一种新型抗肠球菌多肽及其制备方法 技术领域 本发明涉及一种重组的抗肠球菌多肽，编码该多肽的核苷酸和氨基酸序列。
本发明还涉及重组抗肠球菌多肽的制备方法。
背景技术 细菌感染是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续发明的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径来达到抗菌目的。然而这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素耐药性。因此人们一直在致力于开发新型的抗菌素。在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。自然界中，为数不少的细菌毒素就是以这种机制来杀死细菌的，其模式标本就是大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的一种毒素蛋白——大肠菌素(colicin)，1952年Jacob发现其能特异地杀死其它株系的大肠杆菌和相关株系的某些杆菌，如Shigella Sonnei(Jacob et al，)Sur labiosynthese d’unecolicine et son mode d’action，Annals of the Pasteur Institute.83：295-315(1952))。1978年Finkelstern等发现了可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而在根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制(Schein et al，Colicin K acts by forming voltage dependent channels in phospholipid bilayer membranes.Nature 276：159-163(1973))。1996年Qiu和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiu et al.，Majortransmembrane movement associated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107：313-328(1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论基础。
近二十年，人们逐渐发现细菌也具有随外界环境变化而分泌的信号传导多肽，制备信号传导多肽的胞膜受体及胞内调节蛋白的基因往往偶联在一起，协调地控制着细菌的生长和分裂，但该方向的研究一直进展缓慢，比如金黄葡萄球菌地信号传导多肽AgrD，一直到1995年才最后搞清楚是一个八肽(Ji et al.，Cell density control ofstaphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：12055-12059(1995))。1999年发现金黄色葡萄球菌对数生长期的早期或中晚期加入人工合成的这种八肽可以刺激或抑制金黄色葡萄球菌的生长(Mayville et al.，Structure activity analysis of synthetic autoinducing thiolactone peptides fromstaphylococcus aureus responsible for virulence.PNAS，96：1218-1223(1999))。
如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗菌素，缺点是只能作用于大肠杆菌等格兰氏阴性杆菌，如果能利用致病菌特有的信号传导肽作为诱导物，将大肠菌素或其水性孔道结构或诱导至特定的细菌膜附近形成离子通道来杀伤该致病菌，应该是一种理想的抗菌素开发方向。
发明内容 本发明的一个目的在于提供一种新型的重组抗菌多肽，其含有大肠菌素和肠球菌信号传导多肽，从而能避免诱发细菌的耐药性，提高杀菌能力。
本发明的另一目的在于提供编码该重组抗肠球菌多肽的核苷酸序列。
本发明的再一目的在于提供一重组质粒，其含有编码本发明重组抗肠球菌多肽的核苷酸序列。
本发明的再一目的在于提供一氨基酸序列，其编码本发明的重组抗肠球菌多肽。
本发明的再一目的在于提供含有本发明重组抗肠球菌多肽的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供本发明抗肠球菌多肽在制备抗菌药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供重组抗肠球菌多肽的制备方法。
根据本发明的一方面，将编码肠球菌信号传导多肽的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肠球菌多肽的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，采用编码肠球菌的信号传导多肽cCF10的基因(SEQ ID NO.1)作为抗菌多肽的信息素基因，其编码如SEQ ID NO：2所示的七肽；大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B和N或其水性孔道结构域，在本发明的一个优选实施例中，将上述肠球菌信号传导多肽基因与大肠菌素Ia(SEQ ID NO.3)的羧基端连接而形成如SEQ ID NO.4的核苷酸序列。该核苷酸序列编码如SEQ ID NO.5的氨基酸序列，该氨基酸序列所编码的多肽即为本发明的抗肠球菌多肽Ph-EF。
在构建的重组抗肠球菌多肽中，可与靶细菌胞膜受体结合的信号传导多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域穿过细菌外膜与膜间隙到达靶细胞膜附近，然后大肠菌素水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄漏而致靶细菌死亡，从而达到杀菌的目的。
根据本发明的另一方面，提供如图1所示的包含本发明核苷酸的质粒载体，该质粒载体是将如上所述的编码肠球菌信号传导多肽的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素Ia基因的第626位氨基酸上而形成本发明的重组质粒。
本发明中，构建质粒载体的原始质粒pSELECTTM-1来自于Promega公司，其中装载了大肠菌素Ia和immunity蛋白基因，针对肠球菌信号传导基因设计了一对引物，其序列分别如SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO：7所示。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司药箱操作获得重组质粒，再将获得的重组质粒转染入大肠杆菌TG1工程菌而获得宿主细胞。
根据本发明的再一方面，提供含有本发明重组抗肠球菌多肽的药物组合物，可以通过将本发明的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。
根据本发明的又一方面，提供本发明抗肠球菌多肽的制备方法，将编码肠球菌信号传导多肽的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗肠球菌多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表达，分离表达的多肽而获得本发明的抗肠球菌多肽。
本发明的抗肠球菌多肽相较于传统抗菌素的优点在于，其不会诱导细菌产生传统的耐药性。众所周知，细菌可以通过突变产生β-内酰胺酶、减少摄入、改变药物作用位点等方式来改变其细胞壁结构，改变其蛋白质和核酸的代谢等对传统抗菌素产生耐药性。但是细菌却较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而这恰好是本发明的独到之处，本发明的重组多肽通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道而达到杀菌目的。
本发明中编码肠球菌信号传导多肽的核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与Genebank A30128号序列所表达的氨基酸序列相同。
图1示出含有肠球菌信号传导多肽cCF10和大肠菌素Ia的质粒pCHCEF的结构；
图2示出抗肠球菌多肽的结构；
图3为本发明抗肠球菌多肽(Ph-EF)体外杀菌实验结果，其中左图为普通肠球菌，可见制备的Ph-EF与青霉素一样，有效的抑制了肠球菌生长。右图为耐万古霉素肠球菌，万古霉素部分地抑制了肠球菌生长，制备的Ph-EF抑菌效果比万古霉素至少强一倍。
图4为抗肠球菌多肽(Ph-EF)对耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802 VRE)作用效果的透射电镜观察(放大15,000倍)。
下面结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述详细说明本发明。
【实施例1】表达抗肠球菌多肽的质粒的构建和重组抗肠球菌多肽制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia和immunity蛋白基因的pSELECT
TM-1商用质粒(质粒大小8.3kb，Promega公司)(UCSF，P.Gosh赠与)。经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChange
TMKit，Strategeue公司)将编码肠球菌信号多肽cCF10基因插入到大肠菌素Ia基因的I626位点上，制备了抗肠球菌工程多肽的突变质粒pCHCEF(如图1所示)。突变质粒转染入E.coli TG1工程菌(AECOM，K.Jakes赠与)里制备多肽。
突变程序按Strategene QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Catalog#200518)药箱手册进行：
1.准备点突变反应物：
5μl 10X buffer
2μl (10ng)野生型大肠菌素质粒
1.25μl(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.6)
1.25μl(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO.7)
1μl dNTP
双蒸水50μl
1μl pfu
(除质粒、引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2.进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3.加入Dpn1内切酶1μl消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1μl反应物与XL1-Blue感受态细胞50μl冰孵，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4.加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100μl反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50μl/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5.18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功。
6.将质粒50ng与制备的TG1工程菌感受肽细胞50μl冰孵30分42℃，90秒热冲击，取50-100μl反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50μg/ml氨苄青霉素)37℃，18小时后挑取菌落。
7.大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取4℃、50mM硼酸缓冲液(2mM EDTA+2mM DTT)50-80ml悬浮菌体，加0.2M PMSF 250微升后超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心(4℃，30000g，10分钟)后装入分子量15000的透析袋于4℃，50mM硼酸缓冲液4升透析过夜后，高速离心(4℃，30000g，10分钟)后上清上样于CM离子交换柱，4℃，0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液洗脱即可得到重组抗肠球菌多肽Ph-EF，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
上述制备质粒中所设计的寡聚核苷酸序列
5’-3’(SEQ ID NO：6)
gcg aat aag ttc tgg ggt att CTG GTT ACC CTT GTG TTC GTG taa ata aaa tat aag aca ggc
3’-5’(SEQ ID NO：7)
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CAC GAA CAC AAG GGT AAC CAG aat acc cca gaa ctt att cgc
【实施例2】重组抗肠球菌多肽对肠球菌的体外抑制作用
细菌为美国标准菌株，ATCC 29212(普通肠球菌)和ATCC 700802(耐万古霉素肠球菌)，如图3所示，左图加入普通肠球菌菌液5微升(10
8CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母，0.5％葡萄糖，1％HK
2PO
4的培养液10ml中，共准备4组，第一组加入0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中加入的抗菌多肽液体量相同)作为对照，第二组加入3μg/ml青霉素G钠，第三组加入3μg/ml抗肠球菌多肽(保存液为0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液)，第四组待细菌生长三小时后加入3μg抗肠球菌多肽(保存液为0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液)。
右图加入耐万古霉素肠球菌菌液5微升(10
8CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母，0.5％葡萄糖，1％HK
2PO
4的培养液10ml中，共准备4组，第一组加入0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中加入的抗菌多肽液体量相同)作为对照，第二组待细菌生长两小时后，加入10μg/ml万古霉素，第三组待细菌生长两小时后加入10μg/ml抗肠球菌多肽(保存液为0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液)。
上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长，每小时采样100μl加入96孔酶标板中经分光光度计(A 595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌效力。
由图3的结果可见，制备的Ph-EF与青霉素一样，有效地抑制了肠球菌生长。右图为耐万古霉素肠球菌，万古霉素部分地抑制了肠球菌生长，制备的Ph-EF抑菌效果比万古霉素至少强一倍。
抗肠球菌多肽分子量为70,000，是万古霉素分子量1436的49倍，如按同体积中相同药物分子数量比较，抗肠球菌多肽的杀菌效力是去甲万古霉素的数十乃至上百倍。
【实施例3】抗肠球菌多肽对耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)杀菌效果的透射电镜观察(1％磷钨酸染色，放大15,000倍)。
抗肠球菌多肽对耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)杀菌效果的透射电镜观察(1％磷钨酸染色，放大15,000倍)如图4所示。Control，对照组，细菌加入前述培养液中，37℃200rpm生长2小时后仍呈现正常形态；Ph-SA，细菌生长条件同对照组，加入抗金葡菌多肽(10μg/ml)生长两小时后，菌形态仍然正常；Vanco，细菌生长条件同对照组，加入万古霉素(20μg/ml)生长2小时后，菌形态仍然正常；Ph-EF，细菌生长条件同对照组，加入抗肠球菌多肽(10μg/ml)生长半小时后，菌皱缩，内容物泄漏，两小时后，上述病损更加明显。
结论：抗肠球菌多肽可以有效地杀死耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802)。
【实施例4】抗肠球菌多肽对耐万古霉素肠球菌ATCC 700802体内保护试验
小鼠55只，体重20-25gm，分为4组：对照组(n＝10)、青霉素组、万古霉素组、和抗肠球菌多肽(Ph-EF)组，各药物组又分为3个剂量组，每组5只小鼠。小鼠在腹腔注射致死剂量耐万古霉素肠球菌(ATCC 700802，菌量为10
5CFU/ml)1小时后，分别由尾静脉注入图示剂量各种药物一次，每12小时检查小鼠死亡情况，结果见表1。
表1 Ph-EF对耐万古霉素肠球菌ATCC 700802体内保护试验结果
药物 剂量途径×给药量 动 物 数 感染后死亡分布 死 亡 数
(mg/kg)Ml/20g鼠重 (只) 24h 48h 72h 96h 120 h 144 h 168 h 只
Ph-E F 10IV×0.5 5 0 0 0 0 0 0 0 0
5 5 0 1 0 0 0 0 0 1
2.5 5 0 2 0 0 0 0 0 2
青霉 素 10IV×0.5 5 0 0 0 0 0 0 0 0
5 5 0 1 0 0 0 0 0 1
2.5 5 1 0 0 0 0 0 0 1
万古 霉素 10IV×0.5 5 1 0 0 0 0 0 0 1
5 5 0 2 1 0 0 0 0 3
2.5 5 1 2 0 1 0 0 0 4
对照 组IV×0.50.9％NaCl 10 3 3 1 0 3 0 0 10
结果表明，Ph-EF在动物体内可有效地抗肠球菌感染，对动物有较强的保护作用。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>成都阳辉生物科技有限责任公司
<120>一种新型抗肠球菌多肽及其制备方法
<130>1553
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
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<223>编码肠球菌cCF10信号传导多肽
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ctg gtt acc ctt gtg ttc gtg 21
Leu Val Thr Leu Val Phe Val
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<213>人工序列
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Leu Val Thr Leu Val Phe Val
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<220>
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<222>(1)..(1878)
<223>大肠菌素基因
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atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc ggtgcagaat cgctggggta tgattcagat 60
ggccatgaaa ttatggccgt tgatatttat gtaaaccctc cacgtgtcga tgtctttcat 120
ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg 180
gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac 240
aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa 300
cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt 360
gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag 420
ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca 480
gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg 540
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gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg 780
acggaatcgc ttaacacggc ccgtaatgca ttaaccagag ctgaacaaca gctgacgcaa 840
cagaaaaaca cgcctgacgg caaaacgata gtttcccctg aaaaattccc ggggcgttca 900
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acaaccagcg cagtcatcga taaccgtgca aacctgaatt atcttctgag ccattccggt 1020
ctggactata aacgcaatat tctgaatgac cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa 1080
ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg 1140
cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac 1200
ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag 1260
gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa 1320
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aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg 1440
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cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt 1560
gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga 1620
tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680
acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740
acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800
tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860
aataagttct ggggtatt 1878
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<211>1902
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(1899)
<223>编码抗肠球菌多肽
<400>4
atg tct gac cct gta cgt att aca aat ccc ggt gca gaa tcg ctg ggg 48
Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly
1 5 10 15
tat gat tca gat ggc cat gaa att atg gcc gtt gat att tat gta aac 96
Tyr Asp Ser Asp Gly His Glu Ile Met Ala Val Asp Ile Tyr Val Asn
20 25 30
cct cca cgt gtc gat gtc ttt cat ggt acc ccg cct gca tgg agt tcc 144
Pro Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser
35 40 45
ttc ggg aac aaa acc atc tgg ggc gga aac gag tgg gtt gat gat tcc 192
Phe Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser
50 55 60
cca acc cga agt gat atc gaa aaa agg gac aag gaa atc aca gcg tac 240
Pro Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr
65 70 75
aaa aac acg ctc agc gcg cag cag aaa gag aat gag aat aag cgt act 288
Lys Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr
80 85 90 95
gaa gcc gga aaa cgc ctc tct gcg gcg att gct gca agg gaa aaa gat 336
Glu Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp
100 105 110
gaa aac aca ctg aaa aca ctc cgt gcc gga aac gca gat gcc gct gat 384
Glu Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp
115 120 125
att aca cga cag gag ttc aga ctc ctg cag gca gag ctg aga gaa tac 432
Ile Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr
130 135 140
gga ttc cgt act gaa atc gcc gga tat gac gcc ctc cgg ctg cat aca 480
Gly Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr
145 150 155
gag agc cgg atg ctg ttt gct gat gct gat tct ctt cgt ata tct ccc 528
Glu Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro
160 165 170 175
cgg gag gcc agg tcg tta atc gaa cag gct gaa aaa cgg cag aag gat 576
Arg Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp
180 185 190
gcg cag aac gca gac aag aag gcc gct gat atg ctt gct gaa tac gag 624
Ala Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu
195 200 205
cgc aga aaa ggt att ctg gac acc cgg ttg tca gag ctg gaa aaa aat 672
Arg Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn
210 215 220
ggc ggg gca gcc ctt gcc gtt ctt gat gca caa cag gcc cgt ctg ctc 720
Gly Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu
225 230 235
ggg cag cag aca cgg aat gac agg gcc att tca gag gcc cgg aat aaa 768
Gly Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys
240 245 250 255
ctc agt tca gtg acg gaa tcg ctt aac acg gcc cgt aat gca tta acc 816
Leu Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr
260 265 270
aga gct gaa caa cag ctg acg caa cag aaa aac acg cct gac ggc aaa 864
Arg Ala Glu Gln Gln Leu Thr Gln Gln Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys
275 280 285
acg ata gtt tcc cct gaa aaa ttc ccg ggg cgt tca tca aca aat cat 912
Thr Ile Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His
290 295 300
tct att gtt gtg agc ggt gat ccg aga ttt gcc ggt acg ata aaa atc 960
Ser Ile Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr Ile Lys Ile
305 310 315
aca acc agc gca gtc atc gat aac cgt gca aac ctg aat tat ctt ctg 1008
Thr Thr Ser Ala Val Ile Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu
320 325 330 335
agc cat tcc ggt ctg gac tat aaa cgc aat att ctg aat gac cgg aat 1056
Ser His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Asn Asp Arg Asn
340 345 350
ccg gtg gtg aca gag gat gtg gaa ggt gac aag aaa att tat aat gct 1104
Pro Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Ala
355 360 365
gaa gtt gct gaa tgg gat aag tta cgg caa aga ttg ctt gat gcc aga 1152
Glu Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ala Arg
370 375 380
aat aaa atc acc tct gct gaa tct gcg gta aat tcg gcg aga aat aac 1200
Asn Lys Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn
385 390 395
ctc agt gcc aga aca aat gag caa aag cat gca aat gac gct ctt aat 1248
Leu Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gln Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn
400 405 410 415
gcc ctg ttg aag gaa aaa gag aat ata cgt aac cag ctt tcc ggc atc 1296
Ala Leu Leu Lys Glu Lys Glu Asn Ile Arg Asn Gln Leu Ser Gly Ile
420 425 430
aat cag aag ata gcg gaa gag aaa aga aaa cag gat gaa ctg aag gca 1344
Asn Gln Lys Ile Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gln Asp Glu Leu Lys Ala
435 440 445
acg aaa gac gca att aat ttc aca aca gag ttc ctg aaa tca gtt tca 1392
Thr Lys Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser
450 455 460
gaa aaa tat ggt gca aaa gct gag cag tta gcc aga gag atg gcc ggg 1440
Glu Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly
465 470 475
cag gct aaa ggg aag aaa ata cgt aat gtt gaa gag gca tta aaa acg 1488
Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr
480 485 490 495
tat gaa aag tac cgg gct gac att aac aaa aaa att aat gca aaa gat 1536
Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp
500 505 510
cgt gca gcg att gcc gca gcc ctt gag tct gtg aag ctg tct gat ata 1584
Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile
515 520 525
tcg tct aat ctg aac aga ttc agt cgg gga ctg gga tat gca gga aaa 1632
Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys
530 535 540
ttt aca agt ctt gct gac tgg atc act gag ttt ggt aag gct gtc cgg 1680
Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg
545 550 555
aca gag aac tgg cgt cct ctt ttt gtt aaa aca gaa acc atc ata gca 1728
Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala
560 565 570 575
ggc aat gcc gca acg gct ctt gtg gca ctg gtc ttc agt att ctt acc 1776
Gly Asn Ala Ala Thr Ala Leu Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr
580 585 590
gga agc gct tta ggc att atc ggg tat ggt tta ctg atg gct gtc acc 1824
Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr
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ggt gcg ctg att gat gaa tcg ctt gtg gaa aaa gcg aat aag ttc tgg 1872
Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp
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ggt att ctg gtt acc ctt gtg ttc gtg taa 1902
Gly Ile Leu Val Thr Leu Val Phe Val
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<212>PRT
<213>人工序列
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Pro Arg Val Asp Val Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe
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Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu
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Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile
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180 185 190
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Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly
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Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser
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Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe
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545 550 555 560
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565 570 575
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(63)
<223>引物
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ggc 63
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cgc 63