生产成熟的重组螨I类变应原的方法 【技术领域】
本发明涉及一种生产成熟的重组螨I类变应原的方法。
背景技术
WO 01/29078，实施例2描述了在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris)中生产Der f1，包括在YPD培养基中pH 6下培养以生产pro‑Der f1。回收培养介质的上清液并用pH 4.5缓冲液稀释，并在用pH 4.5缓冲液平衡的SP‑Sepharose柱中运行。用20‑25柱体积的具有线性NaCl梯度的pH 4.5缓冲液洗脱蛋白质。这种方法生产Der f1的两种成熟形式，其中一种与另一种相比具有在氨基末端的两个额外氨基酸。一般认为，巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)能生产前体并将其裂解从而生产成熟形式。在WO 01/29078的实施例12中，其推测pro‑Der f1经历自处理并被制备成在活性部位具有突变的惰性突变体(inactive mutant)。制备得到Der p1的相应突变体。在实施例12中没有指出表达所述突变体的方法。
Yasuhara等人(Clinical and Experimental Allergy，2001，Volume 31，pages 116‑124)描述了一种生产rDer f1的方法，其中野生型Der f1的前体的表达是在如下步骤中获得的：使巴斯德毕赤氏酵母在BMMY培养基中pH 6.0下生长48‑72小时，然后通过离心收获上清液。通过在4℃下对100mM乙酸酯缓冲液(pH 4.0)透析48小时，自催化地实现体外活化。
Jacquet等人(Clin Exp Allergy 2002，32_1048‑1053)公开了Der p1的生产，包括在缓冲的最小葡萄糖(BMG)培养基中培育巴斯德毕赤氏酵母，所述巴斯德毕赤氏酵母含有具有编码proDer p1的cDNA的质粒。通过每天加入甲醇0.5％来诱导表达。通过离心收集上清液。所收集的proDer p1在柱上并通过超滤进行纯化。通过Der p1的自催化处理使纯化的proDer p1经受熟化，所述自催化处理是通过对100mM醋酸钠缓冲液pH 4的透析。
De Halleux等人(J Allergy Clin Immunol，2006)公开了野生型rproDer p1的生产和rproDer p1的N52Q非糖基化突变体。使用pPICZαC作为表达载体在巴斯德毕赤氏酵母X‑33中进行表达。所述培养物在30℃下在指定的发酵培养基中培养。然后在30下用甲醇诱导所述培养物3天。在培养和诱导期间将所述培养基的pH调节至6.0。对所述由发酵产生的培养混合物进行离心并将上清液对25mmol/L醋酸钠缓冲液pH 4.5进行透析，并且在4.5C下保持约3‑4天用于pro‑Der p1和pro‑Der p1N52Q成为成熟的变应原的自熟化。然后通过在SP‑Sepharose上的阳离子交换以及附加的步骤进行纯化。
本发明的目的是提供一种生产重组成熟螨I类变应原的改进方法。
发明概述
本发明实现了此目的，即涉及一种生产成熟的重组螨I类变应原的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供宿主细胞形式的变应原表达系统，所述宿主细胞选自包含载体的酵母，所述载体含有编码前变应原的cDNA，
b)在5.5‑7.5的培养pH下培养所述变应原表达系统一定的培养期以表达前变应原，从而获得包含前变应原的培养混合物，
c)将培养混合物的pH调节至3.5‑5.0的熟化pH，
d)将所述培养混合物在熟化pH下维持一定的熟化期以将所述前变应原转变成成熟的变应原，从而获得产物混合物，和
e)使所述产物混合物经历纯化方法，以从产物混合物中分离成熟的变应原。
本发明是基于可能在培养混合物中进行前变应原的熟化以获得成熟的变应原的实验发现，其中表达是在没有任何从培养混合物中的在先分离或纯化产物的情况下进行的。这种方法与现有技术方法相比具有许多优点。第一，本发明的方法简单，因为其允许在同一反应器中进行表达和熟化，由此省去了对单独熟化步骤的需要。第二，在完成表达之后可立即进行熟化而无需任何居间的纯化步骤，这使得可能更有效地控制熟化方法，特别是避免在纯化步骤下发生不受控制的熟化。
本发明方法的第三个优点是缩短成熟期，这对将前变应原和成熟变应原的降解减到最小很重要，由此提高产率。
第四个优点是在熟化期期间中允许继续表达和分泌，这提高了产率和/或允许缩短表达期。
第五个优点是纯化步骤简单化，因为仅仅分离变应原的成熟形式，而在现有技术的方法中表达步骤通常会产生包含前变应原和成熟变应原的混合物的发酵产品，这使得需要额外的纯化步骤。
【附图说明】
图1显示出在熟化期期间内在0、3和18小时时获得的培养混合物样品的SDS‑PAGE。
发明详述
螨I类变应原 通过本发明的方法生产的螨I类变应原可以是任何已知的无气门目(orderAstigmata)的螨I类变应原，特别是选自粉螨总科(Acaroidea)、嗜甜螨总科(Glycyphagoidea)和羽螨总科(Analgoidea)的变应原，更特别是选自粉螨科(Acaridae)、嗜甜螨科(Glycyphagidae)、棘鼠螨科(Echimyopodidae)和蚍螨科(Pyroglyphidae)的变应原，更特别是选自粉螨属(Acarus)、无爪螨属(Blomia)、尘螨属(Dermatophagoides)、嗜霉螨属(Euroglyphus)、食甜螨属(Glycyphagus)、嗜鳞螨属(Lepidoglyphus)和食酪螨属(Tyrophagus)的变应原。在本发明具体的实施方案中，所述螨I类变应原选自Aca s1、Blo t1、Der f1、Der p1、Eur m1、Gly d1、Lep d1和Tyr p1。特别是所述螨I类变应原选自Blo t1、Der f1、Der p1和Eur m1。更具体而言，所述螨I类变应原是Der p1。
此外，通过本发明方法生产的螨I类变应原可以是上述变应原的天然存在的同等型，以及上述变应原的突变的变体，例如通过重组技术制备的突变的变体。例如，可以进行突变以获得野生型变应原的低变应原变体，以使变应原更稳定和/或更易于表达和纯化以及以改变变应原的糖基化类型，例如通过取代带有聚糖侧链的氨基酸。
变应原表达系统 所述宿主细胞可以是任何适于本目的的酵母，特别是酵母目(Saccharomycetales)的酵母，更特别是选自毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)和假丝酵母属(Candida)的酵母。在本发明具体的实施方案中，所述宿主细胞是糖酵母科(saccharomycetaceae)的，更特别是选自毕赤氏酵母属(Pichia)和糖酵母属(Saccharomyces)，以及最特别是选自巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastohs)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
所述载体(vector)可以为用作编码前变应原的DNA的转运体(carrier)的任何传统载体，并且其可以被引入到寄主细胞中并在其中表达。所述载体特别可以是质粒或噬菌体。合适的载体的示例是大肠杆菌(E.coli)/巴斯德毕赤氏酵母穿梭载体pGAPZαA、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9K和pHIL‑S1。
在本发明一个具体的实施方案中，所述载体包括组成型启动子，例如编码甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶的GAP基因的启动子。在本发明另一个具体的实施方案中，所述载体包括甲醇‑可诱导的启动子，例如AOX启动子。在本发明一个具体的实施方案中，所述载体包括用于分泌的信号序列，例如酿酒酵母α因子和PHO1。
在本发明一个具体的实施方案中，所述酵母是巴斯德毕赤氏酵母且所述载体是pGAPZαA。
在本发明具体的实施方案中，修饰所述变应原的氨基酸序列以使得在分子的C‑末端包含许多组氨酸残基。这种组氨酸残基的序列，通常被认为是HIS‑标签(HIS‑tag)，形成供亲和色谱法使用的金属结合位点，用于简化从发酵液体混合物中纯化重组分子。
前变应原的表达 在5.5‑7.5的培养pH下培养所述变应原表达系统一定的培养期以表达前变应原，从而获得包含前变应原的培养混合物。具体而言，所述培养pH为5.8‑7.2之间，更优选6.0‑7.0，更优选6.2‑6.8。
在本发明一个具体的实施方案中，所述培养期为12小时‑144小时，优选24小时‑120小时，更优选48小时‑96小时。
proDer p1向成熟Der p1的熟化 将培养混合物的pH调节至3.5‑5.0的熟化pH。在本发明一个具体的实施方案中，所述熟化pH是3.7‑4.8，更特别是3.9‑4.6，并最特别是4.0‑4.5。
在本发明另一个具体的实施方案中，所述熟化期是8小时‑30小时，特别是12小时‑26小时，更特别是14小时‑24小时，更特别是16小时‑22小时并且最特别是17小时‑21小时。
纯化方法 用于从发酵液体混合物中分离蛋白质产物的任何常规方法都可以用在本发明的方法中作为纯化方法，以从熟化所得到的产物混合物中分离成熟的变应原。
合适的纯化方法的实例是离心法、过滤法、超滤法、透滤法、透析法、胶滤法、沉淀法、亲和色谱法以及这些方法的组合。
定义
关于本发明，使用以下定义：
术语“前变应原”是指变应原分子的前体，即包含成熟部分和分子的前肽的变应原分子。
实施例
实施例1：重组Der p1的生产 本实施例提供一种在巴斯德毕赤氏酵母中表达pro‑Der p1型之后生产成熟的重组Der p1的方法。前体的熟化是在发酵容器中进行的，通过在确定的时段内调节pH至4.0以使所有的pro‑Der p1都被加工成随后被纯化的成熟的Der p1分子。
rproDer p1变体的构建：
通过PCR构建局部遗传密码最优化的rproderp1野生型(wt)(从现在起写为rproderp1)cDNA，所述cDNA包含用于rproDer p1wt(从现在起写为rproDer p1)的完整编码区域并具有额外的10aa C‑末端His标签。所述编码的rproDerp1蛋白质相当于具有额外V204A的UniProt登记号P08176的proDer p1区域(aa 19‑320)(贯穿本实施例的aa编号是从proDer p1的第一个aa开始)，其是天然存在的变体。分别使用正向引物和反向引物以产生在5′和3′末端附近具有引入的Xhol和Xbal限制性位点的964bp片段。将该rproderp1基因克隆到pCR4‑TOPO中，转化到TOP10(Invitrogen)中并验证序列。随后使用限制酶Xhol和Xba1通过定向克隆将rproder p1基因再克隆到大肠杆菌/巴斯德毕赤氏酵母穿梭载体pGAPZaA中。这产生具有酿酒酵母α因子下游的rproDer p1编码区域的质粒rproderp1，所述酿酒酵母α因子在两个蛋白质之间具有促进重组蛋白质分泌的Kex2裂解位点。
所述质体最初被转化入E.coli TOP10细胞中。
通过重叠延伸法(overlap extension method)完成位点特异突变体N132D的构建。简言之，在一个PCR反应中，正向引物1与反向引物7一起使用，在另一个PCR反应中反向引物3与正向引物6一起使用，以及在第三个PCR反应中反向引物2与正向引物8一起使用，所有都以proderp1作为模板。通过在最后的PCR反应中一起使用所述三个生成的PCR产物以及引物1和2产生含有突变得完全片段，继之以将957bp Xhol‑Xbal片段定向克隆到pGAPZaA中，如为proderp1所描述的，产生质体rproderp1‑N132D(从现在起写为rproderp1‑N)。
rproDer p1变体的表达和纯化：
根据制造商的操作流程将pGAPZαA‑rproderp1‑N转化到巴斯德毕赤氏酵母X33wt菌株(Invitrogen)中。将克隆重复划线在YPDZ‑琼脂平板上并检查表达。如制造商(Invitrogen)提供的操作流程所描述，培养表达rproDer p1‑N132E的巴斯德毕赤氏酵母X33::rproder p1‑N克隆(从现在起写为rproDer p1‑N)，简言之：，用来自单个菌落的细胞接种5ml YPDZ培养基(YPD+100μg/ml Zeocin)并使其在震荡器中于220rpm 30℃下生长过夜。2ml的该培养物用于接种400ml的新鲜YPD(酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖)培养基，在使用所述YPD培养基用于接种待用于发酵的3.6l的YPD培养基之前，先将所述YPD培养基培养过夜。
在5L最大容量的容器中，在B.Braun‑Biotech Internationalsystem(BIOSTAT B‑DCU型)中以以下基本发酵条件进行发酵：
‑温度30℃
‑800rpm的搅拌速度
‑0.8体积每分钟的气流供给
‑pH最初控制在pH 6.5，通过自动加入30％NH4OH或5％H2SO4。
发酵是在称为YPD的复合物培养基中进行的，所述YPD的成份为1％酵母提取物、2％大豆蛋白胨和2％葡萄糖。通过在600nm处的光密度测量来控制生长培养物的细胞密度。控制利用pO2电极测量的溶解氧以便于进行细胞分裂(低的pO2水平表明由于高细胞活动的高耗氧量，而增加的pO2水平表明由于例如碳源耗尽的低细胞活动或细胞分裂)。如果加入碳源是必需的，将包含5％葡萄糖、13.4％酵母氮碱(YNB)和0.02％生物素的溶液加入到进行中的培养物。
pH调节以及proDer p1向成熟Der p1的熟化：
以6.5的受控pH发酵48h之后，所表达的重组产物是r‑pro‑Der p1，其可以通过SDS‑PAGE进行验证。为了开始熟化过程，将pH减小至pH 4.0并维持在该水平上，同时使其它发酵条件保护不变。在酸性pH下18小时后，观察到仅有成熟的r‑Der p1作为重组产物，参见图1。在进行分离成熟的r‑Der p1时，为了避免更多的蛋白酶活性，将pH升至pH 8.0，并收集培养物。
纯化方法：
通过离心和随后的过滤从酵母细胞中澄清(clarify)并分离包含所分泌的重组产物的培养液。分两步进行(NH4)2SO4(硫酸铵)沉淀法，第一步达到1.8M的(NH4)2SO4浓度，继之分离沉淀的和可溶的产物，和在第二步中，使第一步后获得的上清液达到3.2M的盐浓度。这样高的盐浓度诱导重组产物从来自第一步的上清液(其包含许多蛋白质污染物)中选择性沉淀，由此使得所述重组产物的纯化。所有这些步骤都是在4℃下进行。离心后，使成团块的沉淀物从在高盐浓度下可溶的组分中分离，并将所述团块贮藏在‑20℃下。
通过亲和色谱法，根据透析样品的BD‑TALON金属亲合力(BD Biosciences)实现重组产物(成熟的r‑Der p1)的进一步纯化。通过组氨酸标签将所述重组产物精特异性地与柱结合，并通过加入咪唑的色谱缓冲液(50mM磷酸钠，300mMNaCl，pH 8.0)至300mM的终浓度进行洗脱。在4℃下，在AKTAexplorer平台上进行色谱步骤。将洗脱峰对缓冲液盐水进行透析并且样品保持冷藏。
结论：
从上可知，本实施例表明可以在同一反应器中进行培养以表达所述前变应原及其熟化，即在熟化之前没有任何从培养混合物的残余组分中分离前变应原的步骤。同时，该实施例表明可在比较短的时段(18小时)内进行熟化。