说明书释放介质
发明领域
本发明总体涉及释放介质，特别涉及适于保留和随后释放物质如生物材料(例如细胞、蛋白质、肽等)和药物的组合物。根据本发明的组合物特别适用于保留和随后释放物质如生物材料和药物，因此将便利地以这类应用为侧重来描述本发明。但是要理解所述组合物可用于保留和随后释放其它物质。
发明背景
迄今已有相当多的研究旨在开发可保留(在其之内和/或之上)和随后释放感兴趣物质的组合物。例如，药物释放组合物在医药工业中构成重要的作用。这类组合物包括其中药物与聚合物掺合以形成药物/聚合物复合物的那些。所述聚合物/药物复合物可然后用作为药物释放介质。例如，包含左炔诺孕酮的硅棒已被用作为缓释避孕植入物。
尽管从这类介质释放药物相当有效，但是会存在与药物释放后给定介质的命运相关的问题。例如，对于左炔诺孕酮植入物，在药物释放后“用过的”植入物必须通过手术从对象中取出。在取出过程中可能需要作数个切口和/或植入物可在撤出时碎裂。
已开发其它类型的介质用于细胞培养。细胞培养通常通过用有待培养的细胞接种合适的培养基来进行。某些细胞类型，如人胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(iPC)，通过提供细胞可在其上粘附和增殖的表面而更有效地培养。在粘附和增殖之后，培养细胞需要被收获并因而从表面上释放。细胞的释放通常通过诸如机械刮擦、声波处理、化学或酶促处理或其组合的技术来促进。
普通的细胞释放技术可呈现一些问题。例如，机械刮擦可破坏细胞，且其经常不适用于有限空间如小直径孔或三维结构。使用化学或生物活性剂来有助于培养细胞从给定基质释放也可破坏细胞和/或呈现将杂质引入培养细胞的风险。例如，已知常用的活性剂如胰蛋白酶可促进细胞功能的恶化。而且，某些细胞可特别粘附于给定基质而需要经受强迫条件来促进其释放，其作用不可避免地造成一定程度的细胞损伤。
用于细胞培养的常规释放介质还常缺乏多功能性，因为给定的介质如适于细胞培养的基质将常常不是用于其它应用如药物释放的适宜介质。
因此仍有机会开发更通用的释放介质，其可用于多种应用和/或解决至少一些与物质如细胞或药物从介质释放有关的问题。
发明概述
本发明提供包含聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的组合物；
所述聚合物颗粒(i)包含嵌段共聚物，和(ii)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物对至少一种共同刺激有响应。
根据本发明的组合物可有利地提供释放介质，在其之上和/或之中所述功能化刺激响应聚合物可以有效、高效率和非侵入性方式被保留和然后被释放。所述功能化刺激响应聚合物可以被诸如药物、蛋白质或细胞的部分功能化。
作为释放介质，所述组合物的组分将通常在液体中提供。换言之，所述组合物可包含所述聚合物颗粒、所述功能化刺激响应聚合物和液体。
所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物可有利地在经受特定刺激后经历转换以展现在液体中不同的溶解度。例 如，所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物可以是热响应性聚合物，其在高于给定温度的液体中不溶而在低于该温度的液体中可溶。
在低于所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物可溶的温度的液体中，所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物可作为单独分开的实体存在(即它们不以物理方式相互关联)。将液体加热到或超过所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物不溶的温度后，所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物将缔合并形成聚集物结构，所述功能化刺激响应聚合物保留在所述聚集物结构之上和/或之中。所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的这种聚集物结构代表所保留的功能化刺激响应聚合物可从其释放的释放介质。
为了促进功能化刺激响应聚合物从聚集物结构释放，聚集物结构位于其中的液体的温度只需降低至所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物再次在所述液体中变得可溶的温度。在该情况中，所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物的溶剂化提供所述聚集物结构解离和随后释放所述功能化刺激响应聚合物的驱动力。
根据本发明的组合物可有利地以多种方式用来充当释放介质，例如在细胞培养和药物递送应用中。
对于细胞培养，所述组合物可发挥作用来促进细胞聚集，且包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体。在该情况中，所述功能化刺激响应聚合物可以是蛋白质功能化的刺激响应聚合物，其中所述蛋白质能够与想要的细胞类型结合。
通过将液体温度维持低于特定温度，例如低于37℃，所述蛋白质功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒可在液体中作为单独离散的实体存在，而通过将液体温度升高至37℃或更高(即施加刺激)，所述蛋白质功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒将缔合形成聚集物结构。
由此，在一个实施方案中，可将液体温度降至低于37℃。然后可引入多个想要的细胞，使得所述细胞与所述蛋白质功能化的刺激响应聚合 物呈现的蛋白质结合以实际上形成细胞功能化的刺激响应聚合物。多于一个蛋白质功能化的刺激响应聚合物将通常与每个细胞结合。
然后可将液体温度升至37℃或更高，这将引起现在细胞功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒缔合并形成聚集物结构。在形成聚集物结构过程中，细胞功能化的刺激响应聚合物的细胞将固有地形成簇，而所述聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物的聚集物结构代表了所保留的细胞功能化的刺激响应聚合物可从其释放的释放介质。
在如此形成的细胞簇中的细胞可随后增殖以形成更大的细胞簇。以此方式的细胞增殖可提供可有利地维持细胞多能性和活力的条件。
在已发生充足增殖后将液体温度降至低于37℃将引起所述聚合物颗粒和细胞功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物在液体中变得可溶。该溶解过程将有助于聚集物结构解离，其继而将有助于释放细胞功能化刺激响应聚合物和随后细胞簇分解成较小的细胞簇和/或个体细胞。换言之，根据本发明的组合物有利地使得细胞能以细胞簇形式被培养，该细胞簇随后可以有效且非侵入性方式解散成个体细胞和/或较小细胞簇。
作为细胞培养的备选形式，所述组合物可包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体，其中所述聚合物颗粒固定到基质。所固定的聚合物颗粒可作为在基质表面上的一层呈现。所述基质可例如作为一层小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在该情况中，所述功能化刺激响应聚合物可以是蛋白质功能化的刺激响应聚合物，其中所述蛋白质能够与想要的细胞类型结合。
通过维持液体温度低于特定温度，例如低于37℃，所述蛋白质功能化的刺激响应聚合物和系连(tethered)的聚合物颗粒可作为单独离散的实体存在于液体中，而通过将液体温度升至37℃或更高，所述蛋白质功能化的刺激响应聚合物和系连的聚合物颗粒可缔合形成具有富含蛋白质表面的聚集物结构。
因此，在另一个实施方案中，可将液体温度升至37℃或更高。这将使得所述蛋白质功能化的刺激响应聚合物和系连的聚合物颗粒缔合 形成具有富含蛋白质表面的聚集物结构。
然后可将想要的细胞引入液体中，由此细胞与聚集物结构表面呈现的蛋白质结合。所述细胞可随后在聚集物结构富含蛋白质的表面增殖，所述聚集物结构实际上系连到基质(如MEF)，新形成的细胞也结合到聚集物结构表面呈现的蛋白质。以此方式的细胞增殖可提供可有利地维持细胞多能性和活力的条件。
在已发生充足增殖后将液体温度降至低于37℃将引起所述聚合物颗粒和现在细胞功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物在液体中变得可溶。该溶解过程将有助于聚集物结构解离，其继而将有助于从基质表面释放细胞功能化的刺激响应聚合物。换言之，培养的细胞可以有利地以有效且非侵入性方式从基质释放。
对于细胞培养，期望的是本发明的组合物不暴露于高于大约37℃的温度。在一个实施方案中，使液体经受共同刺激因而涉及将液体加热至大约37℃以促进所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的聚集。
以类似方式，所述功能化刺激响应聚合物可以是药物功能化的刺激响应聚合物，并且聚合物颗粒固定到适宜的基质。在该情况中，如此形成的药物功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒的聚集物结构可提供独特的药物释放系统。
相应地，在一个实施方案中，所述组合物用于细胞培养或药物递送且包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体。
在另一个实施方案中，所述组合物用于细胞培养或药物递送且包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体，其中所述聚合物颗粒固定到基质上。
根据本发明的组合物还可以凝胶形式呈现，所述功能化刺激响应聚合物保留在所述凝胶之中和/或之上。所述凝胶可响应刺激如温度改变而经历独特的转换以形成液体组合物(即液体状态的组合物)，其中所述功能化刺激响应聚合物不再被保留而是容易地从构成液体组合物的其它组分分离。根据该实施方案，所述组合物还包含液体，且所述聚合物颗粒以足以在至少聚合物颗粒的刺激响应聚合物经受所述至少一种 共同刺激后将液体转换为凝胶的浓度存在于液体之中。在这样的实施方案中，所述聚合物颗粒将通常自由移动和相互聚集(即它们不系连或固定到固定或非移动基质上)。
不希望受理论所限，根据本发明使用的聚合物颗粒据信展现出临界凝胶浓度(CGC)。CGC是在颗粒经受刺激如温度改变后聚合物颗粒可彼此缔合形成将组合物的液体状态转换为凝胶的聚集物结构的液体中颗粒浓度(以相对于液体和聚合物颗粒合并质量的wt％表示)。在本发明上下文中，应领会在经受共同刺激后所述功能化刺激响应聚合物也与聚合物颗粒聚集，且由此所述功能化刺激响应聚合物被保留在如此形成的凝胶之中和/或之上。聚合物颗粒的CGC将取决于其形态且特别是颗粒的纵横比而变化。
本发明因此还可提供包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体的组合物；
所述聚合物颗粒(i)包含嵌段共聚物，和(ii)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物对至少一种共同刺激有响应；和
其中所述聚合物颗粒以足以在至少聚合物颗粒的刺激响应聚合物经受所述至少一种共同刺激后将液体转换为凝胶的浓度存在于液体之中。
提供凝胶的根据本发明的组合物也可有利地以多种方式用于充当释放介质，例如在细胞培养和药物递送应用中。
对于药物释放介质，所述功能化刺激响应聚合物可用药物功能化，且首先以液体组合物形式提供所述组合物。针对刺激如温度改变作出响应，所述药物功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒可缔合形成聚集物结构，所述聚集物结构继而促进液体转换为凝胶。以凝胶形式，所述药物功能化的刺激响应聚合物实际上保留在凝胶界限之中和/或之上。通过使凝胶经受刺激如温度降低并使其转换回成液体组合物(诸如此类以 “释放”状态呈现药物)，可随后从凝胶释放所述药物。
对于细胞培养，所述功能化刺激响应聚合物可用细胞功能化(通常通过蛋白质功能化的刺激响应聚合物的蛋白质与细胞结合而形成)。在该情况中，多个蛋白质功能化的刺激响应聚合物可与给定细胞结合。所述组合物可以首先以包含液体、聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物的液体组合物形式提供，针对刺激如温度改变作出响应，所述细胞功能化的刺激响应聚合物和聚合物颗粒可缔合形成聚集物结构，所述聚集物结构继而促进液体组合物转换为凝胶。以凝胶形式，所述细胞功能化的刺激响应聚合物实际上保留在凝胶界限之中和/或之上。
通过保留在凝胶之中和/或之上，所述细胞功能化的刺激响应聚合物可充当“种子细胞”并可在凝胶基质之中和/或之上增殖。凝胶可包含额外的功能化刺激响应聚合物，其用一种或多种促进细胞粘附和生长的部分(例如蛋白质)功能化。增殖后，可如下释放和收获细胞：通过使凝胶经受刺激如温度降低，并使其转换回成液体组合物，其效应使细胞从组合物的其它组分释放，使其容易被收获。
不像常规的释放介质，根据本发明的组合物可有利地从凝胶转变为液体组合物，该过程促进相关物质如药物或细胞的释放。值得注意的是，凝胶转变为液体组合物导致在释放发生后没有残余的固体或半固体结构留下。对于药物释放，这意味着在药物释放之后无需取出任何“用过的”载体结构。对于细胞培养，这意味着可通过非侵入性的凝胶液化而从凝胶释放细胞。
所述组合物用途特别广泛，在于其可容易地改造而适用于不同的应用：仅仅通过对功能化刺激响应聚合物选择不同的功能实体和/或通过调整聚合物颗粒在液体中存在的浓度。
在一个实施方案中，聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物存在于液体中，其中与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述液体中可溶。在该情况中，与聚合物颗粒关联的非刺激响应聚合物将通常在所述液体中不可溶。例如，根据本发明的组合物可包含亲水性液体(例如含水液体)、聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物，其 中与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述亲水性液体中可溶。在该情况中，与聚合物颗粒关联的非刺激响应聚合物将通常在所述亲水性液体中不可溶。
在另一个实施方案中，所述组合物为凝胶形式，其中与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述液体中可溶。在该情况中，与聚合物颗粒关联的非刺激响应聚合物将通常也在所述液体中不可溶。例如，所述组合物可为凝胶形式，其包含亲水性液体(例如含水液体)，其中与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述亲水性液体中可溶。在该情况中，与聚合物颗粒关联的非刺激响应聚合物将通常在所述亲水性液体中不可溶。根据这一实施方案，所述聚合物颗粒以足以在至少聚合物颗粒的刺激响应聚合物经受所述至少一种共同刺激后将液体转换为凝胶的浓度存在于液体之中。
本发明还提供细胞培养系统，其包含根据本发明的组合物。在该情况中，所述功能化刺激响应聚合物可用细胞功能化。这样的细胞培养系统可有利地不仅有助于细胞培养而且还提供刺激驱动的无酶的细胞收获。
本发明还提供药物递送系统，其包含根据本发明的组合物。在该情况中，所述功能化刺激响应聚合物可用药物功能化。
本发明进一步提供形成包含功能化刺激响应聚合物的凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体的液体组合物；
所述聚合物颗粒(a)包含嵌段共聚物，和(b)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)对至少一种共同刺激有响应，和(b)可溶于所述液体；和
(ii)使所述液体组合物经受所述共同刺激以使所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中可溶转 变为在所述液体中不溶，其中所述转变促进凝胶的形成。
根据这一实施方案，所述聚合物颗粒将当然以足以在至少聚合物颗粒的刺激响应聚合物经受所述至少一种共同刺激后将液体转换为凝胶的浓度存在于液体之中。
本发明进一步提供从凝胶释放功能化刺激响应聚合物的方法，所述方法包括：
(i)提供包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体的凝胶；
所述聚合物颗粒(a)包含嵌段共聚物，和(b)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)对至少一种共同刺激有响应，和(b)不溶于所述液体；和
(ii)使所述凝胶经受所述共同刺激以使所述聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中不溶转变为在所述液体中可溶，其中所述转变使凝胶变成包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体的液体组合物，从而促进所述功能化刺激响应聚合物从凝胶释放。
根据本发明的方法，在一个实施方案中所述液体是亲水性液体，例如含水液体。
根据从凝胶释放功能化刺激响应聚合物的方法，在一个实施方案中所述功能化刺激响应聚合物用细胞功能化。在另一个实施方案中，所述功能化刺激响应聚合物用药物功能化。
本发明的其它方面和/或实施方案在下面更详细描述。
附图简要说明
本发明的实施方案在此后将参考附图仅仅通过举例方式进行例示，其中：
图1图示了根据本发明的组合物，其包含聚合物颗粒、功能化刺 激响应聚合物和液体。图1A显示具有杆样形状的聚合物颗粒，而图1B显示具有球形的聚合物颗粒；
图2例示了用于本发明的蜗杆(worms)(或杆)和球形式的聚合物颗粒的TEM显微照片；
图3例示了蛋白质功能化的PNIPAM/ROD表面以浓度依赖性方式支持hESC细胞附着。(A-F)MEL1细胞与蛋白质功能化的聚(NIPAM-b-STY)二嵌段共聚物表面结合。(A,C)hESC结合依赖于用VN或FN功能化的聚(NIPAM-b-STY)二嵌段共聚物表面，因为如虚线所示细胞不结合未包被表面。(E和F)用合成整联蛋白结合肽(RGD，至多200μg/孔)功能化的聚(NIPAM-b-STY)二嵌段共聚物表面不支持hESC细胞附着。(B,D,F)更高放大图像显示在FN和VN上而非RGD上明显的细胞铺展。所有图像中的比例尺代表400μm。G)对两种独立的hESC细胞系MEL1和MEL2，通过对附着细胞的手工细胞计数来定量结合的细胞数目，并且展现细胞在表面上的铺展。趋势线为对数尺度。数据为三次独立试验的平均值。
图4例示温度对hESC与用FN或VN功能化的聚(NIPAM-b-STY)二嵌段共聚物表面结合的影响作用。于37℃接种在Geltrex对照表面(A)、rVN-pNIPAM/PSTY(D)和rFN-pNIPAM/PSTY(G)玻璃片上的MEL1细胞的光学显微图像。培养物低于LCST于4℃温育，在30(B,E,H)和60分钟(C,F,I)取图像。对于每种条件，较高的放大倍数图像(插图)显示在降低温度温育后细胞变圆并脱附，除外在GeltrexTM对照(D,G)上。比例尺代表400μm；
图5例示hESC片层的脱附。以1x106/孔将MEL1细胞接种在器官培养皿中的rFN功能化的聚(NIPAM-b-STY)二嵌段共聚物表面上并温育24小时。将温度变成25℃，通过轻轻振荡使细胞片层从表面脱附。比例尺为1000μm。(A)放大的图像展示细胞片层周边脱附(深色斑片)。(B)在器官培养皿中细胞片层的较低放大显示于室温温育后脱附；
图6例示根据本发明细胞簇形成的图示；
图7例示与PNIPAM/ROD二嵌段共聚物/玻连蛋白-PNIPAM混合的拟胚体的解离。(A-B)在手工解离之前的对照和经处理的细胞簇。(C-D)在 手工滴定后拟胚体解离成小簇仅在与PNIPAM/ROD二嵌段共聚物/玻连蛋白-PNIPAM温育的条件下发生(D)；
图8例示与可被优化以有助于hESC拟胚体无酶传代的二组分pNIPAM系统有关的数据；和
图9例示与联合pNIPAM缀合物的人胚胎干细胞的多能性3D扩增有关的数据。
一些图含有彩色图示或实体。彩色版的附图可应要求提供。
发明详述
根据本发明的组合物包含聚合物颗粒。所述聚合物颗粒具有核壳结构，如本文所述。只要聚合物颗粒具有所需的核壳结构并可如本文所述使用，关于其形状或大小没有特定限制。
聚合物颗粒可具有球形、椭圆、环状、圆柱、杆状或蜗杆样形状。聚合物颗粒可包含不同形状聚合物颗粒的混合物。
在一个实施方案中，聚合物颗粒的所有维度都小于大约1微米。
在进一步的实施方案中，聚合物颗粒的至少一个维度小于大约100nm，或小于大约70nm，或小于大约50nm，或小于大约30nm，或小于大约20nm，或小于大约15nm，或小于大约10nm。
在另一个实施方案中，聚合物颗粒具有大于1的纵横比(平均长度：平均直径)，例如至少5，或至少10，或至少20，或至少30，或至少40，或至少60，或至少80，或至少100，或至少500。聚合物颗粒的纵横比可从大约5到大约1000或从大约25到大约500，或大约50到大约200。
聚合物颗粒的核壳结构包含嵌段共聚物。“嵌段共聚物”是指为具有在构成上不同的相邻嵌段的嵌段聚合物的共聚物。具有“核壳结构”是指聚合物颗粒具有被实质上不同的外部组合物(壳)围绕的内部组合物(核)。在本发明上下文中，“壳”由嵌段共聚物的刺激聚合物嵌段定义。该刺激聚合物嵌段可以是相对于聚合物颗粒位于其中的液体可溶 或不可溶的。“核”由嵌段共聚物的非刺激聚合物嵌段定义且将通常相对于聚合物颗粒位于其中的液体不可溶。
由此，形成聚合物颗粒的嵌段共聚物包含非刺激响应聚合物嵌段和刺激响应嵌段，其中非刺激响应聚合物嵌段形成聚合物颗粒的至少部分核结构，而刺激响应聚合物嵌段形成聚合物颗粒的至少部分壳结构。聚合物颗粒可因此被描述为具有包含非刺激响应聚合物的核和包含刺激响应聚合物的壳，其中从核过渡到壳对应于从共聚物的非刺激响应聚合物嵌段过渡到共聚物的刺激响应聚合物嵌段。
嵌段共聚物的一个重要特征是刺激响应聚合物嵌段。刺激响应聚合物(也称为“智能”聚合物)是对刺激如温度、pH、离子强度和/或光的波长的改变作出反应而经历物理或化学变化的聚合物。
刺激响应聚合物对给定刺激作出反应而表现出的物理或化学变化可取决于所采用的聚合物的类型而改变。例如，一种形式的物理变化是对刺激作出反应聚合物经历从特征为疏水到特征为亲水的可逆转变。
在一个实施方案中，嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段是在经受刺激后经历从特征为疏水到特征为亲水或反过来的转变的类型。
在进一步的实施方案中，嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段是对温度改变作出反应而经历物理或化学转变的温度响应聚合物嵌段。
在再一个进一步的实施方案中，嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段是对温度改变作出反应而经历从特征为疏水到特征为亲水或反过来的转变的温度响应聚合物。
本领域技术人员将领会，诸如“特征为疏水”和“特征为亲水”的表述通常用在本领域中表达一种物质相对于另一种之间的有利或不利的相互作用(例如吸引或排斥的相互作用)而非限定特定物质的绝对性质。例如，亲水材料更有可能为含水介质所润湿或溶解(吸引相互作用)，而疏水材料不太可能为含水介质所润湿或溶解(排斥相互作用)。除非另有说明，在本发明上下文中，这些表述旨在引述刺激响应聚合物的极性相对于含水液体的极性。因此，特征为亲水是指刺激响应聚合物可为含水液体润湿或溶解。特征为疏水是指刺激响应聚合物不能为含水 液体润湿或溶解。
嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段可以为均聚物或共聚物的形式。
嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段可以是天然聚合物或合成聚合物。
温度响应聚合物的实例包括N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm,NIPAm或NIPAM)的均聚物和共聚物。
聚(N-异丙基丙烯酰胺)均聚物(P(NIPAAm),PNIPAm,PNIPAM或pNIPAM)是广为人知的温度响应聚合物且表现出在含水介质中大约36℃的低临界溶解温度(LCST)。其可以可逆地呈现(i)低于LCST时的展开无规卷曲结构，其特征为亲水且容易为含水液体润湿或溶解，和(ii)高于LCST时的收缩球状结构，其特征为疏水且不容易为含水液体润湿或溶解。
当NIPAAm与一种或多种亲水性烯不饱和共聚用单体如丙烯酰胺共聚时，所得共聚物的LCST可相对于P(NIPAAm)升高。当NIPAAm与一种或多种疏水性共聚用单体如N-叔丁基丙烯酰胺共聚时可发生相反情况。NIPAAm与亲水单体如丙烯酰胺的共聚物具有较高的LCST和通常较宽的沉淀温度范围(相对于P(NIPAAm))，而NIPAAm与疏水单体如N-叔丁基丙烯酰胺的共聚物具有较低的LCST(相对于P(NIPAAm))且通常更可能保留P(NIPAAm)的尖锐转变特征。
pH响应聚合物的实例包括源自pH响应乙烯基单体如丙烯酸、甲基丙烯酸和其它烷基取代的丙烯酸类、马来酸酐、马来酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、氨基乙基甲基丙烯酸酯、磷酰基乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的那些。pH响应聚合物还可作为多肽从氨基酸制备(例如多聚赖氨酸或多聚谷氨酸)，其都源自天然存在的聚合物如蛋白质(例如溶菌酶、白蛋白、酪蛋白)，或多糖(例如藻酸、透明质酸、角叉菜胶、壳聚糖、羧甲基纤维素)或核酸如DNA。pH响应聚合物通常包含pH敏感侧基官能团如-OPO(OH)2,-COOH或-NH2。
通过使产生温度响应聚合物的单体如NIPAAm与少量(例如少于大约10摩尔％)产生pH响应聚合物的共聚用单体如丙烯酸发生共聚，所得的共聚物可展现出温度和pH响应性。这样的共聚物的LCST可保持不受影响，有时甚至降低几度，在共聚物不被离子化的pH下；但如果pH敏感基团变成离子化的话LCST可显著升高。当pH敏感基团以高浓度存在时，温度响应效应的LCST响应可为了所有实际目的而被消除。
源自pH和温度响应单体的嵌段共聚物可制备成使得它们独立地保留pH和温度转变。例如，具有pH响应嵌段(聚丙烯酸)和温度响应嵌段(P(NIPAAm))的嵌段共聚物可保留独立的pH和温度响应性。
嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段可因此本身就是嵌段共聚物。
在一个实施方案中，嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段本身不是嵌段共聚物。
光响应聚合物的实例包括含有侧悬于或沿着聚合物主链的发色团的那些，且当暴露于适宜波长的光时可发生异构化从反式到顺式，其可以是两极的且更亲水并促进可逆的聚合物构象变化。其它光敏性基团也可被光刺激转化从相对非极性疏水非离子化状态到亲水离子状态。
对于光敏性侧基如光敏性染料(例如芳族偶氮化合物或芪衍生物)，它们可与反应性单体缀合(例外是如叶绿素的染料，其已经包含乙烯基团)并且然后与一众或多种其它单体包括温度响应或pH响应单体发生均聚或共聚。光敏性基团还可缀合到聚合物链包括刺激响应聚合物链的末端。将这类光敏性基团缀合到单体或聚合物链的技术是已知的。
一般而言，光响应聚合物将从含有光敏性侧基的乙烯基单体制备。这类单体可与一种或多种其它烯不饱和单体发生均聚或共聚。
光敏性基团可以是这样的染料分子，当其吸收特定波长的光时发生异构化或变成离子化，将其从疏水转化为亲水构象或反过来，或者它们可以是当吸收特定波长的光时放热的染料分子。在前一种情况中，单单异构化就可引起链展开或收缩，而在后一种情况中，如果聚合物也是温度响应性的话其可发生沉淀。
可产生光响应特性的发色团的实例包括芳族重氮染料。当该类型的染料暴露于350-410nm紫外光时，特征为疏水的染料反式形式可异构化成其顺式形式，后者是两极的且特征更为亲水，这继而可导致聚合物构象变化。染料暴露于大约750nm的可见光可逆转该现象。
特异性离子响应聚合物的实例包括多糖如角叉菜胶，作为暴露于离子如K+或Ca2+的功能，其改变其构象，例如从随机到有序构象。特异性离子响应聚合物的其它实例包括带有离子螯合侧基如组氨酸或EDTA的聚合物。
如上所述，刺激响应聚合物可以对多种刺激有反应。例如，如果光响应聚合物也是温度响应性的，则紫外或可见光刺激的沿聚合物主链缀合的发色团向更疏水或亲水构象的转化也可刺激所述聚合物的溶解/润湿或沉淀，取决于聚合物组成和温度。或者，如果发色团吸收光并将其转化为热能而非刺激异构化，则当系统温度接近相分离温度时局限加热也可刺激温度响应聚合物如P(NIPAAm)发生相变。通过适宜单体的共聚而引入多种敏感性可赋予根据本发明使用的刺激响应聚合物以更大的通用性。
只要嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段供给根据本发明使用的聚合物颗粒，关于刺激响应聚合物嵌段的数均分子量没有特定限制。刺激响应聚合物嵌段的数均分子量将通常落在大约1,500到大约40,000的范围内，例如从大约2,000到大约20,000，或从大约2,000到大约10,000。
有关本文所指的聚合物的数均分子量，其是通过大小排阻色谱法(SEC)测定的。
还可便利地参考刺激响应聚合物嵌段的嵌段长度，以形成嵌段的聚合单体残基的数目表示。在该情况中，刺激响应聚合物嵌段将通常包含大约20到大约200，或大约30到大约150，或大约40到大约80个聚合单体单元。
形成聚合物颗粒的嵌段共聚物还包含非刺激响应聚合物嵌段。“非刺激响应聚合物嵌段”是指不会被本领域技术人员视为刺激响应聚合物 嵌段且照此不对刺激如温度、pH、离子强度和/或光的波长作出反应而经历物理或化学变化的聚合物嵌段。
非刺激响应聚合物嵌段可为均聚物或共聚物的形式。
非刺激响应聚合物嵌段可以为天然聚合物或合成聚合物。
非刺激响应聚合物嵌段可包含具有供给刺激响应聚合物所需特性的单体类型的聚合残基。但是在该情况中，这类聚合单体残基的量将不足以赋予聚合物嵌段以刺激响应特性。
在一个实施方案中，非刺激响应聚合物嵌段不含有可供给刺激响应聚合物的类型的聚合单体残基。
只要嵌段共聚物的非刺激响应聚合物嵌段供给根据本发明使用的聚合物颗粒，关于非刺激响应聚合物嵌段的数均分子量没有特定限制。非刺激响应聚合物嵌段的数均分子量将通常落在大约500到大约40,000的范围内，例如从大约2,000到大约20,000，或从大约4,000到大约10,000。
嵌段共聚物的非刺激响应聚合物嵌段和刺激响应聚合物嵌段将通常通过适宜烯不饱和单体的聚合来制备。用于制备嵌段共聚物的单体将当然经适当选择来分别供给非刺激响应和刺激响应聚合物嵌段。这类单体也将通常能够与其它单体聚合。决定多种单体可共聚性的因素在本领域记载充分。例如参见：Greenlee,R.Z.,in Polymer Handbook 3rd Edition(Brandup,J.,and Immergut.E.H.Eds)Wiley:New York,1989p II/53。
可聚合来制备嵌段共聚物的适宜的烯不饱和单体包括式(I)的那些：
其中U和W独立选自：-CO2H,-CO2R1,-COR1,-CSR1,-CSOR1,-COSR1,-CONH2,-CONHR1,-CONR12,氢，卤素和任选取代的C1-C4烷基，或者U 和W一起形成内酯，酐或酰亚胺环，其自身可任选被取代，其中任选的取代基独立选自羟基，-CO2H,-CO2R1,-COR1,-CSR1,-CSOR1,-COSR1,-CN,-CONH2,-CONHR1,-CONR12,-OR1,-SR1,-O2CR1,-SCOR1,和-OCSR1；
V选自氢，R1,-CO2H,-CO2R1,-COR1,-CSR1,-CSOR1,-COSR1,-CONH2,-CONHR1,-CONR12,-OR1,-SR1,-O2CR1,-SCOR1,和-OCSR1；
其中每个R1独立选自任选取代的烷基，任选取代的烯基，任选取代的炔基，任选取代的芳基，任选取代的杂芳基，任选取代的碳环基，任选取代的杂环基，任选取代的芳烷基，任选取代的杂芳基烷基，任选取代的烷基芳基，任选取代的烷基杂芳基和任选取代的聚合物链。
每个R1还可独立选自任选取代的C1-C22烷基，任选取代的C2-C22烯基，任选取代的C2-C22炔基，任选取代的C6-C18芳基，任选取代的C3-C18杂芳基，任选取代的C3-C18碳环基，任选取代的C2-C18杂环基，任选取代的C7-C24芳烷基，任选取代的C4-C18杂芳基烷基，任选取代的C7-C24烷基芳基，任选取代的C4-C18烷基杂芳基和任选取代的聚合物链。
R1还可选自任选取代的C1-C18烷基，任选取代的C2-C18烯基，任选取代的芳基，任选取代的杂芳基，任选取代的碳环基，任选取代的杂环基，任选取代的芳烷基，任选取代的杂芳基烷基，任选取代的烷芳基，任选取代的烷基杂芳基和聚合物链。
在一个实施方案中，R1可独立选自任选取代的C1-C6烷基。
R1的任选取代基的实例包括选自以下的那些：环氧环烃基(环氧基)，羟基，烷氧基，酰基，酰氧基，甲酰基，烷基羰基，羧基，磺酸，烷氧基-或芳氧基-羰基，异氰基，氰基，甲硅烷基，卤代，氨基，包括其盐和衍生物。聚合物链的实例包括选自以下的那些：聚环氧烷烃，聚芳醚和聚亚烷基醚。
式(I)单体的实例包括马来酸酐，N-烷基马来酰亚胺，N-芳基马来酰亚胺，二烷基延胡索酸酯和可环聚的单体，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，丙烯酸和甲基丙烯酸，苯乙烯，N-烷基丙烯酰胺，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，和甲基丙烯腈，这些单体的混合物，和这些单体与其它单体的混合物。
式(I)的单体的进一步实例包括：甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸丙酯(所有异构体)，甲基丙烯酸丁酯(所有异构体)，甲基丙烯酸2-乙基己酯，甲基丙烯酸异冰片酯，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸苄酯，甲基丙烯酸苯酯，甲基丙烯晴，α-甲基苯乙烯，丙烯酸甲酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸丙酯(所有异构体)，丙烯酸丁酯(所有异构体)，丙烯酸2-乙基己酯，丙烯酸异冰片酯，丙烯酸，丙烯酸苄酯，丙烯酸苯酯，丙烯晴，苯乙烯，选自以下的功能性甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯和苯乙烯类：甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸2-羟基乙酯，甲基丙烯酸羟基丙酯(所有异构体)，甲基丙烯酸羟基丁酯(所有异构体)，甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯，甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯，甲基丙烯酸三甘醇酯，衣康酸酐，衣康酸，丙烯酸缩水甘油酯，丙烯酸2-羟基乙酯，丙烯酸羟基丙酯(所有异构体)，丙烯酸羟基丁酯(所有异构体)，丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯，丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯，丙烯酸三甘醇酯，甲基丙烯酰胺，N-甲基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N,N-二甲基丙烯酰胺，N-叔丁基甲基丙烯酰胺，N-正丁基甲基丙烯酰胺，N-羟甲基甲基丙烯酰胺，N-羟乙基甲基丙烯酰胺，N-叔丁基丙烯酰胺，N-正丁基丙烯酰胺，N-羟甲基丙烯酰胺，N-羟乙基丙烯酰胺，乙烯基苯甲酸(所有异构体)，二乙基氨基苯乙烯(所有异构体)，α-甲基乙烯基苯甲酸(所有异构体)，二乙基氨基α-甲基苯乙烯(所有异构体)，对乙烯基苯甲酸，对乙烯基苯磺酸钠盐，甲基丙烯酸三甲氧硅烷基丙酯，甲基丙烯酸三乙氧硅烷基丙酯，甲基丙烯酸三丁氧硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二甲氧基甲基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二乙氧基甲基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二丁氧基甲基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二异丙氧基甲基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二甲氧基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二乙氧基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二丁氧基硅烷基丙酯，甲基丙烯酸二异丙氧基硅烷基丙酯，丙烯酸三甲氧硅烷基丙酯，丙烯酸三乙氧硅烷基丙酯，丙烯酸三丁氧硅烷基丙酯，丙烯酸二甲氧基甲基硅烷基丙酯，丙烯酸二乙氧基甲基硅烷基丙酯，丙烯酸二丁氧基甲基硅烷基丙酯，丙烯酸二异丙氧基甲基硅烷基丙酯，丙烯酸二甲氧基硅烷基丙酯，丙烯酸二乙氧基硅烷基丙 酯，丙烯酸二丁氧基硅烷基丙酯，丙烯酸二异丙氧基硅烷基丙酯，醋酸乙烯酯，丁酸乙烯酯，苯甲酸乙烯酯，氯乙烯，氟乙烯，溴乙烯，马来酸酐，N-苯基马来酰亚胺，N-丁基马来酰亚胺，N-乙烯吡咯烷酮，N-乙烯咔唑，丁二烯，乙烯和氯丁二烯。这一列表不是穷举性的。
在一个实施方案中，嵌段共聚物包含源自一种或多种选自苯乙烯、4-甲基苯乙烯和丙烯酸正丁酯的单体的非刺激响应聚合物嵌段。
在进一步的实施方案中，嵌段共聚物包含源自一种或多种选自N-异丙基丙烯酰胺和单甲氧基醚聚(氧化乙烯)丙烯酸酯的单体的刺激响应聚合物嵌段。
在进一步的实施方案中，嵌段共聚物包含聚苯乙烯非刺激聚合物嵌段和聚(N-异丙基丙烯酰胺)刺激响应聚合物嵌段。
只要聚合物颗粒具有所需的嵌段共聚物组成，对可制备它们的方法没有特别限制。
聚合物颗粒可以例如根据WO 2010/091465中所概述的方法制备，其整个内容通过交叉参考引入本文。在该情况中，聚合物颗粒可使用常规的分散聚合技术(例如常规乳液、细乳液和悬浮液聚合)和设备来制备。
例如，聚合物颗粒可通过包括如下步骤的方法制备：提供分散体，其具有连续水相，包含一种或多种烯不饱和单体的分散有机相，具有与其共价结合的可控自由基聚合部分的刺激响应聚合物，和对有机相的稳定剂。制备了所述分散体后，使所述一种或多种烯不饱和单体在可控自由基聚合物部分的控制下聚合。
选择所用一种或多种烯不饱和单体使得可供给非刺激响应聚合物嵌段。相应地，所述聚合供给包含非刺激响应聚合物嵌段和刺激响应聚合物嵌段的嵌段共聚物。
在可控自由基聚合部分“控制下”聚合是指单体的聚合经由适宜的可控自由基聚合机制进行以形成聚合物。可控自由基聚合部分因此是可根据特定类型的可控自由基聚合来参与控制或介导一种或多种烯不饱和单体的自由基聚合以形成聚合物链的部分。
可控自由基聚合的实例包括引发-转移-终止剂聚合，稳定自由基介导的聚合(SFRP)，原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合。例如，当可控自由基聚合部分是RAFT部分时，单体的聚合将经由RAFT机制进行以形成聚合物。
这样的聚合提供包含具有刺激响应聚合物嵌段和非刺激响应聚合物嵌段的嵌段共聚物的聚合物颗粒的分散体。通过使如此形成的聚合物颗粒经受适宜的刺激(即引起嵌段共聚物的刺激响应聚合物嵌段经历化学或物理变化的刺激)，聚合物颗粒可经历形态转化以形成具有不同形态的多种聚合物颗粒。例如，当聚合中所用的刺激响应聚合物包含温度响应刺激聚合物嵌段时，通过使聚合物颗粒的分散体经受高于和低于刺激响应聚合物嵌段的LCST的加热/冷却循环，可提供所得的聚合物颗粒以杆状或蜗杆样形状。
使用常规的分析技术如透射电镜(TEM)可确证所形成的聚合物颗粒的多种不同形状。
除了聚合物颗粒外，根据本发明的组合物还包含功能化刺激响应聚合物。表述“功能化刺激响应聚合物”是指通过物理或化学关联(例如共价键)附着有有待从根据本发明的释放介质释放的功能实体的刺激响应聚合物。关于这类功能实体的性质没有特别限制，只要其或其修饰或衍生形式可从所述释放介质释放。
例如，功能化刺激响应聚合物可用选自生物材料、药物和细胞受体配体的功能实体功能化。
生物材料的实例包括但不限于细胞、蛋白质、肽、核酸、脂质和碳水化合物。
细胞受体配体的实例包括但不限于蛋白质、肽、神经递质、激素、药物、激动剂和拮抗剂。
细胞的具体实例包括但不限于胚胎干细胞(hESCs)，间充质干细胞(MSCs)，造血干细胞(HSCs)，神经干细胞(NSCs)，癌症干细胞(CSCs)，诱导多能干细胞，成体干细胞，胎儿干细胞，组织特异性干细胞，脐带干细胞，胎盘衍生干细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，幼 仓鼠肾脏细胞(BHK)，人羊水细胞，NS0细胞，PER.C6细胞，Madin-Darby犬肾脏细胞(MDCK)，杂交瘤细胞，人胚胎肾脏细胞(HEK)，美洲家鸭，Vero细胞(非洲绿猴)，NIH-3T3，MRC-5，WI-38，FRhl-2，鸡胚成纤维细胞(CEF)，鸡胚肾脏(CEK)和胚盘衍生胚胎干细胞(例如EB14,Vivalis)，昆虫细胞(例如Sf9和High Five)，HeLa细胞，COS细胞，和原代或无限增殖化细人类细胞。
蛋白质的具体实例包括但不限于胞外基质组分和蛋白聚糖，例如玻连蛋白，层粘连蛋白，胶原，纤连蛋白和弹性蛋白。
肽的具体实例包括但不限于细胞粘附模序，包括RGD,YIGSR,REDV和多聚丙氨酸，和促血小板生成素(TPO)衍生肽。
药物的具体实例包括但不限于阿非迪霉素，Blebbistatin，秋水仙碱，细胞松弛素，拉春库林，轻肌蛋白，ROCK抑制剂(Y-27632)，糖原合成酶激酶3抑制剂(例如BIO(6-溴靛红-3′-肟)和CHIR99021)，RA(视黄酸)，Pluripotin/SC1,PD0325901,A83-01,IDE1,(-)吲哚内酰胺V，Stauprimide，SB431542,BIX-01294,RG108,(+)Bayk8644,Parnate(硫酸反苯环丙胺),Kenpaullone，丙戊酸，逆转素和十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯。
功能化刺激响应聚合物的刺激响应聚合物组分可以是如本文所述的刺激响应聚合物。所述功能实体和刺激响应聚合物可使用本领域已知的技术以化学或物理方式彼此关联。例如，所述功能实体和刺激响应聚合物可各自提供有互补的反应性官能团，其经历化学反应以供给在功能实体和刺激响应聚合物之间的共价键。
根据本发明的组合物可包含液体。当组合物是液体组合物时，与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述液体中可溶。为了防止聚合物颗粒完全溶解在液体中，共聚物中形成聚合物颗粒核的非刺激响应聚合物嵌段将当然在所述液体中不溶。
在一个实施方案中，所述液体是亲水性液体，如含水液体。
除了选择与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物以具有在所述液体中期望的溶解度之外，还选择各刺激响应聚合 物对至少一种共同刺激有反应。换言之，各刺激响应聚合物可对相同刺激作出反应而经历物理或化学变化。例如，聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物可均为温度响应聚合物。
一般而言，聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物将不仅对至少一种共同刺激有反应，而且这两种刺激响应聚合物将以相同或相似方式对该共同刺激有反应。例如，当聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物均为温度响应聚合物时，它们将均具有相同或相似的LSCT。
在一个实施方案中，聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)均为温度响应聚合物，且(b)具有差异不超过5℃,或4℃,或3℃,或2℃,或1℃的LSCT。
当与聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物关联的刺激响应聚合物在所述液体中可溶时，功能化刺激响应聚合物和聚合物颗粒作为离散单独的实体(即它们不聚集)存在于所述液体组合物中。
只要所述组合物能发挥预期的功能，关于可用的液体没有特别限制。在一个实施方案中，所述液体是亲水性液体，如含水液体，水溶性醇或聚醚如聚氧化乙烯。作为含水液体，水可包含一种或多种水溶性液体或固体。
参考图1，图1A和1B图示了根据本发明的组合物，其包含聚合物颗粒、功能化刺激响应聚合物和液体。图1A例示了具有杆样形状的聚合物颗粒，而图1B例示了具有球形形状的聚合物颗粒。参照低于LCST(左)和高于LCST(右)的温度例示了所述组合物。
特别参考图1A(左手侧)，聚合物颗粒具有核(10)和壳(20)，其分别从嵌段共聚物的聚合物嵌段形成。非刺激响应聚合物嵌段(10)形成至少部分核(10)且不溶于所述液体(30)。刺激响应聚合物嵌段(20)形成至少部分壳(20)。为清楚起见限制了显示的刺激响应聚合物嵌段(20)的数目。在该实例中，聚合物颗粒的刺激响应聚合物嵌段(20)是热响应性聚合物嵌段且处于低于其LCST的温度，所以它们可溶于所述液体(30)。聚合物颗粒作为离散实体存在于液体中。组合物 还包含功能化刺激响应聚合物(40)。在该实例中，功能化刺激响应聚合物的刺激响应聚合物是热响应性聚合物且处于低于其LCST的温度也可溶于所述液体(30)。功能化刺激响应聚合物也作为离散实体存在于液体中。
特别参考图1A(右手侧)，液体(30a)的温度已升高到高于LCST。这一施加的刺激使得聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的热响应性聚合物变得不溶于液体(30a)，其继而导致聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物形成聚集物结构(50)。在聚集物结构中，聚合物颗粒包含(i)非刺激响应聚合物嵌段(10)，其形成至少部分核(10)，所述核不溶于液体(30a)，和(ii)刺激响应聚合物嵌段(20a)，其形成至少部分壳(20a)，所述壳现在也不溶于液体(30a)。在聚集物结构中，功能化刺激响应聚合物的热响应性聚合物也不溶于液体(30a)且与聚合物颗粒缔合形成聚集物结构(50)。功能化刺激响应聚合物可简单通过将液体(30a)温度冷却至低于LCST而从聚集物结构(50)释放。
类似的考量适用于图1B，除外在该情况中聚合物颗粒具有球形形状。
关于可用于本发明组合物的聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的量或者聚合物颗粒与功能化刺激响应聚合物之比没有特别限制。所用的量和比值将通常由预期的应用来主宰且可由本领域技术人员容易地确定。
当组合物要用于形成凝胶时，它们将包含液体，且聚合物颗粒以足以在至少聚合物颗粒的刺激响应聚合物经受所述至少一种共同刺激后将所述液体转化为凝胶的浓度存在于液体中。为了形成凝胶，提供聚合物颗粒，使得它们可容易地彼此缔合且产生聚集物结构(即形成以物理方式相互关联的颗粒集合)。
对给定类型的聚合物颗粒的CGC将主要取决于颗粒的纵横比而变化。为了形成凝胶，聚合物颗粒将以或高于其CGC来提供。具有低纵横比的聚合物颗粒将通常具有比具有高纵横比的那些颗粒要高的CGC。例如，纵横比为10的聚合物颗粒可具有大约5-10wt％的CGC，而纵横比为 100的聚合物颗粒可具有大约0.1-0.5wt％的CGC。本领域技术人员将能够容易地确定给定聚合物颗粒或聚合物颗粒混合物的CGC。
术语“凝胶”是指表观固体样物质具有不表现出典型的液体流动特征的胶样稠度。以“凝胶”形式呈现的根据本发明的组合物将包含聚合物颗粒、刺激响应聚合物和液体。
不希望受理论所限，据信(通过施加刺激)使得聚合物颗粒的刺激响应聚合物经历物理或化学转变，例如从在液体中可溶到在液体中不溶，可导致形成所述颗粒的三维聚集物结构。当聚合物颗粒以或高于其CGC存在时，该聚集据信可产生渗透颗粒网络，这继而导致组合物从处于液体状态转变为凝胶。
同样不希望受理论所限，据信(通过施加刺激)使得功能化刺激响应聚合物的刺激响应聚合物经历物理或化学转变，例如从在液体中可溶到在液体中不溶，导致功能化刺激响应聚合物与聚合物颗粒(也经历了类似的转变)形成聚集物结构。这继而实际上将功能化刺激响应聚合物结合到聚集物结构(即形成释放介质)，取决于聚合物颗粒的浓度可形成或不形成部分凝胶。
例如，根据本发明的组合物可包含聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物在含水液体之中。聚合物颗粒的嵌段共聚物可包含(a)形成至少部分核结构且在所述含水液体中不溶的疏水非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构且低于其LCST在所述含水液体中可溶的热响应性聚合物嵌段。功能化刺激响应聚合物可以是功能化热响应性聚合物，所述热响应性聚合物(a)具有与形成至少部分壳结构的热响应性聚合物嵌段相同的LCST，和(b)低于其LCST在所述含水液体中可溶。在低于LCST的温度，聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物作为单独和离散的实体存在。
使所述液体经受温度升高高于聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物的热响应性聚合物的LCST使得热响应性聚合物的亲水特征从在所述含水液体中可溶转变为特征为疏水且在所述含水液体中不溶。这一转变引起聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物缔合并形成聚集物结构。
聚集物结构的形成产生释放介质，从其可随后释放功能化热响应性聚合物或其修饰形式。
开发可重复大规模产生hESC的充分限定条件对于广泛治疗应用而言仍然是显著的挑战。在其它基于细胞的制造工业如生物药品的生产中，所用的细胞可以作为单分散的悬浮培养物以大规模(10,000-20,000L)在搅拌釜反应器中生长。但是hESC仍不能容易适应悬浮培养而需要附着于生物活性基质来保持高活力、长期生长和扩增同时维持其未分化状态，限制了临床和商业应用。
hECS通常源自受精胚胎5-6日龄囊胚的内细胞团。它们具有两个重要的特征：(1)无限增殖同时维持稳定染色体组型的能力，和(2)分化成为来自所有四种成体细胞谱系(外胚层、中胚层、内胚层和生殖细胞)的体细胞的能力。但是，为使这些应用成为现实，重要的是开发出稳固、可规模化和标准化的体系来产生最初未分化hESC扩增随后高效分化成感兴趣的谱系。预期未分化hESC或诱导多能肝细胞(iPSC，一起统称为多能肝细胞PSC)以足以实现谱系特异性分化的量进行可重复扩增将提供有力的体系供随后用于细胞疗法或药物发现。
任何给定PSC细胞系对培养条件的反应可收到多种因素的影响，包括培养基组分各批次之间的差异，遗传变异性，细胞系是hESC还是iPSC，以及特别是关于iPSC——iPSC是否事实上已去分化到如其hESC表亲等同的发育阶段。
并非所有PSC都生来相同。实际上，PSC的构成一直在演化，从1998年hESC的最初衍生到2006年iPSC时代和最近在乳腺中发现了Oct4+多能细胞。除此之外，总是将hESC与小鼠胚胎干细胞(mESC)作比较，两者之间许多关键差异曾被认为源自它们是来自不同物种的细胞系这一事实。然而，近来的研究提出hESC可能类似于小鼠外胚层干细胞，且mESC与hESC之间的差异是由于hESC在发育路径上稍稍更进一步。鉴于这些变量，主要的问题变成生成能对多种细胞系实现细胞扩增的可重复培养体系。
可重复性的问题还可就培养基组成和胞外基质(ECM)来考虑。文献 中已知关于各批次间的差异和对在动物源组分中或上生长的细胞的潜在免疫原性反应的顾虑。由此，PSC的培养过程已从最初用于hESC衍生的含胎牛血清(FBS)的培养基、小鼠饲养层共培养体系进展到利增加确定成分培养基配方的体系。确定成分培养基的效率和利用有赖于有效选择附着基质，其通常基于小鼠源ECM混合物Matrigel或Geltrex。最近，在用由重组蛋白质象层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白和E-钙粘蛋白或装饰有小肽的简单聚合物组成的充分限定基质取代这些动物源组分方面已取得了进展。
报道已显示，与其它层粘连蛋白包括层粘连蛋白-332、层粘连蛋白-411和层粘连蛋白-111相比，在mTeSR1培养基中层粘连蛋白-511能够维持hESC的长期多能扩增并具有稳定的染色体组型。另一种被充分研究且表征其对多能hESC扩增支持的ECM蛋白质是玻连蛋白(VN)。其它研究已显示，VN生长调节素B结构域的短重组产生片段能够维持hESC，然后是负责与细胞表面整联蛋白缔合和细胞结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序。进一步的研究通过重组产生由不同VN结构域组成的VN片段而突显了hESC对ECM组成反应的一些变异，显示在其特异性生长条件下RGD基序和肝素结合结构域在附着和生长方面给出来自hESC的最佳反应。
细胞-细胞和细胞-ECM接触的重要性也已在一组最近研究中得到证实，其中显示了1)Rho激酶和肌球蛋白在胚胎细胞-细胞信号传导中的作用，2)hESC的酶促解离导致对细胞表面E-钙粘蛋白和整联蛋白信号传导的致命破坏，和3)酶促解离后的肌动蛋白-肌球蛋白收缩通过组织混乱(失巢凋亡)而导致增加的细胞死亡。酶促消化可破坏负责重要的存活和多能维持信号传导途径的细胞表面整联蛋白和生长因子受体。使用非酶方法培养hESC的能力和适当选择表面基质对于干细胞在治疗应用中的未来至关重要。
但是，这类体系/ECM组成的进展由于2D培养的限制而在其可规模化方面受限。
为了克服这一点，3D悬浮培养可能是适宜的选择，因为其允许可 重复、可控自动化大量产生高质量细胞，与此同时排除了涉及贴壁培养容器的劳动密集的耗时方法。
但是，在3D体系中进行PSC扩增可能存在问题，在于首先PSC在最初用于PSC分化的称为拟胚体(EB)的细胞簇中生长。其次，如上所述PSC培养中对细胞-细胞接触的要求使得PSC的单个细胞或小簇扩增倾向于高细胞死亡率，50％或更高，甚至是在肌动蛋白-肌球蛋白诱导的失巢凋亡的抑制剂存在下。第三，如果3D扩增需要EB或PSC聚集体，则聚集体大小需要受到紧密控制，因为这会影响细胞在生长和多能状态方面的行为。最后，PSC扩增需要可重复性，从而获得临床相关数目的细胞用于有效分化成感兴趣的细胞类型。例如用于治疗心肌梗塞患者的心肌细胞，假设所需的心肌细胞数估计为大约1-2x 109细胞。目前利用微型生物反应器或悬浮拟胚体进行分化培养报道了低产率的心肌细胞生成，从3.1×104到1.1×105心肌细胞/ml。
鉴于这些因素，常规的PSC 3D扩增技术利用含有一种或多种不确定组分的培养基，使用随后需要细胞死亡抑制剂的酶促或其它传代方法，或维持不比2D等同技术更好的低扩增率，限制了按比例增加规模的潜能。
本发明提供了针对hPSC培养问题中至少一些的独特解决方案。根据本发明的组合物可提供优异的生物相容性，并允许细胞生长和随后使用施加的非侵入刺激而非酶促释放细胞。
根据本发明的独特组合物可提供优于常规细胞培养组合物/技术的优势，包括：1)包括不同的生长因子或ECM片段，其可按需调制，2)非侵入刺激可用于促进细胞释放，其对细胞更温和，从而消除了对酶或ROCKi的需要，和3)组合物可容易在2D和3D环境之间转移，从而使其适用于治疗应用。
在细胞培养的一个实施方案中，根据本发明的组合物可包含聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物在含水液体之中。聚合物颗粒的嵌段共聚物可包含(a)形成至少部分核结构且在所述含水液体中不溶的疏水非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构且低于其LCST在所述 含水液体中可溶的热响应性聚合物嵌段。功能化刺激响应聚合物可以是功能化热响应性聚合物，所述热响应性聚合物(a)具有与形成至少部分壳结构的热响应性聚合物嵌段相同的LCST，和(b)低于其LCST在所述含水液体中可溶。在低于LCST的温度，聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物作为单独和离散的实体存在。
使所述液体经受温度升高高于聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物的热响应性聚合物的LCST使得热响应性聚合物的亲水特征从在所述含水液体中可溶转变为特征为疏水且在所述含水液体中不可溶。这一转变引起聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物缔合并形成聚集物结构。
聚集物结构的形成产生释放介质，从其可随后释放功能化热响应性聚合物或其修饰形式。
当聚合物颗粒固定于基质时，如此形成的释放介质可存在于该基质表面上。例如，聚合物颗粒可固定于基质如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)层。在该情况中的功能化热响应性聚合物可以是蛋白质功能化的热响应性聚合物，其中所述蛋白质能够与想要的细胞类型结合。当液体低于LCST时，聚合物颗粒和功能化热响应性聚合物将作为离散单独实体存在。
将液体加热至或高于LCST后，蛋白质功能化的热响应性聚合物将聚集到系连的聚合物颗粒上并为其所保留以形成充当释放介质的聚集物结构。以该状态，聚合物颗粒的表面可以充满来自蛋白质功能化的热响应性聚合物的蛋白质。然后可将一种或多种能够与蛋白质功能化的刺激响应(聚合物)的蛋白质组分结合的细胞引入液体。所述一种或多种细胞可随后与所述蛋白质结合并在此富含蛋白质表面上增殖，新细胞也与所述蛋白质结合。以此方式的细胞增殖可提供可有利地维持细胞多能性和活力的条件。
在已发生充分增殖后将液体温度降至低于LCST可促进聚集物结构解离，这继而可有助于现在细胞功能化的热响应性聚合物的释放。换言之，可有利地释放培养的细胞而以有效且非侵入方式从基质收获。
这类基质的实例包括玻璃、金属、陶瓷、塑料、饲养细胞(例如 成纤维细胞如小鼠胚胎成纤维细胞)及其组合。
在一个实施方案中，本发明因而提供了培养细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供包含液体、固定于基质的聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物的液体组合物；
所述聚合物颗粒(a)包含嵌段共聚物，并且(b)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)对至少一种共同刺激有响应，并且(b)在所述液体中可溶；
(ii)使所述液体组合物经受所述共同刺激以使所述聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中可溶转变为在所述液体中不可溶，其中所述转变促进聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物的聚集以形成表面包含细胞受体配体的聚集物结构；
(iii)将一种或多种有待培养的细胞引入所述液体使得其与细胞受体配体结合；和
(iv)在所述包含细胞受体配体的表面上培养细胞。
该方法可进一步包括以下步骤：
(v)使包含培养细胞的液体组合物经受所述共同刺激以使聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中不可溶转变为在所述液体中可溶，其中所述转变有助于所述培养细胞的释放。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(vi)从所述液体组合物取出至少一些在步骤(v)中形成的培养细胞。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(vii)在步骤(vi)后重复步骤(i)-(v)中一个或多个步骤以在所述 包含细胞受体配体的表面上培养更多细胞。
在进一步的实施方案中，本发明还提供了培养细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供包含液体、聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物的凝胶组合物；
所述聚合物颗粒(a)包含嵌段共聚物，并且(b)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)对至少一种共同刺激有响应，并且(b)在所述液体中不可溶；
(ii)将一种或多种有待培养的细胞引入所述凝胶使得其与细胞受体配体结合；和
(iii)在所述凝胶上和/或之中培养细胞。
该方法可进一步包括以下步骤：
(iv)使包含培养细胞的凝胶经受所述共同刺激以使聚合物颗粒和细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中不可溶转变为在所述液体中可溶，其中所述转变有助于所述培养细胞的释放。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(v)从所述液体组合物取出至少一些在步骤(iv)中形成的培养细胞。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(vi)在步骤(v)后重复步骤(i)-(iv)中一个或多个步骤以在所述凝胶上和/或之中培养更多细胞。
当聚合物颗粒自由移动(即它们不固定到固定或非移动基质)时，通过维持液体温度低于LCST，功能化热响应性聚合物和聚合物颗粒将作为单独离散实体存在于所述液体中，而通过升高液体温度高于LCST，功能化热响应性聚合物和聚合物颗粒将缔合以形成三维聚集物结构。在该情况中的功能化热响应性聚合物也可以是蛋白质功能化的热响应性聚 合物，其中所述蛋白质能够与想要的细胞类型结合。
在该情况中，当液体温度低于LCST时，可引入多种想要的细胞使得细胞与蛋白质功能化的热响应性聚合物所呈现的蛋白质结合以实际上形成细胞功能化的热响应性聚合物。多于一个蛋白质功能化的热响应性聚合物将通常与每个细胞结合。
然后可将液体温度升至高于LCST，这将使得现在细胞功能化的热响应性聚合物和聚合物颗粒缔合并形成聚集物结构。在形成聚集物结构过程中，细胞功能化的热响应性聚合物的细胞将固有地成簇，而聚合物颗粒和细胞功能化的热响应性聚合物的聚集物结构代表可从其释放所保留的细胞功能化的热响应性聚合物的释放介质。
在如此形成的细胞簇之中的细胞然后可增殖以形成更大的细胞簇。以此方式的细胞增殖可提供可有利地保持细胞多能性和活力的条件。
在已发生充分增殖后将液体温度降至低于LCST可促进聚集物结构解离，这继而可有助于细胞功能化的热响应性聚合物的释放和随之发生的细胞簇的瓦解。换言之，根据本发明的组合物有利地使得细胞能够在分散在液体之中的细胞簇中培养，其中所培养的细胞簇可随后以有效且非侵入方式被瓦解成单个细胞和/或较小的细胞簇。
根据本发明的这一形式，一旦培养的细胞簇被瓦解成单个细胞和/或较小的细胞簇，可在低于LCST的温度引入额外的蛋白质功能化的热响应性聚合物并重复细胞培养过程。以此方式细胞可有利地以连续循环过程培养并收获。
在一个实施方案中，本发明因而提供了培养细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供包含液体、聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物的液体组合物；
所述聚合物颗粒(a)包含嵌段共聚物，并且(b)具有核壳结构，所述嵌段共聚物包含(a)形成至少部分核结构的非刺激响应聚合物嵌段，和(b)形成至少部分壳结构的刺激响应聚合物嵌段；
其中聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物(a)对至少一种共同刺激有响应，并且(b)在所述液体中可溶；
(ii)使所述液体组合物经受所述共同刺激以使所述聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中可溶转变为在所述液体中不可溶，其中所述转变促进聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物的聚集以形成细胞簇；和
(iii)在所述细胞簇之中和/或上培养细胞。
该方法可进一步包括以下步骤：
(iv)使包含培养细胞的液体组合物经受所述共同刺激以使聚合物颗粒和细胞功能化的刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物从在所述液体中不可溶转变为在所述液体中可溶，其中所述转变有助于从所述细胞簇释放单个细胞和/或较小的细胞簇。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(v)从所述液体组合物取出至少一些如此在步骤(iv)中形成的单个细胞和/或较小的细胞簇。
该方法还可进一步包括以下步骤：
(vi)在步骤(v)后重复步骤(i)-(iv)中一个或多个步骤以在如此形成的细胞簇之中和/或上培养更多细胞。
根据本发明培养细胞的方法可有利地连续进行，使得可重复培养然后收获细胞。
当聚合物颗粒以等于或高于颗粒CGC的浓度存在于液体之中时，将液体加热高于LCST后液体将反而被转化为凝胶且细胞培养可如本文所述备选进行。
由此，以凝胶组合物形式本发明可有利地用于保留物质如药物和/或生物材料，其作为功能化刺激响应聚合物的功能实体呈现。
当功能化刺激响应聚合物的功能实体是药物时，凝胶形式的组合物可有利地用作为该药物的释放介质。这样的药物释放介质可以任何期望的形状提供，例如使凝胶取得在其中形成凝胶的容器的形状。
使用本发明的组合物形成的凝胶具有优异的稳定性且可维持凝胶 状态数天、数月甚至数年。
只要给定药物也具有足够的稳定性，包含药物的凝胶形式的根据本发明的组合物也可有利地保持稳定凝胶状态数天、数月甚至数年。
当根据本发明的组合物要用于细胞培养时，所用的功能化刺激响应聚合物的功能实体将通常是细胞受体配体如可与感兴趣细胞结合的蛋白质。可使用不同受体配体功能化刺激响应聚合物的组合。例如，可选择一种或多种受体配体以提供特定的功能。一般而言，选择的受体配体将至少能够与细胞结合。但是，还可选择给定的受体配体来促进细胞存活和/或增殖(例如生长因子蛋白)。
在一个实施方案中，根据本发明使用的功能化刺激响应聚合物是细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物。
凝胶形式的根据本发明的组合物可使用细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物来制备，其中选择细胞受体配体使得其可与想要的细胞结合。然后可将种子细胞引入所形成的凝胶使得它们迁移并与细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物的细胞受体配体结合。所得的凝胶然后可用于培养所述细胞。
或者，至少一些这样的细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物可在形成凝胶前首先与细胞结合，并且所得的细胞功能化的刺激响应聚合物，任选地与细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物联合，用于形成凝胶。在该情况中，细胞功能化的刺激响应聚合物(功能为种子细胞)，任选地与细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物联合，在凝胶形成后被包含且随后保留在凝胶之中。所得的凝胶可随后用于细胞培养。
当组合物要用于形成细胞培养凝胶时，该凝胶可在基质(如本文所述)上形成，并使细胞在凝胶之中和/或上增殖。形成根据本发明的凝胶后，所述凝胶可有利地粘附到在其上形成凝胶的表面。例如，凝胶可在塑料容器中形成。在该情况中，如此形成的凝胶可有利地粘附到该容器的表面。
根据本发明使用的细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物可使用本领域已知的技术制备。例如，细胞受体配体可以是蛋白质且刺激响应 聚合物-蛋白质缀合物可使用S-S偶联反应制备。
给定细胞可与多于一条细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物链结合。同样地，给定的细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物链可与多于一个细胞结合。
可使用常规的细胞培养方法根据本发明培养细胞。例如，可以2D和3D格式培养细胞。
根据本发明的组合物可有利地允许细胞在细胞生长和扩增期间维持多能性。所述组合物至少部分通过为细胞提供支撑以在静态或悬浮培养中聚集而实现这一点。所述组合物还可设计为引入所需的细胞线索(cue)来维持多能状态，例如通过整联蛋白信号传导和与整联蛋白结合分子的相互作用。
本发明的一个重要特征是在形成聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物的聚集物结构后，可通过使所述结构经受刺激如温度变化而从该结构释放功能化刺激响应聚合物。应领会，在形成聚集物结构开始时使用的功能化刺激响应聚合物的功能实体在从聚集物结构释放之时可以相同形式或不以相同形式存在。
例如，功能化刺激响应聚合物的功能实体可以是药物，并且正是该药物功能化的刺激响应聚合物最终从聚集物结构释放。
作为进一步的实例，功能化刺激响应聚合物的功能实体可以是细胞受体配体。当组合物用于细胞培养时，该细胞受体配体可在细胞培养期间与细胞结合，且所述功能化刺激响应聚合物可能就最好被描述为细胞功能化的刺激响应聚合物。在该情况中，细胞受体配体功能化的刺激响应聚合物仍然从聚集物结构释放，尽管是以附着有细胞的修饰形式。
在一个实施方案中，功能化刺激响应聚合物提供有功能实体(例如药物或细胞受体配体)与刺激响应聚合物之间的可生物降解偶联，从而使得在从释放介质释放后所述可生物降解偶联降解且功能实体从刺激响应聚合物裂解。
当根据本发明的组合物用于细胞培养时，细胞功能化的刺激响应聚合物从聚集物结构的释放可受到例如使聚集物结构经受刺激的促进，例 如降低其温度，从而使得聚合物颗粒和功能化刺激响应聚合物两者的刺激响应聚合物变得在含有所述聚集物结构的液体中可溶。细胞功能化的刺激响应聚合物的释放也可受到应用机械剪切应力的促进。
在本说明书中，“任选取代”意指基团可被一个、两个、三个或更多的有机和无机基团取代或与之稠合(以形成稠合多环基团)或者可以不被取代或稠合，所述有机和无机基团包括选自以下的那些：烷基，烯基，炔基，碳环基，芳基，杂环基，杂芳基，酰基，芳烷基，烷芳基，烷杂环基，烷杂芳基，烷碳环基，卤素，卤代烷基，卤代烯基，卤代炔基，卤代芳基，卤代碳环基，卤代杂环基，卤代杂芳基，卤代酰基，卤代芳烷基，羟基，羟基烷基，羟基烯基，羟基炔基，羟基碳环基，羟基芳基，羟基杂环基，羟基杂芳基，羟基酰基，羟基芳烷基，烷氧基烷基，烷氧基烯基，烷氧基炔基，烷氧基碳环基，烷氧基芳基，烷氧基杂环基，烷氧基杂芳，烷氧基酰基，烷氧基芳烷基，烷氧基，烯氧基，炔氧基，芳氧基，碳环氧基，芳烷氧基，杂芳氧基，杂环氧基，酰氧基，卤代烷氧基，卤代烯氧基，卤代炔氧基，卤代芳氧基，卤代碳环氧基，卤代芳烷氧基，卤代杂芳氧基，卤代杂环氧基，卤代酰氧基，硝基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基芳基，硝基杂环基，硝基杂芳基，硝基碳环基，硝基酰基，硝基芳烷基，氨基(NH2)，烷基氨基，二烷基氨基，烯基氨基，炔基氨基，芳基氨基，二芳基氨基，芳烷基氨基，二芳烷基氨基，酰基氨基，二酰基氨基，杂环氨基，杂芳基氨基，羧基，羧基酯，酰胺基，烷基磺酰氧基，芳基亚磺酰氧基，烷基亚磺酰基，芳基亚磺酰基，硫代，烷基硫代，烯基硫代，炔基硫代，芳基硫代，芳烷基硫代，碳环基硫代，杂环基硫代，杂芳基硫代，酰基硫代，亚砜，磺酰基，磺酰胺，氨基烷基，氨基烯基，氨基炔基，氨基碳环基，氨基芳基，氨基杂环基，氨基杂芳基，氨基酰基，氨基芳烷基，硫代烷基，硫代烯基，硫代炔基，硫代碳环基，硫代芳基，硫代杂环基，硫代杂芳基，硫代酰基，硫代芳烷基，羧基烷基，羧基烯基，羧基炔基，羧基碳环基，羧基芳基，羧基杂环基，羧基杂芳基，羧基酰基，羧基芳烷基，羧基酯烷基，羧基酯烯基，羧基酯炔基，羧基酯碳环基，羧基酯芳基，羧基酯杂环基，羧基酯 杂芳基，羧基酯酰基，羧基酯芳烷基，酰胺基烷基，酰胺基烯基，酰胺基炔基，酰胺基碳环基，酰胺基芳基，酰胺基杂环基，酰胺基杂芳基，酰胺基酰基，酰胺基芳烷基，甲酰基烷基，甲酰基烯基，甲酰基炔基，甲酰基碳环基，甲酰基芳基，甲酰基杂环基，甲酰基杂芳基，甲酰基酰基，甲酰基芳烷基，酰基烷基，酰基烯基，酰基炔基，酰基碳环基，酰基芳基，酰基杂环基，酰基杂芳基，酰基酰基，酰基芳烷基，亚砜烷基，亚砜烯基，亚砜炔基，亚砜碳环基，亚砜芳基，亚砜杂环基，亚砜杂芳基，亚砜酰基，亚砜芳烷基，磺酰基烷基，磺酰基烯基，磺酰基炔基，磺酰基碳环基，磺酰基芳基，磺酰基杂环基，磺酰基杂芳基，磺酰基酰基，磺酰基芳烷基，磺酰胺基烷基，磺酰胺基烯基，磺酰胺基炔基，磺酰胺基碳环基，磺酰胺基芳基，磺酰胺基杂环基，磺酰胺基杂芳基，磺酰胺基酰基，磺酰胺基芳烷基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基碳环基，硝基芳基，硝基杂环基，硝基杂芳基，硝基酰基，硝基芳烷基，氰基，硫酸基，磷酸基，三芳基甲基，三芳基氨基，噁二唑和咔唑基团。任选取代还可指其中链或环中的-CH2-基团被选自-O-,-S-,-NRa-,-C(O)-(即羰基),-C(O)O-(即酯)和-C(O)NRa-(即酰胺)的基团取代，其中Ra如本文所定义。
优选的任选取代基包括烷基(例如C1-6烷基，如甲基，乙基，丙基，丁基，环丙基，环丁基，环戊基或环己基)，羟烷基(例如羟甲基，羟乙基，羟丙基)，烷氧基烷基(例如甲氧基甲基，甲氧基乙基，甲氧基丙基，乙氧基甲基，乙氧基乙基，乙氧基丙基等)，烷氧基(例如C1-6烷氧基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，环丙氧基，环丁氧基)，卤素，三氟甲基，三氯甲基，三溴甲基，羟基，苯基(其本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，苄基(其中苄基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，苯氧基(其中苯基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨 基取代)，苄氧基(其中苄基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，氨基，烷基氨基(例如C1-6烷基如甲基氨基，乙基氨基，丙基氨基等)，二烷基氨基(例如C1-6烷基如二甲基氨基，二乙基氨基，二丙基氨基等)，酰基氨基(例如NHC(O)CH3)，苯基氨基(其中苯基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，硝基，甲酰基，-C(O)-烷基(例如C1-6烷基如乙酰基)，O-C(O)-烷基(例如C1-6烷基如乙酰氧基)，苄氧基(其中苯基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，CH2替换成C＝O,CO2H,CO2烷基(例如C1-6烷基如甲酯，乙酯，丙酯，丁酯)，CO2苯基(其中苯基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，CONH2,CONH苯基(其中苯基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，CONH苄基(其中苄基本身可被进一步取代，例如被C1-6烷基，卤素，羟基，羟基C1-6烷基，C1-6烷氧基，卤代C1-6烷基，氰基，硝基OC(O)C1-6烷基和氨基取代)，CONH烷基(例如C1-6烷基例如甲酯，乙酯，丙酯，丁酰胺)，CONH二烷基(例如C1-6烷基)，氨基烷基(例如HN C1-6烷基-,C1-6烷基HN-C1-6烷基-和(C1-6烷基)2N-C1-6烷基-)，硫代烷基(例如HS C1-6烷基-)，羧基烷基(例如HO2CC1-6烷基-)，羧基酯烷基(例如C1-6烷基O2CC1-6烷基-)，酰胺基烷基(例如H2N(O)CC1-6烷基-,H(C1-6烷基)N(O)CC1-6烷基-)，甲酰基烷基(例如OHCC1-6烷基-)，酰基烷基(例如C1-6烷基(O)CC1-6烷基-)，硝基烷基(例如O2NC1-6烷基-)，亚砜烷基(例如R(O)SC1-6烷基如C1-6烷基(O)SC1-6烷基-)，磺酰基烷基(例如R(O)2SC1-6烷基-如C1-6烷基(O)2SC1-6烷基-)，磺酰胺基烷基(例如2HRN(O)SC1-6烷基，H(C1-6烷基)N(O)SC1-6烷基-)，三芳基甲基，三芳基氨基，噁二唑和咔唑。
如本文所用，单独或在复合词中所用的术语“烷基”是指直链、支链或环状烷基，优选C1-20烷基，例如C1-10或C1-6。直链和支链烷基的实例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，1,2-二甲基丙基，1,1-二甲基-丙基，己基，4-甲基戊基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，1,1-二甲基丁基，2,2-二甲基丁基，3,3-二甲基丁基，1,2-二甲基丁基，1,3-二甲基丁基，1,2,2-三甲基丙基，1,1,2-三甲基丁基，庚基，5-甲基己基，1-甲基己基，2,2-二甲基戊基，3,3-二甲基戊基，4,4-二甲基戊基，1,2-二甲基戊基，1,3-二甲基戊基，1,4-二甲基-戊基，1,2,3-三甲基丁基，1,1,2-三甲基丁基，1,1,3-三甲基丁基，辛基，6-甲基庚基，1-甲基庚基，1,1,3,3-四甲基丁基，壬基，1-,2-,3-,4-,5-,6-或7-甲基辛基，1-,2-,3-,4-或5-乙基庚基，1-,2-或3-丙基己基，癸基，1-,2-,3-,4-,5-,6-,7-和8-甲基壬基，1-,2-,3-,4-,5-或6-乙基辛基，1-,2-,3-或4-丙基庚基，十一烷基，1-,2-,3-,4-,5-,6-,7-,8-或9-甲基癸基，1-,2-,3-,4-,5-,6-或7-乙基壬基，1-,2-,3-,4-或5-丙基辛基，1-,2-或3-丁基庚基，1-戊基己基，十二烷基,1-,2-,3-,4-,5-,6-,7-,8-,9-或10-甲基十一烷基，1-,2-,3-,4-,5-,6-,7-或8-乙基癸基，1-,2-,3-,4-,5-或6-丙基壬基，1-,2-,3-或4-丁基辛基，1-2-戊基庚基等等。环状烷基的实例包括单环或多环烷基基团如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基等等。当烷基基团概括称为“丙基”、“丁基”等时，应理解这可以指适宜的任何直链、支链和环状异构体。烷基基团可任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。
如本文所用的术语“烯基”是指从直链、直链或环状烃残基形成的基团，其含有至少一个碳-碳双键，包括烯单-,二-或多不饱和的如先前定义的烷基或环烷基基团，优选C2-20烯基(例如C2-10或C2-6)。烯基的实例包括乙烯基，烯丙基，1-甲基乙烯基，丁烯基，异丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，环戊烯基，1-甲基-环戊烯基，1-己烯基，3-己烯基，环己烯基，1-庚烯基，3-庚烯基，1-辛烯基，环辛烯基，1-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，1-癸烯基，3-癸烯基，1,3-丁二烯基，1,4-戊二 烯基，1,3-环戊二烯基，1,3-己二烯基，1,4-己二烯基，1,3-环己二烯基，1,4-环己二烯基，1,3-环庚二烯基，1,3,5-环庚三烯基和1,3,5,7-环辛四烯基。烯基基团可任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。
如本文所用的术语“炔基”是指从直链、直链或环状烃残基形成的基团，其含有至少一个碳-碳双键，包括烯单-,二-或多不饱和的如先前定义的烷基或环烷基基团。除非指明碳原子数，该术语优选指C2-20炔基(例如C2-10或C2-6)。实例包括乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基和丁炔基异构体及戊炔基异构体。炔基基团可任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。
术语“卤素”(“卤代”)是指氟、氯、溴或碘(氟代、氯代、溴代或碘代)。
术语“芳基”(或“碳芳基”)是指芳族烃环体系的任何单、多核、共轭和稠合残基(例如C6-24或C6-18)。芳基的实例包括苯基，联苯，三联苯，四联苯，萘基，四氢萘基，蒽基，二氢蒽基，苯并蒽基，二苯并蒽基，菲基，芴基，芘基，茚基，甘菊环基，屈基。优选的芳基包括苯基和萘基。芳基基团可以被或不被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。术语“亚芳基”旨在表示芳基的二价形式。
术语“碳环”包括任何非芳族单环、多环、稠合或共轭烃残基，优选C3-20(例如C3-10或C3-8)。环可以是饱和的，例如环烷基，或可以具有一个或多个双键(环烯基)和/或一个或多个三键(环炔基)。特别优选的碳环基部分是5-6员或9-10员环体系。合适的实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环壬基，环癸基，环戊烯基，环己烯基，环辛烯基，环戊二烯基，环己二烯基，环辛四烯基，茚满基，十氢化萘基和茚基。碳环基团可以任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。术语“亚碳环基”旨在表示碳环基的二价形式。
如本文所用的术语“杂原子”或“杂”以其最广义指可以是环状有机基团成员的除碳原子以外的任何原子。杂原子的特别实例包括氮，氧，硫，磷，硼，硅，硒和碲，更特别是氮，氧和硫。
术语“杂环基”当单独或在复合词中使用时包括任何单环、多环、稠合或共轭烃残基，优选C3-20(例如C3-10或C3-8)，其中一个或多个碳原子被杂原子替换以提供非芳族残基。合适的杂原子包括O,N,S,P和Se，特别是O,N和S。当两个或更多个碳原子被替换时，这可以是被两个或更多个相同的杂原子或被不同的杂原子。杂环基基团可以是饱和或部分不饱和的，即具有一个或多个双键。特别优选的杂环基是5-6员和9-10员杂环基。杂环基基团的合适实例可包括吖啶基，环氧乙烷基，环硫乙烷基，氮杂环丁烷基，氧杂环丁烷基，硫杂环丁烷基，2H-吡咯基，吡咯烷基，吡咯啉基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，二氢吲哚基，咪唑烷基，咪唑啉基，吡唑烷基，硫代吗啉基，二噁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡咯基，四氢噻吩基，吡唑啉基，dioxalanyl，噻唑烷基，异噁唑烷基，二氢吡喃基，噁嗪基，噻嗪基，硫代吗啉基，噻烷基，二噻烷基，三氧杂环己烷基，噻二嗪基，二噻嗪基，三噻烷基，吖庚因基， 庚因基，噻庚因基，茚基，茚满基，3H-吲哚基，异吲哚啉基，4H-quinolazinyl，苯并吡喃基，色满基，异色满基，吡喃基和二氢吡喃基。杂环基基团可任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。术语“亚杂环基”旨在表示杂环基的二价形式。
术语“杂芳基”包括任何单环、多环、稠合或共轭烃残基，其中一个或多个碳原子被杂原子替换以提供芳族残基。优选的杂芳基具有3-20个环原子，例如3-10。特别优选的杂芳基是5-6和9-10员二环环体系。合适的杂原子包括O,N,S,P和Se，特别是O,N和S。当两个或更多个碳源自被替换时，这可以是被两个或更多个相同的杂原子或被不同的杂原子。杂芳基基团的合适实例可包括吡啶基，吡咯基，噻吩基，咪唑基，呋喃基，苯并噻吩基，异苯并噻吩基，苯并呋喃基，异苯并呋喃基，吲哚基，异吲哚基，吡唑基，吡嗪基，嘧啶基，哒嗪基，吲哚嗪基，喹啉基，异喹啉基，酞嗪基，1,5-二氮杂萘，quinozalinyl，喹唑啉基，喹啉基，噁唑基，噻唑基，异噻唑基，异噁唑基，三唑基，噁二唑基，噁三唑基，三嗪基和呋咱基。杂芳基基团可任选地被一个或多个如本文定义的任选取代基所取代。术语“亚杂芳基”旨在表示杂芳基的二价形式。
术语“酰基”单独或在复合词中表示含有C＝O部分(且不是羧酸、酯或酰胺)的基团。优选的酰基包括C(O)-Re，其中Re是氢或烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，碳环基或杂环基残基。酰基的实例包括甲酰基，直链或支链烷酰基(例如C1-20)如乙酰基，丙酰基，丁酰基，2-甲基丙酰基，戊酰基，2,2-二甲基戊酰基，己酰基，庚酰基，辛酰基，壬酰基，癸酰基，十一烷酰基，十二烷酰基，十三烷酰基，十四烷酰基，十五烷酰基，十六烷酰基，十七烷酰基，十八烷酰基，十九烷酰基和二十烷酰基；环烷基羰基，如环丙基羰基，环丁基羰基，环戊基羰基和环己基羰基；芳酰基，如苯甲酰，甲苯酰和萘酰；芳烷酰基，如苯烷酰基(例如苯乙酰基，苯丙酰基，苯丁酰基，苯异丁酰基，苯戊酰基和苯己酰基)和萘烷酰基(例如萘乙酰基，萘丙酰基和萘丁酰基)；芳烯酰基，如苯烯酰基(例如苯丙烯酰基，苯丁烯酰基，苯基甲基丙烯酰基，苯戊烯酰基和苯己烯酰基)和萘烯酰基(例如萘丙烯酰基，萘丁烯酰基和萘戊烯酰基)；芳氧烷酰基，如苯氧乙酰基和苯氧丙酰基；芳基氨基硫羰基，如苯基氨基硫羰基；芳基乙醛酰如苯基乙醛酰和萘基乙醛酰；芳基磺酰基如苯磺酰基和萘磺酰基；杂环羰基；杂环烷酰基，如噻吩乙酰基，噻吩丙酰基，噻吩丁酰基，噻吩戊酰基，噻吩己酰基，噻唑乙酰基，噻二唑乙酰基和四唑乙酰基；杂环烯酰基，如杂环丙烯酰基，杂环丁烯酰基，杂环戊烯酰基和杂环己烯酰基；和杂环乙醛酰，如噻唑乙醛酰和噻吩乙醛酰。残基Re可如本文所述任选地被取代。
术语“亚砜”单独或在复合词中指基团-S(O)Rf，其中Rf选自氢，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，杂环基，碳环基和芳烷基。优选Rf的实例包括C1-20烷基，苯基和苄基。
术语“磺酰”单独或在复合词中指基团-S(O)2Rf，其中Rf选自氢，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，杂环基，碳环基和芳烷基。优选Rf的实例包括C1-20烷基，苯基和苄基。
术语“磺酰胺”单独或在复合词中指基团S(O)NRfRf，其中每个Rf独立选自氢，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，杂环基，碳环基和芳烷基。优选Rf的实例包括C1-20烷基，苯基和苄基。在一个实施方案中， 至少一个Rf是氢。在另一个实施方案中，两个Rf都是氢。
术语“氨基”在此以其如本领域所理解的最广义使用且包括式NRaRb的基团，其中Ra和Rb可以是独立选自氢，烷基，烯基，炔基，芳基，碳环基，杂芳基，杂环基，芳烷基和酰基的任何基团。Ra和Rb与它们所连的氮一起还可以形成单环或多环环体系，例如3-10员环，特别是5-6和9-10员体系。“氨基”的实例包括NH2，NH烷基(例如C1-20烷基)，NH芳基(例如NH苯基)，NH芳烷基(例如NH苄基)，NH酰基(例如NHC(O)C1-20烷基，NHC(O)苯基)，N烷基烷基(其中每个烷基例如C1-20可以是相同或不同的)和5或6员环，任选地含有一个或多个相同或不同的杂原子(例如O,N和S)。
术语“酰胺基”在此以其如本领域所理解的最广义使用且包括具有式C(O)NRaRb的基团，其中Ra和Rb如上定义。“酰胺基”的实例包括C(O)NH2，C(O)NH烷基(例如C1-20烷基)，C(O)NH芳基(例如C(O)NH苯基)，C(O)NH芳烷基(例如C(O)NH苄基)，C(O)NH酰基(例如C(O)NHC(O)C1-20烷基，C(O)NHC(O)苯基)，C(O)N烷基烷基(其中每个烷基例如C1-20可以是相同或不同的)和5或6员环，任选地含有一个或多个相同或不同的杂原子(例如O,N和S)。
术语“羧基酯”在此以其如本领域所理解的最广义使用且包括具有式CO2Rg的基团，其中Rg可选自包括烷基，烯基，炔基，芳基，碳环基，杂芳基，杂环基，芳烷基和酰基的基团。“羧基酯”的实例包括CO2C1-20烷基，CO2芳基(例如CO2苯基)，CO2芳烷基(例如CO2苄基)。
如本文所用，术语“芳氧基”指“芳基”基团通过氧桥附着。芳氧基取代基的实例包括苯氧基，联苯氧基，萘氧基等等。
如本文所用，术语“酰氧基”指“酰基”基团，其中“酰基”基团继而通过氧原子附着。“酰氧基”的实例包括己基羰基氧基(庚酰氧基)，环戊基羰基氧基，苯甲酰氧基，4-氯苯甲酰氧基，癸基羰基氧基(十一烷酰氧基)，丙基羰基氧基(丁酰氧基)，辛基羰基氧基(壬酰氧基)，联苯羰基氧基(例如4-苯基苯甲酰氧基)，萘基羰基氧基(例如1-萘酰氧基)等等。
如本文所用，术语“烷氧羰基”指“烷氧基”基团通过羰基基团附着。“烷氧羰基”基团的实例包括丁基甲酸酯，仲丁基甲酸酯，己基甲酸酯，辛基甲酸酯，癸基甲酸酯，环戊基甲酸酯等等。
如本文所用，术语“芳烷基”指从直链或支链烷烃用芳环取代形成的基团。芳烷基的实例包括苯甲基(苄基)，苯乙基和苯丙基。
如本文所用，术语“烷基芳基”指从芳基基团用直链或支链烷烃取代形成的基团烷基芳基的实例包括甲基苯基和异丙基苯基。
下面将参考以下非限定性实施例来进一步描述本发明。
实施例
材料：
所用溶剂为HPLC或AR级。活化碱性氧化铝(Aldrich:Brockmann I，标准级，～150目,58)，MilliQ水，十二烷基硫酸钠(SDS:Aldrich,99％)按到货原样使用。使苯乙烯(STY:Aldrich,>99％)通过碱性氧化铝柱以除去抑制剂。在使用前，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM:Aldrich,97％)从己烷重结晶，偶氮二异丁腈(AIBN：Riedel-de Haen)从甲醇重结晶。二硫化碳(99％)，1-丁硫醇(99％)，溴代丙酸甲酯(98％)，二甲基亚砜(DMSO,>99.9％)，AldrithilTM-2(98％)，己胺(99％)按从Aldrich收货原样使用。三乙胺(>99％)按从MERCK收货原样使用。hESC细胞系MEL1(男性)和MEL2(女性)由Stem Core Queensland(前身为Australian Stem Cell Centre)提供且经Australian National Health and Medical Research Counci l批准(许可号309709)作为在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的手工传代培养物而常规维持。所有试验中使用的培养基为用于hESC的无血清培养基(Life Technologies Carlsbad,CA,USA)。对照接种到在1：200GeltrexTM中包被一小时的组织培养塑料皿(BD Falcon)上。
分析技术
大小排阻色谱(SEC)
使用配备有顺序连接的自动进样器、示差折光率(RI)检测器和光电二极管阵列(PDA)检测器的Waters Alliance 2690 Separations Module 进行SEC测量。HPLC级四氢呋喃用作为洗脱剂，流速为1mL/min。柱由顺序连接的两个7.8x 300mm Waters linear Ultrastyragel SEC柱组成。聚苯乙烯标准用于校准。
透射电镜(TEM)
于室温使用JEOL-1010透射电镜分析聚合物乳胶的纳米结构外观，利用100kV的加速电压，光斑大小6。典型的TEM光栅制备如下：将聚合混合物用Milli-Q水稀释至大约0.05wt％。然后将聚醋酸甲基乙烯酯预包被的铜TEM光栅浸在稀释的乳胶溶液中并于25℃在滤纸上干燥。
1H核磁共振(NMR)光谱
所有NMR光谱记录在Bruker DRX 500MHz光谱仪上。
基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-ToF)质谱
MALDI-ToF MS质谱使用配备有氮激光器(337nm,200Hz最大射速)的Bruker MALDI-ToF autoflex III smart beam获得，质量范围为600-400,000Da。以reflectron模式(2,000-5,000Da)和线性模式(5,000-20,000Da)记录质谱。反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-亚丙烯基]丙二睛(DCTB；20mg/mL在THF中)用作为基质，且Na(CF3COO)(1mg/mL在THF中)作为阳离子源。通过将基质(20μL)、Na(CF3COO)(1μL)和聚合物溶液(20μL,1mg/mL在THF中)共点样在靶板上来制备样品。
使用TrypLE(Life Technologies)酶促消化使细胞适应单细胞传代。使用TrypLE(Life Technologies)使细胞从组织培养表面上脱附并铺板到包被有用玻连蛋白、纤连蛋白或RGD肽(表1)功能化的pNIPAM/PSTY二嵌段共聚物的盖玻片(插入24孔板)或器官培养皿上(Life Technologies)中。以5×104细胞/盖玻片或器官培养皿接种细胞用于附着测定，1×106用于细胞片层形成。对于结合对照，器官培养皿和盖玻片包被有在DMEM-F12中稀释1：200的GeltrexTM(Life Technologies)。在EVOSfl倒置显微镜(Advanced Microscopy Group,Bothell WA)上以20x放大倍数取图像，使用标准血细胞计数器手工计数细胞。对于温度依赖性脱附，通过于室温或4℃轻轻振荡温育从表面释放细胞。在接种后24小时从pNIPAM/PSTY二嵌段共聚物ECM功能化表面释放细胞片层。
表1：重组蛋白片段序列
实施例1
部分(a)：2-(丁基硫代硫羰基硫代)丙酸甲酯的合成
在氮气氛下向1-丁硫醇(10mL,0.093mol)和TEA(14.3mL,0.103mol)在DCM(100mL)中的搅拌溶液于0℃经30分钟逐滴加入二硫化碳(6.18mL,0.103mol)的DCM(50mL)溶液。在添加期间溶液逐渐变黄。在添加完成后将溶液在室温搅拌1小时。然后将MBP(11.5mL,0.103mol)的DCM(50mL)溶液经30分钟逐滴加入所述溶液中，并搅拌2小时。在氮气氛下除去DCM并将残余物溶于二乙醚。将该溶液用冷10％HCl溶液(3×50mL)和MilliQ水(3×50mL)洗，然后经无水MgSO4干燥。在真空下除去溶剂，残余的黄色油通过柱色谱纯化(9：1石油醚/乙酸乙酯于二氧化硅上，第二条带)。
1H NMR(CDCl3)ppm 0.92(tr,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.43(mult,J＝7.5Hz,2H,CH2),1.62(d,J＝7.5Hz,3H,CH3),1.65(quin,J＝7.5Hz,2H,CH2),3.36(tr,J＝7.5Hz,2H,CH2),3.73(s,3H,CH3),4.84(quad,J＝7.5Hz,1H,CH)；13C NMR(CDCl3)□13.55,16.91,22.02,29.89,36.94,47.68,52.82,171.63(CH-C(＝O)-O),221.99(S-C(＝S)-S)
部分(b)：通过RAFT聚合合成PNIPAM43-SC(＝S)SC4H9
在50ml Schlenk烧瓶中将NIPAM(15g,0.133mol)、RAFT试剂(0.75g 3.0x 10-3mol)和AIBN(50mg,3.0x 10-4mol)溶于30ml DMSO中。将溶液用Ar吹洗30分钟。然后将反应溶液浸没在60℃预热油浴中16小时。通过在冰浴中冷却和将溶液暴露于空气而停止反应。然后将聚合混合物用500ml DCM稀释并用Milli-Q水洗三次。有机相经MgSO4干燥， 过滤，浓缩并在二乙醚中沉淀。过滤后，将黄色粉末在真空下于R.T.干燥48小时(Mn,GPC＝4800)。
1H NMR(CDCl3,298K,500MHz)；6.47(b,聚(NIPAM)重复单元的-NH-C＝O-),3.97(b,聚(NIPAM)重复单元的-NH-CH(CH3)2),4.62(b,1H,-CH-SC(＝S)S-C4H9),3.97(b,聚(NIPAM)重复单元的-NH-CH(CH3)2),3.66(b,3H,CH3O-RAFT残余基团)3.34(b,2H,-SC(＝S)S-CH2C3H7),1.06-2.45(b,聚(NIPAM)主链的亚甲基和次甲基质子),1.12(b,聚(NIPAM)重复单元的甲基质子),0.90(b,6H,RAFT残余基团的甲基质子).
部分(c)：吡啶二硫化物功能化的聚(NIPAM)-PDS的合成
将PNIPAM43-SC(＝S)SC4H9(Mn,GPC＝4800,0.29g,6.0x 10-5mol),AldrithiolTM-2(40mg,1.8x 10-4mol)和TEA(40mg,1.8x 10-4mol)溶于5ml DMF中。将溶液用Ar吹洗20分钟并通过气密注射器加入己胺(40mg,1.8x 10-4mol)。于室温搅拌过夜后，将反应混合物用空气管路吹以除去一些DMF。然后将残余物溶于二氯甲烷并在二乙醚中沉淀。将溶解/沉淀操作重复三次并过滤。然后将聚合物在真空下于室温干燥48小时，生成0.22g白色粉末状产物，产率为75.8％。
1H NMR(CDCl3,298K,500MHz)；δ8.45(b,1H,吡啶质子),7.63(b,2H,吡啶质子),7.13(b,1H；吡啶质子),6.47(b,聚(NIPAM)重复单元的-NH-C＝O-),3.97(b,聚(NIPAM)重复单元的-NH-CH(CH3)2),3.66(b,3H,CH3O-RAFT残余基团)3.46(b,1H,靠近二硫键的次甲基质子),1.36-2.10(b,聚(NIPAM)主链的亚甲基和次甲基质子),1.12(b,聚(NIPAM)重复单元的甲基质子),0.88(b,3H,RAFT残余基团的 甲基质子).
部分(d)：聚(NIPAM)-蛋白质(GFP,Cheery,纤连蛋白和玻连蛋白)缀合的合成
重组蛋白质(GFP和mCherry)或ECM肽(纤连蛋白和玻连蛋白)如文献中所述产生且序列如表1所示。将PNIPAM-PDS溶于Milli-Q水，浓度为10mg/mL。蛋白质已经在溶液中(以不同浓度)。将PNIPAM-PDS溶液加入蛋白质溶液中，使得达到3：1摩尔比。将反应混合物于RT缓慢摇动6小时。缀合效率通过UV-Vis光谱测量。归于与蛋白质缀合后从PNIPAM-PDS释放出来的pyridinthione的在340nm的吸光度用于定量缀合效率。对于GFP、Cherry、纤连蛋白和玻连蛋白，缀合效率分别为100％，97.7％，89.6％和28.0％。然后将溶液对水透析1天(换水三次)并冻干。
部分(e)：RAFT介导的苯乙烯与PNIPAM43-SC(＝S)SC4H9macroCTA和SDS在水中的聚合以制备蜗杆和纳米球
典型的聚合如下：将PNIPAM43-SC(＝S)SC4H9(0.350g,7.4×10-5mol,5wt％),SDS(0.0145g,5.0×10-5mol)和Milli-Q水(6.25g)加入配备有磁力搅拌棒的10mL Schlenk管中。为了溶解聚合物，通过将烧瓶置于冰浴中而将溶液冷却低于PNIPAM的LCST。将聚合物溶液用氩气吹洗40分钟。将苯乙烯(0.350g,3.4×10-3mol,5wt％)和AIBN(0.0012 g,7.3×10-6mol)加入冷却的聚合物溶液中。将反应混合用氩气再吹洗10分钟，并将聚合反应在70℃油浴中加热3小时(SEC:Mn＝8300,PDI＝1.10)。
为制备蜗杆，将3mL乳胶溶液加入预热玻璃小瓶中，其中含60μL甲苯作为塑化剂。将混合物摇动10秒，然后冷却至25℃。然后将水中的聚合物蜗杆冻干以回收粉末状蜗杆。为了制备纳米球，在聚合之后将反应容器通空气以停止反应并于70℃继续加热4小时以除去任何未聚合的STY单体。然后将水中的聚合物纳米球冻干以回收粉末状蜗杆。然后通过TEM表征蜗杆和纳米球(图2)。蜗杆形状的结构在实施例3中称为“p蜗杆”。
部分(f)：PNIPAM-蛋白质和蜗杆或纳米球之间热响应性基质的形成
将冻干的蜗杆(或纳米球)用Milli-Q水于4℃再水化。然后将PNIPAM-蛋白质溶液(4℃)加入蜗杆(或纳米球)悬浮液中并通过摇动混合。然后将溶液加热高于LCST(29℃)以允许PNIPAM-蛋白质在蜗杆(或纳米球)基质表面上的结合。
实施例2
人胚胎干细胞培养
在此所述的所有哺乳动物组织培养试剂都来自Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)，除非另有说明。所用的hESC细胞系为NKX2-5(eGFP/w)(hES3背景，来自Andrew Elefanty和Ed Stanley1的馈赠),H9(WiCell,Wisconsin,MI,USA),MEL1和MEL2(在2中参考)。NKX2-5,MEL1和MEL2由Stem Core Queensland维持，作为在MEF饲养层上的手工传代培养物常规支持，如前所述3。在试验之前，在含有 4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和0.1mM(3-巯基乙醇)(Sigma-Aldrich,Grand Island,NY,USA)的Knockout血清替换培养基中,如前所述4,5使细胞适应单细胞传代，。
部分(a)：人胚胎干细胞附着到功能化PNIPAM/ROD二嵌段共聚物
将35μL p蜗杆(30％w/v)在PBS中的混合物与在PBS中的35μL pVN或pFN(范围从0-50μg的每种ECM聚合物缀合物)合并。将这些溶液于4000rpm旋转30s包被到器官培养皿(15mm直径组织培养表面，BD Biosciences,FranklinLakes,NJ,USA)上。将MEL1或MEL2的单细胞悬液以5×104细胞/皿铺板在培养基中。2小时结合后，用37℃温PBS从表面洗去未结合细胞。在EVOSfl倒置显微镜(Advanced Microscopy Group,Bothell WA)上以20×放大倍数取图像并手工计数细胞6。
在二组分体系中(如图1中)，在水中的蜗杆与聚(NIPAM)-蛋白质混合，其中蛋白质是纤连蛋白、玻连蛋白或整联蛋白结合三肽RGD。包被有纤连蛋白或玻连蛋白功能化聚合物的表面显示出hESC细胞的良好附着(图3A-D)，而带RGD的表面在此情况中则没有(图3E-F)。此外，附着到功能化聚合物的细胞数目可以通过改变聚(NIPAM)-蛋白质的浓度(图3G)直至50μg/孔来调节。随着聚(NIPAM)-蛋白质浓度增加，附着细胞数目相应增加。蜗杆与聚(NIPAM)-蛋白质的组合对于细胞结合是必需的(图3A和C)。
部分(b)：人胚胎干细胞的温度依赖性无酶解离
通过降低温度低于PNIPAM的LCST，hESC无需酶的帮助而从表面脱附。我们在Geltrex包被组织培养板上或在包被有与聚(NIPAM)-蛋白质于4℃混合1小时的蜗杆的盖玻片上于37℃培养细胞24小时。我们在Geltrex包被组织培养板上或在包被有蜗杆/聚(NIPAM)-蛋白质(即蛋白质为纤连蛋白或玻连蛋白)的盖玻片上于37℃培养细胞24小时。将培养物冷却到4℃1小时。于4℃在Geltrex对照表面上温育细胞对细胞形态没有显著影响，没有细胞变圆，这是细胞脱附的显著特征(图4A-C)。相比之下，当附着于蜗杆/聚(NIPAM)-蛋白质表面的细胞低于LCST温育 时，可以观察到显著的细胞变圆，并且许多细胞自发从表面脱附(图4D-I)。然后轻轻吸取培养基可从表面移除剩余的细胞。
部分(c)：人胚胎干细胞片层的生成
以1×106细胞/皿用MEL1或MEL2细胞接种用50μg pVN或pFN如上制备的器官培养皿，并培养24小时以使细胞连接形成。将培养皿从37℃温箱中取出，并置于RT(即低于PNIPAM的LCST)30分钟以使细胞片层释放。还以低细胞密度(1x 105/皿)接种细胞以进一步证实在～4℃温育后低于LCST无酶脱附和释放。包被到器官培养皿上的GeltrexTM(0.5％v/v在DMEM-F12中)用作为对照。于室温温育这些培养物容易地释放细胞片层，其可通过轻轻振荡完全移除(图5)。该方法可使得能够迅速生成小hESC丛，其常用于分化规程。使用该方法可允许生成限定大小的完整细胞丛而无需使用诸如胰蛋白酶和胶原酶的酶类。
实施例3
部分(a)：人胚胎干细胞丛(拟胚体)的形成和解离用pVN和p蜗杆形成hESC 3D拟胚体
MEL1、MEL2和NKX2-5用于在APEL培养基中形成拟胚体(EB)，如前所述7稍加修改使用旋转EB过程。简而言之，于RT将含有3500个细胞的50μL细胞悬液接种到圆底96孔板的每个孔中。将一定浓度的p蜗杆(156μg/mL),pVN(14μg/mL)和bFGF(100ng/mL)加入细胞悬液中。然后将板于37℃以480g离心5分钟。将细胞于37℃在5％CO2和5％O2气氛下温育。在第三天，将EB于RT温育30分钟，然后轻轻吸取以破解EB。图7A-B和图8B-C证实对照细胞和与PNIPAM/ROD二嵌段共聚物/玻连蛋白-PNIPAM温育的细胞能够形成拟胚体。但是，在温度降低后，仅在PNIPAM/ROD二嵌段共聚物/玻连蛋白-PNIPAM存在下培养的拟胚体可以于室温手工解离成小簇(图7C-D)。如图8A所示基于四个类别对EB解离进行评分。
在无聚乙烯醇存在下的旋转EB形成和解离
如前所述制备APEL培养基，除了去除聚乙烯醇(PVA)并且等同体积用F-12营养混合物替换。无PVA的培养基称为AEL。将p蜗杆(0-1560μg/mL)和pVN(0-50μg/mL)加入含100ng/mL bFGF的AEL培养基。在第一天基于密度均一性、球形EB结构和EB边界平滑度对EB作形成效率评分。基于pVN和p蜗杆稀释系列(图8D)，分别选择50μg/mL和1.56ng/mL的最佳浓度用于在缺乏PVA条件下的EB形成。
用pVN和p蜗杆的3D hESC扩增
基于pVN和p蜗杆稀释系列(图8D和E)，分别选择50μg/mL和1.56ng/mL的最佳浓度用于在缺乏PVA条件下的EB形成。NKX2-5、MEL2和H9用于18天的3D多能扩增。用于旋转EB形成的培养基是AEL或含和不含BSA的hESC SFM 8。AEL和hESC SFM分别补充有100和10ng/ml bFGF。将板和细胞于37℃以480g离心5分钟。将细胞于37℃在5％CO2和5％O2气氛下温育。将EB于RT轻轻重悬，使用手工吸取在第三天和第十天传代。用于qPCR和流式细胞术的阳性对照是如所述2在MEF饲养层上在KSR培养基中或无饲养层在培养基中在20μg/cm2VN上的2D培养物。
拟胚体(EB)形态和细胞生长动力学
使用EVOSfl倒置显微镜(Advanced Microscopy Group)在第10、11和18天拍摄EB的亮视野照片。使用Image J(v1.41)以μm测量EB直径。每种条件每次重复测量60个EB的大小，总共每种条件180个。对于细胞计数，使用TrypLE对所选的EB进行解离并用台盼蓝染色以排除死细胞，然后用血细胞计数器计数。代表性的扩增倍数如图9A所概述，且传代前后平均EB大小分布如图9B和C所示。
定量PCR
所用的完整规程紧密符合对进行和报告qPCR结果的最新指南9。RNA提取和DNA去除使用Qiagen RNeasy RNA extraction kit(Qiagen)且在柱DNASE set上进行。简而言之，扩增后在第18天从hESC或如图所示在不同的时间点从分化细胞提取RNA。使用Life Technologies’s Superscript III First Strand Sythesis Supermix将一微克无DNA的 RNA转化为cDNA。在qPCR前将cDNA稀释1：10。用于qPCR的引物序列可见于表2。如所述10使用Applied Biosystems 7500 Fast ThermoCycler和SYBR Green Master Mix进行qPCR。引物-产物特异性通过在逐步熔化曲线分析中存在一个峰而得到证实。相对于在MEF上生长的hESC确定改变倍数示意。使用Pfaffl方法12，将所有感兴趣基因相对于3个看家基因作参考：人0-肌动蛋白，HPRT和GAPDH11。所有试验和qPCR运行一式三份进行。结果如图9D所示。
表2：qPCR引物序列
流式细胞术
解离后将细胞固定在4％福尔马林中并用一抗小鼠IgG1,,抗-Oct-4(2μg/mL)(Merck Millipore)于4℃染色过夜。以1μg/mL使用缀合到Alexa fluor 488的同种型特异性二抗。通过流式细胞术使用带Sampler arm的C6 Accuri流式细胞仪(BD Biosciences)测定多能标志Oct-4的表达。使用CFlow Sampler software(v1.0.264.15,BD Biosciences) 分析数据，结果如图9E所示。
有关图8和9的进一步讨论如下：
图8-二组分PNIPAM体系可被优化以有助于hESC拟胚体的无酶传代：(A)于RT轻轻手工滴定后EB丛分类的实例。使用旋转EB规程在含有p蜗杆(156μg/mL)和pVN(14μg/mL)的APEL培养基中形成EB。在第三天，将EB于RT温育20分钟，然后通过200μL吸管尖以解离。比例尺为1000μm。(B)手工解离后破碎EB的百分比。在有或无如A中定义的p蜗杆/pVN的APEL培养基中形成EB。在第三天，于37℃或于RT手工解离EB并分类为破碎或未破碎。(C)于RT解离后EB丛大小分布。RT解离后，将EB根据大小分成四类，如A所概述。(D)在缺乏PVA条件下在p蜗杆和pVN滴定期间形成的EB的亮视野图像。在缺乏PVA条件下使用旋转包被方法形成EB同时如所示滴定p蜗杆和pVN浓度。在第一天对EB就形成评分1-4，基于形成EB(1)，部分形成(2)，不同程度的丛形成(3)和无形成(4)。形成评分对三次独立试验和每次试验中6份技术重复n＝18取平均。(E)在含p蜗杆和pVN的无PVA培养基中于RT的EB解离。在第三天解离在含p蜗杆(1.56ng/mL)和pVN(50μg/mL)的AEL培养基中形成的EB并如(A)中所概述根据EB丛大小分类。APEL：白蛋白聚乙烯醇必需脂质；PVN：PNIPAM-玻连蛋白；AEL：白蛋白必需脂质。
图9-使用pNIPAM缀合物人胚胎干细胞的多能3D扩增
(A)Nkx2-5hESC作为拟胚体的扩增倍数。以3,500个细胞/聚集体在含和不含BSA和PNIPAM(pVN 50μg/mL和p蜗杆1.56ng/mL)的SP培养基中使用旋转EB法形成EB。在第3和10天通过于RT温育20分钟然后轻轻吸取对EB进行传代。改变倍数是基于在第18天的总细胞数与在第0天的投入细胞数相比。(B)平均EB直径。在第10、11和18天对EB拍照。使用Image J图像分析软件确定EB直径。每次重复每份样品对60个EB测量大小，n＝180。(C)传代前后的EB大小分布。(D)Nanog和Oct4基因表达的qPCR分析。在第18天，从EB提取mRNA并转化为cDNA， 然后进行qPCR测量Oct4和Nanog表达。改变倍数是相对于在MEF饲养层上生长的hESC，并使用三个看家基因(3-肌动蛋白、GAPDH和HPRT)平均。误差条表示三次独立试验的标准偏差。(E)通过流式细胞术测量的Oct4蛋白质表达。SP：StemPro；BSA：牛血清白蛋白；PNIPAM：含pVN 50μg/mL和1.56ng/mL pWORMs的培养物；APEL：白蛋白聚乙烯醇必需脂质；2D VN：在包被有玻连蛋白的组织培养塑料上的hESC；2D MEF：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上生长的hESC。
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