一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法.pdf

本发明公开了一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法。本方法所用细菌为木醋杆菌(Acetobacter xylinum RZS.1)，具体步骤如下：首先采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，灭菌。在发酵形成一定厚度的细菌纤维素膜后，将海藻酸钙小球均匀铺撒在膜上，继续静态培养。待培养结束后，除去细菌及残留的发酵液，再除去掺杂其中的海藻酸钙小球，最后用去离子水冲洗数遍即可。使用本方法制备的细菌纤维素孔径得到调控，且海藻酸钙小球的尺寸大小可控，使得细菌纤维素的孔径尺寸在一定范围内可以任意改变。

权利要求书
1.  一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：分别配制5-30 g/L的海藻酸钠溶液和10-100 g/L氯化钙溶液，控制流速5-20 ml/h、电压4-20 kV，采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，将小球固定化2-36 h后，115-121℃灭菌15-30 min，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌进行种子扩增培养；
第三步：制备发酵液；
第四步：接种后，在25-32℃条件下进行静态培养，静态培养后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：静态培养结束后，取出上层膜，用0.1-1mol/L EDTA溶液溶解海藻酸钙小球；
第六步：去除残留的细胞及发酵液，用去离子水冲洗BC膜至中性。

2.  如权利要求1所述的利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第二步中，种子液配方为：葡萄糖20 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。

3.  如权利要求1所述的利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第三步中，发酵液配方为：葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.7 g/L、乳酸钙0.2 g/L、 柠檬酸0.6 g/L、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。

4.  如权利要求1所述的利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，其特征在于，第四步中，静态培养1-5天。

说明书一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法
技术领域
本发明涉及一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，属于生物材料制备领域。
背景技术
细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称BC）是由多种微生物分泌合成的一种胞外多糖，静置条件下培养，会在培养液-空气表面形成一种水凝胶膜。BC与植物纤维素（Plant cellulose，简称PC）具有相同的化学组成成分，但相比于PC，BC具有一些优越的性能，如拉伸强度高，纯度高，生物相容性好，且具有三维纳米网络结构。
基于BC的优良性能，BC已作为再生组织用于人造皮肤、血管移植等。但BC的纤维网络尺寸过小，使哺乳动物细胞在培养过程中不能渗透生长进入BC内部，限制了BC在组织工程材料上的应用。目前已发展多种提高细胞孔隙率，改变细胞空洞结构的方法，多种文献均有报道（1Baah-Dwomoh A, Rolong A, Gatenholm P, et al. The feasibility of using irreversible electroporation to introduce pores in bacterial cellulose scaffolds for tissue engineering. Appl Microbial Biotechnol, 2015:1-10. 2Yin N, Stilwell M D, Santos T M A, et al. Agarose particle-templated porous bacterial cellulose and its application in cartilage growth in vitro. Acta biomaterialia, 2015, 12:129-138. 3 Andersson J, Stenhamre H, B?ckdahl H, Gatenholm P. Behavior of human chondrocytes in engineered porous bacterial cellulose scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010, 94A:1124–1132.），如发酵过程中掺入石蜡小球、淀粉颗粒及琼脂小球等，但这些方法都存在一定的缺陷，如石蜡不易除去，反复处理会对已形成的孔洞结构造成破坏，淀粉颗粒会发生沉淀，制孔效果不明显，琼脂小球不易灭菌，BC培养过程存在染菌风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效调节细菌纤维素三维结构的方法。
本发明的原理是：木醋杆菌（Acetobacter xylinum RZS.1，简称A. xy RZS.1）是一种严格好氧菌，是BC生产的模式菌株。本发明中使用A. xy RZS.1，通过静态培养，获得正在生长的BC膜，向BC膜上铺撒海藻酸钙小球，利用A. xy RZS.1的好氧性及对营养的趋向性，细胞会穿过海藻酸钙小球向空气界面渗透移动，在随后合成BC的过程中，会将海藻酸钙小球包裹进纤维素网络结构中。由于通过静电纺丝条件的改变，调节海藻酸钙小球的大小，且获得的小球尺寸均一，这样可以制备不同孔径结构的BC。海藻酸钙小球是由钙离子交联的多糖，易于去除，在后处理的过程中不会对已调节形成的三维结构造成明显的影响。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，包括如下步骤：
第一步：分别配制5-30 g/L的海藻酸钠溶液和10-100 g/L氯化钙溶液（氯化钙用作交联剂），控制流速5-20 ml/h、电压4-20 kV，采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，将小球固定化2-36 h后，115-121℃灭菌15-30 min，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌进行种子扩增培养；
第三步：制备发酵液；
第四步：接种后，在25-32℃条件下进行静态培养，静态培养1-5天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：静态培养结束后，取出上层膜，用0.1-1mol/L EDTA溶液溶解海藻酸钙小球；
第六步：去除残留的细胞及发酵液，用去离子水冲洗BC膜至中性。
第二步中，种子液配方为：葡萄糖20 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
第三步中，发酵液配方为：葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸铵1 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、硫酸镁0.7 g/L、乳酸钙0.2 g/L、 柠檬酸0.6 g/L、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L和羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
本发明与现有技术相比其显著优点是：
1、海藻酸钠为天然多糖，且具有药物制剂敷料所需的安全性，对细菌生长代谢亦无影响。
2、采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，可以通过控制电压和流速，获得不同尺寸的海藻酸钙小球。
3、海藻酸钙小球易于去除，用EDTA溶液溶解即可。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是利用海藻酸钙调节BC结构的流程图。
图2是实施例1制备的海藻酸钙小球的显微镜放大图。
图3是本发明实施例1的结构经调控的BC扫描电镜图。
图4是本发明对比例的结构未经调控的BC扫描电镜图。
具体实施方式
结合附图1，调节细菌纤维素结构的方法，步骤如下：
第一步：配制5-30 g/L的海藻酸钠、10-100 g/L氯化钙溶液，静电纺丝控制流速5-20 mL/h、电压4-20 kV，制备海藻酸钙小球，固定化一段时间后，高温灭菌，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌在温度25-32℃，摇床转速90-250 rpm条件下进行种子扩增培养，培养6-72 h；
第三步：发酵液配制，高压蒸汽灭菌，冷却至室温，以2-20%接种量接种，进行静态培养；
第四步：静态培养1-3天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上1-5 mm厚的海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：发酵结束后，取出上层膜，用浓度0.1-1mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，搅拌至海藻酸钙小球溶解；
第六步：将第五步获得的膜浸泡在含质量分数1-10 g/L的NaOH、1-10 g/L的H2O2溶液中，在70-100℃条件下水浴0.5-3.0小时，去除残留的细胞及发酵液；
第七步：用流动的去离子水冲洗BC膜至中性。
在所有实施案例中，
种子液配方采用：葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.7 g/L，乳酸钙0.2 g/L， 柠檬酸0.6 g/L，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
发酵液配方采用：葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.7 g/L，乳酸钙0.2 g/L， 柠檬酸0.6 g/L，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纤维素钠0.4 g/L。
实施例1：
本发明提供了一种调节细菌纤维素结构的方法，具体制备方法如下：
第一步：配制10 g/L的海藻酸钠、50 g/L氯化钙溶液，静电纺丝控制流速10 mL/h、电压9.5 kV，制备海藻酸钙小球，固定化2 h后，121℃灭菌20 min，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌在温度30℃，摇床转速160 rpm条件下进行种子扩增培养，培养36 h；
第三步：发酵液配制，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至室温，以8%接种量接种，进行静态培养；
第四步：静态培养2天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上2 mm厚的海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：发酵结束后，取出上层膜，用浓度0.5 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，搅拌至海藻酸钙小球溶解；
第六步：将第五步获得的膜浸泡在含质量分数3 g/L的NaOH、3 g/L的H2O2溶液中，在80℃条件下水浴2小时，去除残留的细胞及发酵液；
第七步：用流动的去离子水冲洗BC膜至中性。
结合图2、图3、图4可知，静电纺丝制备的海藻酸钙小球能很好地掺入正在生长的BC膜中，除去海藻酸钙后，原有位置会形成孔洞，孔径尺寸在200-300 μm，与对比例获得的电镜图相比，结构得到了明显调控。
实施例2
本发明提供了一种调节细菌纤维素结构的方法，具体制备方法如下：
第一步：配制15 g/L的海藻酸钠、50 g/L氯化钙溶液，静电纺丝控制流速10 mL/h、电压15 kV，制备海藻酸钙小球，固定化1 h后，115高温灭菌25 min，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌在温度28℃，摇床转速150 rpm条件下进行种子扩增培养，培养24 h；
第三步：发酵液配制，高压蒸汽灭菌，冷却至室温，以10%接种量接种，进行静态培养；
第四步：静态培养3天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上3 mm厚的海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：发酵结束后，取出上层膜，用浓度0.7 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，搅拌至海藻酸钙小球溶解；
第六步：将第五步获得的膜浸泡在含质量分数5 g/L的NaOH、5 g/L的H2O2溶液中，在70℃条件下水浴3.0小时，去除残留的细胞及发酵液；
第七步：用流动的去离子水冲洗BC膜至中性。
实施例3
本发明提供了一种调节细菌纤维素结构的方法，具体制备方法如下：
第一步：配制17 g/L的海藻酸钠、6 g/L氯化钙溶液，静电纺丝控制流速10 mL/h、电压10 kV，制备海藻酸钙小球，固定化24 h，121℃高温灭菌20 min，冷却至室温，备用；
第二步：木醋杆菌在温度31℃，摇床转速170 rpm条件下进行种子扩增培养，培养48 h；
第三步：发酵液配制好后，121℃高温灭菌20 min，冷却至室温，以12%接种量接种，在28 ℃进行静态培养；
第四步：静态培养2天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上4mm厚的海藻酸钙小球，继续静态培养；
第五步：发酵结束后，取出上层膜，用浓度1 mol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，搅拌至海藻酸钙小球溶解；
第六步：将第五步获得的膜浸泡在含质量分数4 g/L的NaOH、4 g/L的H2O2溶液中，在90℃条件下水浴0.5小时，去除残留的细胞及发酵液；
第七步：用流动的去离子水冲洗BC膜至中性。
对比例：
未调节细菌纤维素结构的方法：
第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h；
第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌20 min，冷却至室温；
第三步：木醋杆菌以8%的接种量进行接种，接种后静置培养，培养5天；
第四步：发酵结束后，用质量分数3 g/L的NaOH和3 g/L的H2O2在80℃条件下水浴3.0小时，除去残留的细胞及发酵液；
第五步：用去离子水冲洗BC膜至中性。
结果如图4所示，未经调控的BC膜结构致密，无明显孔洞结构。