N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的新型多晶 型物 【技术领域】
本发明涉及名称为 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺， 分子式是 (I) 的化合物的两种新型多晶型物， 和它们在药物依赖的治疗， 且特别是在酒精中毒的治疗中 的用途。
背景技术 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺作为在药物依赖和酒精中毒的治疗 中有用的酰胺基团的一部分在欧洲专利 EP 0 932 597 B1 中已经被首次公开了。
根据该专利， 当与在酒精中毒的治疗中众所周知的 γ- 羟基丁酸 (GHB) 的盐类比 较时， 具有 4- 三氟甲基苯甲基残基的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺在神经 药理学活性方面显示了最佳的特性。 特别地， 在对小鼠的运动行为的影响的评估中， 它已经 显示出了作用的潜力和持续作用的特性， 这要好于 GHB 并还要好于在此结构中具有不同残 基的其它酰胺。
因此， 根据它的最佳神经药理学活性， 需要用于药理学的高纯度和高产量的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺。
首先， 本发明的发明人已经尝试通过上述专利中描述的制备方法获得 N-[4-( 三 氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺。
具体地， 根据 EP 0932597B1， 通过下述的此专利第 8 页中描述的常规的合成方法 制备了此化合物， 包括以下步骤 ： A) 在 NH4Cl 的存在下， 在 160-170℃的温度下， 将 4- 烷氧 基丁酸酯与适当的胺反应， 从而获得粗产物， B) 用环己胺 / 乙酸乙酯洗脱硅胶上的粗产物 进行层析， 并且最后 C) 由 CH2Cl2/Et2O 进行结晶。
然而， 根据这一方法， 本发明人发现， 即使他们获得了所希望的化合物， 但是每次 它具有不同的物理 - 化学参数。因此， EP 0 932 597 B1 中描述的常规合成方法显出它本 身缺乏再现性， 并且由于步骤 B) 的纯化是非常昂贵的， 并且因此不适合用于工业规模的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的制备。
发明内容 通过尝试解决 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺制备方法中的再现性 问题， 本发明人惊讶地发现此化合物可以是不同的多晶型物。具体地， 在开展制备， 蒸馏和 分析每次获得的产物中， 他们发现了具有不同晶胞堆积的多晶型物 A 和多晶型物 B 的两种 新的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物。
因此， 在一方面， 本发明提供了分子式 (I) 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧 基丁酰胺的多晶型物 A ：
在 X- 射线粉末衍射图 ±0.2 中， 在衍射度 (2-θ) 下具有下述的峰值 ：
9.7 ； 12.0 ； 18.0 ； 24.1 ； 25.9。
在另一方面， 本发明提供了分子式 (I) 的化合物的多晶型物 B， 其在 X- 射线粉末衍 射图 ±0.2 中， 在所述衍射度下具有下述的峰值 ：
11.7 ； 19.8 ； 22.3 ； 23.6。
此外， 本发明人还发现了一种不需要层析纯化步骤就能够生产出始终具有再现性 和稳定且纯度高的这两种新型多晶型物 A 和 B 的方法。
因此， 在又一个方面， 本发明涉及制备 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰 胺的多晶型物 A 的方法， 所述方法包括下述步骤 ：
i) 在催化剂的存在下， 使 4- 三氟甲基苯甲胺与 4- 甲氧基丁酸甲酯反应， 从而获得 粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 ； 和
ii) 从含有粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的有机溶机的溶液中 获得结晶多晶型物 A， 所述溶液结晶析出 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多 晶型物 A。
在又一个方面， 本发明涉及制备 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的 多晶型物 B 的方法， 所述方法包括下述步骤 ：
i) 在催化剂的存在下， 使 4- 三氟甲基苯甲胺与 4- 甲氧基丁酸甲酯反应， 从而获得 粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 ； 和
ii) 从含有粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的有机溶机的溶液中获得结 晶多晶型物 B， 所述溶液结晶析出 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B。
N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 和 B 在药物依赖的治 疗中和在酒精中毒的治疗中的有用的。更具体地， 它们在减少乙醇的自发消耗和在戒断综 合症的治疗中是有用的。此外， 上述的多晶型物 A 和多晶型物 B 在对例如海洛因， 可卡因， 吗啡和神经活性药物等上瘾的药物的戒断的紧要关头的治疗中同样是有用的。
因此， 本发明还涉及 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 作为药物的用途和 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 作为药物的 用途。
在另一方面， 本发明还涉及一种药物组合物， 所述组合物包括作为活性剂的有效 量的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 和药物可接受的载体， 以 及另一种包括作为活性剂的有效量的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶 型物 B 和药物可接受的载体的药物组合物。 附图说明 图 1 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的结晶多晶型物 A 的 X- 射线粉末衍射图 ；
图 2 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的结晶多晶型物 B 的 X- 射线粉末衍射图 ；
图 3 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的结晶多晶型物 A 的红 外光谱 ；
图 4 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的结晶多晶型物 B 的红 外光谱 ；
图 5 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 的示差扫 描热量 (DSC) 光谱 ；
图 6 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 的示差扫 描热量 (DSC) 光谱 ；
图 7 显示了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 和多晶型 物 B 的 IR 光谱之间的相关性 ；
图 8A 显示了未剥夺 (non deprivated) 的 sP 小鼠在服用多晶型物 A 之后的自发 型酒精摄入模型的结果 ；
图 8B 显示了未剥夺的 sP 小鼠在服用高剂量的多晶型物 A 之后的抑制酒精的效果 模型的结果 ； 和
图 8C 显示了未剥夺的 sP 小鼠在服用低剂量的多晶型物 A 之后的抑制酒精的效果 模型的结果。
具体实施例
本发明涉及 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的新型多晶型物 A 和新 型多晶型物 B， 它们在 X- 射线粉末衍射图中在衍射度 ( 角度 ±0.2°， 2-θ) 下具有不同的 相关峰值， 具体地， 多晶型物 A 是 9.7 ； 12.0 ； 18.0 ； 24.1 ； 25.9， 多晶型物 B 是 11.7 ； 19.8 ； 22.3 ； 23.6。
更具体地， 多晶型物 A 在图 1 描述的 X- 射线粉末衍射图中显示了在下述的表 1 中 显示的衍射度下的 18 个峰值。
表1： 多晶型物 A 的峰值 ( 角度 ±0.2°， 2-θ)
9101855200 A CN 101855202说峰值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 2-θ 6.0 9.7 11.0 12.0 17.6 18.0 18.7 18.9 19.6 20.7 21.6 22.2 23.4 24.1 24.7 25.9 26.2 28.2明书I/I0 40 8 7 80 20 21 26 32 9 69 27 26 32 100 17 54 18 194/17 页强度 (cps) 4082 797 640 8297 2032 2173 2658 3293 919 7158 2730 2601 3261 10380 1663 5534 1771 1889
根据本发明， N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 可以通 过包括下述步骤的方法进行制备 ：
(i) 在催化剂的存在下， 使 4- 三氟甲基苯甲胺与 4- 甲氧基丁酸甲酯反应， 从而获 得粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 ； 和
(ii) 从含有粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的有机溶剂的溶液中 获得结晶多晶型物 A， 所述溶液结晶析出 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多
晶型物 A。
步骤 (i) 的 4- 三氟甲基苯甲胺可以根据已知的芳胺合成方法进行制备。优选地， 4- 三氟甲基苯甲胺可以根据下述的反应式使 4- 三氟甲基苯甲醛与羟胺反应进行制备 ：
根据这个反应式， 4- 三氟甲基苯甲胺的产率可以达到 90％。
根据本发明， 在步骤 (i) 中， 4- 三氟甲基苯甲胺在催化剂的存在下与 4- 甲氧基丁 酸甲酯反应， 优选甲醇中含有 30％的甲醇钠溶液， 但是 N， N- 二甲氨基吡啶和氯化铵也是可 以使用的。优选地， 这一步骤 (i) 在 95℃至 135℃的温度， 较优选 110℃至 120℃的温度下 进行。在反应最后， 可以通过例如使用有机溶剂蒸馏的传统的分离技术分离出粗 N-[4-( 三 氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺。有利地， 步骤 (i) 使得粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲 基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的产率达到 70％。
这样获得的粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺在步骤 (ii) 中以多 晶型物 A 被结晶， 所述步骤 (ii) 通过首先在有机溶剂中制备粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲 基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的溶液， 并且随后通过在所述溶液中结晶析出所述多晶型物 A 实现。
这样的溶剂可以是能够帮助多晶型物 A 结晶的任何适合的有机溶剂。优选地， 这 一有机溶剂可以选自甲苯， 乙酸乙酯和 n- 己烷的混合物。更优选地， 粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的溶液使用乙酸乙酯和 n- 己烷的混合物制备。有利地， 当粗产 物被溶解于乙酸乙酯和 n- 己烷的混合物中时， 乙酸乙酯∶ n- 己烷的比例在 1 ∶ 4 至 1 ∶ 2 之间， 较优选 1 ∶ 3。
溶剂中的粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的溶液优选在结晶析出 多晶型物 A 之前， 将其从 35℃加热至 70℃， 较优选从 40℃加热至 60℃。多晶型物 A 的沉淀 优选在 0℃至 35℃之间发生， 较优选在 10℃至 20℃之间发生。
有利地， 步骤 (ii) 使得 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 的产率达到大约 95％。
根据本发明的其它实施例， 提供了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 的多晶型物 B。多晶型物 B 在图 2 描述的 X- 射线粉末衍射图中显示了在下述的表 2 中显示
的衍射度下的 16 个峰值。
表2： 多晶型物 B 的峰值 ( 角度 ±0.2°， 2-θ)
峰值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
2-θ 5.9 11.7 17.6 19.0 19.8 20.9 21.9 22.3 23.6 24.0 24.8 26.0 27.0 27.4 28.1 29.6强度 (cps) 5211 7402 1845 3985 4334 3405 7127 6896 7594 2689 1434 1654 1590 1089 2695 1252I/I0 69 98 25 53 58 45 94 91 100 36 19 22 21 15 36 17根据本发明， N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 可以通 过包括下述步骤的方法进行制备 ：
(i) 在催化剂的存在下， 使 4- 三氟甲基苯甲胺与 4- 甲氧基丁酸甲酯反应， 从而获 得粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 ； 和
(ii) 从含有粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的有机溶剂的溶液中 获得结晶多晶型物 B， 所述溶液结晶析出 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多 晶型物 B。
上述提到的制备多晶型物 A 的方法， 即步骤 (i) 的苯甲胺的制备的优选方面和步 骤 (i) 和 (ii) 的全部有利的特点对于制备多晶型物 B 的方法是相同的， 并且在此通过参考 被引入。
根据本发明， 多晶型物 A 和多晶型物 B 通过简单的方法方便地获得， 该方法还避免 了为了获得纯的晶型所使用的层析方法， 并且更有利地， 该方法具有再现性并且可以选择 性地以稳定的形式获得所希望的晶型。
结晶多晶型物 A 和 B 可以分别通过图 1 和 2 显示的它们的 X- 射线粉末图进行区 别， 而且它们还可以通过在试验部分的它们的红外光谱进行区别。
结晶多晶型物 A 和 B 都是热力学稳定的， 不会从一种晶型转化为另一种晶型。对 每种多晶型物进行溶出度试验， 并且这两种多晶型物 A 和 B 在溶解度特性中没有显示出差 异。在药物依赖的治疗并特别是在酒精中毒的治疗中， 它们还显示出令人惊讶的药理学活 性。
由于这样的特性， 结晶多晶型物 A 和 B 可以作为药物使用。
因此， 根据本发明， 提供了包括多晶型物 A 或多晶型物 B 和适合的药物赋形剂的药 物组合物。
根据本发明的组合物优选包括重量比 12.5％至 50％的多晶型物 A 或多晶型物 B。
这一组合物可以使用传统的稀释剂或赋形剂以及医学中已知的技术进行制备。 包 括多晶型物 A 和 B 的药物组合物可以通过任何适合的途径， 例如口服或注射进行给药。
用于口服给药的药物组合物以固体形式或液体形式是有利的， 固体形式例如粉 末， 颗粒， 药片， 任选泡腾片， 压缩或涂层丸， 糖衣丸， 小囊， 硬胶囊或软胶囊， 液体形式例如 溶液， 悬浮液或乳状液。 注射给药的药物组合物可以水状或非水状溶液， 悬浮液或乳状液的 形式。
在固体组合物中， 多晶型物 A 和多晶型物 B 可以与任何适合的固体赋形剂结合， 这 些赋形剂例如选自润滑剂， 分散剂， 填充剂等。
在液体组合物中， 多晶型物 A 或多晶型物 B 可以溶解于例如水， 有机溶剂或酒精 中。
多晶型物 A 或多晶型物 B 可以有利地用于药物依赖的治疗和酒精中毒的治疗中。
为了这些目的， 这两种多晶型物可以优选以 5 至 50mg/kg 的剂量进行给药。
根据本发明， 虽然这两种多晶型物用作药物使用具有相似的特性和相似的活性， 但是 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 是优选的。作为一个事 实， 多晶型物 A 显示出了最佳的物理特性， 例如可压缩性和密度， 从而使得其具有在配制和 产品生产中极其重要的较好的可使用性和操作性。
此外， 如从试验部分证实的， 多晶型物 A 令人惊讶地显示出以 5 至 10mg/kg 的非常 低的药理学剂量对酒精依赖具有治疗活性。
对多晶型物 A 还进行了安全药理学， 毒性和遗传毒性试验， 并且它的结果显示它 是安全的， 并且如下述证实的具有非常低的毒性和遗传毒性曲线。
现在， 通过非限制性的实施例更详细地描述本发明， 以更好地表征多晶型物 A 和 多晶型物 B 的特性和它们的化学 - 物理以及药理学特性。
实施例 1 ： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 的制备A)4- 三氟甲基苯甲胺的制备
在反应器中， 加入 15kg 的蒸馏水， 2.50kg 的醋酸钠， 2.30kg 的盐酸羟胺， 4.00kg 的甲醇。在室温下， 添加 5.0kg 的三氟甲基苯甲醛， 并且所述混合物首先被搅拌三十分钟， 并且随后在真空下蒸馏出 5kg 的溶剂。随后， 添加 12.0kg 的 80％的醋酸并随后分次添加 4.5kg 的锌， 从而由于放热， 温度上升至 60-80℃。随后， 这一温度通过冷却被保持。在这个 反应的最后， 添加 10.0kg 的甲苯和 15.0kg 的 30％的氨以去除锌盐。 获得的物质在 50-60℃ 下搅拌并随后将下层的水相去除。
在真空下蒸馏至一半体积之后， 回收含有 4- 三氟甲基苯甲胺的甲苯溶液并用于 下述的步骤 (i)。
通过电位滴定仪确定获得了 4.00kg 的 4- 三氟甲基苯甲胺。产率 ： 79.5％
B) 步骤 (i) 的粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的制备
步骤 A)(4.00kg 的 4- 三氟甲基苯甲胺 ) 中获得的甲苯溶液加入反应器中。 在蒸馏 直至获得油残余物之后， 添加 3.20kg 的 4- 甲氧基丁酸甲酯， 0.40kg 的 30％的甲醇钠。随 后， 将溶液加热至 110-120℃， 常压蒸馏， 以去除全部甲醇 ( 也就是反应器中没有甲醇 ) 并将 这一温度保持至少两小时。随后， 将 110-120℃的反应器放入真空中至少 1 小时。在反应的 最后， 将 12.0kg 的甲苯， 2.0kg 的水和 0.40kg 的 80％的醋酸添加至所述物质中。在搅拌之 后， 将下面的水相分离并去除。随后， 将有机相在真空下蒸馏直至获得油残余物。向所获得 的油残余物中添加 4.00kg 的乙酸乙酯， 12.0kg 的 n- 己烷， 并将最终的物质加热至 40-60℃ 直至获得完全溶解的溶液。 随后， 这一溶液被降温至 20-30℃并被保持此温度直至获得良好 的沉淀物。随后， 所述物质被冷却至 0-10℃， 通过用 0.80kg 的乙酸乙酯， 4.00kg 的 n- 己烷 的混合物清洗离心。获得的潮湿产物用于下述的步骤。
获得 3.8kg 的粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺。产率 ： 60.5％
C) 步骤 (ii) 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 的结 晶
在反应器中， 添加 3.8kg 的粗 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 ( 对 应的潮湿产物 )， 3.8kg 的乙酸乙酯和 11.4kg 的 n- 己烷。所述物质被加热至 40-60℃直至 获得完全溶解的溶液， 并且随后溶液被降温至 25-35℃。0.038kg 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯 甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 结晶析出。所述物质被保持在 25-35℃至少 1 小时， 并且随后被冷却至 10-20℃并且再次保持此温度至少 1 小时。随后， 所述物质通过使用前 面制备的且含有 0.76kg 的乙酸乙酯， 2.28kg 的 n- 己烷的混合物清洗离心。获得的产物在 40-50℃进行干燥。获得 3.4kg 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型 物 A。产率 ： 89.5％
实施例 2 ： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 的制备
使用实施例 1 的试验部分 A) 和 B) 的相同步骤和相同用量获得了粗 N-[4-( 三氟 甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺。
C) 步骤 (ii) 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 的结 晶
在试验室烧瓶中， 加入 34.0g 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺， 34.0g 的乙酸乙酯， 102g 的 n- 己烷。随后将所述物质加热至 40-60℃直至获得完全溶解的溶液。随后， 将所述溶液冷却至 25-35℃， 0.35g 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基 丁酰胺的多晶型物 B 结晶析出。所述物质被保持在 25-35℃至少 1 小时， 并随后被冷却至 10-20℃， 并再次被保持于此温度至少 1 小时。随后， 所述物质通过使用前面制备的且含有 6.8g 的乙酸乙酯， 20.4g 的 n- 己烷的混合物清洗离心。获得的产物在 40-50℃进行干燥。 获得约 31g 的 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B。
实施例 3 ： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 的分析
首先， 分析实施例 1 的结晶产物以证实它是 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧 基丁酰胺。
实施例 1 的样品进行以下分析 ：
使用 Thermo-Finnigam LCQ-Advantage Instrument 通过 (+)ESI( 电喷雾电离 ) 技术进行质谱分析。
分子量是 275， 以及质子 / 质子碎片图的结果在下述的表 3 中显示 ：
表3： 来自质子 / 质子碎片图的结果
分子量和质子 / 质子碎片图证实了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 的结构。
使用在 200MHz 下运行的 Variant Geminy 200 型仪器通过 CDCl3 和 CDCl3+D2O 溶 1 剂进行 H-NMR 分析。
根据下述结果， NMR 图谱证实了 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的 结构 ：
表4： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺 1H-NMR 图谱 多重性 d- 三重 三重 单重 (H) (2) (2) (3)15δ(ppm) 1.91 2.33 3.28J(Hz) 6.2 ； 7.3 7.3 -确定 CH2 CH2 CH3101855200 A CN 101855202说多重性 三重 双重 宽峰 AA’ BB ‘系统 AA’ BB ‘系统 (H) (2) (2) (1) (2) (2)明书J(Hz) 6.2 5.9 8.1 8.1 确定 CH2 CH2 NH H； H H； H10/17 页δ(ppm) 3.40 4.46 6.31 7.37 7.56
- 元素分析
样品提供了下述的元素值， 与计算值对应 ：
表5： C13H16NO2F3 的元素值
C13H16NO2F3 的计算值 (％ ) 基准 (％ )
C 56.72 56.52
H 5.82 5.87
N 5.09 5.00
O 11.64 11.33
F 20.73 20.48
实施例 4 ： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 B 的分析
通过使用相同的技术和仪器对根据实施例 2 获得的结晶产物的样品重复进行质 谱， 1H-NMR 和元素分析。
全部获得的数据证实实施例 2 的产物是 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁 酰胺。
实施例 5 ： N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多态性的确定
实施例 1 和 2 的结晶产物的两个样品通过下述技术进行分析 ：
- 使用 Rigaku Miniflex 仪并使用 Cu-α1- 射线和 Cu-α2- 射线进行 X- 射线粉末 衍射 ；
- 使用 Perkin-Elmer DSC 6 仪并使用温度 50-260℃， 10℃ / 分钟的扫描速度进行 DSC 分析 ；
- 使用 Perkin-Elmer FT-IR Spectrum-one 进行红外分析， 其中被分析的样品是 KBr 中的悬浮液。
实施例 1 的多晶型物 A 的样品的 X- 射线粉末衍射图在图 1 中显示， 并且 2-θ 和 强度值 (cps) 在上述的表 1 中显示。
实施例 2 的多晶型物 B 的样品的 X- 射线粉末衍射图在图 1 中显示， 并且 2-θ 和 强度值 (cps) 在上述的表 2 中显示。
多晶型物 A( 实施例 1) 的 IR 图谱在图 3 中显示。如图 3 描述的 IR 谱带 (cm-1) 如下 ： 3308.68， 3067.42， 2997.56， 2971.26， 2935.88， 2882.97， 2834.85， 2740.58， 1924.26，1642.03 ， 1541.19 ， 1480.60 ， 1446.91 ， 1424.54 ， 1373.53 ， 1330.93 ， 1253.96 ， 1234.94 ， 1209.04， 1165.17， 1114.08， 1068.67， 1047.11， 1031.50， 1020.76， 954.22， 916.98， 886.86， 835.75， 815.71， 757.32， 722.82， 692.97， 639.65， 590.06， 531.17， 508.96， 482.28。
多晶型物 B( 实施例 2) 的 IR 图谱在图 4 中显示。如图 4 描述的 IR 谱带 (cm-1) 如下 ： 3305.52， 3076.93， 2989.08， 2932.17， 2869.83， 2839.20， 2817.11， 2752.21， 2651.07， 2296.64 ， 2069.08 ， 1931.29 ， 1642.82 ， 1542.23 ， 1482.83 ， 1452.36 ， 1417.48 ， 1383.87 ， 1341.05， 1247.47， 1122.67， 1071.56， 1017.95， 955.01， 884.95， 872.11， 853.35， 817.02， 764.69， 722.01， 642.51， 590.87， 536.59， 490.57， 465.16。
多晶型物 A( 由实施例 1 获得的 ) 和多晶型物 B( 由实施例 2 获得的 ) 的 DSC 图谱 分别在图 5 和 6 中显示， 其中显示了初始温度和峰值温度。由全部的图 1-6 可知， 多晶型物 A 和多晶型物 B 明显都包括同构晶体。然而， 根据不同分析中获得的数值， 多晶型物 A 和多 晶型物 B 具有不同的晶体结构。
为了更好的强调它们在结构上的区别， 将图 3 中描述的实施例 1 样品 ( 多晶型物 A) 的 IR 图谱和图 4 中描述的实施例 2 样品 ( 多晶型物 B) 的 IR 图谱重叠为图 7 中所表示 的， 并计算它们的相关性。相关值是 65.26％。这一结果和图 7 证实了多晶型物 A 和多晶型 物 B 是 N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的两种不同的多晶型物。
实施例 6 ： 多晶型物 A 的样品和多晶型物 B 的样品的物理 - 化学特性的评估
对实施例 1 获得的多晶型物 A 的样品微粉化小于 10 微米后进行分析。
分析的结果在下述的表 6 中显示。
表6： 多晶型物 A 和多晶型物 B 的物理 - 化学特性
多晶型物 A 说明 白色晶体粉末多晶型物 B 白色粉末 ( 有些粘并光滑 )熔点 (℃ ) 水 (KF 滴定 )(％ ) 试验 ( 无水体积 )(％ ) 色谱纯度 (％ )
73.2℃ 小于 0.01 99.5 0.0573.4 0.01 100 0.04这两种多晶型物显示是高纯度的晶体。此外， 多晶型物 A 完全是晶体粉末。由于 这一特性， 从更好的可使用性和操作性考虑， 多晶型物 A 被认为是制备药物组合物最好的 备选者。
使用这两种粉末的样品 ( 多晶型物 A 和多晶型物 B) 以评估这两种多晶型物在不 同 pH 值下的溶解性。
在下述 pH 值条件下对这两种样品进行试验 ：
-pH ＝ 1.2 的盐酸缓冲液
-pH ＝ 3.0 的醋酸
-pH ＝ 3.0 的磷酸缓冲液
-pH ＝ 4.6 的磷酸缓冲液
-pH ＝ 6.0 的磷酸缓冲液
-pH ＝ 7.4 的磷酸缓冲液
-pH ＝ 8.0 的碱性磷酸盐缓冲液
使用 100ml 的适合的缓冲液在玻璃烧瓶中溶解 0.5g 的每种样品。随后将这两种 样品搅拌 30 分钟。如果这两种样品完全溶解了， 在所述烧瓶中再添加 1g 的样品并搅拌 30 分钟。 重复进行这一步骤直至在所述烧瓶的底部出现未溶解的产品。 在这一溶解步骤之后， 所述样品被储存 24 小时， 并且随后通过 HPLC 试验分别测定溶解的多晶型物 A 和多晶型物 B 的数量。结果在下述的表 7 中显示 ：
表7： 在不同 pH 值下多晶型物 A 和多晶型物 B 的溶解度
这两种多晶型物在溶解性上没有显示出明前的差别。
这两种化合物的溶解度不受 pH 值的影响， 并且在这种情况下， 微小的差别是不重 要的。低溶解度证实了所述两种多晶型物的高度稳定性。在 24 小时之后， 在不同 pH 值条 件下， 溶解度增加了 10-30％。根据这一试验， 这两种多晶型物 A 和多晶型物 B 都可以用于 制备药物。
实施例 7 ： 药理学试验
A)N-[4-( 三氟甲基 ) 苯甲基 ]-4- 甲氧基丁酰胺的多晶型物 A 在酒精依赖治疗中 的评估。
用 Sardinian 嗜酒小鼠 (sP) 进行试验， 即遗传选择的自发型酒精消耗的啮齿目动 物。由于这些小鼠 ( 在水和 10％的乙醇溶液之间保持自由选择的方式 ) 消耗了大量的酒 精 (6-7g/kg/ 天 )， 都对被试验的化合物 (80-100％ ) 有较大的偏好性， 因而采用这些动物 作为研究计划中的主要特定的动物模型。
在这一标准下， 这些小鼠在动物饲养笼中无限制获得 10％的乙醇和水之间 (24h/ 天 ) 的两瓶自由选择的方式， 并且它们显示出下述这些特性 ： 每日摄入 6g/kg 的酒精 ； 高于 80％的偏好比 ( 酒精溶液 vs 全部液体 ) ； 每天酒精摄入约为 3-4 次狂饮 ； 每次狂饮 (binge) BAL( 血液酒精浓度 ) 高于 50mg％； 通过集中， 享乐定点机理诱发药物效果 ( 镇静作用， 运动 刺激 ) 和规律。
这些试验根据下述的模型进行 ：
1. 未剥夺型 sP 小鼠中的自发型酒精摄入
2. 剥夺型 sP 小鼠中的酒精剥夺效果
1. 未剥夺型 sP 小鼠中的自发型酒精摄入
根据这一模型， 自由选择方式的两个瓶子中的酒精摄入表示人类酒精中毒的 “主 动饮酒” 状态。因此， 被试验的活性化合物应该减弱了小鼠对酒精消耗的嗜好。这一模型中 的全部结果证实多晶型物 A 在以宽范围的剂量 (10-100mg/kg) 紧急灌胃给药之后使酒精摄 入减少了。强调了解酒效果是特别的这是非常重要的， 如摄入水的代偿性增加和通过 sP 小 鼠 ( 未报导数据 ) 中正常食物摄入所证实的， 它减少的酒精摄入与镇静作用不相关。在图 8A 中， 显示了一个试验的结果。具体地， 将 10， 20， 25 和 50mg/kg 剂量的多晶型物 A 进行给 药并评估酒精摄入。令人惊讶地， 10mg/kg 的低剂量明显减少了酒精摄入。
2. 剥夺型 sP 小鼠中的酒精剥夺效果
为了进一步说明多晶型物 A 的解酒效果， 对这一化合物的酒精剥夺效果 (ADE) 进 行评估。 ADE 很好地证实了在戒酒一段时间之后发生的酒精摄入的暂时增加， 并且对于强迫 型， 未控制型的酒精需求和摄取行为表现了酗酒者对酒精再度依赖。 根据这一模型， 摄取酒 精的 sP 小鼠经过两周的戒酒周期， 在此过程中未接触乙醇。在这一周期之后， 开始试验之 前的 30 分钟， 此动物服用多晶型物 A， 并且随后再次接触酒精。 在开始试验的 1 小时之后测 定摄入量。
结晶多晶型物 A 的高剂量和低剂量分别在图 8B 和 8C 中描述了结果。多晶型物 A 完全抑制了 ADE 效果， 以 5-100mg/kg 的剂量范围显示了非常良好的活性。此外， 5mg/kg 的 低剂量完全可以消耗掉额外的酒精。
实施例 8 ： 多晶型物 A 的安全药理学， 毒性和遗传毒性的评估
1. 安全药理学
以不同的试验模式对体外和体内 ( 小鼠和狗 ) 评估多晶型物 A 对 CNS， 心血管， 呼 吸和免疫功能的潜在的副作用。 在体内试验中， 被试验的化合物通常以 100， 300 和 1000mg/ kg 的剂量单独口服给药。
A)CNS 系统- 小鼠中的 Irwin 试验和体温
根据 Irwin 试验通过使用 standard observation battery 研究了多晶型物 A 的神经行为的影响， 评估了周围和中枢神经系统的活性 ( 例如运动活性， 运动协调性， 躯 体感觉 / 运动反射应答， 自主应答 ) ； 通过电子体温计测定了体温。所述化合物在 100mg/ kg 诱导自发运动活性的短暂下降 ； 在较高剂量下， 对运动的影响更加显著并更加持久且与 miorelaxant 效果相关并减弱了意识。以 1000mg/kg 的剂量， 小鼠显示了趾尖定位， 共济失 调和随后横卧或平躺定位 ； 所有影响是可逆的。在 100mg/kg 的剂量下未影响体温， 而在更 高的剂量下， 体温明显下降长达 4 小时。
- 小鼠的海索比妥睡眠时间
试验包括测定海索比妥诱发睡眠的持续时间 ； 具有镇静或提神作用的物质分别增 加或减少了海索比妥诱发睡眠的持续时间。在最低剂量 (100mg/kg)， 对入睡时间或睡眠的 持续时间没有看到显著统计效果。 在中间剂量， 记录到了睡眠持续时间的微弱减少， 而在最 高剂量， 观察到了入睡时间和睡眠持续时间的明显减少。
- 小鼠的痉挛行为
在该研究中， 探索了多晶型物 A 与诱发痉挛反应的戊四唑结合服用后潜在的痉挛 影响 ； 用具有痉挛剂特性的物质预处理快速引发痉挛反应。 以所有剂量服用， 多晶型物 A 没 有明显统计的痉挛影响， 而以 100 和 300mg/kg 的剂量诱发了痉挛发生时间的增加， 这意味 着潜在的抗痉挛的效果。
B) 心血管仪
体外
-HERG 细胞 ( 人类甲醚相关基因细胞 )
研究了多晶型物 A 对来自稳定转染有 HERGG-1cDNA 的 HEK-293 细胞 ( 人类胚胎肾 细胞 ) 所记录的 Herg 拖尾电流的潜在阻断作用。所述方法包括使用膜片钳技术测定全部 细胞结构中 HERG 拖尾电流。证实抑制 HERG 电流的化合物能拖延心肌动作电位并增加 QT 间隔。
获得的结果显示了多晶型物 A 在 10-7M 没有诱发显著统计的 HERG 拖尾电流的抑 制； 在 10-6M 和 10-5M 的浓度， 观察到了微小的和不依赖剂量的减少， 并且在试验的最高浓度 -4 10 M， 出现了 50％的减少。 需要强调的是， 此抑制从没有达到 70％的值， 这被认为是这一试 验中化合物活性的临界值。
- 浦肯雅纤维
在分离的犬科的浦肯雅纤维中评估多晶型物 A 对心肌动作电位所诱发的潜在的 副作用。通过细胞内微电极技术测定横跨膜的动作电位 ； 推荐这一方法来测定物质对诱发 -7 -6 -5 QT 间隔的延时的能力。浓度 10 ， 10 和 10 M 的多晶型物 A 在正常或低刺激小鼠的动作电 位参数上不具有显著统计影响 ； 10-4M 的非常高的浓度观察到了复极的动作电位持续时间 的明显减少。以所有浓度试验， 在复极之后没有记录到提前或延时。
这些结果显示， 根据多晶型物 A 的电生理学曲线， 没有出现 TDP( 室性心动过速 ) 或 QT 延时 ； 多晶型物 A 可被划入不诱发人类 TDP 或 QT 延时的药物中。
体内
- 有知觉的狗的心血管评估在有知觉的， 预先已配备有遥感探测发射机的自由活动的狗身上， 评估以 100， 300 和 1000mg/kg 的剂量通过口服服用的多晶型物 A 对血压， 心率和心电图的任何潜在的影响。 在该研究的第一部分， 仅仅记录了遥感探测值 ； 记录的参数从服用化合物之前的至少 24 小 时开始并在剂量下持续 24 小时。在第二部分， 仅仅服用 1000mg/kg 的最高剂量， 并在治疗 之前和治疗后 3 小时补充测定例如 6- 导联心电图 ( 导联 I， II， III， aVL， aVR 和 aVF)， 血样 和动物的观察。
第一部分 ： 100mg/kg 的多晶型物 A 未诱发血压， 心率和心电图扫描 ( 特别是在 T 波形没有变化 ) 的相关变化。当以 300 和 1000mg/kg 的剂量时， 记录到了动脉血压 ( 平均， 心脏收缩和心脏舒张动脉血压 ) 的稍微升高， PR 和 PQ 间隔时间的稍微减少， 和使用 Sarma 方法用于心率校正的 QT 间隔时间的稍微增加。以 300mg/kg 观察到的变化非常微小且孤立 的， 因此不是由于在 1000mg/kg 观察到的 PR 和 PQ 间隔时间的变化导致的多晶型物 A 的药 理学的相关影响引起的， 而心率校正的 QT 间隔时间的增加明显与多晶型物 A 的影响相关， 这意味着心室复极时间的增加。以所有试验剂量， 在心电图 ( 导联 II) 中没有观察到干扰， 并且特别是在 T 波形中没有观察到变化。
第二部分 ： 在以 1000mg/kg 的剂量服用多晶型物 A 之前和之后的 3 小时观察到在 6- 导联心电图中没有干扰。在服用此剂量之后的 0.5 至 17 小时之间所有动物出现呕吐。 血浆分析证实在给药之后的 3 小时在血浆中多晶型物 A 的存在。
这些结果显示以 100， 300 和 1000mg/kg 的剂量通过口服多晶型物 A， 仅仅 1000mg/ kg 的剂量诱发了轻微的与心室复极时间增加相关的高血压。
C) 呼吸系统
- 有意识的小鼠中的呼吸系统评估
在单纯口服给药之后在有意识的小鼠身上进行多晶型物 A 对呼吸参数 ( 呼吸频 率， 吸气峰值和呼气流量峰值， 吸气和呼气时间， 气道阻力指数， 每分钟呼吸量和潮气量 ) 影响的评估。通过全身体积扫描方法测定呼吸作用。100mg/kg 的多晶型物 A 对呼吸参数没 有相关影响， 300 和 1000mg/kg 在潮气量中诱发了与瞬时减少相关的呼吸急促。 在吸气峰值 和呼气流量峰值， 每分钟呼吸量或气道阻力指数中没有观察到具有统计意义的变化， 这意 味着所述试验化合物不会产生任何抑制呼吸或支气管收缩的影响。
D) 免疫系统
- 小鼠的 PCF 试验
小鼠口服 150， 250 和 500mg/kg 的剂量 28 天之后， 通过使用小鼠的溶血斑形成细 胞 (PCF) 的方法系统评估多晶型物 A 对免疫系统的潜在影响。此方法基于使用抗原剂 ( 羊 的血红细胞 ) 的免疫系统的刺激并评估试验物质对免疫应答的影响。通过在补体的存在 下针对抗原剂 ( 溶血斑形成细胞 ) 产生的抗体测定脾细胞的比例评估免疫应答。研究中 获得的结果显示多晶型物 A 具有轻微的且不依赖剂量的免疫抑制活性 ； 较低剂量 (150 和 250mg/kg) 的试验是对照的边缘效应， 其仅仅在最高剂量 (500mg/kg) 变得清楚。 事实上， 统 计分析显示 150mg/kg 显著， 而不是 250mg/kg ； 这些发现说明在这些剂量下所观察到的影响 是由于这一试验中正常存在的可变性， 因为免疫应答中经常看到异质性并可能与免疫敏感 性中的个体差异相关。
所有上述的对于安全药理学的研究都是根据 GLP 规定和安全药理学的 ICH S7A 指南进行的。
2. 毒性和遗传毒性
在啮齿动物和非啮齿动物中进行单一和重复剂量的毒性研究， 以支持试验化合 物， 即多晶型物 A 的临床试验。 在老鼠和小鼠中通过注射和口服形式进行单一毒性研究。 在 小鼠和狗身上进行重复口服研究 ( 服用 28 天， 随后 14 天恢复期 )。
进行艾姆斯氏试验和微核试验以测定化合物潜在的遗传毒性。
下述的表 8 总结了使用多晶型物 A 进行的研究。
表8： 多晶型物 A 的毒性和遗传毒性研究
研究类型种类途径剂量范围 (mg/kg)方案结果急性毒性老鼠 ip os 200-1000 2000-4000 200-1000 2000-4000 50-1550/1200 125-1125/900 3-500μg/ml 500-2000单一LD50-800 LD50 ＞ 4000急性毒性小鼠Ip os os os 体外 os单一LD50-800 LD50 ＞ 4000亚慢性毒性 亚慢性毒性 遗传毒性 艾姆斯氏试验 微核试验
小鼠 狗 S.typhimurium 小鼠 ( 骨髓细胞 )4 周 + 恢复期 4 周 + 恢复期 / 单一NOEL*100 NOEL*125 阴性 阴性*NOEL ： 未观察到影响水平
在小鼠身上使用艾姆斯氏试验和微核试验进行遗传毒性评估
- 鼠伤寒沙门氏菌回复突变检测 ( 艾姆斯氏试验 )
根据 EC 指南在鼠伤寒沙门氏菌回复突变检测中体外评估多晶型物 A 的突变潜力。 被试验的化合物没有通过碱基对变化或具有和不具有代谢活化作用的 50-3000μg/ml 浓 度的试验的鼠伤寒沙门氏菌 (TA 1535， TA 1537， TA 98， TA 100 和 TA102) 的菌株基因的移 码诱发基因突变。因此， 多晶型物 A 被认为在鼠伤寒沙门氏菌回复突变检测中没有突变。
- 微核试验
通过在治疗过的小鼠的骨髓中检测微核多染红细胞测定了多晶型物 A 的任何的 断裂或纺锤体毒素活性。根据 EC 指南进行研究。此方法包括在骨髓的多色红细胞中查找 染色体片段的存在， 或染色体的数量， 它们是由于敲除或有丝分裂纺锤体毒素作用产生的。 断裂产物在有丝分裂期间可以产生染色体断裂， 而纺锤体毒素干扰了有丝分裂纺锤体的结 而出现在细 构。已经不能正常移动的染色体的无着丝粒片段不能保持在子细胞的核中间， 胞质中。 它被称为豪威尔 - 爵里氏小体或微核。 此微核可以在多色红细胞中被检测出， 因为这些细胞在持续的有丝分裂之后很快将它们的细胞核排出， 且此微核留在血红细胞中。让 雄性和磁性 Sprague Dawley 小鼠以每次 2000-1000-500mg/kg 的剂量口服多晶型物 A， 并在 治疗 24 和 48 小时之后， 抽取它们的大腿骨并提取骨髓细胞。
所有试验剂量和时间， 试验多晶型物 A 没有诱发断裂行为。