测定病毒滴度的酶免疫斑点法 本发明涉及病毒滴度的测定方法，特别是酶免疫斑点法(EIS)测定病毒滴度。
病毒学理论研究应用病毒学的研究及生产过程都涉及病毒量的测定，即病毒滴度的测定。以往和现行的测定方法主要有动物法、蚀斑法和细胞病变法，其中常用的是蚀斑法和细胞病变法，特别是细胞病变法(CPE)，因其较蚀斑法简便，利于多份样品的测定，常在多批量的测定中采用。但是，CPE法是以显微镜下观察细胞病变为判定指标，并依此计算半数细胞感染剂量(TCID50)；试验对操作者技术要求高，不同病毒造成的细胞病变有差异也有雷同，造成病变结果不易辩认。因此，试验结果受主观因素影响较大，操作误差大，另外，CPE工作量大，工作强度高，操作时间长。
本发明的目的是提供一种病毒滴度的测定方法，该方法简便、快速、便于记录结果，操作误差小。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种测定病毒滴度的酶免疫斑点法，它包括以下几个步骤：
(1)单层细胞准备，并向细胞培养板各孔中加入细胞悬液；
(2)病毒稀释，并将稀释后不同浓度的病毒分别加到测定用的细胞培养板孔中；
(3)感染细胞的培养；
(4)将步骤(3)中的感染细胞固定、封闭；
(5)加入该病毒的特异性抗体；
(6)加酶标记的第二抗体；
(7)加酶底物，数分钟后有病变的部位即出现染色斑点。
上述测定步骤中，从细胞准备至感染细胞培养系常规技术方法，对绝大多数病毒均适用，在作具体病毒的测定中，仅需改变该病毒地特异性抗体即可，其余各培养、反应步骤中，温度控制在36-37℃之间，抗体反应时间控制在20分钟至60分钟(除酶与底物作用时间较短外，底物抗体反应在室温下进行)。
本发明利用免疫反应的特异性和酶化学反应放大性特点，创造性地形成染色斑点，使显微镜下才能辩别出来的细胞病变以肉眼可见的形式表现出来，并且保证了这种表现方式的特异性(抗原-抗体特异性结合)，以往的酶联免疫吸附试验(EIA)都以显色反应测定OD值来判定结果或观察液体的颜色变化，其抗原、抗体反应是在可溶解和分散的状态下进行的，底物显色也是在溶解于液体中再表现出来的，而EIS与EIA的不同在于前者的反应及表现都是在细胞病变部位发生的，是定位的，有形的，与酶免疫组织化学技术相比，EIS是在细胞培养板上直接检测染色斑点，是有重要区别的。
本发明优点：通过引入酶免疫技术使微量板上出现的CPE部位形成特异的染色斑点，从而可以用肉眼直接判定各孔是否出现CPE，免去显微镜下观察CPE造成的工作量增加，使结果客观、更直观，快速、便于记录，操作误差小。
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：
1、取培养3-5天，生长良好的FL细胞(长春生研所提供)，用细胞消化液处理后，弃干消化液，将细胞于细胞培养液中(MEM培养基含5％小牛血清，青霉素、链霉素各1万u/ml，稀释成30-50×104/ml浓度。在96孔细胞培养板上每孔加细胞悬液100μl。
2、取麻疹病毒(长春生物制品研究所(长47株)50批)在试管中稀释成10-4、10-5浓度，分别加入细胞培养板孔中，每个浓度加8孔，每孔100μ1，继续做细胞培养。
3、培养板置于5％CO2培养箱中，37℃，8天，
上述几个步骤可见计划免疫技术管理规程(卫生部1987年)。
4、固定：将培养8天的培养板弃其培养液，各孔加固定液(70％丙酮/PBS(磷酸盐缓冲液))150μl，置冰盒内15分钟，弃去固定液，通风处凉干，置-20℃备用或直接进行下一步。
5、封闭：各孔加稀释液(PBS/BT)〔即PBS(0.01M，PH7.2)+0.5％明胶及0.15％吐温-20(Tween-20)〕150μl，37℃，30分钟，再用洗液(PBS/T)〔PBS+0.05％吐温-20(Tween-20)〕洗3次。
6、加抗麻疹病毒单克隆抗体(McAb)V17株，该抗体以PBS/GT稀释1∶3000，随后每孔加75μl，37℃，40分钟，洗6次(洗液同上。
7、加抗鼠IgG-过氧化物酶标记物(Ab-E)(美国ZYmed公司产品)
用时以PBS/GT稀释1∶3000，每孔加75μl置37℃，40分钟，洗6次(洗液同上)。
加底物：用10ml的底物稀释液(用1.0M柠檬酸将0.1M醋酸钠至PH5.5)加入200μlTMB(系Sigma公司产品，100mgTMB溶于20mlDmso中，分装成1ml/瓶，置-20℃备用)再加20％H2O22μl，混匀后每孔加75μl，室温下放置5-20分钟。
结果判定：白色背景下肉眼观察，出现兰色斑点为阳性，未加病毒细胞的对照孔不出现染色斑点，记录各孔情况见图片(附图1)。
图1中两个“S”指两份样品，“-4，-5”指10-4和10-5两个稀释度，NO.V.Contr指没有病毒的对照，即没有感染病毒的细胞经处理后不出现染色斑点，阴性对照。
病毒滴度计算(Karber法)：计算半数细胞感染浓度(TCID50)，用其对数表示病毒滴定，LogTCID50=Xm+d(50-Σpi100)]]>
Xm＝病毒最高浓度的对数
d＝稀释倍数对数
ΣPi＝每个稀释度出现病变(斑点)孔数占同稀释度所用孔数的百分数，在公式中，Xm＝-4，d＝1，Pi计算时分母为8，如10-4浓度下有6孔出现斑点，则P-4＝6/8×100％＝75％，即10-4浓度下有75％孔出现斑点。
结果：
1、试验的50批病毒滴度(TCID50/ml)，最低的小于4.5，最高的6.5，分布见表1，50批病毒滴度与CPE法相比较，49份相符，符合率98.0％(49/50)，其中一份病毒滴度不一致，EIS法滴度为6.50，CPE法是6.375。
2、50批病毒滴度共用800个试验孔，各孔结果(+/-)总符合率为99.88％(799/800)。
所有阴性对照孔未出现斑点。
3、以800个试验孔结果(+/-)计算特异性，按下述方式计算：真阳性数 假阴性数 510 0 510假阳性数 真阴性数 本试验 1 289 290
总数 800敏感性＝510/510×100％＝100％特异性＝289/290×100％＝99.66％
表1 50批麻疹病毒EIS法滴度分布续上 5.50 5.625 5.75 5.85 6.0 6.125 6.25 6.375 6.50 3 5 6 7 3 5 4 4 2