一种剔除Β2微球蛋白基因片段的方法.pdf

本发明公开一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，包括如下步骤:(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞,剔除β2-微球蛋白基因片段；(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。本发明公开的方法是一个新的靶向剔除人体细胞基因的遗传工程方法。此方法利用杆状病毒载体作为传递系统，在人体细胞内高效表达剔除B2M基因的特异性CRISPR/Cas9组件，有效阻断B2M基因表达，降低细胞表面第一型HLA分子的表达，从而产生低免疫源性的人体细胞。

权利要求书
1.  一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；
(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞，剔除β 2-微球蛋白基因片段；
(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。

2.  根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特 征在于，所述步骤(1)中CRISPR/Cas9载体系统，采用如下步骤构建：
B2M基因座外显子2为靶的介导序列和接头序列经过互補黏合后，与 BbsI-切刻的pX260-Cas9质粒运载体粘连，在3’端带3bp TGG前间区序列邻 近基序(PAM)的B2M特异间隔序列引入载体,所述介导序列和接头序列如下：
5’...G A C A T T G A A G T T G A C T T A C T G A A G A A T G G A G A G A G...3’
3’...C T G T A A C T T C A A C T G A A T G A C T T C T T A C C T C T C T C...5’
产生的U6-B2M-crRNA构件随后从质粒通过PCR扩增并插入EcoRI和Xhol 之间以使用GeneArt基因生成形成pFB-U6-B2M-crRNA质粒；
为了制备pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA质粒，人源化的Cas9和px260-Cas9 质粒中的CBh启动子被PCR扩增成两个各2.8kb的片段；采用双重粘连法， 两个片段被同时用BamHI、Xhol、HindIII限制点亚克隆为pFastBac1；然后 再插入从pX260-Cas9质粒得到的H1-tracrRNA；最后，px260-Cas9中原始的 U6-hEMXcrRNA片段通过Xbal和BamHI消化被移除；Xbal和BamHI继续悬挂 于用PCR扩增处理过的小片段，有互补Xbal和BamHI悬挂的质粒上；
为了制备供体质粒pFB-B2M-eGFP，属于B2M基因座的一条636-bp左同源 臂和一条687-bp的右同同源臂由U87细胞基因组DNA扩增得来，然后被插入 pFB-PGK-Neo-EGFP-LoxP，一个pFastBac1载体通过SnaBI/Sall供左同源臂 以及Notl/BstBI供右同源臂已于之前制成；
重组的杆状病毒载体(BV)，包括BV-B2M-crRNA、BV-Cas9/tracrRNA和 BV-B2M-eGFP，用以上pFB-U6-B2M-crRNA,、pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA和 pFB-B2M-eGFP质粒分别生成，并依据Invitrogen Bac-to-Bac杆状病毒表达 系统协议在Sf9昆虫细胞中增殖。

3.  根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特 征在于，步骤(3)中通过流式细胞分析法、蛋白质印迹法、免疫荧光染色法 对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。

4.  根据权利要求1所述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，其特 征在于,还包括免疫反应化验步骤，使用Elipost化验法对转染后的受体细胞 进行免疫反应化验。

说明书一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，特别涉及一剔除β2-微球蛋白基因片段的遗 传工程方法。
背景技术
β2-微球蛋白(B2M)是人类白细胞抗原Ⅰ类分子(HLA-I)复合体的一个 组成部分,与HLA-I分子在细胞表面的表达以及细胞免疫源性密切相关。位于 第6对染色体短臂的人类白细胞抗原系统(HLA)是目前所知的最具多态性的 遗传系统。它们编码了第一型和和第二型的细胞表面分子。HLA第一型分子在所 有有核细胞表面都有表达，用于呈现细胞内来源的肽，调节先天免疫和获得性 免疫。HLA第一型分子在细胞表面的表达取决于是否能适当地和β2-微球蛋白 (B2M)结合成为一个复合体。人B2M分子质量为11.6kDa，含99个氨基酸。人 B2M基因由3个外显子组成。
通过剔除B2M基因，改变细胞表面HLA第一型分子表达，产生低免疫源性 的小鼠和人细胞以前已被测试过(Zijlstra et al.,1990,2010；Matin et al., 2004；Zafarana et al.,2009；Riolobos et al.,2013；Torikai et al.,2013； Lu et al.,2013；Figueiredo et al.,2014)。在80年代，采用了经典同源 重组法剔除小鼠胚胎干细胞中的B2M基因，随后用这些干细胞产生嵌合鼠，再 通过杂交来产生B2M阴性鼠(Koller et al,1989；Zijlstra et al.,1989， 1990，2010)。B2M-/-鼠不表达任何可测量水平的B2M蛋白，几乎完全缺失细 胞表面正常工作的第一型MHC抗原，但是他们是健康的。经典的同源重组法进 行基因打靶的效率很低，现在已少用。在人胚胎干细胞中，RNA干扰(RNAi)对 B2M转译的抑制已有测试(Matinet al.,2004；Zafarana et al.,2009)。但 是，RNAi有一些缺点，如剔除不完全，以及潜在的非特异性。一份最近的研究 已经证明了AAV载体引入一个结束密码子到B2M基因中可提前结束B2M基因表 达(Riolobos et al.,2013)。通过电穿孔方法在人胚胎干细胞中介入锌指核 酸酶(ZFN)mRNA已用于干扰HLA第一型分子表达(Torikai et al.,2013)。 转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)也已用于在人胚胎干细胞中干扰B2M基 因表达(Lu et al.,2013)。
ZFN和TALEN是两种早期的使用定制DNA核酸内切酶进行基因组编辑的方 法，制作比较繁琐，用起来较贵。特别是TALEN分子比ZFN大得多，因此很难 高效导入细胞，比如人胚胎干细胞。使用核酸内切酶进行基因组编辑的新生力 量是所谓的成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统。这一系统带 来了很多好处：简单、灵活，价格低廉、易于编程且非常高效(Hsu et al.,2014)。 CRISPR/Cas9系统以RNA介导方式瞄准一段特定的DNA序列。这项技术使用一段 无编码的介导RNA(gRNA)，gRNA由目标特定CRISPR RNA(crRNA)和一个支架 反式激活crRNA(tracrRNA)来介导Cas9核酸酶至一个特定的基因组目标，引 发DNA双链断裂(DSB)。后续的非同源末端连接(NHEJ)激活或同源重组修复 使在目标位置的基因干扰，修正和插入成为可能。
采用同源重组的基因靶向仍然是一个应用广泛的让选定的DNA序列以一个 事先决定的方式被修改的技术，但是有耗时费力的不利因素。ZFN和TALEN技术 可以在选定的基因组位点引入DNA DSB以刺激容易错误的NHEJ或同源重组修复， 因此增加了基因修改的效率。
发明内容
为了解决上述剔除β2-微球蛋白基因片段过程中的缺陷，本发明公开一种 剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，本发明采用如下技术方案来解决上述技术 问题：
一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，包括如下步骤:
(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；
(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞，剔除β2- 微球蛋白基因片段；
(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。
优选的，在上述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法中，所述步骤(1) 中CRISPR/Cas9载体系统，采用如下步骤构建：
B2M基因座外显子2为靶的介导序列和接头序列经过互補黏合后，与BbsI- 切刻的pX260-Cas9质粒运载体粘连，在3’端带3bp TGG前间区序列邻近基序 (PAM)的B2M特异间隔序列引入载体,所述介导序列和接头序列如下：
5’...GACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAG...3’
3’...CTGTAACTTCAACTGAATGACTTCTTACCTCTCTC...5’
产生的U6-B2M-crRNA构件随后从质粒通过PCR扩增并插入EcoRI和Xhol 之间以使用GeneArt基因生成形成pFB-U6-B2M-crRNA质粒；
为了制备pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA质粒，人源化的Cas9和px260-Cas9 质粒中的CBh启动子被PCR扩增成两个各2.8kb的片段；采用双重粘连法，两 个片段被同时用BamHI、Xhol、HindIII限制点亚克隆为pFastBac1；然后再插 入从pX260-Cas9质粒得到的H1-tracrRNA；最后，px260-Cas9中原始的 U6-hEMXcrRNA片段通过Xbal和BamHI消化被移除；Xbal和BamHI继续悬挂于 用PCR扩增处理过的小片段，有互补Xbal和BamHI悬挂的质粒上；
为了制备供体质粒pFB-B2M-eGFP，属于B2M基因座的一条636-bp左同源臂 和一条687-bp的右同同源臂由U87细胞基因组DNA扩增得来，然后被插入 pFB-PGK-Neo-EGFP-LoxP，一个pFastBac1载体通过SnaBI/Sall供左同源臂以 及Notl/BstBI供右同源臂已于之前制成；
重组的杆状病毒载体(BV)，包括BV-B2M-crRNA、BV-Cas9/tracrRNA和 BV-B2M-eGFP，用以上pFB-U6-B2M-crRNA,、pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA和 pFB-B2M-eGFP质粒分别生成，并依据Invitrogen Bac-to-Bac杆状病毒表达系 统协议在Sf9昆虫细胞中增殖。
优选的，在上述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法中，步骤(3)中 通过流式细胞分析法、蛋白质印迹法、免疫荧光染色法对转染后的受体细胞进 行检测和鉴定。
优选的，在上述的一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法中，还包括免疫 反应化验步骤，使用Elipost化验法对转染后的受体细胞进行免疫反应化验。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明公开了一个新的靶向基因工程方法剔除人体细胞中的B2M基因。此 方法利用杆状病毒载体作为传递系统，在人体细胞内高效表达B2M基因特异性 CRISPR/Cas9组件，阻断B2M基因表达，降低细胞表面第一型HLA分子的表达， 从而产生低免疫源性的人体细胞。
附图说明
图1CRISPR/Cas9在引导HEK293细胞B2M基因座的特定位点干扰的效率
图2BV-B2M-CRISPR在U87细胞中引导的B2M基因座干扰
图3U87细胞中BV-B2M-CRISPR导致的B2M剔除
图4人类胚胎干细胞(hESC)的B2M基因座靶向
图5hESC经过B2M剔除后对多能性和分化能力的保持
图6人类免疫细胞对B2M干扰细胞的反应
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法，包括如下步骤：
(1)构建CRISPR/Cas9载体系统；
(2)利用构建的CRISPR/Cas9载体系统将目的基因导入受体细胞，剔除β2- 微球蛋白基因片段；
(3)对转染后的受体细胞进行检测和鉴定。
如图1所示，上述步骤(1)中，CRISPR/Cas9载体系统通过如下步骤构建：
制造供crRNA转录用的载体，如图1(A)所示一堆含一段20个核苷酸，以 B2M基因座外显子2为靶的介导序列和接头序列经过退火，和BbsI-digested  pX260-Cas9质粒运载体粘连，以将在3’端带3bp TGG前间区序列邻近基序(PAM) 的B2M特异间隔序列引入载体。产生的U6-B2M-crRNA弹夹随后从质粒通过PCR 扩增并插入pFastBac1TM(Invitrogen)的EcoRI和Xhol之间以使用GeneArt基 因生成形成pFB-U6-B2M-crRNA质粒。
制造pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA质粒时，通过PCR将人类化的Cas9和 px260-Cas9质粒中的CBh启动子扩增成两个各2.8kb的片段。采用双重粘连法， 两个片段被同时用BamHI、Xhol、HindIII限制点亚克隆为pFastBac1。然后再 插入用EcoRI和HindIII发达pX260-Cas9质粒得到的H1-tracrRNA。最后， px260-Cas9中原始的U6-hEMXcrRNA片段通过Xbal和BamHI消化被移除。Xbal 和BamHI继续悬挂于用PCR扩增处理过的小片段，有互补Xbal和BamHI悬挂的 质粒上。
制造供体质粒pFB-B2M-eGFP时，属于B2M基因座的一条636-bp左同源臂 和一条687-bp的右同同源臂由U87细胞基因组DNA扩增得来，然后被插入 pFB-PGK-Neo-EGFP-LoxP，一个pFastBac1载体通过SnaBI/Sall供左同源臂以 及Notl/BstBI供右同源臂已于之前制成。在这个载体中，eGFP报告基因表达被 EF1α起始子控制。
重组的BV，包括BV-B2M-crRNA、BV-Cas9/tracrRNA和BV-B2M-eGFP，用 pFB-U6-B2M-crRNA,、pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA和pFB-B2M-eGFP分别生成。 并依据Invitrogen Bac-to-Bac杆状病毒表达系统协议在Sf9昆虫细胞中增殖。
实施例1:人HEK293细胞中B2M的剔除
本发明设计了一个20个核苷酸的介导序列，以碱基置换人类B2M基因外显 子2的一个预设位置，制造需要的B2M靶向CRISPR/Cas 9载体(图1A)。在有 此介导序列的情况下，CRISPR/Cas 9系统以质粒载体或杆状病毒载体表达的切 割效率在人类胎儿肾(HEK)293细胞中以T7E1测量化验测试评估。细胞被两个 表达Cas9/tracrRNA和B2M crRNA的质粒载体共同转染或被BV-Cas9/tracrRNA 和BV-B2M-crRNA(BV-B2M-CRISPR)共同转导。正如图1B所示，和对照组大约 0.46kb的单PCR带相比，在从被质粒B2M靶向CRISPR/Cas9系统或 BV-B2M-CRISPR转染的HEK293细胞中分离出的基因组DNA扩增后的扩增子中可 探测到0.18kb和0.28kb的小片段。这些结果证明了HEK293细胞基因组中B2M 基因座DSB被诱导。被BV-B2M-CRISPR转导的HEK293细胞B2M基因座的序列， 测出一些插入/缺失突变。在15份分析过的样本中，2份有在同一个位置插入了 一对腺苷碱基对，1份跟原生序列比缺失了8对碱基对(图1C)。因为由人造核 酸酶引发的插缺可以通过移动阅读框让目标基因的表达出现缺陷，这些处理过 的细胞中的B2M蛋白表达水平被检验。流式细胞分析显示细胞在被质粒或 BV-B2M-CRISPR系统处理过后，表达水平分别下调约28％和30％(图1D)。因此， 本发明的CRISPR/Cas9系统被证明可以有效导致位特定位点的B2M基因干扰以 及B2M表达的下调。
实施例2：人U87细胞中B2M的剔除
为选取稳定的B2M基因被BV-B2M-CRISPR干扰的人体细胞克隆，本发明制 造了一个基于BV的供体载体，BV-B2M-eGFP，以供选择弹夹在特定位点通过同 源重组整合进B2M基因座(图2A)。U87胶质瘤细胞，一种可以容易被BV转导 的人体细胞系，被BV-B2M-CRISPR转导并用G418选择3周。存活的细胞变为eGFP 阳性，稳定的eGFP表达持续至少3个月(图2B)。通过使用一对一个和eGFP序 列互补，一个在B2M位点右同源臂下游的PCR配子来探测一段1.4kb带，PCR 基因分型(图2C和D)被用来检查eGFP供体弹夹在B2M基因座的特定位点整合。 另外一对和原生B2M等位基因互补，扩增一段0.9kb的DNA片段的配子被用来 鉴别B2M纯合剔除的U87细胞克隆。PCR延伸进行40秒以只允许原生B2M等位 基因短片段扩增。通过检查56个从单细胞克隆得来的稳定克隆，发现49个克 隆(87.5％)显示有B2M特定位点整合(图2E)。但是，在40个有整合供体弹夹 入特定位点的克隆中，没有一个显示有双等位基因转基因整合。对从10个随机 挑选的有B2M特定位点供体弹夹整合的稳定U87克隆进行基因测序，发现目标 区域没有插缺突变(图2E)，确认了产生B2M纯合剔除U87细胞失败。这一失败 可能和这个人类细胞系的癌细胞特性有关。尽管如此，gRT-PCR，蛋白质印迹和 流式细胞分析确认了B2M mRNA和蛋白在所有检验过的B2M杂合剔除细胞克隆中 标大的下调。
实施例3：人多能干细胞中B2M剔除
在证明BV-B2M-CRISPR在人类U87细胞中的有效性后，本发明在人类多能 干细胞H1hESC上利用其对杆状病毒载体的高转导效率测试了这一系统。完成 BV转导72小时后，G418筛选开始以丰富eGFP阳性细胞。eGFP阳性的iPSC菌 落随后在正常再次培养时通过机械筛选继续扩张。纯eGFP阳性hESC菌落在扩 增大约3个月后取得(图4A)。这些克隆中eGFP阳性细胞的百分比在第20天是 18.5％，到第100天升至98.6％。用上面描述的PCR基因分型方法，本发明获得 了2个B2M纯合剔除的hESC克隆。如图4C所示，克隆2.3中一段1.4kb的扩 增证明了供体弹夹在B2M基因座的整合，0.9kb片段的缺失证明了双等位基因 更改。蛋白质印迹分析确认了B2M蛋白表达在这个B2M-/-hESC克隆的缺失(图 4D)。流式细胞分析也证明了细胞表面几乎没有B2M蛋白的表达(图4E)。正如 预计，在一个杂合(B2M+/-)hESC克隆，克隆7.1(图4C)，B2M蛋白表达下调 (图4D，E)。
本发明进一步观察到B2M剔除对hESC细胞生长和形状没有明显影响。克隆 2.3和克隆7.1都继续表达多能干细胞的标记，包括Sox2、Nanog、Oct4和SSEA4 (图5A、B)并在拟胚体形成化验中维持了分化成3系胚细胞的能力(图5C和 D)。畸胎瘤形成化验用B2M纯合剔除hESC克隆2.3来进行。所有10只植入hESC 的小鼠在2月内长出畸胎瘤。对畸胎里的分化组织的组织学检验发现了来自所 有3个胚层的组织(图5E)。因此，hESC多能干细胞的特性和分化能力并没有 收到B2M剔除系统影响。
实施例4：B2M剔除后的第一型HLA缺陷和第一型HLA缺陷细胞的免疫原性
本研究的主要目的是生成低免疫圆形的第一型HLA缺陷细胞。本发明描绘 了B2M杂合剔除(+/-)U87细胞核B2M纯合剔除(-/-)hESC细胞。B2M+/-U87 细胞相对原生U87细胞HLA I表面表达水平降低，在克隆9中大约降低50％(图 6A)。当同种异体体外免疫反应在和正常人类PBMC细胞培养后用IFNγElispot 化验评估时，原生U87细胞显著增加了PBMC中产生免疫干扰因子的细胞相比休 眠响应淋巴细胞的数量(IFNγ点频率)，但是B2M+/-U87细胞没有(图6B)。 对于B2M+/-U87细胞的异种免疫反应也进行了检验。主要鼠脾细胞被丝裂霉 素处理过的原生U87细胞刺激一周后被用于和原生U87或者U87B2M+/-细胞共 同培养的效应细胞。细胞毒性杀伤化验证明了被分解的U87B2M+/-细胞百分比 显著低于原生U87细胞(图6C)。
未分化的hPSC HLA I分子表达水平很低，HLA II水平无法检测到。当本研 究中生成的B2M纯合剔除hESC被分析时，观察到细胞HLA I，HLA II和协同刺 激分子CD40、CD80、CD83和CD86分子均为阴性。正如之前证明的那样，hESC 细胞表面的HLA I分子表达水平在体外和体内分化后只会温和上升，但是在细 胞用IFNγ处理后则会剧烈上升。为评估同种异体免疫反应，上述实验中生成的 B2M纯合剔除hESC被分化为纤维原细胞(图6D)，然后用IFNγ处理。虽然从原 生hESC细胞中分化的纤维母细胞表面HLA I分子表达水平从1.6％显著提升至 66.1％，B2M-/-hESC中分化的纤维母细胞表面HLA I表达水平却没有显著不同， 仅仅从0.9％到1.6％(图6E)。评估异体免疫原性时，过敏源性人类PBMC于HLA  I缺陷或原生hESC细胞在有IFN-γ处理和没有处理的情况下培养后用Elispot 化验评估(图6F)。没有IFNγ处理时，原生hESC和B2M-/-hESC分化的纤维 母细胞都只刺激了PBMC低水平分泌IFNγ。经过IFNγ处理后，原生hESC分化 的纤维母细胞剂量依赖性地刺激PBMC分泌IFNγ。值得注意的是，B2M剔除的 HLA I缺陷显著降低了PBMC分泌IFNγ的水平，到一个类似在没有IFNγ处理过 的纤维母细胞那里观察到的水平的。这些结果证明了产生了可以在延生细胞里 保持免疫不应答性的低免疫原性hESC。
转染实验中，HEK293细胞以1×105每井的密度在6井培养皿种植。达到 70％回合时，每个井中的细胞都用一种含1.2μg的pFB-U6-B2M-crRNA、1.2μg  pFB-CBh-Cas9-H1-tracrRNA和and 5μl脂质体2000的质粒/脂质体混合物转 染。杆状病毒转导实验中，HEK293细胞、U87细胞和H1hESC于第0日种植于6 井培养皿中，并于次日以杆状病毒载体以每个BV载体感染复数(MOI)100每细 胞转导4小时。随后，细胞培养基撤除，换为一般培养基。转导第3日起G418 药物选择转导的U87细胞核H1hESC并进行3周。然后通过有限稀释或者单细 胞筛选机筛选出单细胞克隆。
基因组DNA用Qiagene的DNeasy血液和组织工具箱分离。全RNA用TRIzol 试剂分离。
基因组DNA于转染或转导后第3日从被B2M CRISPR/Cas9系统处理过的细 胞中提取。一段0.5kb，含B2M基因座内CRISPR切割点的片段从基因组DNA中 利用B2M点干扰引子扩增，中间使用PCR SuperMix High Fidelity。PCR产物 经过提纯，去活、重新过火用不匹配敏感的T7内切酶I消化。片段最后用2.0％ 琼脂糖胶分离。
进行PCR基因分型时，使用200ng的样板基因组DNA，HiFi聚合酶，0.5μ mol/l的各引子，0.25mmol/l的dNTP和2mmol/l的氯化镁。过火温度为55摄 氏度或65摄氏度，扩增在一个温度循环器中进行35次循环。一小段延伸时间 (40秒)被用于只扩增原生型等位基因。
为RT-PCR，RNA用SuperScript III第一链生成系统反转录。PCR扩增在 94摄氏度进行15秒，55摄氏度进行20s，然后在72摄氏度进行45秒，共进行 35次循环。扩增过的产物在1.5％琼脂糖胶上分析。SYBR Green PCR master mix 被用于实时定量PCR(95摄氏度下60秒，1循环；95摄氏度下15秒，60摄氏 度下1分钟，40循环)。结果随后根据β-肌动蛋白mRNA水平进行归一化。
B2M或细胞表面第一型HLA分子的存在以流式细胞分析法使用Prep-cy5.5 标记抗B2M或APC标记抗HLA(abc)抗体(BD Biosciences)在非固定细胞中 探测。流式细胞分析也被用于检测H1hESCs用胰岛素-EDTA和冲洗后再B2M靶 向后hESC中eGFP的表达。FACS Calibur流式细胞分析仪C6被使用。
蛋白质印迹分析中，细胞以冷PBS冲洗并在含蛋白酶抑制剂、RIPA缓冲液 中分解。在4摄氏度下以10,000g离心20分钟后，上清液被采集然后蛋白质浓 度用一个BCA蛋白质化验工具包决定。在12％SDS-PAGE胶分离后，蛋白质被转 到PVDF膜上进行免疫印迹法。印迹用抗B2M抗体探测。在四次用PBS冲洗后， 辣根过氧化物酶标记二级抗体被加入。抗原-抗体结合体用增强化学发光显现。
免疫荧光染色反应中，细胞用4％三聚甲醛固定，冲洗，增加穿透性，封锁。 样本与下列抗体培养过夜(4摄氏度)：OCT3/4，SOX2，Nanog和SSEA4。免疫反 应抗原经过Alexa Fluor@594标记抗鼠IgG(1:500)或Alexa Fluor@594标 记抗兔IgG(1:500)染色可视化。细胞核染色由DAPI(1:1000的PBS；5分钟) 实现。荧光标记细胞的图像通过一台Zeiss反向荧光显微镜获得。
Elipsot化验是一种非常敏感的探测单独分泌细胞因子的细胞的方法。此法 被用来测试普通血液捐献者用异体B2M剔除细胞刺激后的外周血单核细胞的同 种异体反应性。PBMC(2×105)作为响应细胞和刺激细胞(2x 104U87或4 x 104FLC)在一个96-井，事先覆盖抗人类gamma干扰因)的Elipsot培养皿 共同在一个37摄氏度，5％二氧化碳的加湿培养器中过夜培养。培养皿的操作遵 循IFNγElispot工具箱生产商的说明。斑由一个Elispot培养皿阅读器自动 计数以供扫描分析。
对B2M干扰的U87的异种免疫也用主要鼠脾细胞测试。脾脏从原生雌性 C57Bl/6鼠(6-8周)取出，分割成小块。加入Liberase至最终浓度达0.6mg.ml。 悬浮液在37摄氏度下培养15分钟，加入EDTA至最终浓度达10mM。脾细胞随后 通过一个MESH膜并冲洗。单个脾细胞悬浮液用和丝裂霉素C处理过的U87细胞 共同培养刺激。1周后，U87刺激过的效应细胞与作为目标细胞的原生U87或者 U87B2M+/-细胞以一式三份方式，在不同的效应细胞和目标细胞比值下于37摄 氏度下共同培养4小时。细胞毒性活动用CytoTox 96非放射性细胞毒性化验并 依据生产商协议测量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现 本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非 限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落 在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权 利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施 方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经 适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。