其中areA、pepC和／或pepE基因已被灭活的真菌 发明所属技术领域
本发明涉及不产生蛋白酶的真菌。本发明的真菌作为产生蛋白质的宿主是有用的，所说的蛋白质易于被通常产生的蛋白酶所酶解。因此，本发明包括利用本发明的真菌以高产率产生兴趣蛋白质的方法。本发明也包括产生这种真菌的方法以及用于这些方法中的DNA构建体。
【发明背景】
真菌(尤其是丝状真菌)在商业上广泛地被使用，这是因为它们具有分泌很高水平的蛋白质的能力。
在丝状真菌中，属于曲霉属的物种用于产生内源性蛋白质(后来也用于产生异源蛋白质)的商业用途已具有很长的历史。
大多数微生物用于产生蛋白质的一个缺点是固有地蛋白酶产生，该蛋白酶使目的产物降解(由于蛋白酶解)。
已研究了避免这一现象发生的各种方法。在这些解决方案中，已经有人提出缺失或破坏编码各种蛋白酶的基因。遗憾地是，真菌产生大量种类的蛋白酶，使得这种解决方案或多或少地有些不现实。
因此需要寻求显示出没有蛋白酶产生或十分低水平的蛋白酶产生的丝状真菌菌株。
一些年来，已知调节基因araA(在构巢曲霉中其介导氮代谢物阻抑)影响胞外蛋白酶的产生(Arst & Cove，molec．gen．Genet．126，(1973)111-141)。
已克隆了构巢曲霉的araA基因(Caddick等，EMBO杂志5，(1986)1087-1090)，并且已对它进行了各种修饰，以评价在由这一基因编码的激活物蛋白质中不同区的功能(Stankovitch等，分子微生物学7，(1993)81-87)。此外，最近似乎已克隆了在烟曲霉中编码相应功能的基因(Hensel等，真菌遗传学的第二次欧洲会议，1994年4月28日至5月1日，摘要册，E11)。
从文献中，基因型argB areAl的构巢曲霉菌株作为产生t-PA的宿主的单一用途是已知的(Upshall等，生物技术5，(1987)1301-1304)。在这一例子中，仅argB基因型通过其精氨酸原养型用作选择标记，而araA基因型只是巧合。
国际专利出版物号WO 95／35385公开了作为在丝状真菌中减少蛋白酶水平的一种手段的araA基因的缺失方法。
除胞外蛋白酶之外，真菌也产生一些胞内蛋白酶(也称为内质蛋白酶)。
在这些中间，枯草菌素型丝氨酸蛋白酶(由黑曲霉产生，指定为PepC)已有描述，并克隆表达它的基因，在EP574 347和Frederick等，基因，125 57-64(1993)中描述了一种缺失突变体。
在Jarai等，基因，145 171-178(1994)中公开了另一种这样的天冬氨酸型蛋白酶(指定为PepE)。该文献公开了pepE基因的克隆与鉴定，并推测了pepE与pepC基因的调节作用。
本发明的目的是缓解对无蛋白酶的丝状真菌的需要。
发明概要
本发明因而涉及这样的真菌，其中的areA、pepC和／或pepE基因已由重组DNA技术修饰，由此它们不能以提供功能性AreA激活物和功能性PepC和／或PepE蛋白酶的方式表达。
此外本发明涉及产生这样的真菌的方法，所说真菌是通过缺失areA、pepC和／或pepE基因获得的。
这可以通过包括以下步骤的方法获得：
i)克隆兴趣真菌的areA、pepC和／或pepE基因，
ii)产生各包含areA基因、pepC基因和／或pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，
iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和
iv)分离areA-、pepC-和／或pepE-的转化体。
从以上提到的克隆areA、pepC和／或pepE基因获得的信息也可以用于与熟知的反义技术相连系，以构建表达质粒并用它转化兴趣真菌，所说的质粒导致一种RNA分子的合成，该RNA分子互补于从areA基因、pepC基因和／或pepE基因转录的mRNA。
此外，本发明涉及意欲用于以上提到的方法中的DNA构建体。
另外，本发明涉及产生所需蛋白质或基因产物(尤其是分泌蛋白质)的方法，该方法为在合适的条件下在适当的生长培养基中培养真菌，并回收和纯化所说的所需基因产物，其中所说的真菌是用DNA构建体修饰过的和任选转化过的，所说的DNA构建体包含至少一种编码兴趣蛋白质或基因产物的DNA序列。
当完成本发明时，惊人地发现本发明的真菌以得到很大改进的产率产生这样的分泌蛋白质。
也惊人地发现，能够使米曲霉areA-菌株生长良好的仅有的氮源是谷氨酰胺。
本发明还涉及用上述方法产生的蛋白质产物。
本发明也涉及编码米曲霉pepC基因或其功能性等位基因的DNA序列(SEQ ID No．1)。
本发明也包括米曲霉PepC蛋白酶(SEQ ID No．2)，以及产生PepC蛋白酶的方法，该方法包括用编码PepC蛋白酶的DNA序列的DNA构建体转化合适的宿主，选择能够产生所说的PepC蛋白酶的转化体，在适当的生长培养基中培养所说的转化体，并且从所说的培养物中回收所说的PepC蛋白酶。
此外，本发明涉及编码米曲霉pepE基因或其功能性等位基因的DNA序列(SEQ ID No．3)。
同时，本发明涉及米曲霉PepE蛋白酶(SEQ ID No．4)，以及产生PepE蛋白酶的方法，该方法包括用编码该蛋白酶的DNA序列的DNA构建体转化合适的宿主，选择能够产生所说的PepE蛋白酶的转化体，在适当的生长培养基中培养所说的转化体，并且从所说的培养物中回收所说的PepE蛋白酶。
按照这些方面，所说的宿主优选地是按照本发明的真菌，尤其是米曲霉，并且其中所说的DNA构建体提供编码所说PepC或PepE蛋白酶的基因的一个额外拷贝。
附图简要描述
参照实施例和附图，在说明书的以下部分中详细描述本发明，其中
图1显示了HowB101的构建中所涉及的步骤，
图2显示了pToC345的构建，
图3显示了pToC315的构建中所涉及的步骤。
图4图示了pyrG基因的两步基因缺失。
图5显示了pJaL235的构建，
图6显示了pJaL335的构建中所涉及的步骤，
图7显示了pJaL363的构建中所涉及的步骤，
图8显示了pJaLz的构建中所涉及的步骤，
图9显示了pSKS和pSK9的构建，
图10a和10b显示了pToC243和pToC266的构建中所涉及的步骤，
图11显示了pMT1606的构建中所涉及的步骤，
图12显示了pToC56的构建，
图13a和13b显示了pJaL368的构建中所涉及的步骤，和
图14a和14b显示了pToC338的构建。
定义
在本说明书中使用了下列定义：
符号areAD意指其中araA基因被缺失的菌株，类似的符号用于其中pepC和／或pepE基因被缺失的菌株。
符号areA-意指不产生功能性AreA激活物的菌株。术语“功能丧失”也常用于该目的。类似的符号用于不产生功能性PepC和／或PepE蛋白酶的菌株。
术语“反义技术“描述了在例如US 5，190，931中公开的方法。发明详述
如上所述，本发明的第一方面涉及真菌，其中的areA基因已由重组DNA技术修饰，使它不能以提供功能性AreA激活物的方式表达，并且其中的编码胞外蛋白酶PepC和／或PepE的基因已被灭活，使它们不能表达产生功能性蛋白酶。
这一目的具体来说可以通过缺失或破裂areA、pepC和／或pepE基因达到。
在实施例中描述了areA、pepC和／或pepE基因的克隆。
其它真菌的AreA类似物可以通过与一种已知的基因杂交或者通过areA突变体(例如在本说明书中描述的构巢曲霉areA-18或米曲霉areA菌株)的互补作用来克隆。
用于缺失或破坏基因的方法具体地说是在WO 90／00192(Genencor)中有描述。
用于在基因中置换DNA的方法一般来说是已知的，并且该置换可以通置换个基因的一个或多个连续的部分来完成，但是它也可以由定点诱变(产生编码非功能性AreA激活物变体的DNA序列)来达到。
可以达到这样的目的另一种方法是通过利用反义技术。
反义技术以及如何使用它在以上提及的US 5，190，931(纽约大学)中有详细描述。
获得灭活的另一种方法是通过在araA基因内插入额外的DNA，从而导致无功能的激活物蛋白质的表达。
与这一方法相结合，由克隆所提供的信息可以用于制备可被整合进araA基因的DNA构建体，并且甚至用另一种基因(例如pyrG基因)取代araA基因。
避免存在araA激活物的方法是通过干扰表达信号的调节作用，该表达信号调节araA基因自身的表达。
以上所描述的原则可等同地用于pepC和／或pepE基因。
按照本发明，优选的真菌属于选自下组的属，该组包括曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、假丝酵母属(Candida)、顶孢霉属(Acremonium)、镰刀菌属(Fusarium)以及青霉属(Penicillium)。
在这些属中，选自下组的种是优选的，该组包括米曲霉(A．oryzae)、黑曲霉(A．niger)、泡盛曲霉(A．awamori)、A．phoenicis、日本曲霉(A．japonicus)、臭曲霉(A．foetidus)、构巢曲霉(A．nidulans)、T．reesei、T．harzianum、H．insolens、H．lanuginosa、禾谷镰孢(F．graminearum)、腐皮镰孢(F．solani)、产黄青霉(P．chrysogenum)等。
如上所述，本发明也包括产生本发明的第一方面的真菌的方法，其中所说的灭活已由缺失araA、pepC和／或pepE基因获得，该方法包括
i)克隆兴趣真菌的areA、pepC和／或pepE基因，
ii)产生各包含areA基因、pepC基因和／或pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，
iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和
iv)分离areA-、pepC-和／或pepE-的转化体。
因为人们相信，PepC蛋白酶的成熟是由PepE蛋白酶控制的，所以本发明也包括产生本发明的真菌的方法，其中所说的灭活已由缺失araA和／或pepE基因获得，该方法包括
i)克隆兴趣真菌的areA和pepE基因，
ii)产生各包含areA基因和pepE基因中之一的DNA构建体，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入，
iii)用所说的构建体转化所说的真菌，和
iv)分离areA-和pepE-的转化体。
本发明也包括产生真菌的方法，其中所说的灭活已利用反义技术获得，该方法包括
i)构建表达质粒，各个这样的质粒导致一种RNA分子的合成，所说的RNA分子互补于从areA基因、pepC基因和／或pepE基因转录的mRNA，
ii)用所说的表达质粒和适当的标记转化所说的宿主真菌，该表达质粒和标记两者在不同的质粒上或者在相同的质粒上，
iii)用所说的标记选择转化体，和
iv)筛选所选择的转化体，以获得显示AreA、PepC和／或PepE产物的合成降低的菌株。
本发明的另一方面包括用于以上提到的方法中的DNA构建体。
就前述方法而言，所说的DNA构建体可以包含araA、pepC和／或pepE基因，其中一个内部部分已被取代、缺失，或者额外的DNA已被插入。
这些DNA构建体的至少一个也可以进一步包含编码兴趣蛋白质产物的DNA序列，例如以下提到的那些。
就后面的反义方法而言，所说的DNA构建体可以包含连接到功能性启动子上的araA、pepC和／或pepE基因的反向DNA序列，从而使其mRNA至少部分互补于从araA、pepC和／或pepE基因产生的mRNA。
本发明的另一方面涉及一种产生所需基因产物(优选地是分泌产物)的方法，该方法通过在适当的条件下在合适的生长培养基中培养按照本发明的真菌，并回收和纯化所需的基因产物。
在基因产物由异源基因表达的情况下，编码所需基因产物的DNA序列可以是用于产生所说的真菌的DNA构建体的一部分。
然而，通常进行本发明真菌的单独的转化，以便制备能够产生所需产物的真菌。
用于转化真菌的方法是本领域已知的，参见例如EP 0 184 438A2(Gist-Brocades N．V．)和EP专利公开号0 98 993(Novo Nordisk A／S)。
对于本来的产物，这当然是不必要的，但是，为了增加产生量，提供掺入到宿主中的编码兴趣蛋白质的基因的多拷贝可能是有利的。
所需基因产物一般是肽或蛋白质，优选地是酶。
优选的酶选自包括蛋白酶(如胰蛋白酶和凝乳酶)、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、果胶酶等的组。
另一种类型的所需基因产物一般是有治疗活性的肽或蛋白质。
在有治疗活性的肽或蛋白质中，优选的蛋白质选自包括胰岛素，生长激素、胰高血糖素、促生长素抑制素、干扰素、PDGF、因子VII、因子VIII、尿激酶、t-PA、CSF、乳铁蛋白、TPO等。
本发明的另一方面涉及编码米曲霉pepC基因(SEQ ID No．1)、米曲霉pepE基因(SEQ ID No．3)或其功能性等位基因的DNA序列。本发明也包括对应的PepC和PepE蛋白酶和它们的产生方法(优选重组方法)。
在这一方面，本发明涉及用于产生米曲霉PepC蛋白酶或PepE蛋白酶的方法，该方法包括用包含编码兴趣蛋白酶的DNA序列的DNA构建体转化合适的宿主，选择能够产生所说的蛋白酶的转化体，在适当的生长培养基中培养转化体，并且从培养物中回收PepC或PepE蛋白酶。
用于这样一种方法的宿主是按照本发明的上述方面的宿主。
在产生PepC或PepE蛋白酶的方法的某些实施方案中，所说的宿主是米曲霉。在这种情况下，更为理想的是DNA构建体(包含编码蛋白酶的DNA序列)提供已经存在于宿主中的基因的额外的拷贝。
DNA构建体(包含编码蛋白酶的DNA序列)通常也包含调节元件，以便在宿主中适当地表达和加工蛋白酶。
在以下给出的实施例中进一步详细地解释本发明。然而，这些实施例不以任何方式限制由所附权利要求限定的本发明的范围。实施例
材料和方法
菌株
米曲霉，IFO 4177：可从大阪发酵研究所(17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-Ku，大阪，日本)获得。
ToC913：这一菌株的构建在实施例中描述。
基因
araA：这一基因编码一种控制氮分解代谢的调节蛋白质。
pepC：这一基因编码枯草菌素型丝氨酸蛋白酶。
pepE：这一基因编码天冬氨酸蛋白酶。
pyrG：这一基因编码乳清酸核苷-S′-磷酸脱羧酶，一种在尿苷的生物合成中所涉及的酶。
bar：这一基因最初从吸水链霉菌中分离得到，其编码膦丝菌素乙酰转移酶。该酶修饰膦丝菌素(=glufosinate)，从而灭活这一化合物(该化合物对细菌、真菌和植物是毒性的)。
质粒
pUC118：Viera和Mesing，酶学方法杂志，1987 153 3-11。
pSO2：这一质粒的构建在实施例中描述。
pJers4：pSO2在pUC118中的2．0kb亚克隆。pjers4含有功能性米曲霉pyrG基因。
pSO5：在实施例中描述从pSO2构建这一质粒。
pToC56：这一质粒的构建在EP出版物0 98 993中描述。
pToC68：这一质粒的构建在WO 91／17243中描述。
pToC90：p3 SR2的亚克隆，携带作为2．7 kb Xba I片段的构巢曲霉amdS基因[Corrick等，基因1987 53 63-71]，其在pUC19载体[Yannisch-Perron等，基因1985 33 103-119]上，是按照WO 91／17243中描述的方法制备的。
pToC266：这一质粒的构建在实施例中描述。
pToC299：这一质粒的构建在实施例中描述。
pToC338：这一质粒的构建在实施例中描述。
pMT1606：在实施例中描述从pBP1T(B．Straubinger等，真菌遗传学新闻39(1992)：82-83)和p775(EP专利公开号0 98 993)构建这一质粒。
p775：这一质粒的构建在EP专利公开号0 98 993中描述。
p777：这一质粒的构建在EP专利公开号0 98 993中描述。
pHW470：这一质粒的构建在实施例中描述。实施例1克隆和缺失米曲霉pepE基因
通过与黑曲霉基因的交叉杂交克隆米曲霉pepE基因。从PCR反应以700 bp PCR片段获得部分黑曲霉基因，所说的PCR反应使用黑曲霉染色体DNA和pepE特异性引物，该引物是按照由G．Jarai等，基因145(1994)171-178发表的pepE序列制造的。通过DNA测序，显示所说的片段含有pepE序列。在严格条件下其杂交到米曲霉染色体DNA上，Southern分析显示，米曲霉含有单一的类pepE基因。
用基因置换法和两步基因置换法(G．May，在“丝状真菌的应用分子遗传学”(1992) pp．1-25．编者J．R．Kinghorn和G．Turner；BlackieAcademic and Professional)两种方法缺失pepE基因。当米曲霉pyrG基因用作标记时，该米曲霉菌株是pyrG-菌株(由缺失pyrG基因制备的)。克隆米曲霉pepE基因
基本上按照“SuperCosl 粘粒载体试剂盒”的供给者(Stratagene)的说明构建米曲霉粘粒文库。
由标准的方法(Christensen，T．等，生物技术6(1988)1419-1422)从原生质体制备米曲霉IFO 4177基因组DNA。在分离原生质体后，将它们在Labofuge T(Heto)中以2500 rpm离心5分钟进行离心沉淀。如Supercos1粘粒载体试剂盒手册中所述，将沉淀悬浮在10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH8．0)，1mM EDTA，100μg／ml蛋白酶K，0．5％SDS中，DNA制备的其它过程按照试剂盒的说明进行。采用Biorad的CHEF-凝胶装置经电泳分析基因组DNA的大小。在200伏特下用10-50秒脉冲进行1％琼脂糖凝胶电泳20小时。凝胶经溴化乙锭染色并摄影。DNA大小是50-＞100kb。将DNA用Sau3A部分限制性消化。当用以上相同类型的CHEF-凝胶分析测定时，限制性消化的DNA的大小是20-50kb。按照所说的手册制备CsCl梯度分离的SuperCosl载体。同样地按照所描述的方法进行连接和包装。在滴度文库后，将来源于一次连接和包装的所有的包装混合物转染进宿主细胞XL1-Blue MR中，并平板接种到50μg／ml氨苄青霉素LB平板上。获得大约3800个菌落。10个菌落的粘粒制品显示出它们都具有预期大小的插入片段。单个挑取菌落，接种到具有100μL LB(100μg／ml氨苄青霉素)的微量滴定板孔中，并在37℃下培养一夜。将100μl 50％的甘油添加至每一孔中，在-80℃下冻结整个文库。贮存总共3822个菌落。它代表约4．4倍米曲霉基因组。
通过利用适配于微量滴定板一半的具有6乘8针的多针装置，将单个冻结的文库菌落接种到LB-平板(100μg／ml氨苄青霉素)上。制备包含文库中所有克隆的菌落的平板。将平板在37℃培养过夜。将剪切至培养皿大小的灭菌的Whatman 540滤膜置于菌落上，菌落在37℃下再培养2个小时。将滤膜转移到含有200μg／ml氯霉素的LB平板上，平板在37℃下培养一夜。第二天，用0．5M NaOH洗涤滤膜两次(5分钟)，然后用2×SCC洗涤两次(5分钟)。将滤膜用乙醇润湿并通风干燥。
使滤膜与0．7kb32P标记的PCR片段杂交，所述片段含有黑曲霉pepE基因的一部分。通过用两种引物(在DNA序列中相隔700bp)在黑曲霉染色体DNA上进行PCR获得PCR片段。在10×Denhart，5×SSC，0．02MEDTA，1％SDS，0．15 mg／ml polyA以及0．05mg／ml酵母tRNA中于65℃下进行杂交16小时。杂交后，在45℃下用2×SSC，0．1％SDS洗涤滤膜两次，并放置在X-光胶片上。5个菌落与探针杂交，它们中的4个随后经分离的粘粒DNA的Southern分析(利用相同的探针)显示含有米曲霉pepE基因。三种粘粒是相同的，由此分离到两种含有pepE的不同的粘粒克隆，将它们称为7C7和33 C1，以它们在贮存文库中的位置命名。将两个重叠片段，4．3 kb EcoRI片段(pToC299)和2．4 kbHindIII(pToC301)片段亚克隆并部分测序。SEQ ID No．1显示了DNA序列和推定的蛋白酶的氨基酸序列，该基因显示出与黑曲霉基因的强同源性。克隆米曲霉pyrG基因
通过与黑曲霉pyrG基因(W．van Hartingsveldt等，Mol．Gen．Genet206：71-75(1987))交叉杂交克隆米曲霉pyrG基因。在低严格性条件下用1kb黑曲霉pyrG基因的DNA片段探查SauIIIA部分消化的米曲霉IFO4177 DNAλ文库。将阳性克隆的3．8kb HindIII片段亚克隆进pUC118载体。所形成的质粒pSO2显示含有pyrG基因(经黑曲霉pyrG-突变体的互补作用)。构建米曲霉pyrG阴性菌株
从质粒pSO2构建pyrG缺失质粒pSO5，该质粒在各末端含有约1kb的pyrG侧翼序列。用这一构建体转化米曲霉IFO4177，由对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性(pyrG突变体的表型特征)选择转化体。经Southern分析，一种转化体(HowB101)显示出在pyrG基因座上具有预期的缺失。由于是pyrG突变体，HowB101的生长需要尿苷。通过就无尿苷下的生长能力进行筛选，可以用wtpyrG基因转化HowB101。
在HowB101的构建中所涉及的步骤在图1中说明。经基因置换法在米曲霉中缺失pepE基因
构建质粒pToC345，其被设计来用pyrG基因替代pepE基因。
以pToC299为模板进行两个PCR反应；第一套引物是：19819 GAAGATCTGCGCGGATGTACATTGTAG19821 TTAGTCAGAAATTCGTCCCG第二套引物是：19820 CCCAAGCTTCATGCTCGACCAGGGCCTCCT19818 GGTCTGTGTTAACCAAAGAAC
用Bgl II／HindIII切割约800 bp的片段(其是用19819／19821获得的)，并与用19820／19818获得的1．1kb片段一起克隆，用HindIII／PstI切割并连入BglII／PstI切割的pIC19R中(J．L．Marsh等，基因32(1984)481-484)。在唯一的HindIII位点切割所形成的质粒，脱磷酸化插入来源于pJaL335的3．5 kb含pyrG的片段(在实施例2中描述)。pToC345的构建在图2中说明。
利用标准方法以EcoRI切割的pToC345转化HowB101，通过在不添加尿苷的条件下它们的生长能力选择转化体。通过分生孢子再分离一次100个转化体。从再分离平板上的单一菌落收集孢子，重悬于含0．01％曲通X-100的100ml水中。将各转化体和IFO 4177(包括其作为对照)的1ml孢子悬浮液涂布到Whatmann 540滤膜上，该滤膜位于它们各自的YPD平板的顶端。将平板在30℃下温育18小时。从平板上移走滤膜，并且在室温下放置在20％SDS中两小时。然后将它们在600瓦微波炉中烘烤3分钟。接着在10％SDS中洗涤滤膜5分钟，在0．5M NaOH，1．5M NaCl中洗涤两次(每次5分钟)，用0．5M Tris-HCl(pH=7．5)，1．5M NaCl洗涤一次(5分钟)，用20xSSC洗涤一次(5分钟)，并通风干燥。通过标准方法将两套滤膜用他们的32P-标记的探针杂交，将一套与600bp BbuI／HindIII片段杂交，该片段来源于pToC299，含有欲被缺失的pepE基因的一部分。将其它的滤膜与米曲霉tpi基因的DNA片段杂交。可以使用以一个拷贝存在的任何基因(但不是pepE)，因为这是结合到滤膜上的DNA量的对照。
在杂交之后，在65℃用0．1xSS，0．1％SDS洗涤滤膜，经PhospoImager显现结合到滤膜上的放射活性。收集13个转化体用于进一步的分析，因为与对照探针的杂交相比，它们显示很少与pepE探针杂交。由标准方法制备染色体DNA，将EcoRI限制消化的DNA的Southern印迹与32P-标记的1．1 kb BbuI片段杂交，所说片段来源于pToC299，含有没有被缺失的pepE基因的3’部分。在wt菌株中，4．3kb片段应该与探针杂交，在正确置换的菌株展中，4．3kb片段应该由7．2kb片段所置换。在两个看上去正确的转化体，一个根本没有杂交带，另一个具有wt带以及可能的一个其它带，说明转化的DNA整合在非同源基因座上。
为了分离pepE缺失菌株的pyrG-衍生物，把107个分生孢子涂布在包含FOA在平板上，选择抗性菌落。再分离FOA抗性菌落，制备DNA，并进行Sonthern分析，以鉴别其中pyrG基因丧失(经侧翼于pToC345中的基因的重复序列之间的重组)的菌株。通过两步基因置换法缺失米曲霉中的pepE基因
构建质粒pToC315，其设计来用于pepE基因的两步基因缺失。将含有pepE基因上游序列的pToC299的1．6kb EcoRI／HindIII(通过用DNA聚合酶的克列诺片段处理使HindIII位点成为平端)与含有pepE基因3’末端的1．4 kb SalI／BbuI(BbuI片段是平端化的)一起克隆进EcoRI／SalI切割的载体pUC19中。在pUC19接头中的唯一的HindIII位点切割所形成的质粒，脱磷酸化，插入来源于pJers4的含1．8kb pyrG的片段。pToC315的构建在图3中说明。
利用标准方法以pToC315转化HowB101，通过在不添加尿苷的条件下它们的生长能力选择转化体。在再分离后，从12个转化体制备染色体DNA，用Asp718切割DNA，并以含有部分pepE基因的pToC3的BbuI片段作为放射性标记探针，用Southern分析进行分析。一个转化体具有整合到内源性pepE基因中质粒，如由pepE特异性Asp 718片段消失(其已经被两个新的带所替代，如所预料的，在pToC315已由同源重组在pepE基因座上以单一拷贝整合时)揭示的。该转化体被命名为ToC1089。将ToC1089的5×107个分生孢子涂布在选择pyrG基因丧失的包含5-氟-乳清酸的平板上。这是两步基因缺失中的第二个步骤，pyrG基因可以通过与两对相同序列(其中之一也导致pepE基因的缺失)之一的重组丧失掉。图4中描述这一方法。5-氟-乳清酸的抗性的频率是大约10-5。再分离5-氟-乳清酸抗性菌落，经Southern分析鉴别缺失pepE基因的菌株。实施例2克隆和断裂米曲霉丝氨酸蛋白酶pepC
通过与黑曲霉基因的交叉杂交克隆米曲霉pepC基因。从PCR反应以1．1kb PCR片段获得黑曲霉基因，所说的PCR反应使用黑曲霉染色体DNA和pepC特异性引物，该引物是按照由Frederick G．D等，基因125(1993)57-64发表的pepC序列制备的。通过DNA测序，所说的片段显示含有pepC序列。在严格条件下其杂交到米曲霉染色体DNA上，Southern分析显示，米曲霉含有单一的类pepC基因。
用两步基因置换法(G．May，在“丝状真菌的应用分子遗传学”(1992)pp．1-25．编者J．R．Kinghorn和G．Turner；Blackie Academic andProfessional)缺失pepC基因。在米曲霉pyrG基因用作标记时，该米曲霉菌株是pyrG-菌株(通过缺失pyrG基因制备)。克隆黑曲霉丝氨酸蛋白酶pepC
从已出版的编码黑曲霉pepC的cDNA核苷酸序列(Frederick G．D等，基因125(1993)57-64)设计两种寡核苷酸，以便在PCR反应中扩增pepC基因的编码部分。这里制备引物#5258(5’-CTAGGATCCAAGGCATTTATGAAGGGCATCCTCGGCCTTTCC)，核苷酸序列的3’末端相应于pepC基因的N-端部分(下划线)，5’末端是为了易于克隆(含有BamHI限制性内切核酸酶位点)。这里制备引物#5259(5’-CTACTCGAGTCAAAAAAAAACCAAGTCTTCCGATCTACG)，核苷酸序列的3’末端相应于pepC基因的C-端部分(下划线)和5’末端是为了易于克隆(含有XhoI限制性内切核酸酶位点)。
在PCR反应中将黑曲霉基因组DNA用作模板。扩增反应在包含2．5单位Taq-聚合酶，100ng黑曲霉基因组DNA，50mM KCl，10mMTris-HCl(pH 8．0)，1．5mM MgCl2，250nM各种dNTP以及以上描述的两种引物各100pM的100微升总体积中进行。
扩增反应在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中进行，并且由在94℃下3分钟的1个循环，接着在94℃下1分钟，55℃下30秒钟和72℃下1分钟的25个循环组成。PCR反应产生一个长度约1．1 kb的DNA片段。采用分子生物学领域已知的标准方法经凝胶电泳分离这一片段，纯化，克隆进载体pCR°II(Invitrogen公司)并测序。所形成的质粒称为pJaL197。克隆米曲霉丝氨酸蛋白酶pepC
将米曲霉IFO 4177基因组DNA的Southern印迹与pJaL197克隆的32P标记的EcoRI DNA片段(含有黑曲霉pepC基因)杂交。用下列限制酶切割基因组DNA：EcoRI，BamHI，XhoI以及HindIII。杂交在65℃下在包含下列物质的溶液中进行16小时：10xDenhart，5xSSC，0．02MEDTA，1％SDS，0．15mg／ml polyA以及0．05mg／ml酵母tRNA。在杂交之后，在65℃下用2xSSC，0．1％SDS洗涤滤膜两次，并置于X-光胶片上。在4个消化物的每一个中，该探针杂交到单一大小的片段上，表明pepC基因以单拷贝存在于米曲霉IFO 4177中。
构建米曲霉基因组DNA的部分文库(包含具有4．5-5．5kb大小的BamHI片段)，并连接到载体pIC19H上。放射性标记上述黑曲霉pepC基因克隆，并用于探查部分米曲霉BamHI基因组文库。如上所述进行杂交。筛选约4000个大肠杆菌菌落，获得4个阳性克隆。经限制酶消化分析，显示这4个克隆是相同的。这些克隆中的一个被成为pJaL235(图5)，具有4．6kb插入片段，用限制性作图和Southern印迹进一步分析该克隆。该克隆显示pepC基因位于2．9kb BamHI／SalI片段中。这一2．9kbBamHI／SalI片段的测序揭示存在一个495个氨基酸长的开放读框，其由具有指示内含子剪接的共有序列的2个内含子所间断。米曲霉pepC基因的序列在SEQ ID No．3中显示。构建侧翼有重复序列的米曲霉基因
采用以下两种引物经PCR在质粒pSO2上扩增一个432bp的片段，所说的引物是引物#7659(5’-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC)和引物#7656(5’-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC)，在前者中，核苷酸序列的3’末端相应于pSO2中的7-26位(下划线)，5’末端用来帮助克隆(含有BglII限制性内切核酸酶位点)，在后者中，核苷酸序列的3’末端相应于pSO2中的385-407位(下划线)，5’末端用来帮助克隆(含有EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶位点)。以BglII和EcoRI消化该片段，经凝胶电泳分离，纯化并克隆到pSO2中的相应位点，形成质粒pJaL335(其构建在图6中概述)。构建米曲霉pepC断裂质粒
以PvuI消化质粒pJaL235，并且用Klenow聚合酶处理，以制造平端，然后以HindIII消化。经凝胶电泳分离2．6kb片段，并纯化。将2．6kb片段克隆进以SmaI和HindIII消化的pUC12中，产生质粒pJaL308。
以SmaI消化质粒pJaL308，并且按照制造商的说明用细菌碱性磷酸酶处理(以除去5’磷酸基)，用苯酚提取并沉淀。
以HindIII消化质粒pSO2，并且用Klenow聚合酶处理，以制造平端。经凝胶电泳分离编码米曲霉pyrG基因的3．8kb片段，并纯化。
将两种片段混合在一起并连接。在转化大肠杆菌后，经小质粒制品的限制性酶切分析鉴别携带有正确质粒的菌落。pJaL363的构建在图7中说明。
质粒pJaL3包含pUC12载体，该载体含有携带侧翼有EcoRI位点和HindIII的pepC基因的片段，其中的pepC由编码米曲霉pyrG基因的3．8kbDNA间断。
以HindIII消化质粒pJaL335，并且用Klenow聚合酶处理，以制造平端。经凝胶电泳分离编码米曲霉pyrG基因的3．5kb片段，并纯化。将该片段克隆进pJaL308的SmaI限制酶切位点。pJaLz的构建在图8中概述。该质粒包含pUC12载体，该载体含有携带侧翼有EcoRI位点和HindIII的pepC基因的片段，其中的pepC由编码米曲霉pyrG基因的3．8kb DNA间断。转化米曲霉菌株HowB101
用HindIII和EcoRI将15μg断裂质粒之一完全消化，通过在凝胶上展开小份试样检查消化的完全程度，剩下的DNA用苯酚提取，沉淀并重悬于10μl无菌水中。
经原生质体方法(Christensen等，生物技术(1988)6：1419-1422)进行米曲霉HowB101宿主菌株的转化。典型地，将米曲霉菌丝体在富含营养物的培养液中生长。通过过滤从培养液分离菌丝体。将酶制剂Novozyme(Novo Nordisk)添加到菌丝体中，所说的菌丝体在渗透稳定缓冲液中，例如用磷酸钠缓冲至pH5．0的1．2M MgSO4中。在搅拌下于37℃温育悬液60分钟。经mira布过滤原生质体，以除去菌丝体碎片。收获原生质体，并用STC(1．2M山梨醇，10mM CaCl2，10mM Tris-HClpH7．5)洗涤两次。最终将原生质体重悬于200-1000μl STC中。
为了转化，将5μgDNA加至100μl原生质体悬液中，然后加入200μlPEG溶液(60％PEG 4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl pH7．5)，在室温下温育混合物20分钟。收获原生质体，以1．2M山梨醇洗涤两次。最后将原生质体重悬于200ml 1．2M山梨醇中，平板接种到选择性平板(基本培养基+10g／l Bacto-琼脂(Difco))，并于37℃培养。在37℃培养3-4天后，稳定的转化体显示出旺盛的生长和孢子形成性菌落。鉴别pepC缺失菌株
将稳定的菌落个体孢子划线培养在新鲜的基本平板上。选择单一菌落，并再划线培养，产生纯的培养物。将其用于接种10ml液体YPM培养基(1％酵母提取物，1％蛋白胨，2％麦芽糖)。于30℃下在180rpm下振荡18小时之后，将菌丝体收集到滤纸上。然后将菌丝体转移到2ml微量管中，并且冻结干燥。在冷冻干燥之后，从单个菌丝体制备DNA。在试管中用研杵将菌丝体研磨成细小粉末。经涡旋将这种粉末重悬于0．5ml50mM EDTA(pH8．0)，0．2％SDS，1μl DEP中。将其在65℃温育20分钟。然后加入0．1ml5M KAc pH6．5，混合并在冰上温育5分钟。通过在20，000rpm下离心5分钟从DNA溶液分离出细胞碎片。用0．3ml异丙醇沉淀0．4ml上清液，并在20，000rpm下离心10分钟。将DNA沉淀再溶解于100μl包含0．1mg／ml RNA酶A的无菌TE缓冲液中。
以EcoRI消化每一种DNA3μg，经琼脂糖凝胶电泳分级分离，将其转移到Immobilan-N滤膜上，用包含部分pepC蛋白酶基因的pJaL335的1．5kb32P标记的NcoIDNA片段探查。携带有断裂pepC的菌株易于识别，因为3．6kb上的野生型带在转化体中变换成7．4kb带。
将断裂的米曲霉pepC菌株制成pyrG-菌株，通过选择5-氟-乳清酸抗性(pyrG突变体的表型特征)自发突变体进行选择。由于是PyrG突变体，菌株的生长需要尿苷。用wt pyrG基因转化该菌株，通过选择在没有尿苷下的生长能力进行选择。实施例3构建米曲霉areAΔ菌株
areAΔ菌株的构建如下：克隆米曲霉araA基因。用携带pyrG基因(在araA基因上游和下游的DNA片段之间插入)的质粒转化也缺损pepC或pepE或pepC加pepE的pyrG菌株。araA的编码区不存在于质粒上。就它们在缺少尿苷和存在氯酸盐的情况下的生长能力选择转化体。这一双选择法选择功能性pyrG基因和araA-两者。最终经Southern分析筛选由这种选择方法获得的菌株，以鉴别其中染色体araA基因由pyrG基因取代的那些。克隆araA基因
通过与构巢曲霉araA基因(B．Kudla等，EMBO J．9：1355-1364(1990))交叉杂交克隆米曲霉araA基因。通过用SauIIIA部分消化染色体DNA制备米曲霉IFO 4177基因组文库，并将所获得的DNA片段克隆进载体1GEM-II(从Promega获得)。于37℃在40％甲酰胺中完成文库与构巢曲霉araA基因的交叉杂交。分离杂交1的克隆，并从中将片段亚克隆进载体pBluescript SK+(从Stratagene获得)，给出图9中所示的质粒pSK5与pSK9。克隆的基因能够补充构巢曲霉araA突变体，证明它确实是米曲霉araA的同系物。对此克隆的5643 bp测序，米曲霉与构巢曲霉araA基因序列的比较显示它们是高度同源的。米曲霉araA基因序列在SEQID No．5中显示。构建araA缺失质粒
为了从米曲霉染色体缺失araA基因，构建了质粒pToC266。pToC266含有源于araA基因上游的2．1kb DNA片段(从pSK5分离)和源于araA基因下游的1．4kb DNA片段(从pSK9分离)。在基因组中这两个片段被约3．2kb分离，编码区位于基因的这一部分中。将pJers4的米曲霉PyrG基因插入araA上游和下游DNA片段之间。pToC266的构建在图10a和10b中说明。pToC266有一个唯一的EcoRI位点，在用于转化之前，经采用这一限制酶切割线性化。选择米曲霉araA菌株
用线性化的pToC266转化也缺损pepC或pepE或pepC加pepE的pyrG-菌株。在基本平板(Cove，生物化学生物物理学报(1966)113：51-56)上选择转化体，该平板上含有作为氮源的谷氨酰胺，作为碳源的葡萄糖。在相同类型的平板上再分离转化体两次，然后在不同的氮源上进行生长试验。在谷氨酰胺上生长良好(但在硝酸盐，铵或尿素上则不然)的转化体预期是缺失araA的。这一缺失由Southern分析确认。实施例4构建pMT1606
构建了一种质粒，该质粒包含在米曲霉TAKA-淀粉酶启动子之后插入的Streptomyces hygroscopius的bar基因(C．J．Thompson等，EMBO J．6：2519-2523(1987))和其后的包含黑曲霉gla基因的转录终止子和聚腺苷酸化信号的片段。
质粒pMT1606可以用于选择米曲霉的glufosinate抗性转化体。通过从质粒pBP1T(B．Straubinger等，真菌遗传学新闻(1992) 39：82-83)分离bar基因，并将它克隆进真菌表达质粒p775(在EP公开号0 098 993 A1中描述)构建pMT1606。图11说明了pMT1606的构建。实施例5在米曲霉(areAΔ，pepEΔ，pepC-)中产生凝乳酶
通过与pMT1606的共转化，用质粒pToC56(图12)转化米曲霉areAΔ，pepEΔ，pepC-菌株，所述质粒是哺乳动物凝乳酶的真菌表达质粒。质粒pToC56的构建在EP公开号0 98 993中描述。
在包含10mM铵和1mg／ml glufosinate的基本培养基上选择转化体，并且通过产生凝乳酶的能力筛选pToC56的存在。在摇瓶中于30℃下培养转化体4天，摇瓶中具有含麦芽糖糊精和谷氨酰胺的基本培养基。经SDS-Page和Western印迹分析上清液中的凝乳酶含量。实施例6在米曲霉中产生PepC
构建pepC表达质粒。用AatII和NsiI消化质粒pJaL235，并且用Klenow聚合酶处理以制造平端。经凝胶电泳分离1．7kb片段，并纯化。将1．7kb片段克隆进用SmaI消化的pIC19H，给出pJaL365。
用BamHI和XhoI消化质粒pJaL365，经凝胶电泳分离1．7kb片段，并纯化。将1．7kb片段克隆进用BamHI和XhoI消化的pToC68，给出pJaL368(图13a和13b)。
通过与pToC90的共转化，用质粒pJaL368转化米曲霉菌株，该质粒是蛋白酶PepC的真菌表达质粒。
在包含10mM乙酰胺的基本培养基上选择转化体，并且通过产生蛋白酶PepC的能力筛选pJaL368的存在。实施例7超量表达pepE
构建了称为pToC338的质粒，其携带有融合进米曲霉TAKA-淀粉酶启动子的pepE基因。图14a和14b描述这一构建过程。
将pToC299的EcoRI／SalI片段(含有pepE的大多数的编码区和约430bp的3’非翻译区)与具有下列序列的合成DNA片段一起克隆进EcoRI／BamHI切割的pUC19中：8681 GATCCACCATGAAG8747 GTGGTACTTCAGCT
用BamHI／EcoRI切割所形成的称为pToC334的质粒，分离含有pepE的整个结构基因的片段，其具有融合在紧靠起始密码子的上游的BamHI位点。约430 bp非翻译3’序列也存在于该片段中。将该片段与质粒p775的大约1．1kb SalI／BamHI片段(含有米曲霉TAKA-淀粉酶启动子)一道克隆进EcoRI／SalI切割的pUC19中。所形成的质粒命名为pToC338。
利用标准方法(例如在EP 0 098 993 A1中描述的)，将pToC338与pToC90(含有构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因)共转化进米曲霉JaL125(米曲霉alp阴性菌株，在丹麦专利申请0354／96中描述)中。通过它们利用作为唯一氮源的乙酰胺的能力选择转化体。通过分生孢子再分离11个转化体。在10ml YPM(具有2％麦芽糖的YP)中于30℃下发酵培养转化体3天，通过SDS-page分离发酵液。一种转化体产生与由pepE基因编码的蛋白质大小相同的蛋白质，蛋白酶活性测量证实来源于这一转化体的培养液与宿主菌株JaL125相比，在pH5．5下具有对酪蛋白的较高活性。纯化所说的蛋白质，N端测序显示它确实是pepE基因编码的蛋白质。该分泌蛋白质的N端是：gly*-arg-his-asp-val-leu-val-asp-asn-phe-leu-asn-ala-gln-tyr-phe-ser-glu-ile-glu-ile-gly-thr-pro-pro-gln-lys-phe-lys*这一残基也可以是赖氨酸。这证实了PepE蛋白酶的表达。
序列表(1)一般信息： (i)申请人：
(A)名称：Novo NordiskA／S
(B)街道：Novo Aile
(C)城市：Bagsvaerd
(E)国家：丹麦
(F)邮区代码(ZIP)：DK-2880
(G)电话：+45 4444 8888
(H)传真：+45 4449 3256 (ii)发明名称：新的微生物 (iii)序列数：12 (iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1．0，版本#1．30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息： (i)序列特征：
(A)长度：2454个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(A)生物体：米曲霉(ix)特征：
(A)名称／关键词：外显子
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(A)名称／关键词：mat_肽
(B)位置：603．．2001(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GCGCGGATGT ACATTGTAGG TACATGGATA GTATGTACTG TATATACCGT CATTTAGTAA 60GGCAACTAAC TAACTTATCA GCCTAGCTCC CGAGACGGCC TTACATCATC CGCAGCGGCA 120ATCAGCTCCA CACCCTTGGA TAGTGATAAG AGACACAAGG AGTTCTGAGT ATGGTATTAT 180AAGTGCAGTG AGTTGGGATG AAACAGAGAG ATAGAGGGAA TACTCCTATT TATCAATGAA 240CGTATACAGA CATACCCCAG CAGCGTTCCT GGCGGTATTG TAAAAGGGCC GTACCTTGGA 300GATCAAGTGA TGAGACACCC GTGATGCAGG AACTCCACTT CAATCCAATG ACGCATCGAG 360TTGCTCCCTG ATTGGTTGAT ACGCAGGTCG CTCCGCAACC GGTCCGCATC ACCTCACTTC 420CCTCCCCCAG ACCTGGAGGT ACCTCTCCCG TCCTTCTCTC CCTCTCCATC CCATCATCTA 480TCCCTCTCCA GACCCTGATT GTATTTCATC ATTCCTATCG TCCCATATTA ATAGAGTATT 540GCTAGTTTTC TTTTGATTTC GTCTGTTGAG GTGCTGCTTT TTTGTCGCCG TTGTCGCCCA 600CC ATG AAG TCG ACC TTG GTT ACG GCC TCT GTG CTG TTG GGC TGT GCT 647 Met Lys Ser Thr Leu Val Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Cys Ala
1 5 10 15TCC GCC GAG GTT CAC AAG CTG AAG CTC AAC AAG GTG CCC GTG TCC GAG 695Ser Ala Glu Val His Lys Leu Lys Leu Asn Lys Val Pro Val Ser Glu 20 25 30CAA TTT GTGAGTAGAC CTTACTATTC CGGCCATGAA AATATTCATC TACCCATCTG 751Gln PheAAAGCTTGTC GGGACGAATT TCTGACTAAA TCGTATCCAG AAC TTG CAC AAC ATC 806 Asn Leu His Asn IleGAC ACC CAT GTG CAG GCT CTC GGC CAG AAG TAC ATG GGA ATC CGT CCC 854Asp Thr His Val Gln Ala Leu Gly Gln Lys Tyr Met Gly Ile Arg Pro 40 45 50AAC ATC AAG CAA GAT CTT CTC AAT GAG AAC CCG ATT AAC GAT ATG GGA 902Asn Ile Lys Gln Asp Leu Leu Asn Glu Asn Pro Ile Asn Asp Met Gly55 60 65 70CGT CAT GAT GTC CTT GTT GAC AAC TTC CTG AAT GCA CAA T 942Arg His Asp Val Leu Val Asp Asn Phe Leu Asn Ala Gln 75 80GTACGAAACC CTAGTAATAC TTGAAGGGGG GCTCCAACTT ACGCGTAGAT TCTCTAAAG AC 1003 TyrTTC TCC GAA ATC GAG ATC GGT ACT CCT CCA CAG AAG TTC AAG GTG GTC 1051Phe Ser Glu Ile Glu Ile Gly Thr Pro Pro Gln Lys Phe Lys Val Val85 90 95 100CTT GAC ACT GGC AGC TCA AAC CTA TGG GTG CCC TCT TCG GAG TGT GGT 1099Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ser Glu Cys Gly 105 110 115TCT ATC GCC TGC TAT TTG CAT AAC AAG TAC GAC TCA TCC TCG TCC TCC 1147Ser Ile Ala Cys Tyr Leu His Asn Lys Tyr Asp Ser Ser Ser Ser Ser 120 125 130ACG TAC CAG AAG AAT GGC AGC GAA TTT GCC ATC AAG TAC GGC TCT GGT 1195Thr Tyr Gln Lys Asn Gly Ser Glu Phe Ala Ile Lys Tyr Gly Ser Gly 135 140 145AGC CTG AGT GGT TTT GTT TCT CAG GAT ACT CTC AAG ATC GGT GAC CTG 1243Ser Leu Ser Gly Phe Val Ser Gln Asp Thr Leu Lys Ile GIy Asp Leu
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305GCC AAG AAG GGC TTC ACC GGC CAA TAC TCG GTT GAC TGT GAC AAG CGC 1777Ala Lys Lys Gly Phe Thr Gly Gln Tyr Ser Val Asp Cys Asp Lys Arg 310 315 320GAT TCC TTG CCT GAC CTC ACC TTC ACC CTG AGC GGA TAC AAC TTC ACC 1825Asp Ser Leu Pro Asp Leu Thr Phe Thr Leu Ser Gly Tyr Asn Phe Thr 325 330 335ATT GGT CCC TAC GAC TAC ACT CTT GAA GTC CAG GGA TCT TGC ATC AGC 1873Ile Gly Pro Tyr Asp Tyr Thr Leu Glu Val Gln Gly Ser Cys Ile Ser340 345 350 355GCC TTC ATG GGC ATG GAC TTC CCT GAA CCC GTT GGC CCC TTG GCC ATC 1921Ala Phe Met Gly Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro Leu Ala Ile 360 365 370CTG GGT GAC GCG TTC CTC AGG AAG TGG TAC AGT GTG TAC GAC CTC GCC 1969Leu Gly Asp Ala Phe Leu Arg Lys Trp Tyr Ser Val Tyr Asp Leu Ala 375 380 385AAC GGT GCT GTT GGC CTG GCC AAG GCT AAG TAACCAAGTA ATCTACCATG 2019Asn Gly Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys
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(i)序列特征：
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(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Ser Thr Leu Val Thr Ala Ser Val Leu Leu-Gly Cys Ala Ser 1 5 10 15Ala Glu Val His Lys Leu Lys Leu Asn Lys Val Pro Val Ser Glu Gln 20 25 30Phe Asn Leu His Asn Ile Asp Thr His Val Gln Ala Leu Gly Gln Lys 35 40 45Tyr Met Gly Ile Arg Pro Asn Ile Lys Gln Asp Leu Leu Asn Glu Asn 50 55 60Pro Ile Asn Asp Met Gly Arg His Asp Val Leu Val Asp Asn Phe Leu 65 70 75 80Asn Ala Gln Tyr Phe Ser Glu Ile Glu Ile Gly Thr Pro Pro Gln Lys 85 90 95Phe Lys Val Val Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser 100 105 110Ser Glu Cys Gly Ser Ile Ala Cys Tyr Leu His Asn Lys Tyr Asp Ser 115 120 125Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Gln Lys Asn Gly Ser Glu Phe Ala Ile Lys 130 135 140Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Phe Val Ser Gln Asp Thr Leu Lys145 150 155 160Ile Gly Asp Leu Lys Val Lys Asp Gln Leu Phe Ala Glu Ala Thr Ser 165 170 175Glu Pro Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Arg Phe Asp Gly Ile Leu Gly
180 185 190Leu Gly Phe Asp Thr Ile Ser Val Asn Lys Ile Pro Pro Pro Phe Tyr 195 200 205Ser Met Leu Asp Gln Gly Leu Leu Asp Glu Pro Val Phe Ala Phe Tyr 210 215 220Leu Gly Asp Thr Asn Lys Glu Gly Asp Asp Ser Val Ala Thr Phe Gly225 230 235 240Gly Val Asp Lys Asp His Tyr Thr Gly Glu Leu Val Lys Ile Pro Leu 245 250 255Arg Arg Lys Ala Tyr Trp Glu Val Asp Leu Asp Ala Ile Ala Leu Gly 260 265 270Asp Ser Val Ala Glu Leu Asp Asn Thr Gly Val Ile Leu Asp Thr Gly 275 280 285Thr Ser Leu Ile Ala Leu Ala Thr Thr Leu Ala Glu Leu Ile Asn Lys 290 295 300Glu Ile Gly Ala Lys Lys Gly Phe Thr Gly Gln Tyr Ser Val Asp Cys305 310 315 320Asp Lys Arg Asp Ser Leu Pro Asp Leu Thr Phe Thr Leu Ser Gly Tyr 325 330 335Asn Phe Thr Ile Gly Pro Tyr Asp Tyr Thr Leu Glu Val Gln Gly Ser 340 345 350Cys Ile Ser Ala Phe Met Gly Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro 355 360 365Leu Ala Ile Leu Gly Asp Ala Phe Leu Arg Lys Trp Tyr Ser Val Tyr 370 375 380Asp Leu Ala Asn Gly Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys385 390 395(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：3224个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：否
(iv)反义：否
(vi)原始来源：
(A)生物体：米曲霉
(ix)特征：
(A)名称／关键词：外显子
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(A)名称／关键词：内含子
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(A)名称／关键词：外显子
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(A)名称／关键词：内含子
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(A)名称／关键词：外显子
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(A)名称／关键词：mat肽
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(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：连接处(388．．756，818．．1753，1815．．1997) (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GGATCCATTA CCCTCTTACC GCCATACCCC AGGTCTTGCG ACCGCGCTAA TCGGGAGCGA 60TCGACGCGCG GCACCTCCTC AGTAAAGCTG TGTCATCATT GTAAATTACC GTATCCCGGT 120TGCATCATCC TCCGCTGCCC TTGCCTGCTT GGGGGATCGA CCTATTAAGC CCAGCTATCT 180TACACCTGCT CCCATCCTCC TCTTCTCCAA CTCCTCATCC ATCCTTCCTC CTCCTTCTTC 240CTTTTAACCC CCCCAACTCA GCATCGTTCC ATCCTCCCAT CTTTCCTTTC TTTTTACCTC 300AAATCTCCAT CTGTATTCTT TCCTCTTAGA ACTCTTCCTT TCCCCCCTTC TGTACCTTGT 360GTTTAGACGT CACTCTTGTT GCCCATC ATG AGA GGC ATC CTC GGC CTT TCC 411 Met Arg Gly Ile Leu Gly Leu Ser 1 5CTG CTG CCA CTA CTA GCA GCG GCC TCC CCC GTT GCT GTT GAC TCC ATC 459Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Val Asp Ser Ile 10 15 20CAC AAC GGA GCG GCT CCC ATT CTT TCG GCC TCA AAT GCC AAA GAG GTT 507His Asn Gly Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Ser Asn Ala Lys Glu Val25 30 35 40CCA GAC TCT TAC ATT GTC GTC TTC AAG AAG CAT GTT TCC GCT GAA ACG 555Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe Lys Lys His Val Ser Ala Glu Thr
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(i)序列特征：
(A)长度：496个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Arg Gly Ile Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15Ser Pro Val Ala Val Asp Ser Ile His Asn Gly Ala Ala Pro Ile Leu 20 25 30Ser Ala Ser Asn Ala Lys Glu Val Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe 35 40 45Lys Lys His Val Ser Ala Glu Thr Ala Ala Ala His His Thr Trp Val 50 55 60Gln Asp Ile His Asp Ser Met Thr Gly Arg Ile Asp Leu Lys Lys Arg65 70 75 80Ser Leu Phe Gly Phe Ser Asp Asp Leu Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ala Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu 100 105 110Asp Val Ile Glu Gln Val Arg Arg His Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu 115 120 125Lys Asp Thr Glu Val His Thr Met Glu Glu Thr Thr Glu Lys Asn Ala 130 135 140Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Ser Phe Gly145 150 155 160Thr Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp 165 170 175Ala Tyr Thr Ile Asp Thr Gly Ile Asn Ile Glu His Val Asp Phe Glu 180 185 190Asp Arg Ala His Trp Gly Lys Thr Ile Pro Ser Asn Asp Glu Asp Ala 195 200 205Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Ile Ala Gly Lys 210 215 220Lys Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn Ile Tyr Ala Val Lys Val Leu225 230 235 240Arg Ser Ser Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Leu Gly Val Glu 245 250 255Trp Ala Val Gln Ser His Leu Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asp Ala 260 265 270Lys Val Lys Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly
275 280 285Ala Lys Ser Arg Thr Leu Glu Ala Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala 290 295 300Gly Leu His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys305 310 315 320Asn Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Ser 325 330 335Thr Leu Gln Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Lys Cys Thr 340 345 350Asp Ile Phe Ala Pro Gly Pro Asn Ile Leu Ser Thr Trp Thr Gly Ser 355 360 365Lys His Ala Val Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His 370 375 380Ile Ala Gly Leu Leu Ala Tyr phe Val Ser Leu Gln Pro Ala Gln Asp385 390 395 400Ser Ala Phe Ala Val Asp Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp 405 410 415Ile Ile Ser Ile Ala Thr Gln Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asp 420 425 430Thr Pro Asn Leu Leu Ala Trp Asn Gly Gly Gly Ala Asp Asn Tyr Thr 435 440 445Gln Ile Val Ala Lys Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Ser Asp Asn Leu Lys 450 455 460Asp Arg Phe Asp Gly Leu Val Asn Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Glu465 470 475 480Glu Leu Gly Ala Ile Tyr Ser Glu Ile Gln Gly Ala Val Val Ala *
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(i)序列特征：
(A)长度：5643个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：否
(iii)反义：否
(vi)原始来源：
(A)生物体：米曲霉
(B)菌株：IFO4177
(ix)特征：
(A)名称／关键词：内含子
(B)位置：2701．．2769
(ix)特征：
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：连接处(2282．．2700，2770．．4949)
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20 25 30CGC TCC TCC AAC AAC CTC CCC CCT ACC TCC TCG CAG CTG TCC GAT GAC 2422Arg Ser Ser Asn Asn Leu Pro Pro Thr Ser Ser Gln Leu Ser Asp Asp 35 40 45TTT TCT TTC GGT TCC CCT CTG AGC CCC GCC GAC TCA CAG GCC CAT GAC 2470Phe Ser Phe Gly Ser Pro Leu Ser Pro Ala Asp Ser Gln Ala His Asp 50 55 60GGC CTA CTT CAG GAC TCC CTC TTC CCT GAA TGG GGG TCT GGT GCG CCT 2518Gly Leu Leu Gln Asp Ser Leu Phe Pro Glu Trp Gly Ser Gly Ala Pro 65 70 75CGA CCC GGC ATT GAC AGT CCG GAT GAG ATG CAG AGG CAA GAT CCG CTA 2566Arg Pro Gly Ile Asp Ser Pro Asp Glu Met Gln Arg Gln Asp Pro Leu80 85 90 95GCG ACT CAA ATA TGG AAG CTC TAT TCT AGG ACC AAG GCC CAG TTG CCC 2614Ala Thr Gln Ile Trp Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Lys Ala Gln Leu Pro 100 105 110AAC CAG GAG CGT ATG GAA AAC CTG ACC TGG CGG ATG ATG GCG ATG AGT 2662Asn Gln Glu Arg Met Glu Asn Leu Thr Trp Arg Met Met Ala Met Ser 115 120 125TTG AAA CGT AAG GAG CGG GAA CGT GCT CAA CAG TCC AT GTAGGTGTTC 2710Leu Lys Arg Lys Glu Arg Glu Arg Ala Gln Gln Ser Met 130 135 140TCCCTCTGTA GAGGAACGGC TGGACCCGCT CATCATTAAT TTTTTTTTTG TCTGTGAAG G 2770TTT CCT GCG AGA CGC GGT AGC GCT GGC CCC AGT GGT ATC GCT CAA CTG 2818Phe Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Gly Pro Ser Gly Ile Ala Gln Leu 145 150 155CGC ATT TCC GAC CCG CCC GTT GCC ACC GGT AAC CCT CAG TCA ACC GAC 2866Arg Ile Ser Asp Pro Pro Val Ala Thr Gly Asn Pro Gln Ser Thr Asp 160 165 170CTG ACC GCC GAC CCT ATG AAC CTC GAC GAT TTC ATC GTG CCC TTC GAA 2914Leu Thr Ala Asp Pro Met Asn Leu Asp Asp Phe Ile Val Pro Phe Glu 175 180 185TCT CCT TCG GAC CAC CCC TCG CCC AGT GCC GTC AAG ATT TCC GAC TCC 2962Ser Pro Ser Asp His Pro Ser Pro Ser Ala Val Lys Ile Ser Asp Ser 190 195 200ACG GCG TCC GCG GCC ATT CCC ATC AAG TCC CGG AAA GAC CAG CTG AGA 3010Thr Ala Ser Ala Ala Ile Pro Ile Lys Ser Arg Lys Asp Gln Leu Arg205 210 215 220GAT TCT ACC CCG GTG CCG GCC TCG TTC CAC CAT CCG GCT CAG GAT CAA 3058Asp Ser Thr Pro Val Pro Ala Ser Phe His His Pro Ala Gln Asp Gln
225 230 235CGG AAG AAC AGT GAA TTT GGC TAC GTC CCC CGT CGC GTG CGC AAG ACG 3106Arg Lys Asn Ser Glu Phe Gly Tyr Val Pro Arg Arg Val Arg Lys Thr 240 245 250AGT ATC GAC GAG CGT CAA TTT TTC TCA CTG CAG GTG CCG ACC CGA AAG 3154Ser Ile Asp Glu Arg Gln Phe Phe Ser Leu Gln Val Pro Thr Arg Lys 255 260 265CGA CCG GCC GAA TCC TCG CCC CAG GTA CCC CCC GTT TCC AAC TCG ATG 3202Arg Pro Ala Glu Ser Ser Pro Gln Val Pro Pro Val Ser Asn Ser Met 270 275 280TTG GCC CAC GAT CCG GAC CTC GCT TCC GGC GTG CCC GAT TAT GCC TTG 3250Leu Ala His Asp Pro Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Tyr Ala Leu285 290 295 300GAC GCC CCG TCC TCG GCC TTT GGC TTC CAT CAG GGT AAC CAC CAT CCG 3298Asp Ala Pro Ser Ser Ala Phe Gly Phe His Gln Gly Asn His His Pro 305 310 315GTC AAT CAT CAC AAC CAC ACC TCC CCC GGG GCA CCG TTT GGC TTG GAT 3346Val Asn His His Asn His Thr Ser Pro Gly Ala Pro Phe Gly Leu Asp 320 325 330ACG TTC GGC CTG GGA GAT GAT CCA ATC TTG CCC TCC GCG GGC CCC TAC 3394Thr Phe Gly Leu Gly Asp Asp Pro Ile Leu Pro Ser Ala Gly Pro Tyr 335 340 345CAG TCG CAA TTC ACC TTC TCA CCC AGC GAG TCT CCG ATG GCC TCC GGT 3442Gln Ser Gln Phe Thr Phe Ser Pro Ser Glu Ser Pro Met Ala Ser Gly 350 355 360CAT CCG TTT GCG AAC CTC TAT TCG CAT ACC CCG GTG GCT TCG TCC CTC 3490His Pro Phe Ala Asn Leu Tyr Ser His Thr Pro Val Ala Ser Ser Leu365 370 375 380AAC TCG ACG GAT TTC TTC TCT CCA CCG CCA TCA GGC TAC CAG TCC ACG 3538Asn Ser Thr Asp Phe Phe Ser Pro Pro Pro Ser Gly Tyr Gln Ser Thr 385 390 395GCA TCC ACG CCG CAG CCC ACC TAC GAC GGG GAC CAT TCC GTT TAT TTC 3586Ala Ser Thr Pro Gln Pro Thr Tyr Asp Gly Asp His Ser Val Tyr Phe 400 405 410GAT ATG CCG TCG GGC GAC GCG CGC ACC CAG CGC CGC ATT CCG AAC TAT 3634Asp Met Pro Ser Gly Asp Ala Arg Thr Gln Arg Arg Ile Pro Asn Tyr 415 420 425ATT TCG CAT CGG TCC AAC TTG TCT GCT TCG CTG CAG CCT CGG TAT ATG 3682Ile Ser His Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ser Leu Gln Pro Arg Tyr Met 430 435 440TTC AAC CAG AAC AAC CAT GAA CAG GCC AGT TCG TCG ACG GTG CAT TCG 3730Phe Asn Gln Asn Asn His Glu Gln Ala Ser Ser Ser Thr Val His Ser445 450 455 460CCG AGC TAC CCC ATT CCC CAG CCG CAA CAT GTG GAC CCC ACT CAG GTG 3778Pro Ser Tyr Pro Ile Pro Gln Pro Gln His Val Asp Pro Thr Gln Val 465 470 475TTG AAC GCC ACC AAT TAC TCG ACC GGC AAC TCC CAC CAT ACC GGC GCC 3826Leu Asn Ala Thr Asn Tyr Ser Thr Gly Asn Ser His His Thr Gly Ala
480 485 490ATG TTT TCA TTT GGA GCC GAT TCA GAT AAC GAG GAT GAC GAT GGT CAT 3874Met Phe Ser Phe Gly Ala Asp Ser Asp Asn Glu Asp Asp Asp Gly His 495 500 505CAG CTG TCC GAG CGG GCT GGT CTG GCG ATG CCG ACT GAA TAT GGG GAC 3922Gln Leu Ser Glu Arg Ala Gly Leu Ala Met Pro Thr Glu Tyr Gly Asp 510 515 520GAG GAC GGG TTC TCG TCG GGC ATG CAG TGG GAT GGG CAG TTC CCG GGC 3970Glu Asp Gly Phe Ser Ser Gly Met Gln Trp Asp Gly Gln Phe Pro Gly525 530 535 540TCC TTC CAT TCG CTG CCG GGC TTT GGC CCT CAA CAT CGC AAG CAT GTT 4018Ser Phe His Ser Leu Pro Gly Phe Gly Pro Gln His Arg Lys His Val 545 550 555ACC ATC GGG TCC ACG GAC ATG ATG GAC ACC CCC GAG GAG TGG AAT CAC 4066Thr Ile Gly Ser Thr Asp Met Met Asp Thr Pro Glu Glu Trp Asn His 560 565 570GGT GGC AGT TTG GGT CGG ACT CAT GGG TCG GTG GCT TCG GTC AGT GAG 4114Gly Gly Ser Leu Gly Arg Thr His Gly Ser Val Ala Ser Val Ser Glu 575 580 585GTG CGC AAC CGA GAG CAG GAC CCT CGC CGG CAG AAG ATT GCC CGC ACC 4162Val Arg Asn Arg Glu Gln Asp Pro Arg Arg Gln Lys Ile Ala Arg Thr 590 595 600ACG TCC ACC CCC AAT ACG GCC CAG CTG TTG CGC CAA AGC ATG CAC TCT 4210Thr Ser Thr Pro Asn Thr Ala Gln Leu Leu Arg Gln Ser Met His Ser605 610 615 620AAT AAC AAT ACG TCT CAT ACC TCC CCT AAT ACG CCG CCC GAG TCC GCC 4258Asn Asn Asn Thr Ser His Thr Ser Pro Asn Thr Pro Pro Glu Ser Ala 625 630 635CTG AGC AGC GCA GTT CCG TCC CGC CCG GCC AGT CCC GGG GGC AGC AAG 4306Leu Ser Ser Ala Val Pro Ser Arg Pro Ala Ser Pro Gly Gly Ser Lys 640 645 650AAC GGC GAC CAA GGC AGC AAC GGA CCG ACC ACC TGC ACG AAC TGC TTC 4354Asn Gly Asp Gln Gly Ser Asn Gly Pro Thr Thr Cys Thr Asn Cys Phe 655 660 665ACT CAA ACC ACT CCG CTG TGG CGT CGG AAC CCA GAG GGC CAG CCA CTG 4402Thr Gln Thr Thr Pro Leu Trp Arg Arg Asn Pro Glu Gly Gln Pro Leu 670 675 680TGC AAT GCC TGC GGG TTG TTT TTG AAA TTG CAC GGT GTC GTG CGC CCT 4450Cys Asn Ala Cys Gly Leu Phe Leu Lys Leu His Gly Val Val Arg Pro685 690 695 700CTG TCC CTG AAA ACG GAC GTT ATC AAA AAG CGC AAC CGT AGC AGT GCC 4498Leu Ser Leu Lys Thr Asp Val Ile Lys Lys Arg Asn Arg Ser Ser Ala 705 710 715AAC AGC TTG GCG GTT GGG ACC TCC CGT GCG TCG AAG AAG ACA GCC CGC 4546Asn Ser Leu Ala Val Gly Thr Ser Arg Ala Ser Lys Lys Thr Ala Arg 720 725 730AAG AAC TCG GTG CAG CAA GCA TCC GTC ACG ACT CCG ACA TCA AGC CGC 4594Lys Asn Ser Val Gln Gln Ala Ser Val Thr Thr Pro Thr Ser Ser Arg
735 740 745GCT CAG AAT GGG ACT TCC TTC GAA TCC CCG CCC GCC GGC TTT AGT GCT 4642Ala Gln Asn Gly Thr Ser Phe Glu Ser Pro Pro Ala Gly Phe Ser Ala 750 755 760GCC GCG GGA CGG TCG AAT GGG GTG GTA CCC ATT GCC GCC GCT CCT CCG 4690Ala Ala Gly Arg Ser Asn Gly Val Val Pro Ile Ala Ala Ala Pro Pro765 770 775 780AAG GCA GCT CCC TCC GCA GCC GCC TCC CCT AGC ACG GGC CAG ACC CGC 4738Lys Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Thr Gly Gln Thr Arg 785 790 795AAC CCG ATC CAG GCT GCC CCG AAA CGT CAA CGA CGG CTG GAA AAG GCC 4786Asn Pro Ile Gln Ala Ala Pro Lys Arg Gln Arg Arg Leu Glu Lys Ala 800 805 810ACG GAG ATG GAA ACG GAC GAG GCT AAC AAG TCC GCG GGA GGC CGA TCC 4834Thr Glu Met Glu Thr Asp Glu Ala Asn Lys Ser Ala Gly Gly Arg Ser 815 820 825AAG GTG GTG CCT CTG GCA CCC GCC ATG CCA CCG GCA GCA GCC AAT CCG 4882Lys Val Val Pro Leu Ala Pro Ala Met Pro Pro Ala Ala Ala Asn Pro 830 835 840GCG AAC CAT AGT ATT GCC GGA GGC CAA GGG GCT AGT CAG GAA TGG GAG 4930Ala Asn His Ser Ile Ala Gly Gly Gln Gly Ala Ser Gln Glu Trp Glu845 850 855 860TGG TTG ACG ATG AGT CTGTAATGGC CGCGCTTACC TCTCTACTTC TCTACACTCG 4985Trp Leu Thr Met Ser Leu 865TTTCTTAATA TCTTTCTTGA ACCCCCCCTT ATATTTTCCC ACCGTTGATG CTACGCCATG 5045ACCGATAGAG ATGATGAATA CTGCAACCAA TGGAATCTCG CTAGACGAGA GGTGTTAGAT 5105GACGTGGCCC GCGATGCACT TAATGAGATA CGAGGAGGTG CAATGCGTTG GTTACGCTAG 5165TTTAATGGTA ACATGACGAG GGATATTCGC TCTGTTATTT CGGGCTTTGA TCTGTTTCAG 5225TCTGCGATTT AACAGCGACT GATCCTCTGC TGTGACAATA CACAGCTTGT CTTGTGGTTC 5285TGTTGTGGCT TTCTGTTTGT TTGGCTGATT TGATTTATGC TTGATACAAT CGCGTCTGTC 5345CGGACCCCGG CCTTTGTTTT GTTTTCAGTT CTGATTCTTC ACTGTTTCTG ATTCTCTTGT 5405TCATGTTTTT GATTTGTTCA AGGCTTGGGG CCGGGCAGAA GTGCGCATCT CTGCTTTGTG 5465TTTTCCGTCA CCGTGCATAG ACGCTGTATG TATATGCTAC AGCAAGATTC TACTTATCCA 5525GTCTGAGCCT GTATTCATTG AAGTGTAGCC AGCTGTCGAA TGAGCTTTTT AACGATATTG 5585TTTTGTTGAG TAGTCAACAA GTAGTATCTG TATATTCCGG AGTCTAAGTA AGACACTT 5643(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：866个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Ser Gly Leu Thr Leu Gly Arg Gly Pro Gly Gly Val Arg Pro Thr 1 5 10 15Gln Thr Ala Thr Phe Thr Thr His His Pro Ser Ala Asp Ala Asp Arg 20 25 30Ser Ser Asn Asn Leu Pro Pro Thr Ser Ser Gln Leu Ser Asp Asp Phe 35 40 45Ser Phe Gly Ser Pro Leu Ser Pro Ala Asp Ser Gln Ala His Asp Gly 50 55 60Leu Leu Gln Asp Ser Leu Phe Pro Glu Trp Gly Ser Gly Ala Pro Arg65 70 75 80Pro Gly Ile Asp Ser Pro Asp Glu Met Gln Arg Gln Asp Pro Leu Ala 85 90 95Thr Gln Ile Trp Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Lys Ala Gln Leu Pro Asn 100 105 110Gln Glu Arg Met Glu Asn Leu Thr Trp Arg Met Met Ala Met Ser Leu 115 120 125Lys Arg Lys Glu Arg Glu Arg Ala Gln Gln Ser Met Phe Pro Ala Arg 130 135 140Arg Gly Ser Ala Gly Pro Ser Gly Ile Ala Gln Leu Arg Ile Ser Asp145 150 155 160Pro Pro Val Ala Thr Gly Asn Pro Gln Ser Thr Asp Leu Thr Ala Asp 165 170 175Pro Met Asn Leu Asp Asp Phe Ile Val Pro Phe Glu Ser Pro Ser Asp 180 185 190His Pro Ser Pro Ser Ala Val Lys Ile Ser Asp Ser Thr Ala Ser Ala 195 200 205Ala Ile Pro Ile Lys Ser Arg Lys Asp Gln Leu Arg Asp Ser Thr Pro 210 215 220Val Pro Ala Ser Phe His His Pro Ala Gln Asp Gln Arg Lys Asn Ser225 230 235 240Glu Phe Gly Tyr Val Pro Arg Arg Val Arg Lys Thr Ser Ile Asp Glu 245 250 255Arg Gln Phe Phe Ser Leu Gln Val Pro Thr Arg Lys Arg Pro Ala Glu
260 265 270Ser Ser Pro Gln Val Pro Pro Val Ser Asn Ser Met Leu Ala His Asp 275 280 285Pro Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Tyr Ala Leu Asp Ala Pro Ser 290 295 300Ser Ala Phe Gly Phe His Gln Gly Asn His His Pro Val Asn His His305 310 315 320Asn His Thr Ser Pro Gly Ala Pro Phe Gly Leu Asp Thr Phe Gly Leu 325 330 335Gly Asp Asp Pro Ile Leu Pro Ser Ala Gly Pro Tyr Gln Ser Gln Phe 340 345 350Thr Phe Ser Pro Ser Glu Ser Pro Met Ala Ser Gly His Pro Phe Ala 355 360 365Asn Leu Tyr Ser His Thr Pro Val Ala Ser Ser Leu Asn Ser Thr Asp 370 375 380Phe Phe Ser Pro Pro Pro Ser Gly Tyr Gln Ser Thr Ala Ser Thr Pro385 390 395 400Gln Pro Thr Tyr Asp Gly Asp His Ser Val Tyr Phe Asp Met Pro Ser 405 410 415Gly Asp Ala Arg Thr Gln Arg Arg Ile Pro Asn Tyr Ile Ser His Arg 420 425 430Ser Asn Leu Ser Ala Ser Leu Gln Pro Arg Tyr Met Phe Asn Gln Asn 435 440 445Asn His Glu Gln Ala Ser Ser Ser Thr Val His Ser Pro Ser Tyr Pro 450 455 460Ile Pro Gln Pro Gln His Val Asp Pro Thr Gln Val Leu Asn Ala Thr465 470 475 480Asn Tyr Ser Thr Gly Asn Ser His His Thr Gly Ala Met Phe Ser Phe 485 490 495Gly Ala Asp Ser Asp Asn Glu Asp Asp Asp Gly His Gln Leu Ser Glu 500 505 510Arg Ala Gly Leu Ala Met Pro Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Asp Gly Phe 515 520 525Ser Ser Gly Met Gln Trp Asp Gly Gln Phe Pro Gly Ser Phe His Ser 530 535 540Leu Pro Gly Phe Gly Pro Gln His Arg Lys His Val Thr Ile Gly Ser545 550 555 560Thr Asp Met Met Asp Thr Pro Glu Glu Trp Asn His Gly Gly Ser Leu 565 570 575Gly Arg Thr His Gly Ser Val Ala Ser Val Ser Glu Val Arg Asn Arg 580 585 590Glu Gln Asp Pro Arg Arg Gln Lys Ile Ala Arg Thr Thr Ser Thr Pro 595 600 605Asn Thr Ala Gln Leu Leu Arg Gln Ser Met His Ser Asn Asn Asn Thr 610 615 620Ser His Thr Ser Pro Asn Thr Pro Pro Glu Ser Ala Leu Ser Ser Ala625 630 635 640Val Pro Ser Arg Pro Ala Ser Pro Gly Gly Ser Lys Asn Gly Asp Gln
645 650 655Gly Ser Asn Gly Pro Thr Thr Cys Thr Asn Cys Phe Thr Gln Thr Thr 660 665 670Pro Leu Trp Arg Arg Asn Pro Glu Gly Gln Pro Leu Cys Asn Ala Cys 675 680 685Gly Leu Phe Leu Lys Leu His Gly Val Val Arg Pro Leu Ser Leu Lys 690 695 700Thr Asp Val Ile Lys Lys Arg Asn Arg Ser Ser Ala Asn Ser Leu Ala705 710 715 720Val Gly Thr Ser Arg Ala Ser Lys Lys Thr Ala Arg Lys Asn Ser Val 725 730 735Gln Gln Ala Ser Val Thr Thr Pro Thr Ser Ser Arg Ala Gln Asn Gly 740 745 750Thr Ser Phe Glu Ser Pro Pro Ala Gly Phe Ser Ala Ala Ala Gly Arg 755 760 765Ser Asn Gly Val Val Pro Ile Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Ala Pro 770 775 780Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ser Thr Gly Gln Thr Arg Asn Pro Ile Gln785 790 795 800Ala Ala Pro Lys Arg Gln Arg Arg Leu Glu Lys Ala Thr Glu Met Glu 805 810 815Thr Asp Glu Ala Asn Lys Ser Ala Gly Gly Arg Ser Lys Val Val Pro 820 825 830Leu Ala Pro Ala Met Pro Pro Ala Ala Ala Asn Pro Ala Asn His Ser 835 840 845Ile Ala Gly Gly Gln Gly Ala Ser Gln Glu Trp Glu Trp Leu Thr Met 850 855 860Ser Leu865(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物19819
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7GAAGATCTGC GCGGATGTAC ATTGTAG 27(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物19821
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8TTAGTCAGAA ATTCGTCCCG 20(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物19820
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9CCCAAGCTTC ATGCTCGACC AGGGCCTCCT 30(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物19818
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10GGTCTGTGTT AACCAAAGAA C 21(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物8681
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11GATCCACCAT GAAG 14(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA引物8747
(iii)假设：是
(iii)反义：否
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12GTGGTACTTC AGCT 14