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发明概述

本发明的一个方面是流体转移控制方法，该方法包括

a)提供含控制染料的待转移溶液，

b)将预定体积的包含一定浓度所述控制染料的所述溶液转移至复数个容器中，

c)测量各个容器内控制染料的强度，

d)将步骤c)中对各个容器测量的强度与预定阈值进行比较，如果步骤c)中测量的强度低于所述预定阈值，则对某一容器检测到流体转移误差，

e)对步骤c)中测量的强度高于所述预定阈值的所有容器编译平均强度数值，

f)对步骤c)中测量的强度高于所述预定阈值的所有容器进行检验，如果所述强度落在步骤e)中编译的所述平均强度数值周围的预定范围之内，其中如果步骤c)中测量的强度未落在所述范围之内，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

g)对步骤c)中测量的强度落在步骤f)中的所述预定范围之内的所有容器宣布为正确的流体转移。

本发明通篇的“溶液”被用作需要被转移至容器用于在所述容器中的随后反应的所有种类液体组分的总称，其中所述反应可能需要向所述容器中加入额外的组分。当然，依照本发明的方法可应用于需要在所述反应之前进行的每一个转移步骤。如果超过一种溶液被转移至一个反应容器，每一种所述溶液可与不同的、有区别的染料混合。备选地，每一种溶液可含有相同的染料，且每一步骤之后强度的变化可用于转移控制。

本发明通篇的控制染料被用作转移控制。控制染料的存在可使用适宜机械测量，所述适宜机械取决于所使用的染料，例如用于光学染料的PMTs或CCD芯片或在放射性染料情况中的闪烁计数器。

所测量的强度通过软件模块进行处理，所述软件模块将经计算的数值与某些阈值(例如，最小荧光，与平均数值的偏差的范围)进行比较。该软件模块生成输出信号(a)提示使用者某一容器未通过转移控制检查(“软关闭”)或(b)抑制未通过转移控制的容器的结果计算(“硬关闭”)。此外，该软件模块可用于避免具有检测到的转移误差的容器的进一步处理。

本发明的优点是，对自动化方式中某一应用要求的所有组分的转移体积正确性进行独立检查。特别是，当自动的液体处理系统(吸液(pipetting)机器人)用于反应装置时，没有经由眼睛的手动控制适用于该处理。此外，在低体积应用(总反应体积＜3μl)中控制转移过程具有特殊的关联性，因为(亚)微升体积的液体处理在准确度和重现性方面是非常苛刻的。

本发明的另一方面是在实时PCR扩增工作流程中的流体转移控制方法，该方法包括

i)提供含控制染料的待转移溶液，

ii)将预定体积的包含一定浓度所述控制染料的所述溶液转移至复数个容器中，

iii)测量各个容器内控制染料的强度，

iv)将步骤iii)中对各个容器测量的强度与预定阈值进行比较，其中如果步骤iii)中测量的强度低于所述预定阈值，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

v)在所述复数个容器中进行实时PCR扩增，其中对在那些具有步骤iv)中检测到的流体转移误差的容器中所进行的实时PCR扩增结果相应地进行标记。

备选地，依照本发明的实时PCR扩增工作流程中的流体转移控制方法也可包含下述步骤代替步骤v)而进行

v’)在那些不具有步骤iv)中中检测到的流体转移误差的容器中进行实时PCR扩增。

因为实时PCR扩增要求几种组分，每一种组分可能含有相同的或不同的染料作为转移控制。在实时PCR反应开始之前，使用实时PCR仪器测量每一种染料的强度。例如，一种染料包含于qPCR主混合物中，第二控制染料包含于样品材料中，第三控制染料包含于引物/探针混合物中。

发明详述

本发明的一个方面是流体转移控制方法，该方法包括

a)提供含控制染料的待转移溶液，

b)将预定体积的包含一定浓度所述控制染料的所述溶液转移至复数个容器中，

c)测量各个容器内控制染料的强度，

d)将步骤c)中对各个容器测量的强度与预定阈值进行比较，其中如果步骤c)中测量的强度低于所述预定阈值，则对某一容器检测到流体转移误差，

e)对步骤c)中测量的强度高于所述预定阈值的所有容器编译平均强度数值，

f)对步骤c)中测量的强度高于所述预定阈值的所有容器进行检验，如果所述强度落在步骤e)中编译的所述平均强度数值周围的预定范围之内，其中如果步骤c)中测量的强度未落在所述范围之内，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

g)对步骤c)中测量的强度落在步骤f)中的所述预定范围之内的所有容器宣布为正确的流体转移。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，所述复数个容器是作为多孔板排列的，所述多孔板具有至少8孔，优选至少96孔，更优选至少384孔，最优选至少1536孔。

备选地，本领域的技术人员将理解，分开的容器排列于支持架上同样适用于本发明。当然，本发明通篇有可能多孔板的一些孔是空的，并且不是复数个容器中的各个容器均接收流体转移。

在依照本发明的再一优选的流体转移控制方法中，步骤d)中所述阈值是基于使用参照溶液所测量的强度数值而预定的，所述参照溶液具有步骤b)中的体积和控制染料浓度。

使用阈值作为第一转移控制是为了检测没有任何溶液和随后没有任何强度的容器，以及只获得较小部分预定体积的容器。为了计算合适的阈值，鉴于所测量的强度可用作阈值，优选采用具有预定流体转移过程的体积和染料浓度的溶液进行参照测量。

备选地，空容器的背景强度可用于定义预定阈值，例如阈值可被定义为背景强度的三倍。

因为较小的转移变动是可接受的，因此更优选允许所测量强度的某一偏差，例如约10％的偏差。在该实例中，10％的转移误差仍然是可接受的。取决于所测量的强度，容器将被标记为“转移控制通过”或“转移控制失败”。

除该第一转移控制之外，进行第二转移控制以评价容器之间的偏差，因为所述偏差提出了所述容器的有意义比较的问题。所述第二吸液控制是基于通过第一吸液控制的所有容器平均强度数值周围的预定范围的。取决于所测量的强度，容器将被标记为“范围控制通过”或“范围控制失败”。

该第二吸液控制在方法的每次使用之间待转移溶液存在高变动的情况中具有特别的重要性。待转移溶液的这种变动可能源于方法的随后应用之间的体积偏置或源于控制染料浓度的移动。在这样的情况中，不可能对平均值设定有意义的阈值以应用于方法的每次使用。

因此，本发明提供了只基于实际转移运行而不需要另一预定阈值的自动化吸液控制的可能性，因为平均强度数值是对每一次运行测定的，以鉴定可比较的容器。

与第一转移控制组合可保证没有转移体积远离预定量的容器被用于测定平均强度数值，因为这些容器将严重地扭曲第二控制的数值。

主要有两种不同的适宜实施方式用于使用平均强度数值周围的这种范围。

依照本发明的一种优选的流体转移控制方法是这样一种方法，其中步骤f)中所述预定范围在步骤e)中编译的所述平均强度数值周围是对称的。

依照本发明的另一优选的流体转移控制方法是这样一种方法，其中步骤f)中所述预定范围在步骤e)中编译的所述平均强度数值周围是不对称的。

这两种实施方式反映了可接受变动的不同情况。在朝向较低和较高转移体积的旋进(precession)具有相等重要性的情况中，鉴于所述范围的宽度是基于可接受的转移变动预定的，应该使用对称的范围。在变动例如朝向较高体积的变动不具关键性的情况中，优选使用对较小体积具有小的亚范围且对较高体积具有较大亚范围的不对称范围。

如果需将超过一种溶液转移至各个容器，同样对其他溶液而言，可在本发明的范围之内使用控制。对一个实施方式而言，其他溶液也将与控制染料混合。本发明通篇有可能对每一种溶液使用相同的控制染料，如果这些溶液是一个接着一个地加入到容器中的，且如果在加入每一种溶液后测量强度。因此，该实施方式中的转移控制是基于加入某一溶液后控制染料的强度增加的。备选地，每一种溶液可与不同的控制染料混合，如此，所述染料在光谱上是可区别的。当然，在该实施方式中，溶液可一次全部或一个接着一个地加入到容器中，因为所有染料的强度可被独立地测量。

如果需将两种溶液需要加入到容器中，依照本发明的优选方法对第一溶液使用控制染料，对第二溶液使用猝灭剂分子。这种装置具有这样的优点，即两种转移控制可只采用一种染料来建立，如此，与要求两种染料的装置相比，这种测量强度的机械较简单。

依照本发明的一种优选的流体转移控制方法是这样一种方法，其中将预定体积的包含一定浓度猝灭剂分子的第二溶液加入到容器中，且其中所述猝灭剂分子猝灭步骤a)中使用的所述控制染料的强度，所述方法包括额外的步骤

h)测量各个容器内控制染料经猝灭强度(quenched intensity)，

i)基于步骤h)中对各个容器测量的经猝灭强度，计算猝灭参数值，其中如果所述猝灭参数值未达到预定猝灭阈值标准，则对某一容器检测到流体转移误差，

j)对步骤i)中计算的猝灭参数值达到所述预定猝灭阈值标准的所有容器编译平均猝灭参数值，

k)对步骤i)中计算的猝灭参数值达到所述预定猝灭阈值标准的所有容器进行检验，如果所述猝灭参数值落在步骤j)中编译的所述平均猝灭参数值周围的预定第二范围之内，然而如果步骤i)中测量的所述猝灭参数值未落在所述预定第二范围之内，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

l)对步骤i)中测量的猝灭参数值落在步骤k)中所述预定第二范围之内的所有容器宣布为正确的第二流体转移。

在该实施方式中，第二流体转移控制是再一次基于两个控制步骤的，即如上所述的“转移控制”和“范围控制”。因为步骤h)-l)是在步骤a)-g)之后的，因此有两种不同的实施方式可能落在本发明的范围之内。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，步骤h)-l)只对在步骤d)中未检测到流体转移误差的容器进行。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，步骤h)-l)只对在步骤g)中宣布为具有正确流体转移的容器进行。

取决于依照本发明的方法的应用，只有在第一流体转移通过了一种或两种转移控制的时候，它可优选进行第二流体转移。另一方面，如果甚至对失败的容器运行整个工作流程也比只对某一量的容器停止工作流程更合理，则这些容器至少应被标记为具有个别误差。

对第二流体转移的第一转移控制而言，计算猝灭参数值以便与预定猝灭阈值标准进行比较。猝灭参数是基于步骤h)中测量的经猝灭强度的，且所述猝灭参数主要有两种主要的实施方式，即所述参数是所测量的经猝灭强度本身，或所述参数是使用控制染料强度和经猝灭强度编译的比值。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，各个容器的所述猝灭参数值是步骤h)中测量的控制染料的经猝灭强度。

在依照本发明的一种更优选的流体转移控制方法中，某一容器的流体转移误差是在步骤i)中检测的，如果步骤h)中测量的控制染料的经猝灭强度高于预定经猝灭的阈值。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，步骤i)中所述经计算的猝灭参数是步骤c)中测量的强度与步骤h)中测量的控制染料经猝灭强度的比值。

在依照本发明的另一更优选的流体转移控制方法中，某一容器的流体转移误差是在步骤i)中测量的，如果所述比值低于或高于预定经猝灭的阈值比。

第二溶液的转移误差等于容器中的小量猝灭剂分子，当然，所测量的经猝灭强度将高于所预期的。因此，在吸液误差的情况中，步骤c)中测量的控制染料强度除以步骤h)中测量的控制染料经猝灭强度的比值将小于预定经猝灭的阈值比。另一方面，步骤h)中测量的控制染料经猝灭强度除以步骤c)中测量的控制染料强度的比值必须大于预定经猝灭的阈值比以便检测吸液误差。

如关于第一流体转移的阈值和范围所讨论的，同样预定的猝灭阈值标准是基于使用参照溶液的测量的，当然对该实施方式而言要求两种参照溶液。

再一次，同样所述预定的猝灭阈值标准可使用空容器的强度和不含猝灭剂分子的容器的强度而被经验地定义。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，所述预定的猝灭阈值标准是基于使用两种参照溶液的测量的，第一参照溶液具有步骤b)中的体积和控制染料浓度，且第二参照溶液具有将在所述第二溶液的流体转移中使用的体积和猝灭剂染料浓度。

同样关于所述第二范围，有两种不同的实施方式也用于其装置以及上面关于第一范围在此应用的讨论。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，步骤k)中所述预定的第二范围在步骤j)中所述平均猝灭参数值周围是对称的，且所述第二范围的宽度是基于可接受的转移变动而预定的。

在依照本发明的再一优选的流体转移控制方法中，步骤k)中所述预定的第二范围在步骤j)中所述平均猝灭参数值周围是不对称的，且所述第二范围的宽度是基于朝向较低或较高转移体积的不同可接受转移变动而预定的。

关于依照本发明的方法不同步骤的连续性，对加入第二溶液而言有两种不同的备选方式。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，将所述预定体积的包含猝灭剂分子的第二溶液在步骤g)之后且步骤h)之前加入到容器中。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，将所述预定体积的包含猝灭剂分子的第二溶液在步骤c)之前加入到容器中。

因此，对于第一备选方式即在第一流体转移的控制结束之后加入第二溶液而言，控制染料的强度测量是在猝灭剂分子存在之前进行的。

对于第二备选方式而言，将两种溶液在进行两种流体转移控制之前混合，因而控制染料和猝灭剂分子存在于容器中用于两次控制测量。依照本发明方法的装置是可能的，如果控制染料的猝灭可在所述容器内打开和关闭。

在依照本发明的一种更优选的流体转移控制方法中，步骤c)所述控制染料的强度和步骤h)中所述控制染料的经猝灭强度是在所述容器内基于在控制染料的经猝灭状态和非经猝灭状态之间切换而连续测量的。

如此，猝灭分子能够猝灭控制染料的强度，猝灭剂分子需要紧密靠近控制染料，因而猝灭剂分子必须具有结合于控制染料的亲和力。因此，为了避免猝灭剂分子与控制染料的结合，它必须可能克服容器中溶液内的所述亲和力。取决于猝灭剂分子和控制染料之间相互作用的类型，本领域的技术人员将知道避免所述相互作用的操作。

在依照本发明的另一更优选的流体转移控制方法中，所述溶液参数为溶液温度。

在依照本发明的再一更优选的流体转移控制方法中，所述溶液参数为溶液摩尔浓度或溶液pH。

除上述猝灭剂分子和控制染料的亲和力之外，重要的是控制染料的发射和猝灭剂分子的吸光度在光谱上是相互适应的。如果发射光谱和吸收光谱之间的重叠不是彻底地充足，则猝灭将变得不充分。

在依照本发明的又一优选的流体转移控制方法中，所述猝灭剂分子和所述控制染料在光谱上是适应的，如此，控制染料的强度可被所述猝灭剂分子有效地猝灭。

另一方面，可能使用其吸收光谱只能猝灭控制染料一部分发射光谱的猝灭剂分子，因而控制染料强度以及经猝灭强度的测量只在相应于猝灭剂分子的吸收光谱的频谱之内进行。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，所述控制染料为荧光染料。

不限制本发明的范围，本发明的方法特别适用于为了准备实时PCR扩增的流体转移过程。对于这种实时PCR而言，需混合几种组分，即待扩增的样品、包含聚合酶和核苷酸类的主混合物以及包含引物和探针的检测混合物。作为依照本发明的适宜流体转移方案的实例，将包含控制染料的主混合物与检测混合物混合，并将所述混合物转移至进行第一流体转移控制的容器中。然后，将包含猝灭剂分子的样品加入到进行第二流体转移控制的所述容器中。备选地，当然可能使用包含控制染料的样品和包含猝灭剂分子的主混合物。此外，也可能通过使用加入到检测混合物中的第二控制染料从而控制主混合物和检测混合物的混合。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，依照步骤a)-g)转移所述溶液用于随后的含有检测染料的实时PCR扩增。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，依照步骤a)-l)转移所述溶液用于随后的含有检测染料的实时PCR扩增。

如果将依照本发明的方法应用于实时PCR准备过程中的流体转移控制，则考虑到PCR扩增在线监测所要求的检测染料的发射光谱不受控制染料的影响是重要的。

在依照本发明的一种更优选的流体转移控制方法中，所述控制染料与所述检测染料在光谱上是分离的。

在依照本发明的另一更优选的流体转移控制方法中，所述控制染料和所述检测染料为荧光染料。

不限制本发明的范围，依照本发明方法的一个优选实施方式是基于寡核苷酸类作为控制染料以及猝灭剂分子的亲和标记物的。

在依照本发明的一种优选的流体转移控制方法中，所述控制染料连接于寡核苷酸。

在依照本发明的另一优选的流体转移控制方法中，所述猝灭剂分子连接于第二寡核苷酸。

如果连接于控制染料和猝灭剂分子的寡核苷酸类应该互相具有亲和力，则它们的序列必须是至少部分互补的。

在依照本发明的一种更优选的流体转移控制方法中，所述寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有互补的序列。

寡核苷酸类用作亲和标记物具有额外的优点，即控制染料的猝灭可分别通过增加或降低溶液温度高于或低于寡核苷酸和第二寡核苷酸的杂化解链温度而轻易地关闭和打开。

本发明的另一方面为实时PCR扩增工作流程中的流体转移控制方法，该方法包括

i)提供含控制染料的待转移溶液，

ii)将预定体积的包含一定浓度所述控制染料的所述溶液转移至复数个容器中，

iii)测量各个容器内控制染料的强度，

iv)将步骤iii)中对各个容器测量的强度与预定阈值进行比较，其中如果步骤iii)中测量的强度低于所述预定阈值，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

v)在所述复数个容器中进行实时PCR扩增，其中对在那些具有步骤iv)中检测到的流体转移误差的容器中所进行的实时PCR扩增结果相应地进行标记。

在依照本发明的实时PCR扩增工作流程中流体转移控制方法的另一实施方式中，步骤v)可被下述步骤代替

v’)在那些不具有步骤iv)中检测到的流体转移误差的容器中进行实时PCR扩增。

依照本发明的实时PCR扩增工作流程中的一种优选的流体转移控制方法是这样一种方法，其中将预定体积的包含一定浓度猝灭剂分子的第二溶液在步骤v)之前加入到容器中，且其中所述猝灭剂分子猝灭步骤

i)中使用的所述控制染料的强度，所述方法包括在步骤v)之前进行的额外的步骤

A)测量各个容器内控制染料的经猝灭强度，

B)基于步骤A)中对各个容器测量的经猝灭强度，计算猝灭参数值，其中如果所述猝灭参数值未达到预定猝灭阈值标准，则对某一容器检测到流体转移误差，

C)对步骤B)中计算的猝灭参数值达到所述预定猝灭阈值标准的所有容器编译平均猝灭参数值，

D)对步骤B)中计算的猝灭参数值达到所述预定猝灭阈值标准的所有容器进行检验，如果所述猝灭参数值落在步骤C)中编译的所述平均猝灭参数值周围的预定第二范围之内，其中如果步骤B)中测量的所述猝灭参数值未落在所述预定第二范围之内，则对某一容器检测到流体转移误差，以及

E)对步骤B)中测量的猝灭参数值落在步骤D)的所述预定第二范围之内的所有容器宣布为正确的第二流体转移。