的新的末端距原始末端至少10个氨基酸、特别优选至少20个氨基酸、特别是至少30、35或40个氨基酸。
在优选实施方案中，环状变换变异体的新末端位于实际的三级结构的外部，特别是在初始酶的环结构的区域中，即在位于蛋白的复杂折叠外部的区域中，并改为表现出桥接性质。
因此，在这个实施方案中，环状变换的BLAP蛋白酶的末端，位于初始酶的氨基酸1-4、10-14、18-26、32-45、49-62、70-76、78-87、93-102、115-118、122-131、142-146、154-169、175-179、181-183、185-192、196-199、203-207、211-215、231-237、247-264或267-268之间。
因此，在这个实施方案中，环状变换的BPN′蛋白酶的末端，相应地位于初始酶的氨基酸1-7、10-14、19-26、32-46、50-64、95-104、117-120、124-133、145-148、156-175、181-185、187-189、191-198、202-205、209-213、217-220、237-243、252-270或273-275之间。
因此，在本实施方案中，环状变换的枯草溶菌素Carlsberg的末端，相应地位于初始酶的氨基酸1-7、9-13、19-26、32-46、50-64、72-89、95-104、116-121、124-134、145-148、156-175、181-185、187-189、191-198、202-205、209-213、217-220、237-243、250-270或274-275之间。
但是，根据本发明，已经意外地发现，新末端在位于初始酶的实际三级结构外部的环状结构或类似区域中的定位，对于酶的功能性来说不是必需的，反而对于新末端来说，位于折叠的初始蛋白的三级和/或四级结构的中间而不破坏酶的活性或稳定性，也是可能的。因此，在这种实施方案中，环状变换的蛋白的末端不位于环结构的区域中。
因此，在这个实施方案中，环状变换的BLAP蛋白酶的末端，位于初始酶的氨基酸4-10、14-18、26-32、45-49、62-70、76-78、87-93、102-115、118-122、131-142、146-154、169-175、179-181、183-185、192-196、199-203、207-211、215-231、237-247、264-267或268-末端之间。
因此，在这个实施方案中，环状变换的BPN′蛋白酶的末端，相应地位于初始酶的氨基酸7-10、14-19、26-32、46-50、64-95、104-117、120-124、133-145、148-156、175-181、185-187、189-191、198-202、205-209、213-217、220-237、243-252、270-273或275-末端之间。
因此，在本实施方案中，环状变换的枯草溶菌素Carlsberg的末端，相应地位于初始酶的氨基酸7-9、13-19、26-32、46-50、64-72、89-95、104-116、121-124、134-145、148-156、175-181、185-187、189-191、198-202、205-209、213-217、220-237、243-250、270-274或275-末端之间。
在本发明的特别优选的实施方案中，BLAP的环状变换变异体选自与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％，优选至少85或90％，特别优选至少95、98或99％的序列同源性和/或序列同一性的多肽，和/或选自与具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多肽序列的多肽相比，具有多达30、25或20个，优选多达18、16、14或12个，特别优选多达10、9、8、7或6个，特别是多达5、4、3、或2个氨基酸的插入、缺失或倒位，特别是具有正好一个氨基酸的插入或缺失的多肽。
同源性的度量是百分同一性，可以按照例如D.J.Lipman和W.R.Pearson在Science
227(1985)，1435-1441页中所指示的方法来确定。这种指标可以是指整个蛋白或相应指定的区域。另一种解释同源性的术语“相似性”，还考虑到了保守变异，即具有相似化学活性的氨基酸，因为它们通常在蛋白中执行相似的化学活性。对于核酸来说，只知道百分同一性。根据本发明，被当作同一性或同源性的基础的指标，是所考虑的本发明的具体多肽(或多核苷酸)的完整序列，或所考虑的本发明的多肽区域(或多核苷酸区域)的完整序列，而不仅仅是本发明的多肽(或多核苷酸)或本发明的多肽区域(或多核苷酸区域)与对比蛋白(或对比核苷酸)之间相应的重叠区域。如果作为同源性和同一性的指标是指不包含接头肽的本发明的多肽，那么由接头桥接的多肽序列将被当作连续的序列。同样地，这也类似地适用于编码本发明的多肽的多核苷酸序列。
本发明的另一个目标是含有本发明的多核苷酸的载体、特别是克隆载体和表达载体，以及含有本发明的多核苷酸、载体和/或多肽的宿主细胞。
在优选实施方案中，细胞选自革兰氏阴性细菌，特别是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)或克雷伯氏杆菌(Klebsiella)的物种，特别是选自大肠杆菌K12、大肠杆菌B或植生克雷伯氏杆菌(Klebsiellaplanticola)的菌株，非常特别是选自大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌RV308、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM 109、大肠杆菌XL-1或植生克雷伯氏杆菌(Rf)菌株的衍生株。
在另一个优选实施方案中，细胞选自革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或棒状杆菌属(Corynebacteria)的细菌，非常特别是缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、球形芽孢杆菌(B.globigii)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的菌种。
含有本发明的多肽的制剂
本发明的另一个目标由含有上述的本发明多肽的制剂所代表。
其可用性通过添加上述本发明的蛋白得到改进的所有类型的制剂，特别是混合物、制剂、溶液等，因此都包含在本发明的保护范围内。根据应用的领域，它们可以是例如固体混合物，例如含有冷冻干燥的或囊封的蛋白的粉末，或胶凝的或液体剂。优选的制剂包含例如缓冲物质、稳定剂、反应配偶体和/或蛋白酶的辅因子，和/或其他与蛋白酶协同作用的成分。其中特别需要了解的是用于下文中提到的应用领域的制剂。其他的应用领域可以从现有技术中明显看出。
在这种情况下，可能的应用领域具体来说是应用于纺织品制造中以回收或处理原材料或中间产物，特别是用于移除织物、特别是羊毛或丝绸上的保护层，以及用于含有天然纤维、特别是羊毛或丝的纺织品的护理。
因此，本发明的目标还包括用于处理纺织品原材料和用于纺织品护理的方法，其中在至少一个方法步骤中使用了本发明的多肽。其中优选的是用于纺织品原材料、纤维或含有天然成分、特别是含有羊毛或丝的纺织品的方法。它们可以是例如其中制备材料用于加工成纺织品、例如用于抗毡化精整的方法；或例如用提供护理的成分对以前用旧的纺织品补充清洁的方法。
其他可能的应用领域是例如：
-应用于生物化学分析或用于合成低分子量化合物或蛋白；其中优选的是用于在肽序列分析的情况中测定末端基团；
-应用于天然物质或生物有用物质的制备、纯化或合成；
-应用于天然原材料的处理，特别是用于表面处理，非常特别是用于处理皮革的方法，特别是用于皮革脱毛；
-应用于照相底片的处理，特别是用于移除含有明胶的保护层或类似的保护层；以及
-应用于食品或动物饲料的制造，特别是用于豆奶和/或豆奶制品的酶法处理。
上面提到的本发明的多肽，在其用途被证明是适合的所有其他技术领域中的应用，原则上都并入本发明的保护范围内。
本发明的另一种应用可能性是在美容品中使用本发明的多肽。应该理解其中包含了用于人类皮肤或人类毛发的所有类型的提供清洁和护理的制剂，特别是清洁剂。根据意向的应用，制剂也可以是药剂。
可以列举的本发明的美容品和/或药剂的例子是香波、肥皂、清洗液、面霜、去皮剂，以及提供口腔、牙齿或假牙护理的制剂。这些制剂也可以包含特别是下文中列举的洗涤和清洁剂的成分。
本发明的特别优选的目标是含有本发明的多肽的洗涤和清洁剂。这是因为，正如在本申请的示例性实施方案中所示，意外地，已有可能确定含有本发明的优选蛋白酶的洗涤和清洁剂，与含有以常规方式使用的蛋白酶的制剂相比，洗涤性能增加了。
出于本申请的目的，洗涤剂或清洁剂分别的“洗涤性能”或“清洁性能”，将被理解为所讨论的制剂施加在脏的物件、例如纺织品或具有硬表面的物体的作用。这些制剂的各种成分，特别是本发明的酶，分别评估它们对整个洗涤或清洁剂的洗涤或清洁性能方面的贡献。在这种情况下，必须特别考虑到下述事实，即不能根据酶的酶学性质对酶对制剂的洗涤性能的贡献直接做出结论。相反，除了酶活性之外，因素特别是例如稳定性、底物结合、与待清洁的材料的结合、或与洗涤或清洁剂的其他成分的相互作用，在这里也发挥了作用，特别是在污渍移除的情况下包括了可能的协同效应。
因此，本发明的另一个目标是洗涤和清洁剂，特别是包含表面活性剂和/或漂白剂、含有本发明的多肽的洗涤和清洁剂。
本发明的洗涤和清洁剂可以包括所有可以想象类型的清洁剂，包括在商业规模上在洗衣机中使用的或用于手洗或清洁的浓缩物和不稀释使用的清洁剂。其中包括了例如用于织物、地毯或天然纤维的洗涤剂，对于它们来说，术语“洗涤剂”按照本发明使用。其中还包括了例如用于自动洗碗机的洗碗剂或手动洗碗剂，或用于硬表面例如金属、玻璃、瓷器、陶器、砖、石、涂漆表面、塑料、木材或皮革的清洁剂；对于它们来说，术语“清洁剂”按照本发明使用。出于本发明的目的，杀菌剂和消毒剂也被当作洗涤和清洁剂。
本发明的实施方案包含了本发明的洗涤或清洁剂适合的和/或根据现有技术已建立的所有施用形式。其中包括例如固体、粉末、液体、凝胶或糊状制剂，任选也可以由多相构成，压缩或不压缩；其中还包括例如挤出物、颗粒、片剂或小袋，可以包装在大的容器中和分成小份包装。
除了本发明的多肽，本发明的洗涤或清洁剂任选还包含其他成分，例如其他的酶，酶的稳定剂，表面活性剂例如非离子、阴离子和/或两性表面活性剂，漂白剂，漂白活化剂，漂白催化剂，助洗剂，溶剂，增稠剂，螯合剂，电解质，荧光增白剂，抗变灰剂，银腐蚀抑制剂，颜色转移抑制剂，泡沫抑制剂，研磨物质，染料，香味剂，抗微生物活性物质，UV吸收剂，所谓的污物释放活性物质或污物驱除剂，以及其他适用的常用成分。对于上述可用于本发明的类型的成分来说，具体可以参考专利申请DE 10 2007 049 830.8。
在本发明的清洁或洗涤剂中包含的表面活性剂，优选总量为完成的制剂的5到50wt％，特别优选为8到30wt％；在优选实施方案中，使用了至少一种非离子表面活性剂。
洗涤或清洁剂的漂白剂含量可以为1到40wt％，特别是10到20wt％，单水过硼酸盐或过碳酸盐被用作漂白剂是有利的。
如果适用的话，本发明的洗涤或清洁剂中可以包含助洗剂物质，其含量最高90wt％。优选它们的含量为最高75wt％。
优选本发明的制剂中包含的增稠剂的量为完成的组合物的最多5wt％，特别是0.05到2wt％，特别优选为0.1到1.5wt％。
为了增加洗涤和清洁性能，本发明的制剂可以在本发明的多肽之外包含其他酶，所有现有技术中已确定的用于这些目的的酶，在原则上都可以使用。具体来说，它们包括其他蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、半纤维素酶、纤维素酶或氧化还原酶，以及优选其混合物。这些酶原则上是天然来源的；基于天然分子的改进的变异体可用于洗涤和清洁剂中，并且相应地是优选使用的。优选本发明的制剂包含这些其他酶的总量为活性蛋白的1x10-6到5重量百分比。
在其他蛋白酶中，优选的是前面已经描述过的枯草溶菌素类型的天然形式的酶，以及其他前面也已经描述过的洗涤剂蛋白酶。
其例子是前面已经列举过的酶：来自缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)的碱性蛋白酶，枯草溶菌素BPN′和Carlsberg，蛋白酶PB92，枯草溶菌素147和309，枯草溶菌素DY，以及酶(但是在较狭窄的意义上被分类为枯草杆菌酶而不再是枯草溶菌素)嗜热蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶TW3和TW7。枯草溶菌素Carlsberg的进一步开发的形式可以在商标名下从Novozymes A/S，，Denmark获得。枯草溶菌素147和309由Novozymes公司分别在商标名和下销售。在名称下销售的变异体源自于来自缓慢芽孢杆菌DSM 5483的蛋白酶(WO 91/02792A1)，具体描述在WO 92/21760A1、WO 95/23221A1、WO 02/088340A2和WO 03/038082A2中。其他可用的来自芽孢杆菌(Bacillus)物种和吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)的各种不同菌株的蛋白酶，显示在专利申请WO 03/054185、WO03/056017、WO 03/055974和WO 03/054184中。
其他可用的蛋白酶是例如可以从Novozymes公司在商标名Nafizym、和下，从Genencor公司在商标名OxP和下，从Advanced Biochemicals Ltd.，Thane，India在商标名下，从Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.，China在商标名下，从Amano Pharmaceuticals Ltd.，Nagoya，Japan在商标名和下，以及从Kao Corp.，Tokyo，Japan在名称蛋白酶K-16下获得的酶。
可用于本发明的淀粉酶的例子是来自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、来自淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)或来自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的-淀粉酶，以及为了在洗涤和清洁剂中使用而进一步改进的开发产品。来自地衣芽孢杆菌的酶可以从Novozymes公司在名称下，以及从Genencor公司在名称ST下获得。这些-淀粉酶的其他开发的产品可以从Novozymes公司在商标名和ultra下，从Genencor公司在名称OxAm下，以及从Daiwa Seiko Inc.，Tokyo，Japan作为获得。来自淀粉液化芽孢杆菌的-淀粉酶由Novozymes公司在名称下销售，而来自嗜热脂肪芽孢杆菌的-淀粉酶的衍生的变异体，也由Novozymes公司在名称和下销售。其他可用的商业化产品是例如和，后者也来自Novozymes公司。
为此目的，还应该强调的是在专利申请WO 02/10356A2中公开的来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)A 7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶，以及在专利申请WO 02/44350A2中描述的来自琼脂附着杆菌(B.agaradherens)(DSM 9948)的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)。还可以使用属于α-淀粉酶的序列空间并在专利申请WO 03/002711A2中定义的淀粉水解酶，以及在专利申请WO 03/054177A2中描述的那些。上述分子的融合产物同样可以使用，例如专利申请DE 10138753A1中的那些。
可以从Novozymes公司在商标名下获得的，来自黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(A.oryzae)的α-淀粉酶的其他开发产品，也是适合的。其他的商业化产品是例如
本发明的制剂可以包含脂肪酶或角质酶(cutinases)，具体来说是因为它们的甘油三酯裂解活性，而且也是为了从适合的前体原位产生过酸。这些酶包括例如最初可以从嗜热羊毛状腐质霉(Humicolalanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus))获得的脂肪酶或进一步开发的脂肪酶，特别是具有D96L氨基酸交换的那些。它们由例如Novozymes公司在商标名Ultra、和下销售。此外，可以使用例如最初从茄腐镰孢菌豌豆专化型(Fusarium solani pisi)和特异腐质霉(Humicolainsolens)分离的角质酶。其他可以使用的脂肪酶，可以从Amano公司在名称或LipaseBacillis sp.和Lipase下获得。可以使用例如来自Genencor公司的脂肪酶和角质酶，其起始酶最初从门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和茄腐镰孢菌(Fusariumsolanii)分离。作为其他重要的商业化产品提到的有，最初由Gist-Brocades公司销售的制剂M1和，和由MeitoSangyo KK，Japan在名称Lipase和Lipase下销售的酶，以及Genencor公司的产品。
本发明的制剂，特别是如果打算将它们用于处理纺织物时，可以包含纤维素酶，根据目的为纯酶，为酶制剂，或为混合物的形式，所述混合物中各种成分根据它们的各不相同的性能方面有利地彼此互补。这些性能方面具体包括对制剂的初级洗涤性能、次级洗涤性能(抗重新沉积效应或泛灰抑制)和增柔处理(布面效应)、或甚至执行“石洗”效应的贡献。
可用的富含内切葡聚糖酶(EG)的基于真菌的纤维素酶制剂及其进一步的开发产品，由Novozymes公司在商标名下提供。同样可以从Novozymes公司获得的产品和，分别基于特异腐质霉(H.insolens)DSM 1800的50kD EG和43kD EG。该公司的其他可用的商业化产品是和。后者是基于专利申请WO 96/29397A1。性能改进的纤维素酶变体描述在例如专利申请WO 98/12307A1中。专利申请WO 97/14804A1中公开的纤维素酶也可以使用，例如其中公开的来自Melanocarpus的20kD EG，可以从芬兰AB Enzymes公司在商标名和下获得。ABEnzymes公司的其他商业化产品是是和。其他适合的来自芽孢杆菌CBS 670.93和CBS 669.93的纤维素酶公开在WO96/34092A2中，来自芽孢杆菌CBS 670.93的纤维素酶可以从Genencor公司在商标名下获得。Genencor公司的其他商业化产品是“Genencor去污剂纤维素酶L”和Neutra。
具体来说，为了移除某些难除污渍，本发明的制剂，除了本发明的多肽之外，还可以包含其他分类在术语“半纤维素”名下的酶。这些酶包括例如甘露聚糖酶、黄原胶裂解酶、果胶裂解酶(＝果胶酶)、果胶酯酶、果胶酸裂解酶、木聚葡聚糖酶(＝木聚糖酶)、支链淀粉酶和β-葡聚糖酶。适合的甘露聚糖酶可以从Novozymes公司在名称和Pektinex下，从AB Enzymes公司在名称B1L下，从Diversa Corp.，San Diego，CA，USA在名称下获得。适合的来自嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)的β-葡聚糖酶显示在例如专利申请WO 99/06573A1中。从枯草芽孢杆菌回收的β-葡聚糖酶可以从Novozymes公司在名称下获得。
为了增强漂白效果，本发明的洗涤和清洁剂可以包含氧化还原酶，例如氧化酶，加氧酶，过氧化氢酶，过氧化物酶例如卤代、氯代、溴代、木质素、葡萄糖、或锰过氧化物酶，双加氧酶，或漆酶(酚氧化酶，多酚氧化酶)。可以提到的适合的商业化产品是Novozyme公司的1和2。有利地，另外添加与酶相互作用的优选有机的、特别优选为芳香族化合物，以便增加相关氧化还原酶的活性(增强剂)，或者如果在氧化的酶与污渍之间存在大的氧化还原电位差时，用于确保电子流动(介质)。
本发明的多肽以及附加使用的酶，可以以依照现有技术确立的任何形式添加到本发明的制剂中。其中包括例如通过成粒作用、挤出或冷冻干燥获得的固体制品，或特别是在液体或凝胶剂的情况下的酶的溶液，该溶液尽可能浓缩，水少，和/或添加有稳定剂是有利的。
可选地，这些蛋白可以被囊封以用于固体和液体施用形式，例如通过酶溶液与优选的天然聚合物一起喷雾干燥或挤出，或者采取胶囊的形式，例如将酶封闭在例如固化的凝胶中的胶囊，或核/壳类型的胶囊，其中包含酶的核心被不透水、空气和/或化学物质的保护层覆盖。其他的活性物质，例如稳定剂、乳化剂、色素、漂白剂或染料，可以另外施加成叠加的层。这样的胶囊通过本身已知的方法施加，例如通过振动或滚动粒化或通过流化床工艺方法。由于例如使用了聚合薄膜形成剂，这样的颗粒优势是粉尘低，并得益于包层而储存稳定。
将两种或以上的酶、例如本发明的多肽和其他酶包装在一起也是可能的，以便单一颗粒表现出几种酶活性。
在本发明的制剂中包含的蛋白，具体来说包括本发明的多肽，在特别是储存过程中可以得到保护，免遭例如由物理影响、氧化或蛋白水解切割引起的失活、变性或分解。在从微生物回收蛋白和/或酶的情况下，抑制蛋白水解是特别优选的，特别是当制剂也包含蛋白酶的时候。为此目的，本发明的优选制剂可以包含稳定剂。
可逆蛋白酶抑制剂是一类稳定剂。盐酸苯甲脒、硼砂、硼酸(boricacids)、硼酸(boronic acids)或其盐或酯，通常用于此，其中主要的是具有芳香基团的衍生物，例如邻-、间-或对-位取代的苯硼酸，特别是4-甲酰基苯硼酸，或上述化合物的相应的盐或酯。肽醛，即具有还原的C-末端的寡肽，特别是由2到50个单体组成的那些，也用于此目的。就中，卵类粘蛋白和亮抑蛋白酶肽，属于肽类型的可逆蛋白酶抑制剂。蛋白酶枯草溶菌素的特异性可逆肽抑制剂，以及蛋白酶与特异性蛋白酶抑制剂的融合蛋白，也适合于此。
其他酶稳定剂是氨基醇，例如单-、双-、三-乙醇胺和-丙醇胺，及其混合物，多达C12的脂族羧酸，例如琥珀酸、其他二羧酸，或上述酸的盐。封端(End-capped)的脂肪酸酰胺烷氧化物也适合于此目的。此外，某些用作助洗剂的有机酸，例如在WO 97/18287中公开的，也能够使包含的酶稳定化。
低级脂肪醇，但主要是多元醇，例如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨糖醇，是其他常用的酶稳定剂。磷酸二甘油酯也针对物理影响引起的变性进行保护。钙和/或镁盐同样可以使用，例如乙酸钙或甲酸钙。
聚酰胺低聚体或聚合的化合物例如木质素、水溶性乙烯基共聚物或纤维素醚，丙烯酸聚合物和/或聚酰胺，能够稳定酶制品，尤其是在物理影响或pH波动方面。含有聚酰胺-N-氧化物的聚合物同时作为酶稳定剂和颜色转移抑制剂起作用。其他的聚合稳定剂是直链C8到C18聚氧化烯。烷基聚糖苷也可以稳定本发明的制剂的酶成分，并优选能够再增加其性能。交联的含氮化合物优选执行污物释放剂和酶稳定剂的双重功能。具体来说，疏水性非离子聚合物稳定了可能包含的纤维素酶。
还原剂和抗氧化剂在氧化破坏方面增强酶的稳定性；例如，含硫还原剂常用于此目的。其他例子是亚硫酸钠和还原糖。
使用稳定剂的组合是特别优选的，例如由多元醇、硼酸和/或硼砂组成的组合，硼酸或硼酸盐、还原盐与琥珀酸或其他二羧酸的组合，或硼酸或硼酸盐与多元醇或多氨基化合物以及与还原盐的组合。肽醛稳定剂的效应通过与硼酸和/或硼酸衍生物和多元醇的组合得到了有利的增强，并通过二价阳离子、例如钙例子的附加作用甚至得到进一步增强。
因为本发明的制剂可以以所有可以想象的形式提供，因此在所有适合于添加到相应制剂的剂型中的本发明的多肽，代表了本发明的相应实施方案。这些包括例如液体剂型、固体颗粒或胶囊。
囊封形式是保护酶或其他成分免于其他组成成分例如漂白剂的影响，或允许受控释放的良好选择。根据这些胶囊的尺寸，可以区分出毫胶囊、微胶囊和纳胶囊，对于酶来说，微胶囊是特别优选的。这样的胶囊公开在例如专利申请WO 97/24177和DE 19918267中。一种可能的囊封方法包括从蛋白溶液与淀粉或淀粉衍生物的溶液或悬液的混合物开始，将蛋白囊封在该物质中。这种类型的囊封方法描述在专利申请WO 01/38471中。
在固体剂的情况下，蛋白——本发明的多肽以及可以任选包含的其他酶——可以以例如干燥、成粒和/或囊封的形式使用。它们可以单独、即作为独立的相添加，或者与同样的相中其他成分一起添加，可以压实或不压实。如果打算将微囊封的酶加工成固体形式，可以使用从现有技术已知的方法，例如喷雾干燥、离心或再增溶作用，将水从得自于制品的水性溶液中除去。以这种方式获得的颗粒通常具有50到200μm之间的颗粒尺寸。
从按照现有技术进行的蛋白回收和制备工艺过程产生的蛋白，可以以浓缩的水性或非水性溶液、悬液或乳浊液的形式添加到本发明的液体、凝胶化或糊状制剂中，而且也可以以凝胶形式或囊封形式或作为干粉添加。本发明的这种洗涤或清洁剂，通常通过将可以作为料团或溶液导入的成分在自动混合器中简单地混合来进行生产。
本发明的清洁剂，特别是本发明的用于硬表面的清洁剂，可以包含一种或多种推进剂(根据INCI命名法)，其含量通常为1到80wt％，优选为1.5到30wt％，特别是2到10wt％，特别优选为2.5到8wt％，极其优选为3到6wt％。
根据本发明，本发明的具体实施方案，表现为使用本发明的多肽来激活、失活或释放洗涤或清洁剂的成分。
本发明的具体目标，还表现为用于清洁纺织品或硬表面的方法，其中在方法的至少一个步骤中使用了本发明的多肽。
其中包括了手动方法和自动方法，由于在例如使用的量和接触时间方面的更精确的可控制性，优选使用自动方法。
本发明的另一个目标表现为使用本发明的碱性蛋白酶清洁纺织物或硬表面。
此外，本发明的另一个目标是含有本发明的组合物或本发明的洗涤或清洁剂、特别是本发明的用于硬表面的清洁剂以及喷洒分配器的产品。在这种情况下，产品可以是单室和多室容器，特别是双室容器。在这种情况下，喷洒分配器优选为手动致动的喷洒分配器，具体选自气溶胶喷洒分配器(压缩气体容器，也尤其被称为是喷雾罐)，自身产生压力的喷洒分配器，泵喷洒分配器和触发式喷洒分配器，特别是具有由透明的聚乙烯或聚对苯二甲酸乙二酯制成的容器的泵喷洒分配器和触发式喷洒分配器。喷洒分配器在WO 96/04940(Procter&Gamble)以及在其中就喷洒分配器方面引用的美国专利中进行了更详尽的描述，这些专利以其整体内容在这方面引为参考，其内容在此并入本申请。触发式喷洒分配器和泵喷雾器与压缩气体容器相比，具有不需要使用推进剂的优点。利用喷洒分配器上的适合的颗粒适用的附件、喷嘴等(所谓的“喷嘴阀门”)，在本实施方案中可以包含的酶，也可以任选以固定在颗粒上的形式添加到制剂中，并因此作为清洁泡沫计量。
下面的实施例对本发明进行了进一步解释，但不对本发明构成限制。
示例性实施方案
实施例1：执行环状变换 成熟蛋白酶的基因在两侧带有用于可变接头(P接头，长度为1到40个氨基酸)的DNA片段，并将由此获得的构建物克隆到质粒中(起始质粒)。在5’方向上位于5’末端的侧翼以及在3’方向上位于3’末端的侧翼的两个编码P接头的DNA片段，是限制性酶的界面，在限制性消化后，形成了互相契合的突出端。因此，在成熟蛋白基因两侧、编码P接头的两个DNA片段，在限制性消化后能够彼此连接，因此也彼此连接了编码成熟蛋白的C-和N-末端的核酸。为此，使用连接酶将限制性消化获得的构建物闭合成环。选择P接头的长度，使得可以跨过天然蛋白中C-和N-末端之间的距离。
在将编码C-和N-末端的DNA连接后，然后在随机位置用酶将环打开，从而产生了编码具有新的C-和N-末端的成熟蛋白酶的核酸。然后可以在适合的宿主中通过使用筛选质粒的筛选方法，来鉴定通过环状变换获得的、编码具有可能程度的性质的活性蛋白酶的核酸。
如果可行，将编码蛋白酶的前肽原的核酸在3’末端装配上编码可变接头(L-接头，长度为0到40个氨基酸)的核酸，克隆到含有用于表达待筛选的构建物的启动子、并任选装备有抗性基因的质粒(筛选质粒)中。位于前肽原的编码核酸的3’方向，或如果存在的话，在编码L接头并与编码前肽原的核酸相邻的核酸的3’方向上的，是一个或多个限制性酶界面，以允许通过平末端克隆，掺入按照上面描述的方法获得的环状变换突变体，并随后对其进行表达。
L接头的长度，取决于成熟蛋白酶的新的C-末端与为了前肽原的正确加工所必需的前肽原相对于新的C-末端的定位之间的距离。根据本发明，已经意外地发现，L接头一般可以被省略，因为不论前肽原的改变过的位置如何，前肽原的加工一般都可以成功进行。
作为概述，再一次在下面陈述方法的各个步骤。
方法步骤：
1.质粒的限制性
按照酶制造商的说明书，将初始质粒用相应的酶消化，以便获得在两翼带有编码P接头片段的核酸的成熟蛋白编码基因。
2.琼脂糖凝胶电泳和凝胶洗脱
将消化物在琼脂糖凝胶上分离，然后切下所需条带。凝胶洗脱使用试剂盒，按照销售商的方案进行。
3.使用T4连接酶进行DNA环化
使用1到5.5ng/μL的DNA浓度，在连接酶缓冲液中制备连接混合物，通过加入1到40单位的连接酶开始反应。
4.乙醇沉淀
进行了乙醇沉淀以减小体积。
5.使用外切核酸酶III消化残留的线性DNA
在37℃下使用外切核酸酶III进行消化，以便分解仍然存在的线性DNA。
6.QIAquick纯化
使用QIAquick纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)的PCR纯化方案，将样品重新缓冲。
7.用DNase I部分消化，通过加入EDTA终止，将环化的基因线性化
通过将DNA用高度稀释的DNase I在室温下进行处理，将DNA随机线性化。
8.QIAquick纯化
使用PCR纯化方案将样品重新缓冲。
9.使用T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶，添加dNTPs来修复线性化的DNA
因为在DNase I消化过程中不总是产生完美的平末端，因此在本步骤中产生它们。
10.琼脂糖凝胶电泳和凝胶洗脱
将消化产物在琼脂糖凝胶上分离，并切下所需条带。凝胶洗脱使用试剂盒按照方案进行。
11.线性化DNA的克隆和筛选
将线性化的DNA克隆到制备的筛选载体中，转化到蛋白酶阴性的芽孢杆菌菌株中。使用所产生的菌落进行蛋白酶活性的筛选。
关于环状变换方法的执行，读者可以进一步参见下面的引用文献：
Qian，Z.，Lutz，S.(2005)Journal of the American Chemical Society127(39)，pp.13466-13467；Beernink等，(2001)Protein Science，10(3)，pp.528-537；Baird等，(1999)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，96(20)，pp.11241-11246；Graf，R.，Schachman，H.K.(1996)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，93(21)，pp.11591-11596。
实施例2：使用由14个氨基酸构成的接头对BLAP蛋白酶进行环状变换 使用成熟BLAP蛋白酶的基因进行环状变换；使用长度为14个氨基酸、序列为GAATSGKLNGSTAG(SEQ ID NO：1)的接头作为连接N-和C-末端的接头。通过这种方式获得了下面描述的带有侧翼序列的构建物(所描述的不是DNA本身而是对应于DNA的蛋白序列)：
LNGSTAGVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGADGRGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGASSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGS
GAATSGK(SEQ ID NO：7)
两个接头片段被下划线。成熟蛋白的开始和末端用框围住。
一旦环状变换进行后，就中获得了下面描述的两个环状变换变异体NHT04240353和NHT04241867，然后测试了它们的洗涤性能。
交替变换变异体NHT04240353：
GEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGADGRGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGASSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGS
GAATSGKLNGSTAGVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVP(SEQ ID NO：5)
交替变换变异体NHT04241867：
YASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGS
GAATSGKLNGSTAGVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGADGRGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGASSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGST(SEQ ID NO：6)
实施例3：使用环状变换变异体NHT04240353的洗涤实验 为了检查NHT04240353克隆的洗涤性能，测试了下列污渍：
-棉花上的血液/牛奶/墨水：CFT B.V.，Vlaardingen，Holland的C5号产品
-棉花上的全蛋/色素：可以从wfk Testgewebe GmbH，Brüggen-Bracht，Germany获得的10N号产品，切成小片
-棉花上的巧克力奶/墨水：CFT B.V.，Vlaardingen，Holland的C3号产品
-聚酯/棉花上的花生油/色素/墨水：CFT B.V.，Vlaardingen，Holland的PC10号产品
-棉花上的草：可以从Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG[瑞士联邦材料与测试局测试材料]，St.Gallen，Switzerland获得的164号产品
-棉花上的可可：可以从Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG，St.Gallen，Switzerland获得的112号产品
将环状变换变异体掺入到下面显示的基本配方中，与初始BLAP酶进行比较，检查了其洗涤性能：
表1：用于纺织物洗涤剂的基本配方
化学名称 纯物质的wt％
黄原胶 0.3到0.5
消泡剂 0.2到0.4
甘油 6到7
乙醇 0.3到0.5
FAEOS 4到7
非离子表面活性剂(FAEO，APG等) 24到28
硼酸 1
化学名称 纯物质的wt％
柠檬酸钠x 2H2O 1到2
苛性钠 2到4
椰子油脂肪酸 14到16
HEDP 0.5
PVP 0到0.4
荧光增白剂 0到0.05
染料 0到0.001
香料 0到2
H2O，去矿物质的 剩余量
48孔板中的测试混合物(1ml)：
体积 溶液
420μl 161到966mg纺织物洗涤剂在42ml水或缓冲液中
30到530μl 1到100U/ml蛋白酶
剩余量 H2O
污渍直径＝1cm
温育：60min，40℃，大约600rpm.
温育后：漂洗污渍(3次)，干燥和固定。使用CM508d色度计(Minolta)进行亮度测量。
为了进行该测试，将测试织物的圆片(直径10mm)，在24孔微量滴定板中的1ml洗涤液体中，在37℃温育30分钟，振动频率为100rpm。每个实验进行三次测定。
洗涤后，通过与归一化到100％的白色标准品(d/8，8mm，SCI/SCE)进行比较，测量了洗过的纺织物的白度(测定L值)。测量在色度计(Minolta CM508d)上进行，使用10°/D65光源设置。获得的结果表示成性能百分率，将不含酶的基本洗涤剂与含有WT蛋白酶的洗涤剂之间好转值之差，归一化到100％。
通过这种方式，意外地发现NHT04240353变体表现出对全蛋/炭黑和可可的清洁性能比野生型BLAP好50％，同时对草和牛奶/油的清洁性能与野生型大致一样好，对血液/牛奶/墨水和巧克力奶/炭黑的清洁性能比野生型的稍微差一些。
图示：
图示描绘了按照实施例3使用环状变换变异体NHT04240353的洗涤试验的结果。图1描绘了使用血液/牛奶/墨水、全蛋/炭黑和巧克力奶/炭黑的洗涤实验的结果。图2描绘了使用草、牛奶/油、可可和再一次使用血液/牛奶/墨水的洗涤实验的结果。在每种情况下，使用野生型(WT)、即BLAP的结果被设定为100％。
实施例4：特定蛋白酶的环的定位 a)BLAP(缓慢芽孢杆菌碱性磷酸酶)的环
环位于下面的序列片段中：
Ala 1-Val 4，Arg 10-Pro 14，Asn 18-Val 26，Asp 32-Gly45，Phe 49-His 62，Ile 70-Ser 76，Gly 78-Glu 87，Val 93-He102，Asn 115-His 118，Leu 122-Ala 131，Ser 142-Leu 146，Ser154-Met 169，Asp 175-Asn 179，Ala 181-Phe 183，Gly 185-He192，Gly 196-Val 199，Tyr 203-Thr 207，Leu 211-Ser 215，Lys231-Asn 237，Thr 247-Ala 264以及Ala 267-Thr 268。
BLAP的氨基酸序列如下：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGADGRGAISSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGASSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：1)
b)BPN′的环
环位于下面的序列片段中：
Ala 1-Gly 7，Gln 10-Pro 14，Gln 19-Val 26，Asp 32-Gly46，Phe 50-His 64，Val 95-Tyr 104，Asn 117-Asp 120，Met 124-Ala 133，Ser 145-Val 148，Glu 156-He 175，Asp 181-Gln 185，Ala187-Phe 189，Ser 191-Val 198，Gly 202-He 205，Leu 209-Lys213，Lys 217-Thr 220，Lys 237-Asn 243，Asn 252-Val 270以及Ala273-Gln 275。
BPN′的氨基酸序列如下：
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPALKVAGGASFVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVLAVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIWSTLPGNKYGAKSGTCMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINV EAAAQ(SEQ IDNO：2)
c)枯草溶菌素Carlsberg/P300的环：
环位于下面的序列片段中：
Ala 1-Gly 7，Pro 9-Ala 13，Gln 19-Val 26，Asp 32-Gly 46，Phe 50-His 64，Val 72-Ser 89，Val 95-Tyr 104，Thr 116-Val121，Met 124-Ala 134，Arg 145-Val 148，Ser 156-He 175，Asp181-Asn 185，Ala 187-Phe 189，Ser 191-Val 198，Gly 202-Val205，Tyr 209-Thr 213，Leu 217-Thr 220，Lys 237-Ala 243，Leu250-Val 270以及Ala 274-Gln 275。
枯草溶菌素Carlsberg的氨基酸序列如下：
AQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGNSGSTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ(SEQ ID NO：3)。
【序列表】
<110>汉高两合股份公司
<120>通过环状变换得到的新的蛋白变异体
<130>SCT100240-50
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>269
<212>PRT
<213>Bacillus lentus
<400>1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210>2
<211>266
<212>PRT
<213>Bacillus amyloliquefaciens
<400>2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Ala Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala Val Ala Pro Ser Ala Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser
85 90 95
Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val
100 105 110
Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala
115 120 125
Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala
130 135 140
Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln
165 170 175
Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro
180 185 190
Gly Val Ser Ile Trp Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Lys
195 200 205
Ser Gly Thr Cys Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
210 215 220
Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser
225 230 235 240
Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
245 250 255
Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
260 265
<210>3
<211>274
<212>PRT
<213>Bacillus licheniformis
<400>3
Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg
130 135 140
Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 200 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala Gln
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Linker
<400>4
Gly Ala Ala Thr Ser Gly Lys Leu Asn Gly Ser Thr Ala Gly
1 5 10
<210>5
<211>282
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>zirkulare Permutationsvariante
<400>5
Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala
20 25 30
Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Arg
35 40 45
Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn
50 55 60
Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala
65 70 75 80
Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val Leu Val
85 90 95
Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Ala
100 105 110
Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn
115 120 125
Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro
130 135 140
Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu
145 150 155 160
Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
165 170 175
Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg Asn His
180 185 190
Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser
195 200 205
Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ser Gly Lys
210 215 220
Leu Asn Gly Ser Thr Ala Gly Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser
225 230 235 240
Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly
245 250 255
Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu
260 265 270
Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro
275 280
<210>6
<211>282
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>zirkulare Permutationsvariante
<400>6
Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln
20 25 30
Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn
35 40 45
Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Gly Ala Ala
50 55 60
Thr Ser Gly Lys Leu Asn Gly Ser Thr Ala Gly Ala Gln Ser Val Pro
65 70 75 80
Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His Asn Arg Gly Leu
85 90 95
Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr
100 105 110
His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu
115 120 125
Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr
130 135 140
Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser
145 150 155 160
Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Arg Gly Ala
165 170 175
Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn Gly Met
180 185 190
His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala Thr Leu
195 200 205
Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val Leu Val Val Ala
210 215 220
Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr
225 230 235 240
Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala
245 250 255
Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val
260 265 270
Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr
275 280
<210>7
<211>282
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Konstrukt zur Herstellung yon Permutationsvarianten
<400>7
Leu Asn Gly Ser Thr Ala Gly Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser
1 5 10 15
Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly
20 25 30
Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu
35 40 45
Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln
50 55 60
Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu
65 70 75 80
Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr
85 90 95
Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile
100 105 110
Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn
115 120 125
Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val
130 135 140
Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met
165 170 175
Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln
180 185 190
Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser
195 200 205
Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala
210 215 220
Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro
225 230 235 240
Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr
245 250 255
Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu
260 265 270
Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ser Gly Lys
275 280