6磷酸葡萄糖脱氢酶和S羰基还原酶偶联提高S苯基乙二醇转化效率的方法.pdf

6- 磷酸葡萄糖脱氢酶和 (S )- 羰基还原酶偶联提高 (S )- 苯 基乙二醇转化效率的方法
    技术领域 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶和 (S )- 羰基还原酶偶联提高 (S )- 苯基乙二醇转化效率的方 法， 利用基因共表达提高全细胞不对称转化 (S )- 苯基乙二醇的效率和批次稳定性的方法， 本发明涉及利用基因工程的手段， 构建了 (S )- 羰基还原酶 （SCR Ⅱ） 和 6- 磷酸葡萄糖脱氢 酶 （G6PDH） 共表达的重组毕赤酵母菌 （Pichia pastoris ） SCR Ⅱ G， 高效制备 (S )- 苯基乙二 醇， 属于生物催化不对称转化技术领域。
     背景技术
     光学纯的苯基乙二醇 （PED） 是液晶材料中不可缺少的手性添加剂， 也是制备具有 光学活性的医药、 农药和功能材料的重要中间体。生物法转化制备光学纯 (S )- 苯基乙二 醇， 通常以微生物全细胞或酶为催化剂， 采用不同的化学反应途径， 如 Bakers’ 酵母不对称 还原 2- 羟基苯乙酮法， 环氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法， 和萘双氧化酶 （NDO） 选择性氧化苯乙烯法等， 这些方法存在底物浓度低， 需要昂贵的辅酶， 产物光学纯度 低等缺点。氧化还原酶催化的不对称还原反应中， 辅酶不能循环使用是限制其工业化应用 的 “瓶颈” 因素。
     全细胞体系辅酶再生主要有两种策略 ： 一是在反应体系中添加醇或糖类辅助底 物， 构成底物耦联再生系统 ； 二是通过基因工程手段在细胞中构建酶耦联再生系统。如 Degussa 公司利用该辅酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不对称还原合成 L- 叔亮氨酸， 大大 提高了产物的转化率。 ω - 转氨酶、 醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的耦联体系用于高效转化 (R )- 苯乙醇。
     本实验室已经利用重组菌株催化不对称还原反应， 制备 (S )- 苯基乙二醇， 在此基 础上， 利用基因工程技术， 将酿酒酵母 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶 （G6PDH） 基因 ZWF1 与近平滑 假丝酵母 (S )- 羰基还原酶基因 scr Ⅱ整合至毕赤酵母基因组中， 构建了共表达偶联体系 Pichia pastoris /SCR Ⅱ G， 在 5% (w/v) 葡萄糖的参与下， Pichiapastoris /SCR Ⅱ G 不对 称还原 2- 羟基苯乙酮的催化效率大大提高， 反应十个批次后， 产物 (S )- 苯基乙二醇光学纯 度和产率分别高达 100% 和 85% 以上。 发明内容
     （1） 要解决的技术问题 本发明的目的是提供一种基因工程方法构建多酶偶联体系， 实现了多种酶功能的成功 整合。利用酶偶联后的重组菌株 Pichiapastoris /SCR Ⅱ G ( 菌种保藏号 ： CGMCC No.4198) 高效不对称转化制备 (S )- 苯基乙二醇的方法。本发明根据酿酒酵母 6- 磷酸葡萄糖脱氢 酶和近平滑假丝酵母 (S )- 羰基还原酶的功能， 利用基因工程技术， 构建双酶偶联毕赤氏酵 母体系， 以酶偶联重组菌为催化剂， 实现了从 2- 羟基苯乙酮到 (S )- 苯基乙二醇的高效转 化。在 5% (w/v) 葡萄糖的参与下， 当底物浓度为 6 mg/mL 时， 经过十批次的催化反应， 产物 (S )- 苯基乙二醇光学纯度高达 100％， 产率维持在 85% 以上。本发明为解除辅酶再生循 环的限制， 成功整合双酶功能， 提高手性醇制备效率提供了一条崭新的思路。
     （2） 技术方案 一株不对称制备 (S )- 苯基乙二醇的重组菌， 其分类命名为巴斯德毕赤酵母 （Pichia pastoris ） SCR Ⅱ G ， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编 号： CGMCC No.4198。
     利用重组菌 CGMCC No.4198 不对称转化制备 (S )- 苯基乙二醇的方法， 不对称转化 反应条件 ： 在 0.1 mol/L pH 5.5 的醋酸缓冲液中， 加质量 / 体积比 5% 葡萄糖， 底物 2- 羟基 苯乙酮的浓度为 6 mg/mL， 重组菌细胞浓度为 0.1 g/mL， 不加辅助底物， 反应温度为 35℃， 反 应时间为 24 h， 转速 150 r/min， 重组菌菌体重复利用十个批次。
     反应结束后， 将反应混合物离心除去菌体， 上清液加入 2 倍体积乙酸乙酯萃取， 有 机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱 (Agillent HP1100) 进 行分析， 条件为 Chiralcel OB-H 柱 (4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)， 流动相为正己烷 / 异丙醇 （9/1， V/V） ， 流速 0.5 mL/min， 检测波长为 215 nm。产物 的光学纯度通过对映过量值来衡量。
     产 物 (S )- 苯 基 乙 二 醇 对 映 过 量 值 的 计 算 ： 对 映 过 量 值 ( e.e.%)=[(C S-C R)/ (C R+C S)]*100% 产物 (S )- 苯基乙二醇产率的计算 ： 产率 （%） = CS/C 0*100% 式中 C R 为反应后 (R )- 对映体的浓度， C S 为反应后 (S )- 对映体的浓度， C 0 为反应前底 物 (R )- 苯基乙二醇的浓度。
     以全细胞为催化剂， 不对称生物转化反应后， 产物均为 (S )- 苯基乙二醇。
     重组菌的培养 ： BMGY（Buffered Glycerol-complex Medium） 培养基， 以质量 / 体积 % 计 ： 酵母膏 1%， 蛋白胨 2%， 甘油 1%， pH 6.0、 100 mmol/L 磷酸缓冲液 10%， YNB1.34%， 生物素 4×10-5%， 用去 离子水补足至 100% ； BMMY（Buffered Methanol-complex Medium） 培养基， 以质量 / 体积 % 计 ： 酵母膏 1%， -5 蛋白胨 2%， 甲醇 0.5%， pH 6.0、 100 mmol/L 磷酸缓冲液 10%， YNB1.34%， 4×10 % 生物素， 用 去离子水补足至 100% ； 培养条件 ： 将重组菌 CGMCC No.4198 按 1% 的接种量接种于装有 25 mL BMGY 培养基的 100 mL 摇瓶中， 在 28 ℃、 250 r/min 的条件下， 培养至菌浓 OD 600=2-6 ； 室温 3000 g 离心 5 min， 收集菌体， 用 100 mL BMMY 重悬菌体， 使 OD 600 为 1.0， 置于 500 mL 的摇瓶中， 在 28℃、 250 r/min 的条件下培养， 每 12 h， 按培养基质量 / 体积 % 计添加甲醇 0.5% 至培养基中， 培 养 96h， 10,000 rpm 离心 10 min， 沉淀用生理盐水洗涤两次， 收集得到重组菌全细胞。
     所 述 重 组 菌 CGMCC No.4198 的 构 建 方 法， 将 scr Ⅱ 基 因 插 入 pPIC3.5K 中 构 建 重 组 质 粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ， 电 击 转 化 毕 赤 氏 酵 母 GS115 感 受 态 细 胞， 获得重组菌 Pichia pastoris / pPIC3.5K-SCR Ⅱ ； 同时将基因 ZWF1 插入载体 pPICZα， 获得重组质粒 pPICZα-ZWF1， 用 Sac I 对 pPICZα-ZWF1 进行单酶切线性化， 电转化感受态重组毕赤酵母 Pichia pastoris / pPIC3.5K-SCR Ⅱ的感受态细胞， 涂布含有 100 μg/mL Zeocin（博来霉 素） 的 YPD 平板， 挑取阳性单克隆得到重组菌 Pichia pastoris /SCR Ⅱ G。质粒 pPIC3.5K和质粒 pPICZα 均购自 Invitrogen 公司。
     重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ的构建 ： 利用限制性内切酶 Bam H I 和 Not I 分别对载 体 pPIC3.5K 和基因片段 scr Ⅱ进行酶切， 纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连 接， 获得重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ。
     重组质粒 pPICZα-ZWF1 的构建， 利用限制性内切酶 Bst B I 和 Xho I 分别对载体 pPICZα 和基因片段 ZWF1 进行酶切， 纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接， 获 得重组质粒 pPICZα-ZWF1。
     基因片段scr Ⅱ的获取 ： 实验室已知scr Ⅱ基因全序列， 以近平滑假丝酵母的基因 组为模板， 设计含有 Bam H I 酶切位点的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和含有 Not I 酶切位点的 引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R， 通过 PCR， 获得 scr Ⅱ基因全长， 全长为 837 bp。
     SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCATAGC AGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (Bam H I) SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATCGAC (Not I) PCR 反应体系 ： 10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R 各 1 μL， 近平滑假丝酵母 DNA 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL ； PCR 反应条件 ： 95℃预变性 4 min ； 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循 环； 72℃延伸 10 min ； 获得 scr Ⅱ基因。
     基因片段 ZWF1 的获取 ： 通过 NCBI 检索得到 ZWF1 基因全长， 以酿酒酵母基因组 为模板， 利用含 Bst B I 酶切位点的引物 pPIC_G6PDH_F 和含 Xho I 酶切位点的引物 pPIC_ G6PDH_R， 通过 PCR， 获得 ZWF1 基因的全长为 1518 bp ； pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTTG AAAAAAATACCG (Bst B I) pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (Xho I) PCR 反应体系 ：10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μL， 酿酒酵母基因组 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL ； PCR 反应条件 ： 94℃ 预变性 5 min ； 94℃ 1 min， 55℃ l min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环， 72℃ 延伸 10 min ； 获得 ZWF1 基因。
     具体操作如下 ： 一、 近平滑假丝酵母 (C. parapsilosis )CCTCC M203011（中国专利 03132140.2， 已公 开） 和酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae ） 培养 近平滑假丝酵母的培养基组成以 g/L 计 ： 葡萄糖 40， 酵母膏 5， (NH4)2HPO4 13， KH2PO4 7， ZnSO4·7H2O 0.3， NaCl 0.1， pH 7.0 ； 将近平滑假丝酵母菌种 CCTCC M203011 接种于培养基 装液量为 20% 的 250 mL 摇瓶中于 30℃、 150 rpm 振荡培养 48h ； 酿酒酵母的培养基组成以 g/L 计 ： 胰蛋白胨 10， 酵母提取物 5， NaCl 10， 葡萄糖 10， pH 7.0 ； 将酿酒酵母菌种接种于培养基装液量为 20% 的 250 mL 摇瓶中于 30℃、 150 rpm 振荡培 养 48h ； 二、 近 平 滑 假 丝 酵 母 (C. parapsilosis )CCTCC NO ： M 203011 基 因 组 和 酿 酒 酵 母 （Saccharomyces cerevisiae ） 基因组的获取近平滑假丝酵母 CCTCC M203011 和酿酒酵母培养结束后， 分别将菌体于 6,000 g 离 心 20 min， 用生理盐水洗涤两次后收集细胞， 利用 VIOGENE 公司的基因组 DNA 提取试剂盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System 提取近平滑假丝酵母基因组和酿酒酵母的基因 组。
     三、 scr Ⅱ基因的获得 以近平滑假丝酵母 （C. parapsilosis )CCTCC M203011 基因组作为 PCR 反应模板， 利 用含有 Bam H I 酶切位点的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和含有 Not I 酶切位点的引物 SCR Ⅱ _ pPIC3.5K_R， 通过 PCR 扩增获得 scr Ⅱ基因， 全长为 837 bp。
     SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCAT AGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (Bam H I) SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCAT CGAC (Not I) PCR 反应体系 ： 10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引 物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R 各 1 μL， 近平滑假丝酵母 DNA 5 μL， 5 U/ μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL。PCR 反应条 件： 95℃预变性 4 min ； 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环 ； 72℃延伸 10 min， 获得 scr Ⅱ基因 ； 利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩 生物科技有限公司） 纯化 scr Ⅱ基因。
     四、 ZWF1 基因的获得 以酿酒酵母基因组为模板， 利用含Bst B I 酶切位点的引物 pPIC_G6PDH_F 和含Xho I 酶 切位点的引物 pPIC_G6PDH_R， 通过 PCR 获得 ZWF1 基因， 全长为 1518 bp。
     pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG (Bst B I) pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (Xho I) PCR 反应体系 ：10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μL， 酿酒酵母基因组 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL ； PCR 反应条件 ： 94℃ 预变性 5 min ； 94℃ 1 min， 55℃ l min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环， 72℃延伸 10 min ； 获得 ZWF1 基 因。利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公 司） 纯化 ZWF1 基因。
     五、 重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ的构建 用 Bam H I 和 Not I 分别对载体 pPIC3.5K 和基因片段 scr Ⅱ进行酶切， 纯化后的基因 片段 scr Ⅱ与载体 pPIC3.5K 通过粘性末端连接， 获得带有目标基因片段 scr Ⅱ的重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ。
     六、 重组质粒 pPICZα-ZWF1 的构建 利用限制性内切酶 Xho I 和 Bst B I 分别对载体 pPICZα 和基因片段 ZWF1 进行酶切， 纯 化后的基因片段 ZWF1 与载体 pPICZα 通过粘性末端连接， 获得带有目标基因片段 ZWF1 的 重组质粒 pPICZα-ZWF1。
     七、 重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ转化毕赤氏酵母 取 20 μL 重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ， 用限制性内切酶 Sac I 单酶切线性化后， 电击转化感受态毕赤酵母 GS115， 30℃静置 1 h， 涂布于 MD 平板上， 挑取克隆经 PCR 验证， 获得重组 菌 Pichiapastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ。
     PCR 验证反应体系 ： 10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/ μL 的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R 各 1 μL， 毕赤氏酵母 DNA 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL。PCR 验证 反应条件 ： 95℃预变性 4 min ； 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环 ； 72℃ 延伸 10 min。
     八、 重组质粒 pPICZα-ZWF1 转化重组菌 Pichiapastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ 将 Pichia pastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ涂布 MD 平板， 两天后挑取单克隆， 制备感受态， 采用Sac I 单酶切后的质粒 pPICZα-ZWF1， 电转化Pichiapastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ感受态 细胞， 通过 100 μg/mL Zeocin 的 YPD 平板筛选， 获得重组菌 Pichia pastoris /SCR Ⅱ G， 即 CGMCC No.4198。
     九、 重组菌 CGMCC No.4198 的培养 BMGY （Buffered Glycerol-complex Medium） 培养基 ： 1% 酵母膏， 2% 蛋白胨， 1% 甘油， 10% 100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0， 1.34% YNB， 4×10-5% 生物素 ; BMMY（Buffered Methanol-complex Medium） ： 1% 酵母膏， 2% 蛋白胨， 0.5% 甲醇， 10% 100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0， 1.34% YNB， 4×10-5% 生物素， 以去离子水补足至 100%。 培养条件 ： 将重组菌 CGMCC No.4198 按 1% 接种量接种于装有 25 mL BMGY 培养基 的 100 mL 摇瓶中， 在 28℃、 250 r/min 的条件下， 培养至菌浓 OD 600 为 2-6 ； 以 3,000 g 离心 5 min， 收集菌体， 用 100 mL BMMY 重悬菌体， 使菌体 OD 600 达 1.0 左右， 转至 500 mL 的摇瓶 中， 在 28℃、 250 r/min 的条件下进行培养 ； 每隔 12 h， 添加 0.5% 甲醇于培养基中， 菌体连 续培养 96h 后， 于 10,000 rpm 离心 10 min， 收集菌体， 并用生理盐水洗涤两次， 重新收集菌 体细胞。
     （3） 有益效果 通过将 (S )- 羰基还原酶 SCR Ⅱ ( 编码基因的 GenBank 登记号 FJ939563) 和 6- 磷酸 葡萄糖脱氢酶 G6PDH ( 编码基因的 GenBank 登记号 BK006947.2) 进行偶联， 共表达于毕赤 酵母细胞中。利用成功构建的重组菌 CGMCC No.4198（P . pastoris /SCR Ⅱ G） 不对称催化 2- 羟基苯乙酮， 转化 (S )- 苯基乙二醇。通过反应条件优化， 在 pH5.5 的 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液中， 利用 0.1 g/mL 重组菌 CGMCC No.4198 催化 6 mg/mL 底物 2- 羟基苯乙酮， 35℃下 反应 24h， 连续反应十个批次， 最终产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 86.2%。这些工作为从 2- 羟基苯乙酮到 (S )- 苯基乙二醇的转化提供了有效途径， 为辅酶再 生循环途径耦合入 (S )- 苯基乙二醇的生物转化途径提供了新的研究思路， 而且通过菌体 多批次循环使用， 大大降低了 (S )- 苯基乙二醇制备成本， 为手性醇工业化生产奠定了坚实 的基础。
     生物材料样品保藏 巴斯德毕赤氏酵母 （Pichia pastoris ） SCR Ⅱ G， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 简称 CGMCC， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国 科学院微生物研究所， 保藏编号 ： CGMCC No.4198。保藏日期 ： 2010 年 9 月 26 日。
     具体实施方式
     实施例 1 近平滑假丝酵母和酿酒酵母的培养。
     近平滑假丝酵母培养基组成 ： 葡萄糖 4%， 酵母膏 0.5%， (NH4)2HPO4 1.3%， KH2PO4 0.7%， ZnSO4·7H2O 0.03%， NaCl 0.01%， pH7.0。将菌种 CCTCC NO ： M 203011 接种于 50 mL 培养基的 250mL 摇瓶中， 30℃、 150 rpm 振荡培养 48 h。
     酿酒酵母培养基组成 ： 胰蛋白胨 1%， 酵母提取物 0.5%， NaCl 1%， 葡萄糖 1%， pH 7.0 ； 将酿酒酵母菌种接种于培养基装液量为 20% 的 250 mL 摇瓶中于 30℃、 150 rpm 振荡培 养 48h。
     实施例 2 近平滑假丝酵母和酿酒酵母的基因组的获得 ： 近平滑假丝酵母和酿酒酵母培养结束 后， 分别将菌体于 6,000 g 离心 20 min， 用生理盐水洗涤两次后收集细胞， 利用 VIOGENE 公 司的基因组 DNA 提取试剂盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System 提取近平滑假丝 酵母基因组及酿酒酵母的基因组。
     实施例 3 scr Ⅱ基因的获得。以近平滑假丝酵母基因组为模板， 利用含有 Bam H I 酶切位点的引 物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和含有 Not I 酶切位点的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R， 通过 PCR， 获得 SCR Ⅱ基因全长。
     SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCA TAGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (Bam H I) SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATC GAC (Not I) PCR 反应体系 ： 10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引 物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R 各 1 μL， 近平滑假丝酵母 DNA 5 μL， 5 U/ μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL。PCR 反应条 件： 95℃预变性 4 min ； 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环 ； 72℃延伸 10 min。获得 scr Ⅱ基因片段。
     实施例 4 ZWF1 基因的获得。 以酿酒酵母的基因组为模板， 利用含利用含 Bst B I 酶切位点的引物 pPIC_G6PDH_F 和含 Xho I 酶切位点的引物 pPIC_G6PDH_R， PCR 获得 ZWF1 基因。
     pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG (Bst B I) pPIC_G6PDH_R:CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (Xho I) PCR 反应体系 ：10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引 物 pPIC_G6PDH_F 和 pPIC_G6PDH_R 各 1 μL， 酿酒酵母基因组 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL ； PCR 反应条件 ： 94℃ 预变性 5 min ； 94℃ 1 min， 55℃ l min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环， 72℃ 延伸 10 min ； 获得 ZWF1 基因。
     实施例 5 重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ的获得。利用限制性内切酶 Bam H I 和 Not I 分别对载体pPIC3.5K 和基因片段 SCR Ⅱ进行酶切， 纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接， 获得重组质粒 pPIC3.5K-SCR Ⅱ。采用 Sac I 对其进行单酶切线性化， 电转化感受态毕赤 酵母 GS115, 30℃静置 1 h， 涂布于 MD 平板上， 挑取单克隆， 经 PCR 验证后获得重组菌 P . pastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ。
     基因 scr Ⅱ及质粒 pPIC3.5K 的酶切 利用质粒提取试剂盒 Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit （北京博大泰克生物基因技 术有限公司） 提取质粒 pPIC3.5K。
     分别按照水、 缓冲液、 基因 scr Ⅱ和酶的顺序， 及水、 缓冲液、 质粒 pPIC3.5K 和酶的 顺序分别加到不同的 Eppendorf 管中， 盖好管盖， 振荡使液体充分混匀， 置于离心机离心 2 s 使液体集中于管底， 37℃水浴 3 h， 在管中加入 1/10 的 Loading Buffer 或将管置于 65℃ 保温 10 min， 终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 回收和浓缩目的片段。
     反应体系组成 ： 10×Buffer H 4 μL， 基因 scr Ⅱ或质粒 pPIC3.5K 10 μL， Bam HI 2 μL， Not I 2 μL， ddH2O 将体系补足 40 μL。
     基因 scr Ⅱ及质粒 pPIC3.5K 的连接 连接反应体系组成 ： 质粒 pPIC3.5K 0.8 μL， 基因scr Ⅱ 4.2 μL， Ligation Solution 5 μL。混合连接液， 将其置于 16℃培养箱中连接 12-16 h。 实施例 6 重组质粒 pPICZα-ZWF1 的获得。利用限制性内切酶 Xho I 和 Bst B I 分别对载体 pPICZα 和 ZWF1 基因进行酶切， 纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接， 获得重 组质粒 pPICZα-ZWF1。
     基因 ZWF1 及质粒 pPICZα 的酶切 利用质粒提取试剂盒 Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit （北京博大泰克生物基因技 术有限公司） 提取质粒 pPICZα。
     分别按照水、 缓冲液、 基因 ZWF1 和酶的顺序， 及水、 缓冲液、 质粒 pPICZα 和酶的顺 序加到 Eppendorf 管中， 盖好管盖， 振荡使液体充分混匀， 置于离心机离心 2 s 使液体集中 于管底， 37℃水浴 3 h， 在管中加入的 Loading Buffer 或将管置于 65℃保温 10 min， 终止酶 切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 回收和浓缩目的片段。
     反应体系组成 ： 10×Buffer H 4 μL， 基因 ZWF1 或质粒 pPICZα 10 μL， Xho I 2 μL， Bst B I 2 μL， ddH2O 将体系补足 40 μL。
     基因 ZWF1 与质粒 pPICZα 的连接 连接反应体系组成 ： 质粒 pPICZα 0.8 μL， 基因 ZWF1 4.2 μL， Ligation Solution 5 μL。混合连接液， 将其置于 16℃培养箱中连接 12-16 h。
     实施例 7 重组菌 P . pastoris / pPIC3.5K- SCR Ⅱ的获得。
     毕赤酵母感受态细胞的制备 ： 将毕赤酵母单克隆接种于 5 mL YPD 液体培养基， 30℃， 200 r/min， 培养过夜 ； 取 50 ??L 过夜培养物至 100 mL YPD 液体培养基中， 30℃， 200 r/min， 培养至 OD 600 为 2-6 ； 于 4℃， 5000 r/min 离心 5 min 收集菌液， 用 100 mL 冰预冷的 无菌水洗涤两次， 收集菌体 ； 分别用 10 mL 和 1 mL 冰预冷的 1 mol/L 的山梨醇溶液洗涤菌 体， 并收集菌体， 每 80 ??L 分装保存。
     重组质粒电击转化毕赤氏酵母感受态细胞 ： （1） 质粒线性化 ： 提取 pPIC3.5k- SCR Ⅱ质粒， 酶切体系为 10×buffer 5 μL， 质粒 （约 20 ??g） 43 μL， Sac I 2 μL， 37℃ 4 h， 1% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物， 检测酶切是否完全， 胶回收酶切产物 ； （2） 取 10 ??L（约 5 ??g ～ 10 ??g） 的线性化质粒与 80 μL 的感受态 GS115 菌体混 匀， 转至 0.2 cm 冰预冷的电击杯中 ； （3） 冰上放置 5 min， 电压 1500 V， 电容 25 ??F， 电阻 200 Ω， 电击时间为 5 ms， 进行电 击； （4） 电击完毕后， 立即加入 1 mL 冰预冷的 1 mol/L 的山梨醇溶液， 混匀 ； （5） 30℃静置 1 h， 涂布于 MD 平板上， 30℃培养 2 d。
     重组巴斯德毕赤酵母的鉴定 ： 以提取的近平滑假丝酵母基因组 DNA 为模板， 用引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _ pPIC3.5K_R 进行 PCR， PCR 反应体系 ： 10×Taq buffer 5 μL， 25 mmol/L 的 dNTP 4 μL， 50 pmol/μL 的引物 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_F 和 SCR Ⅱ _pPIC3.5K_R 各 1 μL， 毕赤氏酵母 DNA 5 μL， 5 U/μL 的 Taq DNA polymerase 0.5 μL， ddH2O 33.5 μL， 反应总体积 50 μL。 PCR 反应条件 ： 95℃预变性 4 min ； 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 1 min， 进行 30 个循环 ； 72℃ 延伸 10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物检测 PCR 结果。并保藏阳性克隆 P . pastoris / pPIC3.5K- SCR Ⅱ。
     实施例 8 重组菌 P . pastoris /SCR Ⅱ G 的获得。将 P . pastoris /pPIC3.5K-SCR Ⅱ涂布 MD 平 板， 两天后挑取单克隆， 制备感受态， 采用 Sal I 单酶切后的质粒 pPICZα-ZWF1， 电转化 P . pastoris / pPIC3.5K- SCR Ⅱ感受态毕赤酵母， 涂布含有 100 μg/ml Zeocin 的 YPD 平板， 挑取阳性单克隆得到重组菌 P . pastoris /SCR Ⅱ G。
     实施例 9 重组毕赤氏酵母的诱导表达。将重组菌 P . pastoris /SCR Ⅱ G 按 1% 的接种量接种于 装有 25 mL BMGY 培养基的 100 mL 摇瓶中， 在 28℃、 250 r/min 的条件下， 培养至菌浓 OD 600 为 2-6 ； 室温 3000 g 离心 5 min， 收集菌体， 用 100 mL BMMY 重悬菌体， 使 OD 600 为 1.0 左右， 置于 500 mL 的摇瓶中， 在 28℃、 250 r/min 的条件下培养 ； 每 12 h， 添加培养体系体积 0.5% 的甲醇至培养基中， 共培养 96h， 10,000 rpm 离心 10 min， 用生理盐水洗涤两次， 收集重组菌 细胞。
     实施例 10 用实施例 9 中收集的菌体细胞进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 mg/mL 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1 g/mL 重组毕赤酵 母 P. pastoris /SCR Ⅱ G 菌体， 混匀后于 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心取上 清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 97.2%。离心收集的菌体， 用生理盐水洗两次用于第二批次的转化。
     实施例 11 用实施例 10 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 mg/mL 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1g/mL 实施例10 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃 取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 93.4%。离心收集的菌体， 用生理 盐水洗两次再用于第三批次的转化 实施例 12 用实施例 11 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6mg/mL 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1g/mL 实施例 11 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 离心取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 91.7%。 离心收集的菌体， 用生理盐水洗两 次， 用于第四批次的转化。
     实施例 13 用实施例 12 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1g/mL 实施例 12 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 90.2%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第五批次的转化。 实施例 14 用实施例 13 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1 g/mL 实施例 13 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 89.2%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第六批次的转化。
     实施例 15 用实施例 14 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1 g/mL 实施例 14 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 88.9%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第七批次的转化。
     实施例 16 用实施例 15 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1 g/mL 实施例 15 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 88.0%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第八批次的转化。
     实施例 17 用实施例 16 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1 g/mL 实施例 16 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 87.6%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第九批次的转化。
     实施例 18 用实施例 17 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1g/mL 实施例 17 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心， 取上清液萃取， 产物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 87.2%。离心收集的菌体， 用生理盐 水洗两次用于第十批次的转化。
     实施例 19 用实施例 18 中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在 1 mL 0.1 mol/L 醋酸缓 冲液 （pH5.5） ， 分别加入 6 g/L 底物 2- 羟基苯乙酮， 5% (w/v) 葡萄糖和 0.1g/mL 实施例 18 中收集的菌体细胞， 混匀后在 35℃恒温摇床上振荡反应 24 h， 混合物离心取上清液萃取， 产 物 (S )- 苯基乙二醇的光学纯度为 100%e.e.， 产率为 86.2%。13