具有抗病毒活性的6－2－膦酰基甲氧基烷氧基嘧啶衍生物.pdf

具有抗病毒活性的6-2’- (膦酰基甲氧基)烷氧基嘧啶衍生物
    【发明背景】

    【发明领域】

    在例如US 4659825、4808716、4724233、5142051、5302585、5208221、5352786、5356886、EP 269947、481214、630381、369409、454427、468119、434450、618214、398231和WO 95/07920、94/03467和96/3 3200中公开了含膦酸酯基团的无环核苷酸类似物。这些专利的教导包括：其中膦酸酯基团通过2-(甲氧基)丙基、2-(甲氧基)乙基、2-甲氧基-3-羟丙基或2-甲氧基-3-氟丙基与所定义的嘌呤或嘧啶碱相连(通常连接在嘧啶或嘌呤碱的1-或9-位上)的化合物分别被称为PMP、PME、HPMP和FPMP嘌呤或嘧啶化合物。这些化合物具有抗病毒和抑制细胞活性。

    Daluge等人(34th Interscience Conference on AntimicrobialAgents and Chemotherapy，Oct.4-7，1994)公开了carbovir衍生物，其中，嘌呤的6位被环丙基氨基、N-环丙基-N-甲基氨基或N-丫丙啶基取代。

    在Cihlar et al.，″Antimicrobial Agents and Chemotherapy″39(1)：117-124(1995)中公开了N⁶-氨基己基-PMEDAP。

    在Holy et al.，″ACS Symp.Ser.″401：57-71(1989)和Holy″Kem.Ind.″38(10)：457-462(1989)中描述了一些N6-取代的核苷酸类似物的抗病毒活性。

    在Holy et al.，″Collect.Czech.Chem.Commun.″64：242-256(1999)；Eger et al.，″J.Med.Chem.″37：3057-3061(1994)；Wormstadt et al.，″J.Heterocyclic Chem.″37：1187-1191(2000)和Franchetti et al.，″Nucleosides&Nucleotides″14(3-5)：607-610(1995)中公开了其它的膦酸酯-取代的嘧啶类似物。后三篇文献公开的类似物具有膦酸酯的侧链，该侧链通过2，4-二取代嘧啶的6-N取代基连接。

    发明目的

    本发明的一个目的是提供具有抗病毒活性，特别是抗RNA或DNA病毒(如，HIV、HBV或HSV)活性的化合物。

    本发明的另一个目的是提供可用于制备离子交换树脂或手性介质的化合物。

    本发明的再一个目的是提供用于制备所述化合物的中间体和方法。

    通过进一步参阅本发明公开内容，将更充分地理解上述目的和其它目的。

    发明概述

    根据本发明，提供了式(I)新化合物、其盐和其溶剂合物，

    

    其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₂是H、甲基、卤素、-N(R₅)₂、羟基、保护的羟基或式(Ia)基团

    

    R₃独立地是H、甲基、羟甲基、卤代甲基或保护的羟甲基；

    R₄是H或卤素；

    X独立地是氧、硫或键；

    Z独立地是羟基、酯或酰胺；

    R₅独立地是H、C₁-C₈烷基或保护基；和

    *表示手性碳原子。

    本发明目的还可通过式(I)化合物的制备方法实现，

    

    其中，

    R₁、R₂、R₃、R₄、X、Z、R₅和*定义同上；所述方法包括在碱存在下和在偶极非质子溶剂中，将式(II)化合物，

    

    其中，

    R₁和R₅定义如上；

    R₂是H、甲基、卤素、-N(R₅)₂、羟基或被保护的羟基；和

    X是O或S；

    与式(III)化合物反应，

    *

    Y-CH₂CH(R₃)-O-CH₂P(O)(Z)₂

    其中，    (III)

    Z是酯或酰胺；

    *表示手性碳原子；

    R₃是H、甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；和

    Y是离去基团，

    得到式(I)化合物，其中，Z是酯或酰胺；(b)任选转化一个或两个Z基团，制得至少一个Z为羟基的式(I)化合物。

    在本发明的另一实施方案中，提供了式(I)化合物的制备方法，其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₂是-N(R₅)₂；

    R₃独立地是H、甲基、羟基甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    R₄是H或卤素；

    X是氧或硫；

    Z独立地是羟基、酯或酰胺；

    R₅独立地是H、C₁-C₈烷基或保护基；和

    *表示手性碳原子，

    所述方法包括将式(IV)化合物，

    

    其中，

    R₃是H、甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    X是O或S；和

    Z是酰胺或酯；

    与N(R₅)₂反应。任选转化一个或两个Z基团，得到至少一个Z为羟基的式(I)化合物。

    在又一实施方案中，提供了式(V)化合物的制备方法，

    

    其中，

    R₃是H、甲基、羟甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    R₅独立地是H、C₁-C₈烷基或保护基；

    X是O或S；

    Z独立地是羟基，酯或酰胺；和

    *表示手性碳原子；

    所述方法包括，在无水溶剂、碱金属氢氧化物或碱金属碳酸盐的水溶液中，将式(IVa)化合物与N(R₅)₂反应，

    

    并任选将Z基团转化，得到一个或两个Z为羟基的式(V)化合物。

    在另一实施方案中，提供了式(VI)化合物的制备方法，

    

    其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₃是H、甲基、羟基甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    Z独立地是羟基、酯或酰胺；和

    *表示手性碳原子；

    所述方法包括，在碱存在下，将式(VII)化合物，

    

    其中，R₁是H、氨基或甲硫基；

    与式(VIII)化合物反应。

    HOCH₂CH(R₃)OCH₂P(O)(Z)₂

    (VIII)

    任选将一个或两个Z转化成羟基。

    在本发明的另一实施方案中，提供了式(XIII)化合物的制备方法，

    

    其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    *是手性碳原子；

    R₂是H、氯、羟基或氨基；

    R₃是H、甲基、卤甲基或羟基甲基；和

    Z是酰胺或酯；

    所述方法包括，在无溶剂的碱存在下或在非质子溶剂存在下，将式(IX)化合物，

    

    其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₂是H、氯或氨基；

    与式(X)化合物反应，

    

    其中，

    R₃是H、甲基、羟基甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    *是手性碳原子；

    R₆是羟基或被保护的羟基；或

    R₃和R₆通过环状缩醛或缩酮保护基连接；

    制得式(XI)化合物，

    

    其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    *是手性碳原子；

    R₂是H、氯或氨基；和

    R₃是H、甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；和

    (b)在碱存在下，在二甲基甲酰胺或四氢呋喃中，将化合物(XI)与式(XII)化合物反应，得到式(XIII)化合物，

    Y-CH₂P(O)(OZ)₂

    (XII)

    式(XII)中，

    Y是离去基团；

    Z是酰胺或酯；和

    (c)任选将式(XIII)化合物中的Z水解，制得其中1或2个Z为羟基且X是氧原子的式(VI)化合物。

    在本发明的另一实施方案中，提供了式(I)化合物的制备方法，其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₃是H、甲基、羟基甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    R₄是卤素；

    X是氧；

    Z独立地是羟基、酯或酰胺；和

    *是手性碳原子；

    所述方法包括(a)在惰性溶剂中，将式(VI)化合物，其中，

    R₁是H、氨基或甲硫基；

    R₃是H、甲基、羟基甲基、卤甲基或被保护的羟基甲基；

    Z独立地是酯；和

    *是手性碳原子；

    与卤元素反应，得到式(I)化合物。

    任选将一个或两个Z转化成羟基。

    本发明的其它目的通过一种方法实现，该方法包括对需要上述治疗的患者施用治疗有效量的式(I)化合物。

    发明详述

    如本发明所述，除非本文另有修改，烷基指支链、直链或环状饱和烃，包括甲基、乙基、丙基、环丙基、环丁基、异丙基、正、仲、异和叔丁基、戊基、异戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、新戊基和叔戊基。

    卤素一般是指氯，但包括溴、氟或碘。

    R₁一般是H或氨基，但也可以是甲硫基(即，甲硫基)；

    R₂一般是羟基或-N(R₅)₂，其中，R₅独立地是H或C₁-C₈烷基；

    R₃一般是H或甲基，但可以是羟基甲基(一般是基本上不含(R)对映体的(S)构型)或卤甲基，并且，如果是甲基或卤甲基，则优选为基本上没有(2S)构型的(2R)构型。卤甲基一般是氟甲基。

    R₅一般是H，但也可以是低级(C₁-C₃)烷基(一个或两个R₅为低级(C₁-C₃)烷基)。

    如下文进一步详细说明，Z适宜是迄今已知的用于核苷酸膦酸酯上的任何酯或酰胺。当Z是酯时，其结构为OR₇。虽然下述其它R₇酯基合适用作保护基或用作前药的前官能团，但是，在本身具有抗病毒活性的化合物中，R₇通常是H(即，Z是羟基)。

    X优选是O。

    如果希望保护本发明化合物以免发生不需要的反应或当目的是提供化合物的体内前药时，Z是酯或酰胺。否则，Z是OH。

    在其中Z＝OH的本发明化合物的合成中，酯或酰胺用作被保护的中间体。在该实施方案中，根据所涉及反应的性质，对酯或酰胺的选择可能并不重要。在合成中，在想要除去Z取代基的步骤之前不除去Z取代基，并且，如果根据理论难以判断，则可通过基本实验来决定。例如，酯尤其可用于保护膦酸酯羟基以防发生烷基化反应。

    当Z用作前药官能团时，在体内从膦酸酯上除去酯或酰胺。根据酯酶和/或羧基肽酶的底物特异性任选合适的前药酯或酰胺，所述酯酶和/或羧基肽酶应当在前体需在其中进行水解的细胞内发现。这些酶的特异性是未知的，因而，筛选多个本发明核苷酸类似物，直至发现所需的底物特异性。根据出现的游离膦酸酯或抗病毒活性，这一点是显而易见的。通常选择的化合物为：(i)在上消化道内不水解或水解较慢；(ii)可渗透肠和细胞；和(iii)在细胞质和/或体循环内水解。特定组织的细胞筛选用于识别在易受靶病毒或微生物感染的器官中释放的前体，例如，就肝而言，前药能在肝中水解。诸如CMV或HIV的其它感染任选用前体进行处理，所述前体在所有组织内的水解速率和水解程度基本相同。本领域的已知测定法适用于上述目的，包括肠腔稳定性测定、细胞渗透性测定、肝匀浆稳定性测定和浆稳定性测定。这些测定法用于测定前体的生物可利用率特性。

    酯和酰胺取代基Z的典型实例参见WO95/07920、WO98/04569和EP 481214 A1。在这些文献(及其所引证的文献)中公开的任何酯或酰胺类基团可用作本发明的Z基团。

    通常，两个Z均为羟基或均为酯和/或酰胺，即，一般是两个Z都是或都不是羟基。一般而言，当两个Z都不是OH时，则其中一个Z是酰胺，另一个Z是酯。优选带有天然氨基酸的酰胺和带有苯基的酯。氨基酸Z基团的羧基一般用C₁-C₈烷基酯化。

    一般而言，在直接用于抗病毒的化合物中，Z是羟基，即，所述化合物无需任何酯或酰胺体内水解就可使用。

    羟基保护基包括缩醛、缩酮或C₁-C₈烷基。氨基的典型保护基是三苯甲基。其它的常规保护基是已知的(Greene等人，″ProtectingGroups in Organic Synthesis，2^ndEd.1991，pp.10-142和309-405)。

     用途

    本发明化合物用于治疗病毒，或用作制备所述化合物的中间体。待治疗的病毒感染或用于测验本发明化合物敏感性的病毒感染的实例包括由DNA或RNA病毒导致的感染，所述DNA或RNA病毒是，例如，疱疹病毒(CMV、HSV 1、HSV 2、EBV、水痘带状疱疹病毒[VZV]、1型牛科疱疹病毒、1型马科疱疹病、HHV-6、乳头状瘤病毒(包括致癌HPV的1-55型HPV)、黄病毒(包括黄热病病毒、非洲猪霍乱病毒和日本脑炎病毒)、披膜病毒(包括委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒)、流感病毒(甲-丙型)、逆转录病毒(HIV-1、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、SIV、FeLV、FIV、MoMSV)、腺病毒(1-8型)、痘病毒(牛痘病毒)、肠道病毒(1-3型脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒和ECHO病毒)、肠胃炎病毒(诺沃克病毒、轮状病毒)、汉坦病毒属(汉坦病毒)、多瘤病毒、乳多空病毒、鼻病毒、1-4型副流感病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、甲型、乙型、丙型和戊型肝炎病毒等。

    本发明用于治疗疱疹病毒、嗜肝DNA病毒和HIV的优选化合物为其中R₁＝NH₂、R₂＝NH₂或OH、X＝O和R₃＝H或甲基的化合物。使用本领域技术人员所熟悉的酶抑制试验、组织培养试验和动物模型试验等，通过常规抗病毒活性实验，测定本发明化合物的其它抗病毒活性。

    本发明新化合物本身或作为中间体还可用于制备具有多种诊断、治疗和工业用途的聚合物。

    本发明化合物适合用作制备亲和吸收介质的中间体，所述亲和吸收介质带有取代基，该取代基具有能够从不纯混合物中吸收化合物的性质。亲和吸收介质的制备和使用方式与其它含有诸如膦酸酯或氨基的相同取代基的离子交换介质相同。例如，本发明化合物的膦酸酯基团与不溶基质共价连接，且杂环碱上的游离R₁氨基取代基用作离子交换位部位。或者，杂环碱的氨基与基质连接，而游离膦酸酯基团用于带正电分子色谱吸附。本发明的其它固定化化合物可用于提纯蛋白质，例如，本发明化合物可与之结合的酶，如转运蛋白(参见Cihlar，supra)。

    将本发明化合物掺入诸如聚合树脂的不溶基质中的合适方法对本领域技术人员而言是显而易见的。通过将嘧啶氨基或羟基共价交联到不溶基质上，可以将本发明化合物固定化。类似地，使用迄今为止已知的共价交联剂，通过将膦酸酯基团的羟基或将羟基甲基R₃结合到基质或树脂上，使本发明化合物掺入到不溶树脂中。在Cihlar(supra)中描述了合适的交联方法。

    在亲和吸收基质的制备中，本发明化合物还可用作交联剂或间隔基(与上一段说明的本质上作为亲和部分的功能相反)。本发明化合物含有多种官能团，它们适合作为与预期物质的交联部位。通常将诸如激素、肽、抗体、酶、药物等亲和试剂连接至不溶基质上。使用这些不溶试剂，按已知方式从制成制剂、诊断样品和其它不纯混合物中吸收物质。类似地，将固定化酶用于进行易于从产物中分离酶的催化转化。

    在一些实施方案中，无需将本发明化合物交联至不溶基质上。例如，在可溶诊断试剂的制备过程中，本发明化合物可用来将分析物连接到可检测基团上。

    采用本发明化合物中的取代基进行交联的方法是本领域已知的。例如，膦酸被用来与醇形成酯或与胺形成酰胺。类似地，存在于嘧啶上的氨基、卤素、羟基和其它活性部位是合适的。当然，在装配交联试剂时，必要时可以保护活性基团。一般，在使用本发明化合物时，通过膦酸将其交联至交联配体的羟基或氨基上，并通过本发明化合物的其它取代基共价结合至其它结合配体上。例如，用本发明的膦酸酯化诸如甾体激素的第一结合配体，然后，该结合体再通过R₃羟基甲基交联至溴化氰活化的琼脂糖上，从而获得固定化类固醇。用于结合的其它化学过程是已知的。例如，参见Maggio，″Enzyme-Immunoassay″(CRC，1988，pp 71-35)和其中引述的参考文献。

     药物制剂

    将本发明化合物和其生理上可接受的盐和溶剂合物(下文总称为活性组分)进行配制，并通过与所治疗疾病相适的任何途径进行给药。优选将化合物和制剂灭菌。

    将活性组分混入药物制剂中。该制剂，不论用于兽医还是用于人类，含有至少一种上文定义的活性组分以及一种或多种可药用载体和任选的其它治疗组分。载体必须是“可接受的”是指：其与制剂中的其它组分相容并且对于接受者无害。

    制剂适宜以单位剂型存在，并可通过药学领域任何已知方法制得。一般，通过将活性组分与液体载体和/或细碎固体载体均匀和紧密结合来制备所述制剂，然后，如果需要，将产品成形。

    适于口服给药的本发明制剂可以是分散单元剂型，例如，各自含有预定量活性组分的胶囊、扁囊剂或片剂；粉剂或粒剂；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油或油包水乳状液。活性组分也可以是大丸剂、干药糖剂或糊剂。

    对于眼或诸如口和皮肤的其它外部组织感染，制剂优选是为含有下述含量活性组分的局部给药膏剂或霜剂，例如，活性组分的含量为0.075-20％w/w(包括活性组分含量为0.1％-20％且增量为0.1％w/w，例如，0.6％w/w、0.7％w/w等)，通常的含量为0.2-15％w/w，最典型的含量为0.5-10％w/w。当配制成膏剂时，活性组分可以与石蜡或与同水溶混的膏剂基质一起使用。或者，可以将活性组分与水包油霜剂基质一起配制成霜剂。

    如果需要，霜剂基质的水相可包含，例如，至少30％w/w多羟基醇，即，具有两个或多个羟基的醇，例如，丙二醇、1，3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、聚乙二醇(包括PEG 400)和其混合物。局部给药制剂最好可以含有能通过皮肤或其它感染区域提高活性组分的吸收或渗透的化合物。所述的皮肤渗透增加剂的实例包括二甲亚砜和相关类似物。

    本发明乳剂的油相可以按已知方法由已知组分构成。该相可以仅含有乳化剂，或含有至少一种乳化剂与脂肪和/或油类的混合物。优选，同时含有亲水性乳化剂和用作稳定剂的亲脂性乳化剂。还优选同时含有油和脂肪。适合在本发明制剂中使用的乳化稳定剂包括吐温^_60、斯潘^_80、十六醇十八醇混合物、苄醇、十四烷醇、甘油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。合适的油或脂肪包括直链或支链、一元或二元烷基酯，例如，二异己二酸酯、硬脂酸异鲸蜡酯、椰子油脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸基酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯或棕榈酸2-乙基己酯。根据所需的特性，它们可以单独使用或混合使用。或者，可以使用高熔点脂类，如白软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。

    适于对眼局部给药的制剂还包括滴眼剂，其中，活性组分溶解或悬浮在合适载体中，尤其是溶解或悬浮在用于活性组分的含水溶剂中。该制剂中活性组分的含量一般为0.01-20重量％。

    其中载体为固体的经鼻给药制剂含有粗粉，所述粗粉的粒径为，例如，20-500微米(包括粒径为20-500微米且增量为5μm，例如，30μm、35μm等)，从粉末容器中经鼻通道迅速吸入该制剂给药。其中载体为液体的合适制剂，例如，以鼻喷雾剂或滴鼻剂给药的制剂，包括活性组分的水溶液或油溶液。根据常规方法可制得适合气雾剂给药的制剂，并可与其它治疗剂，如用于治疗肺囊虫肺炎的戊双脒，一起递送。

    适合阴道给药的制剂可以是阴道栓、塞子、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂，所述制剂除含有活性组分外，还含有诸如本领域已知的合适载体。

    适合肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧剂、缓冲液、制菌剂和溶质，其中所述溶质使制剂与接受治疗者的血液等渗；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以含有悬浮剂和增稠剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，存在于密封的安瓿和小瓶中，并可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需在使用前即刻加入无菌液体载体，如注射用水。由上述无菌粉剂、粒剂和片剂可以制得临时注射溶液和悬浮液。优选的单位剂量制剂为含有上述日剂量或单位日亚剂量活性组分的制剂或是适当含有日剂量或单位日亚剂量的几分之一的活性组分的制剂。

    本发明还提供了兽用组合物，所述组合物含有至少一种上述活性组分和兽用载体。兽用载体是用来施用该组合物的材料，其可以是固体、液体或气体材料，该材料是惰性的或在兽医领域是可接受的，并且与活性组分相容。这些兽用组合物可以经口、经肠胃外或经其它任何理想的途径给药。

    任选将本发明化合物用于含有一种或多种活性化合物作为活性组分的缓释药物制剂中，其中，控制和调节活性组分的释放，以减少频繁给药或提高给定化合物的药动学或改善毒性。一般而言，通过缓释体系，如WO 92/14450或US 5,098,443的植入片或US 4,740,365或US 5,141,752的基质，来施用化合物。许多其它缓释体系是已知的，并适用于本发明。

     治疗给药

    合适的给药途径包括经口、直肠、鼻、局部(包括眼、颊和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、玻璃体内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)给药。连同临床医师已知的情况一道，根据患者的病症、化合物的毒性和感染部位来决定优选的给药途径。

    对于上述各种治疗病症，所需的活性组分(如上所述)的量由各种因素决定，包括：待治疗疾病的严重程度、传染剂(用于预防或治疗急性传染)、感染或病变部位和其它最终由主治医师或兽医自行决定的因素。但是，一般而言，考虑到体外实验的药效差异，临床医师考虑的合适剂量在类似的甲氧基膦酸酯范围内(参见supra)，一般为0.1-250mg/千克患者体重/剂(包括活性组分含量为0.1mg-400mg/Kg/剂且增量为0.5mg/Kg/剂，例如2.5mg/Kg/剂、3.0mg/Kg/剂、3.5mg/Kg/剂等)，典型的剂量为0.5-50mg/kg体重/剂，最常用的剂量为1-300mg/kg体重/剂。

    按合适的时间间隔，以单位剂量形式施用所需的剂量，通常采用相对较高的诱导剂量和相对较低的多次较小维持剂量。化合物也用于预防，例如，在病毒感染前大约1-7天给药。HPV肿瘤或囊肿和疱疹损害通常通过局部注射或局部施用凝胶、膏剂等进行局部治疗。

    本发明化合物任选与用于治疗或预防感染或上述疾病的其它治疗剂混合使用。所述其它治疗剂的实例包括能有效治疗或预防病毒感染的试剂。其包括，但不限于，NRTIs、3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷(齐多夫定和AZT)、2’-脱氧-3’-thiacytidine(3TC)、2’，3’-二脱氧-2’，3’-二脱氢胸腺嘧啶核苷(D4T)、carbovir(碳环2’，3’-二脱氧-2’，3’-二脱氢鸟苷)、abacavir(ABC)、2’，3’-二脱氧肌苷(ddI)、二脱氧肌苷、2’，3’-二脱氧胞苷(ddc，扎西它宾)、3’-叠氮基-2’，3’-二脱氧尿苷、(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷(BVDU)、2-氯-2’-脱氧腺甙、2-脱氧助间型霉素、5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷、5-氟-2’脱氧尿苷、5-三氟甲基-2’-脱氧尿苷、6-氮杂尿苷、5-氟乳清酸、甲氨蝶呤、三乙酰尿苷、1-(2’-脱氧-2’-氟-1-β-D-阿糖基)-5-碘胞苷(FIAC)、四氢咪唑并(4，5，1-jk)-(1，4)-苯并二丫庚因-2(1H)-硫酮(TIBO)或其它非核苷反转录酶抑制剂(例如，nevirapine、delaviridine、efavirens、daparivine等)、蛋白酶抑制剂(例如，saquinavir、indinavir、ritonovir、amprenavir等)、2’-去甲-环状GMP、6-甲氧基嘌呤(ara-M)、6-甲氧基嘌呤阿糖苷2’-O-戊酸酯、阿糖胞苷(ara-C)、开琏式核苷(如无环鸟苷、缬氨酸无环鸟苷、penciclovir、famciclovir、ganciclovir)、开琏式核苷酸类似物(如HPMPC、PMEA、PMEG、PMPA、PMPDAP、FPMPA、HPMPA和HPMPDAP)、(2R，5R)-9-[四氢-5-(膦酰基甲氧基)-2-呋喃基]腺嘌呤、(2R，5R)-1-[四氢-5-(膦酰基甲氧基)-2-呋喃基]胸腺嘧啶和包括利巴韦林(阿糖腺苷)、2-硫代-6-氮杂尿苷、块菌素、金精三羧酸、3-deazaneoplanocin、neoplanocin、rimantidine、金刚乙胺(adamantine)和膦甲酸(膦酰基甲酸三钠)在内的其它抗病毒剂。

     合成方法

    在通常是DMF的非质子溶剂中，在NaH、Cs₂CO₃或DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯)存在下，用2-氯乙氧基甲基膦酸二烷基酯(或其它R₃基团类似物)将相应的6-羟基嘧啶碱烷基化，合成式(I)化合物，然后，任选进行脱保护，例如，使用溴化三甲基硅烷进行处理并水解。式(I)产物含有各种含量的相应N1-异构体，即，2，4-二取代的1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6-酮。在用溴化三甲基硅烷处理之前，可将其作为中性二酯通过色谱除去。

    制备式(I)化合物的另外一种方法包括：在无水溶剂(例如，乙醇)、碱金属氢氧化物或碱金属碳酸盐水溶液中，通过与伯或仲胺反应，将2-取代的4-氯-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶衍生物(和其R₃类似物)转化。可以使用，例如，1，3，5-三唑、咪唑或优选使用DABCO(二氮杂二环辛烷)来催化该反应。然后，任选除去保护基，例如，通过用溴化三甲基硅烷处理并进行水解。

    通过2，4-二取代的6-卤嘧啶与2-羟基乙基膦酸二烷基酯(或其它R₃类似物)的醇钠反应，然后任选脱保护，也可制得式(I)化合物。该方法的优点在于仅形成所需的O6-异构体。对合适的合成方法的选择取决于用作原料的杂环嘧啶衍生物的可利用性。

    在NaH存在下，通过2，4-二取代的6-(2-羟基烷基)嘧啶与对甲苯磺酰氧基甲基膦酸二烷基酯反应，也可制得式(I)化合物。在碱存在下，用保护或未保护的二醇处理合适的6-氯嘧啶，可制得有原料。

    通过在嘧啶环的不同位置进行取代也可制得式(I)化合物。因此，通过与卤元素反应或通过卤素阴离子交换反应，可制得5-卤代衍生物。

    通过水解将Z基团酰胺或酯转化成羟基。

    通过用叠氮化锂或叠氮化钠的DMF溶液处理二酯或二酯和单酯的混合物，能够容易地制得单酯(A.Holy，″Synthesis 1998″381-385(1998))。

    所有引述的文献将引入本发明作为参考。

    通过下述实施例更充分地说明本发明。

    实施例1

    

    (a)2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2，4-二氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    将2，4-二氨基-6-羟基嘧啶(2.52g，20mmol)和碳酸铯(3.25g，10mmol)在二甲基甲酰胺(40mL)中的混合物在80℃下搅拌30分钟，加入2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(3.5mL，23.4mmol)。在100℃搅拌混合物16小时，过滤除去盐。将滤液置于真空中，残余物用氯仿(300mL)在硅胶柱上进行色谱分离。洗脱得到产物，并从乙酸乙酯-石油醚中结晶，得到1.2g(17.2％)2，4-二氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：159℃。对于C₁₃H₂₅N₄O₅P(348.3)，元素分析理论值：44.83％C、7.23％H、16.08％N和8.89％P；元素分析测定值：44.99％C、7.28％H、16.18％N和9.03％P。质谱：

    349.3(MH⁺)(100)，265.1(MH⁺-2×iPr)(6)；139(26)；127.1(BaseH⁺)(37).¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.24d，6H and1.24d，6H，J(CH₃，CH)＝6.2(4×CH₃)； 3.74m，2H(H-2′)；3.78d，J(CH₂-P)＝8.2(CH₂-P)；4.22m，2H(H-1′)；4.59dh，2H，J(CH，P)＝8.2，J(CH，CH₃)＝6.2(2×CH)；5.02s，1H(H-6)；5.85bs，2H and 6.00bs，2H(2×NH₂).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：23.85d，J(CH₃，P)＝4.6(2×CH₃)；23.99d，J(CH₃，P)＝4.1(2×CH₃)；63.65(C-1′)；65.02d，J(CH₂-P)＝164.4(CH₂P)；70.32d，J(CH，P)＝6.0(2×CH-O)；71.05d，J(2′，P)＝11.9(C-2′)；76.35(C-5)；163.01，166.15 and 169.92(C-2，C-4 and C-6).

    将该化合物(1.0g，2.9mmol)用BrSiMe₃(4mL)在乙腈(40mL)中处理过夜。真空除去溶剂，残余物与乙腈(2×25mL)共馏，并向残余物中加入水(50mL)。用浓氨水碱化溶液，并真空蒸发。将残余物的水溶液置于Dowex 50×8(H⁺-型)柱(100mL)上中，并用水(3mL/分钟)洗脱柱；然后，在254nm连续测定洗脱液的UV-吸收。在除去没有UV-吸收的馏分后，用2.5％氨水洗脱柱，并收集UV-吸收馏分。将其置于真空中，并重新用水(20mL)溶解，用浓氨水调节pH为9-10，并置于预先用水充分洗涤的Dowex 1×2(乙酸盐形式)柱(70mL)上。用水洗脱得到产物(有保留)，将产物从水中结晶，得到2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(0.60g，78.3％)，熔点：279℃(水)。Eu_p0.80。对于C₇H₁₃N₄O₅P(264.2)，元素分析理论值：31.83％C、4.96％H、21.21％N，和11.72％P；元素分析测定值：31.52％C、5.04％H、20.96％N和11.53％P。UV-光谱[λ_max(ε_max)](pH2)：276(9100)和(pH7)：265(7500)。这些数据与公开的2，4-二氨基-6-甲氧基嘧啶的UV-光谱(分别为λ_max263和275)吻合。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃，40℃)：3.58d，2H，J(CH₂，P)＝8.7(CH₂P)；3.74t，2H，J(2′，1′)＝4.9(H-2′)；4.23t，2H，J(1′，2′)＝4.9(H-1′)；5.07s，1H(H-5)；5.86bs，2H and 6.01bs，2H(2×NH₂).¹HNMR(D₂O)：3.69d，2H，J(CH₂，P)＝8.7(CH₂P)；3.91m，2H(H-2′)；4.30m，2 H(H-1′)；5.45s，1H(H-5).¹³C NMR(D₂O)：69.30(C-1′)；70.28 d，J(CH₂-P)＝151.3(CH₂P)；73.35d，J(2′，P)＝10.3(C-2′)；79.63(C-5)；165.46，169.35 and 171.08(C-2，C-4 and C-6).

    在O-异构体(二酯和游离膦酸酯)中，低场位置的C-1’-碳信号(分别为δ63.65和69.30)表明，PME-基团连接在C-6氧原子上。

    进一步用氯仿洗脱硅胶柱，用P₂O₅真空干燥后，得到1.8g(26％)无定形2，4-二氨基-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮(R_F0.35，S1)。熔点：196-197℃。用溴化三甲基硅烷(6mL)在乙腈(60mL)中处理残余物(5.17mmol)过夜，并用上述处理O-异构体的方法处理。在Dowex 1柱上提纯脱盐的混合物(用水洗脱)，将得到产物从水中结晶，得到0.95g(65％)2，4-二氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-(1H)-酮，熔点：228℃(水)。E_Up0.90。对于C₇H₁₃N₄O₅P·H₂O(282.2)，元素分析理论值：29.79％C、5.36％H、19.85％N和10.98％P；元素分析测定值：29.76％C、5.22％H、20.01％N和10.92％P。质谱：349.2(MH⁺)(100)；265.1(MH⁺-2x iPr)(35)；126(BH⁺)(26)。UV-光谱[λ_max(ε_max)](pH2)：264(18000)，(pH7)：267(12200)。λ_max值与公开的2，4-二氨基-1-甲基嘧啶-6(1H)-酮(268 nm)的λ_max一致。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：3.59d，2 H，J(CH₂，P)＝8.4(CH₂P)；3.60t，2H，J(2′，1′)＝6.1(H-2′)； 3.96t，2H，J(1′，2′)＝6.1(H-1′)；4.61s，1H(H-5)；5.88bs，2H and 6.61bs，2H(2×NH₂).¹H NMR(D₂O)：3.48d，2H，J(CH₂，P)＝8.4(CH₂P)； 3.76t，2H，J(1′，2′)＝5.2(H-1′)；4.09t，2H，J(2′，1′)＝5.2(H-2′)；5.06s，1H(H-5).¹³C NMR(D₂O)：45.15(C-1′)；70.41 d，J(CH₂-P)＝154.7(CH₂P)； 74.09d，J(2′，P)＝11.8(C-2′)；81.05(C-5)；159.73，166.79 and 168.04(C-2，C-4and C-6).

    高场位置的C-1’(δ45.15)表明N-取代。在DMSO中的¹H NMR光谱中观察到的两个NH₂基团信号(δ6.61和5.88)排除了在外位2-NH₂和/或4-NH₂取代，且和预期的N(1)取代一致。

    实施例2

    

    (a)2-氨基-4-氯-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2-氨基-4-氯-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    将2-氨基-4-氯-6-羟基嘧啶一水合物(25mmol)与甲苯(3×50mL)真空共馏，残余物用DMF(50mL)、DBU(3.8mL)和2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(7mL)处理。在100℃搅拌混合物16小时，并在50℃/2kPa下蒸发除去挥发物。将残余物吸收至氯仿(200mL)中，过滤，用饱和NaCl(100mL)洗涤。水性洗液用氯仿萃取(5×50mL)，用硫酸镁干燥合并的萃取液并蒸发。在氯仿中，通过氯仿-乙醇梯度洗脱，在硅胶柱(150mL)上进行分离，得到2-氨基-4-氯-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，收率27.2％，熔点：89℃。对于C₁₃H₂₃ClN₃O₅P(367.77)，元素分析理论值：42.46％C、6.30％H、9.64％Cl、11.43％N和8.42％P；元素分析测定值：42.34％C、6.34％H、9.79％Cl、11.30％N和8.23％P。质谱：368.3(MH⁺)(100)。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.22d，6H and 1.23d，6H，J(CH₃，CH)＝6.1(CH₃)；3.78d，J(CH₂-P)＝8.3(CH₂-P)；3.80m，2H(H-2′)；4.37m，2H(H-1′)；4.58m，2H(P-OCH)；6.06s，1H(H-5)；7.05bs，2H(NH₂).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：23.83d，2C，J(CH₃，P)＝4.9 and23.97d，2C，J(P，C)＝3.9(CH₃)；65.00d，J(P，C)＝164.1(P-C)； 65.15(C-1′)；70.35d，2C，J(P，C)＝6.7(P-OC)；70.52d，2C，J(P，C)＝11.7(C-2′)；94.46(C-5)；160.12(C-2)；162.97(C-4)；170.56(C-6).

    进一步洗脱，并从乙酸乙酯-乙醚中结晶，得到2-氨基-4-氯-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮，收率52.4％，熔点：95℃。对于C₁₃H₂₃C1N₃O₅P(367.77)，元素分析理论值：42.46％C、6.30％H、9.64％Cl、11.43％N和8.42％P；元素分析测定值：42.28％C、6.22％H、9.65％Cl、11.50％N和8.27％P。质谱：368.4(MH⁺)(100)。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.20d，6H and 1.22d，6H，J(CH₃，CH)＝6.1(CH₃)；3.69t，2H，J(2′，1′)＝5.5(H-2′)；3.76 d，J(CH₂-P)＝8.1(CH₂-P)；4.06t，2H，J(1′，2′)＝5.5(H-1′)；4.55m，2H(P-OCH)；5.67s，1H(H-5)；7.60bs，2H(NH₂).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：23.84d，2C，J(CH₃，P)＝3.9 and 23.97d，2C，J(P，C)＝3.9(CH₃)；40.29(C-1′)；65.03d，J(P，C)＝164.1(P-C)；69.01d，2C，J(P，C)＝11.7(C-2′)；70.41d，2C，J(P，C)＝5.9(P-OC)； 98.28(C-5)； 155.73(C-2)；157.87(C-4)；161.48(C-6).

    (b)2-氨基-4-羟基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    将2-氨基-4-氯-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(5.7g)、DABCO(3.6g)和K₂CO₃(9.0g)在水(100mL)中的混合物回流搅拌150分钟，冷却，并加入Dowex 50×8(H⁺-型)酸化。悬浮液用浓氨水碱化，搅拌5分钟后，过滤，树脂用50％乙醇水溶液(200mL)洗涤。蒸发滤液至干，加入乙醇(50mL)，蒸发混合物至干。将残余物加到硅胶柱色谱(150mL)上，用氯仿-乙醇梯度洗脱，得到晶体2-氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]-4-羟基嘧啶，熔点：154℃，收率78％。对于C₁₃H₂₄N₃O₆P(349.3)，元素分析理论值：44.70％C、6.92％H、12.03％N和8.37％P；元素分析测定值：44.58％C、7.02％H、11.95％N和8.53％P。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.24d，6H and1.23d，6H，J(CH₃，CH)＝6.2(4×CH₃)；3.74m，2 H(H-2′)；3.76d，J(CH₂-P)＝8.3(CH₂-P)；4.19m，2H(H-1′)；4.59m，2H(P-OCH)；4.75s，1H(H-5)；6.65bs，2H，2H(NH₂)；10.45s，1H(OH).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：23.87d，2C，J(CH₃，P)＝4.9 and 24.01d，2C，J(P，C)＝3.9(CH₃)；65.03 d，J(P，C)＝164.6(P-C)；65.04(C-1′)；70.37d，2C，J(P，C)＝6.3)(P-OC)；70.87d，J(P，C)＝11.7(C-2′)；79.95(C-5)；155.68(C-4)；164.25(C-2)；171.01(C-6).

    用溴化三甲基硅烷(10mL)在乙腈(80mL)中处理该产物过夜，真空蒸发，残余物用水(50mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，并混合物蒸发。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，将UV-吸收氨水洗脱液蒸发至于。通过加入浓氨水将残余物溶解在最少量热水中，加入浓HCl酸化至pH＝3-3.5。收集沉淀，用水和乙醇洗涤并真空干燥，得到0.7g产物，熔点227℃。对于C₇H₁₂N₃O₆P，(265.16)，元素分析理论值：31.71％C、4.56％H、15.85％N和11.68％P；元素分析测定值：31.55％C、4.62％H、16.15％N和11.51％P。

    实施例3

    (a)2，4-二氨基-6-(S)-[2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶(H-3560)

    在90℃，将在DMF(40mL)中的(S)-2-(4-甲苯磺酰氧基)丙氧基甲基膦酸二异丙酯(25.7g，63mmol)加入2，4-二氨基-6-羟基嘧啶(60mmol)、DMF(40mL)和DBU(10.6mL，60mmol)的搅拌混合物中。在100℃搅拌反应混合物24小时并真空蒸发。然后将残余物转移至氯仿(200mL)中，过滤并用饱和NaCl(100mL)洗涤。水性洗液用氯仿萃取(5×50mL)，用硫酸镁干燥合并的萃取液，并蒸发。在氯仿中，通过氯仿-乙醇梯度洗脱，在硅胶柱(150mL)上进行分离，得到油状残余物主要产物(06-异构体)，用五氧化磷真空干燥过夜。加入乙腈(80mL)和溴化三甲基硅烷(20mL)，溶液在塞好的烧瓶中静置过夜。真空蒸发挥发物，残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，并蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。用浓氨水碱化该产物的水溶液(20mL)，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(200mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各自为0-0.5M，1.5L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶，得到3.5g产物(19.7％)，熔点：281℃。对于C₈H₁₅N₄O₅P·H₂O(296.22)(-水合物)，元素分析理论值：32.44％C、5.78％H、18.91％N和10.46％P；元素分析测定值：32.67％C、5.86％H、19.40％N和10.60％P

     ¹H NMR(D₂O+NaOD)：1.26d，3H，J(3′，2′)＝6.4(H-3′)；3.51dd，1H，J(CH_b，P)＝9.4，J(gem)＝12.2(CH_bP)； 3.60dd，1H，J(CH_a，P)＝9.4，J(gem)＝12.2(CH_aP)； 3.92m，2H(H-2′)；4.06dd，1H，J(1′b，2′)＝5.5，J(gem)＝＝10.5(H-1′b)；4.14dd，1H，J(1′a，2′)＝3.7，J(gem)＝10.5(H-1′a)；5.41s，1H(H-5).¹³C NMR(D₂O)：15.84(C-3′)；66.99 d，J(CH₂-P)＝149.9(P-C)；69.68(C-1′)；75.14d，J(2′，P)＝11.2(C-2′)；76.84(C-5)；166.74(C-2)；162.83(C-4)；171.05(C-6).

    (b)2，4-二氨基-6-(R)-[2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶(H-3567)

    用类似于实施例3(a)的方法，由在DMF(70mL)中的(R)-2-(4-甲苯磺酰氧基)丙氧基甲基膦酸异丙酯(50mmol)、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶(60mmol)和DBU(60mmol)制得(R)对映体。在100℃搅拌反应混合物24小时。然后用实施例4的方法处理。收率：24％，在290℃以下不熔化。对于C₈H₁₅N₄O₅P·H₂O(296.22)(一水合物)，元素分析理论值：32.44％C、5.78％H、18.91％N和10.46％P；元素分析测定值：32.54％C、5.90％H、19.10％N和10.65％P。¹H NMR和¹³C NMR光谱与(S)对映体相同。

    实施例4

    

    2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙基巯基]嘧啶

    将2，4-二氨基-6-巯基]嘧啶半硫酸盐(2.616g，13.7mmol)的DMF(40mL)悬浮液用氢化钠(1.0855g，27mmol， 60％的石蜡油分散液)搅拌处理1小时，然后，用2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(9mL，17.2mmol)处理。在80℃搅拌混合物8小时，用塞力特硅藻土垫过滤，真空蒸发。将氯仿中的残余物在硅胶柱(150mL)上提纯，用氯仿-乙醇(49∶1)洗脱，得到2，4-二氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基巯基]嘧啶(4.0g，80％)，熔点：109℃。对于C₁₃H₂₅N₄O₄PS(364.40)，元素分析理论值：42.85％C、6.91％H、15.38％N、8.50％P和8.80％S；元素分析测定值：42.48％C、6.94％H、15.50％N、8.63％P和9.01％S。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.24d，6H and 1.25d，6H，J(CH₃，CH)＝6.1(CH₃)；3.17t，2H，J(1′，2′)＝6.6(H-1′)；3.68t，2H，J(2′，1′)＝6.6(H-2′)；3.77d，J(CH₂-P)＝8.3(CH₂-P)；4.60m，2H(P-OCH)；5.60s，1H(H-5)；5.95brs，2Hand 6.17brs，2H(NH₂).

    将乙腈(50mL)中的上述化合物用溴化三甲基硅烷(5mL)处理过夜，真空蒸发挥发物。残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，并将UV-吸收氨水洗脱液蒸发至干。用浓氨水碱化该产物水溶液(20mL)，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(100mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各自为0-0.5M，1.5L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，将残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶残余物，得到2.8g(91％)2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙基巯基]嘧啶，熔点：246℃。对于C₇H₁₃N₄O₄PS(280.24)，元素分析理论值：30.00％C、4.68％H、19.99％N、11.05％P和11.44％S；元素分析测定值：30.27％C、4.80％H、19.74％N、10.98％P和11.60％S。

     ¹H NMR(D₂O+NaOD)：3.18t，2H，J(1′，2′)＝6.8(H-1′)；3.56d，2H，J(CH₂，P)＝8.7；(CH₂P)；3.68t，2H，J(2′，1′)＝6.8(H-2′)；5.70s，1H(H-5)；6.32brs，2H(2-NH₂)；6.48brs，2H(4-NH₂).

    实施例5

    

    4-氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和4-氨基-1-[2-(膦酰基-甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    在沸腾乙醇(300mL)中，用阮内镍搅拌处理4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶(20g)直至原料消失。趁热过滤悬浮液，沉淀物用热乙醇(300mL)洗涤，并蒸发滤液至干。将残余物从乙醇中结晶(加入乙醚直至浑浊)，得到4-氨基-6-羟基嘧啶，熔点：272℃，收率10.0g(64.4％)。对于C₄H₅N₃O(111.10)，元素分析理论值：43.24％C、4.54％H和37.82％N；元素分析测定值：43.40％C、4.65％H和38.01％N。质谱：112(MH⁺)。

     ¹H-NMR(CD₃SOCD₃)：4.97s，1H(H-5)；6.42brs，2H(NH₂)；7.77s，1H(H-2)；11.41brs，1H(OH).

    将在DMF(70mL)中的该化合物(3.6g，33.6mmol)用NaH(1.36g，34mmol，60％的石蜡油分散液)搅拌处理并0.5小时，加入2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(9.4mL，40.5mmol)。在80℃搅拌混合物8小时，用塞力特硅藻土垫过滤，真空蒸发。将残余物的氯仿溶液在硅胶柱上提纯，用氯仿-乙醇(97.5∶2.5)洗脱，并从乙酸乙酯-石油醚中结晶，得到3.0g(26.8％)4-氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点112℃。对于C₁₃H₂₄N₃O₅P(333.32)，元素分析理论值：46.84％C、7.26％H、12.61％N和9.29％P；元素分析测定值：46.69％C、7.38％H、12.45％N和9.40％P。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.22d，6H and 1.23d，6H，J(CH₃，CH)＝6.1(4×CH₃)；3.78 brt，2H，J(2′，1′)＝4.5(H-2′)；3.78d，J(CH₂-P)＝8.4(CH₂-P)；4.31brt，2H，J(1′，2′)＝4.5(H-1′)；4.59m，2H(P-OCH)；5.67s，1H(H-5)；6.62bs，2H(NH₂)；8.07s，1H(H-2).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：64.42(C-1′)

    在室温下，用溴化三甲基硅烷(10mL)在乙腈(70mL)中处理该化合物过夜。真空蒸发后，残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，将UV-吸收氨水洗脱液蒸发至干。用浓氨水碱化该产物水溶液(20mL)，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(1 50mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各自为0-1M，1L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶，得到1.8g(80％)4-氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：254℃。对于C₇H₁₂N₃O₅P(249.16)，元素分析理论值：33.74％C、4.85％H、16.86％N和12.43％P；元素分析测定值：34.02％C、4.80％H、16.88％N和12.58％P。

    在硅胶柱上用氯仿-乙醇(95∶5)进一步洗脱粗反应混合物，真空干燥后得到4.6g(41.1％)油状4-氨基-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)-乙基]嘧啶-6(1H)-酮。在室温下用溴化三甲基硅烷(10mL)在乙腈(70mL)中处理化合物过夜。真空蒸发后，残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物置于Dowex 50×8柱(100mL)上，用洗脱水。将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，将残余物从70％乙醇水溶液中结晶(加入乙醚直至浑浊)，得到2.8g(91％)4-氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮，熔点：233℃。对于C₇H₁₂N₃O₅P(249.16)，元素分析理论值：33.74％C、4.85％H、16.86％N和12.43％P；元素分析测定值：34.02％C、4.80％H、16.88％N和12.58％P。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：3.56d，2H，J(CH₂，P)＝8.8(CH₂P)；3.64t，2H，J(2′，1′)＝4.9(H-2′)；3.90t，2H，J(1′，2′)＝4.9(H-1′)；5.06s，1H(H-5)；6.45brs，2H(NH₂)；6.90brs，2H(P-OH)；7.98s，1H(H-2).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：44.44(C-1′).

    实施例6

    

    2-氨基-4-二甲基氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2-氨基-4-二甲基氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    在高压釜中，在100℃，将2-氨基-4-氯-6-羟基嘧啶一水合物(5.0g)与30％二甲胺在乙醇(180mL)中搅拌16小时。滤出结晶产物，用水、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥，得到4.3g(81％)2-氨基-4-二甲基氨基-6-羟基嘧啶，在300℃以下不熔化。对于C₆H₁₀N₄O(154.17)；元素分析理论值：46.34％C、6.54％H和36.34％N；元素分析测定值：46.38％C、6.65％H和36.68％N。

     ¹H-NMR(CD₃SOCD₃)：2.89s，6H(N-CH₃)；4.51s，1H(H-5)；6.18brs，2H(NH₂)；9.75brs，1H(OH).

    在100℃，将该化合物(4.0g，26mmol)和碳酸铯(4.22g，13mmol)在DMF(60mL)中搅拌1小时，加入2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(8mL)。在100℃搅拌混合物24小时，趁热过滤，真空蒸发。用氯仿(100mL)萃取残余物，过滤并通过硅胶柱色谱(200mL)提纯。用氯仿洗脱，得到稠油状2-氨基-4-二甲基氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(4.6g)。在室温下用溴化三甲基硅烷(5mL)和乙腈(50mL)处理该产物过夜。真空蒸发后，残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，将得到的主要UV-吸收氨水洗脱液蒸发至干。用浓氨水碱化该产物的水溶液(20mL)，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(1 50mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各自为0-0.4M，1L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶残余物，得到1.1g 2-氨基-4-二甲基氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：168℃。对于C₉H₁₇N₄O₅P(292.23)，元素分析理论值：36.99％C、5.86％H、19.17％N和10.60％P；元素分析测定值：37.05％C、5.80％H、18.98％N和10.51％P。

     ¹H NMR(DMSO)：6.69bs，2H(NH₂)；4.69s，1H(H-5)；3.98t，J＝6.0Hz，2H(2×H-1′)；3.61t，J＝6.0Hz，2H(2×H-2′)；3.59d，2H，J(H，P)＝8.3Hz(P-CH₂)；2.89s，6H(N(CH₃)₂).¹³C NMR(DMSO)：162.37，161.94 and 154.67(C-2，C-4and C-6)； 75.79(C-5)；69.82d，J(C，P)＝10.3Hz(C-2′)；66.76d，J(C，P)＝158.7Hz(P-CH₂)；～40.0(C-1′，overlapped with DMSO)；36.93(N(CH₃)₂).

    在硅胶柱上进一步用氯仿-乙醇进行梯度洗脱，得到稠油状2-氨基-4-二甲基氨基-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮(2.0g)，用溴化三甲基硅烷(5mL)和乙腈(50mL)处理过夜和进行类似处理。在经过Dowex 1色谱提纯后，将产物从水中结晶，得到2-氨基-4-二甲基氨基-1[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮，熔点：235℃。对于C₉H₁₇N₄O₅P(292.23)；元素分析理论值：36.99％C、5.86％H、19.17％N和10.60％P；元素分析测定值37.15％C、5.92％H、19.28％N和10.66％P。

     ¹H NMR(DMSO)：6.03bs，2H(NH₂)；5.20s，1H(H-5)；4.26m，2H(2×H-1′)；3.74m，2H(2×H-2′)；3.58d，2H，J(H，P)＝8.8Hz(P-CH₂)；2.93s，6H(N(CH₃)₂).¹³C NMR(DMSO)：169.93，164.91 and 161.92(C-2，C-4 and C-6)；75.02(C-5)；70.89d，J(C，P)＝11.4Hz(C-2′)；66.96d，J(C，P)＝160.7Hz(P-CH₂)；64.28(C-1′)；36.95(N(CH₃)₂).

    实施例7

    

    2-氨基-4-环丙基氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2-氨基-4-环丙基氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    将2-氨基-4-氯-6-羟基嘧啶一水合物(5.0g)和环丙胺在乙醇(150mL)中回流12小时。将混合物真空蒸发，并与乙醇(3×50mL)共馏，从甲醇中吸附到硅胶上，并置于氯仿中的硅胶柱(200mL)上。用氯仿-乙醇洗脱梯度，得到结晶产物，从乙醚中滤出产物，真空干燥，得到3.0g 2-氨基-4-环丙基氨基-6-羟基嘧啶，熔点：229℃。对于C₇H₁₀N₄O(166.18)，元素分析理论值：50.59％C、6.07％H和33.71％N；元素分析测定值：50.49％C、6.25％H和33.61％N。

     ¹H NMR(DMSO)：9.73brs，1H(OH)；6.55bs，2H(NH)；6.08brs，2H(NH₂)；4.66s，1H(H-5)；2.30m，1H and 0.62m，2H and 0.40，m，2H(C-CH₂，N-CH).

    将该化合物(3.0g，18mmol)和碳酸铯(2.92g，9mmol)在DMF(50mL)中的混合物在100℃搅拌1小时，加入2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(6mL)。在100℃搅拌反应混合物24小时，趁热过滤，真空蒸发。残余物用氯仿(100mL)萃取，过滤，真空浓缩，并用硅胶柱色谱(2×200mL)提纯。用氯仿洗脱，得到稠油状2-氨基-4-环丙基氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(1.8g)。用溴化三甲基硅烷(5mL)和乙腈(50mL)在室温下处理过夜。真空蒸发后，残余物用水(100mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。用浓氨水碱化产物的水(20mL)溶液，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(150mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各为0-0.4M，1L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶残余物，得到1.0g 2-氨基-4-环丙基氨基-6-[2-(膦酰基-甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：244℃。对于C₁₀H₁₇N₄O₅P(304.24)，元素分析理论值：39.48％C、5.63％H、18.42％N和10.18％P；元素分析测定值：39.65％C、5.70％H、18.59％N和10.11％P。

     ¹H NMR(D₂O+NaOD)：0.54m，2H and0.80m，2H(C-CH₂)；2.53m，1H(N-CH)；3.57d，2H，J(CH₂，P)＝8.4(CH₂P)；3.91m，2H(H-2′)；4.32m，2H(H-1′)；5.61s，1H(H-5).

    用氯仿-乙醇进-步梯度洗脱硅胶柱，得到(从乙醇-乙醚中结晶后)黄色2-氨基-4-环丙基氨基-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮(1.6g)，将该化合物用溴化三甲基硅烷(5mL)和乙腈(50mL)处理过夜，并进行类似处理。通过Dowex 50色谱提纯，用水洗脱产物并真空蒸发。将残余物从水中结晶，得到0.90g 2-氨基-4-环丙基氨基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-2-酮，在290℃以下不熔化。对于C₁₀H₁₇N₄O₅P(304.24)，元素分析理论值：39.48％C、5.63％H、18.42％N和10.18％P；元素分析测定值：39.70％C、5.78％H、18.69％N和10.32％P。

     ¹³C NMR(D₂O+NaOD)：173.71，170.07 and165.53(C-2，C-4 and C-6)；78.75(C-5)；73.31d，J(C，P)＝10.3Hz(C-2′)；72.19d，J(C，P)＝149.4Hz(P-CH₂)；69.14(C-1′)；25.96(N-CH)；9.43(2×CH₂ of cyclopropyl).

     实施例8

    

     2-氨基-4-甲基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2-氨基-4-甲基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    将2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(15mL，62.5mmol)加入到已在100℃预先搅拌1小时的2-氨基-6-羟基-4-甲基嘧啶(6.25g，50mmol)和碳酸铯(11.3g，25mmol)的DMF(70mL)混合物中。然后，在100℃搅拌反应混合物14小时，趁热过滤，真空蒸发。将残余物用氯仿萃取，随后在硅胶柱(250mL)上提纯，并从乙酸乙酯-石油醚中结晶，得到5.75g 2-氨基-4-甲基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：72-73℃。对于C₁₄H₂₆N₃O₅P(347.35)，元素分析理论值：48.41％C、7.54％H、12.10％N和8.92％P；元素分析测定值：48.70％C、7.60％H、12.32％N和9.14％P。

     ¹H NMR(CDCl₃)：5.95q，1H，J＝0.6Hz(H-5)；4.90b，2H(NH₂)；4.76dh，2H，J(H，P)＝7.6Hz and J(H，H)＝6.2Hz(2×OCH(iPr))；4.42m，2H(2×H-1′)；3.90m，2H(2×H-2′)；3.82d，2H，J(H，P)＝8.2Hz(P-CH₂)；2.26 d，3H，J＝0.6Hz(CH₃)；1.34d，6H，J＝6.2Hz and 1.33d，6H，J＝6.2Hz(4×CH₃(iPr)).¹³C NMR(CDCl₃)：170.36，168.27 and 162.48(C-2，C-4 and C-6)；97.03(C-5)；71.17d，J(C，P)＝10.8Hz(C-2′)；71.06d，J(C，P)＝6.8Hz(OCH(iPr))；65.99d，J(C，P)＝167.6Hz(P-CH₂)；64.60(C-1′)；24.04d，J(C，P)＝3.9Hz and 23.90d，J(C，P)＝4.9Hz(4×CH₃(iPr))；23.61(CH₃).

    在室温下用溴化三甲基硅烷(5mL)中乙腈(50mL)中处理该化合物过夜，真空蒸发挥发物。将残余物溶解在水(100mL)中，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。用浓氨水碱化水(20mL)中的产物，并置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(150mL)(乙酸盐形式)上。用水洗脱，然后用乙酸线性梯度洗脱(各自为0-0.4M，1L)，将得到的主要UV-吸收馏分蒸发，残余物与水(3×50mL)共馏，并从水中结晶，得到3.67g 2-氨基-4-甲基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：245℃。对于C₈H₁₄N₃O₅P(263.19)，元素分析理论值：36.51％C、5.36％H、15.97％N和11.77％P；元素分析测定值：36.65％C、5.60％H、15.69％N和11.92％P。

     ¹H NMR(D₂O+NaOD)：6.13s，1H(H-5)；4.39m，2H(2×H-1′)；3.92m，2H(2×H-2′)；3.57d，2H，J(H，P)＝8.5Hz(P-CH₂)；2.26s，3H(CH₃).¹³C NMR(D₂O+NaOD)：173.63，172.80 and 165.50(C-2，C-4 and C-6)；98.75(C-5)；73.09d，J(C，P)＝10.2Hz(C-2′)；72.06d，J(C，P)＝149.4Hz(P-CH₂)；68.85(C-1′)；25.42(CH₃).

    进一步洗脱硅胶柱，然后从乙酸乙酯-石油醚中结晶，得到2-氨基-4-甲基-1-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6-(1H)-酮(4.2g)，熔点：88℃。对于C₁₄H₂₆N₃O₅P(347.35)，元素分析理论值：48.41％C、7.54％H、12.10％N和8.92％P；元素分析测定值：48.49％C、7.62％H、12.30％N和9.08％P。

     ¹H NMR(CDCl₃)：5.79q，1H，J＝0.8Hz(H-5)；5.62b，2H(NH₂)；4.72dh，2H，J(H，P)＝7.6Hz and J(H，H)＝6.2Hz(2×OCH(iPr))；4.20m，2H(2×H-1′)；3.90m，2H(2×H-2′)；3.74d，2H，J(H，P)＝8.6Hz(P-CH₂)；2.12d，3H，J＝0.8Hz(CH₃)；1.32d，6H，J＝6.2Hz and 1.29d，6H，J＝6.2Hz(4×CH₃(iPr)).

     ¹³C NMR(CDCl₃)：164.33，162.93 and 156.37(C-2，C-4 and C-6)；102.22(C-5)；72.88d，J(C，P)＝11.7Hz(C-2′)； 71.27d，J(C，P)＝6.8Hz(OCH(iPr))；66.17d，J(C，P)＝168.1Hz(P-CH₂)；43.06(C-1′)；23.97d，J(C，P)＝3.9Hz and 23.91d，J(C，P)＝4.9Hz(2×CH₃(iPr))；23.64(CH₃).

    类似地，用溴化三甲基硅烷(5mL)在乙腈(50mL)中处理该产物，将去离子化的反应混合物在Dowex 1×2上进行色谱提纯，并从水中结晶，得到2.3g 2-氨基-4-甲基-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6-(1H)-酮，熔点：283℃。对于C₈H₁₄N₃O₅P(263.19)，元素分析理论值：36.51％C、5.36％H、15.97％N和11.77％P；元素分析测定值：36.40％C、5.23％H、15.77％N和12.00％P。

     ¹H NMR(D₂O+NaOD)：5.77s，1H(H-5)；4.18t，2H，J＝5.3Hz(2×H-1′)；3.82t，2H，J＝5.3Hz(2×H-2′)；3.50d，2H，J(H，P)＝8.7Hz(P-CH₂)；2.12s，3H(CH₃).¹³C NMR(D₂O+NaOD)：169.48，168.32 and 160.25(C-2，C-4 and C-6)；102.40(C-5)；73.17(C-2′)； 72.55d，J(C，P)＝142.0Hz(P-CH₂)；45.60(C-1′)；25.43(CH₃).

    实施例9

    

    4-氨基-2-甲硫基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    在0℃，用NaH(1.0g，60％的石蜡油分散液)处理DMF(40mL)中的2-羟基乙基膦酸二乙酯(5.3g，25mmol)，在0℃搅拌1小时后，一次加入4氨基-6-氯-2-甲硫基嘧啶(3.5g，20mmol)。在100℃搅拌混合物16小时，真空蒸发至干，用热氯仿(300mL)萃取。真空蒸发萃取液，在室温下用溴化三甲基硅烷(10mL)在乙腈(50mL)中处理残余物过夜。真空蒸发混合物至干，将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。加入浓氨水使产物溶解于水(20mL)中，用HC1酸化至pH＝3-3.5。收集沉淀，用水和乙醇洗涤，真空干燥。得到0.8g 4-氨基-2-甲硫基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：210-211℃。对于C₈H₁₄N₃O₅P(263.19)，元素分析理论值：32.54％C、4.78％H、14.23％N、10.49％P和10.86％S；元素分析测定值：32.42％C、4.93％H、14.07％N、10.62％P和11.04％S。

     ¹H NMR(D₂O)：5.68s，1H(H-5)；4.36m，2H(2×H-1′)；3.94m，2H(2×H-2′)；3.72d，2H，J(H，P)＝8.5Hz(P-CH₂)；2.48s，3H(SCH₃).¹³C NMR(D₂O)：173.70，172.13 and 167.93(C-2，C-4 and C-6)；84.82(C-5)；73.53d，J(C，P)＝10.7Hz(C-2′)；70.01d，J(C，P)＝156.3Hz(P-CH₂)；69.20(C-1′)；16.02(SCH₃).

    实施例10

    

    2-氨基-4，6-二-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶和2-氨基-4-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮

    在100℃搅拌DMF(200mL)中的2-氨基-4，6-二羟基嘧啶(12.7g，0.1mol)和碳酸铯(27.8g，85mmol)1小时，加入2-氯乙氧基甲基膦酸二异丙酯(30mL)。在100℃搅拌混合物16小时，趁热过滤，真空蒸发。将残余物用硅胶色谱(200mL柱)提纯，得到2.8g油状残余物，然后用溴化三甲基硅烷(7mL)在乙腈(50mL)中处理该油状残余物过夜。将残余物溶解在水(100mL)中，加入浓氨水碱化反应，蒸发混合物。将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。产物与乙醇共馏，并从乙醇中滤出产物，得到1.4g 2-氨基-4，6-二-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：127℃。对于C₁₀H₁₉N₃O₁₀P₂(403.22)，元素分析理论值：29.79％C、4.75％H、10.42％N和15.36％P；元素分析测定值：29.90％C、4.87％H、10.24％N和15.64％P。

     ¹H NMR(DMSO)：6.55b，2H(NH₂)；5.36s，1H(H-5)；4.29m，2H(2×H-1′)；3.76m，2H(2×H-2′)；358d，2H，J(H，P)＝8.6Hz(P-CH₂).¹³C NMR(DMSO)：171.30(C-4，C-6)，162.76(C-2)；78.60(C-5)；70.70d，J(C，P)＝11.7Hz(C-2′)；66.86d，J(C，P)＝160.2Hz(P-CH₂)；64.81(C-1′).

    进一步在硅胶柱上洗脱，得到稠油状物(4.8g)，将其在乙腈(70mL)中用溴化三甲基硅烷(10mL)处理过夜，真空蒸发。将残余物通过Dowex50×8柱(H⁺-型)(150mL)，并用水洗脱柱。洗脱出无机酸后，保留洗脱产物。将其蒸发，用乙醇-丙酮混合物(1∶1，100mL)搅动残余物。滤出淡黄色产物，用乙醚洗涤并干燥，得到1.8g 2-氨基-4-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]-1-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘧啶-6(1H)-酮，熔点：108℃。对于C₁₀H₁₉N₃O₁₀P₂(403.22)，元素分析理论值：29.79％C、4.75％H、10.42％N和15.36％P；元素分析测定值：29.90％C、4.87％H、10.24％N和15.64％P。

    实施例11

    

    (a)2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    在排除湿气的条件下，将氢化钠(60％的石蜡油悬浮液)(2.4g，60mmol)小心地分次加入到再蒸馏的乙二醇(50mL)中直至溶解。然后-次加入2，4-二氨基-6-氯嘧啶(2.89g，20mmol)，在80℃搅拌混合物6小时。冷却反应混合物，用水(200mL)稀释，使其通过在酸循环中的Dowex 50×8柱(200mL)。用水(1L)洗涤该柱，将树脂悬浮在水(300mL)中。将该悬浮液用浓氨水碱化，过滤，用沸水(1L)洗涤树脂。将合并的滤液蒸发至干，从水中结晶残余物，得到2.3g(79.4％)2，4-二氨基-6-(2-羟基乙氧基)嘧啶，熔点：190℃。对于C₆H₁₀N₄O₂(170.18)，元素分析理论值：42.34％C、5.92％H和30.37％N；元素分析测定值：42.09％C、5.89％H和30.63％N。质谱：171.3(MH⁺)。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：3.67brq，2H，J(CH₂，CH₂)～J(CH₂，OH)＝4.8(O-CH₂)；4.10t，2H，J(CH₂，CH₂)＝5.0(O-CH₂)；4.79t，1H，J(OH，CH₂)＝4.5(OH)；5.05s，1H(H-5)；5.89brs，2H and 6.01brs，2H(NH₂).

    用60％NaH(3.5g，3.5当量)处理该化合物(4.25g，25mmol)和对甲苯磺酰氧基甲基膦酸二异丙酯(8.75g，25mmol)的DMF(50mL)溶液。在室温下搅拌混合物3天，滴加乙酸(4mL)。真空除去溶剂，用氯仿萃取残余物。用硅胶柱色谱提纯反应产物，从乙酸乙酯-石油醚中结晶后，得到6.45g(74％)2，4-二氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，熔点：159℃。对于C₁₃H₂₅N₄O₅P(348.3)，元素分析理论值：44.83％C、7.23％H、16.08％N和8.89％P；元素分析测定值：44.86％C、7.15％H、16.21％N和9.05％P。质谱：349.3(MH⁺)。¹H NMR光谱(CD₃SOCD₃)与实施例1中的相同。

    用基本上与实施例1相同的方法，将该化合物转化为2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶，根据NMR和质谱，所得到的化合物与真实化合物相同。

    (b)2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    除了用相同摩尔量的叔丁醇钾代替NaH外，基本上按上述(a)的方法进行反应，2，4-二氨基-6-(2-羟基乙氧基)嘧啶的收率为81％。其它步骤保持不变。

    实施例12

    

    (a)2，4-二氨基-6-[(RS)-3-羟基-2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶

    将在新近再蒸馏的四氢呋喃(100mL)中的4-羟基甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(1 3.2g，0.1mol)滴加至NaH(0.2mol)的四氢呋喃(400mL)悬浮液中。搅拌混合物直至溶解，加入2，4二氨基-6-氯嘧啶(14.46g，0.1mol)。在氩气气氛下搅拌回流反应混合物12小时，用乙酸中和。过滤淤浆，用四氢呋喃洗涤。将滤液真空蒸发至干。用在氯仿中的硅胶柱(300mL)提纯，从乙酸乙酯-石油醚中结晶后，得到16.0g(66.6％)2，4-二氨基-6-[2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲氧基]嘧啶，熔点：1 28℃。对于C₁₀H₁₆N₄O₃(240.3)，元素分析理论值：49.99％C、6.71％H和23.32％N；元素分析测定值：49.95％C、6.84％H和23.05％N。质谱：241.3(MH⁺)。

     ¹HNMR(CD₃SOCD₃)：1.27s，3H and 1.33s，3H(CH₃)；3.68dd，1H，J(3′b，2′)＝6.2，J(gem)＝8.3(H-3′b)； 4.02dd，1H，J(3′a，2′)＝6.6，J(gem)＝8.3(H-3′a)；4.19m，2H(H-1′a)；4.10dd，1H，J(1′b，2′)＝6.0，J(gem)＝11.0(H-1′b)；4.13dd，1H，J(1′a，2′)＝5.0，J(gem)＝11.0(H-1′a)；4.30m，1H(H-2′)；5.06s，1H(H-5)； 5.94brs，2H and 6.06brs，2H(NH₂).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：25.75和26.94(CH₃)；65.72(C-3′)；66.22(C-1′)；74.00(C-2′)；76.58(C-5)；109.06(C_iPr)；163.23和166.38和170.11(C-6，C-2，C-4).

    将在0.25M H₂SO₄(250mL)中的上述化合物(14.4g，60mmol)在室温静置过夜。用饱和氢氧化钡溶液中和混合物，过滤，将滤液蒸发至干。将残余物从90％乙醇中重结晶(加入乙醚直至浑浊)，得到10.0g(83.3％)2，4-二氨基-6-(2，3-二羟基丙氧基)嘧啶，熔点：160℃。对于C₇H₁₂N₄O₃(200.2)，元素分析理论值：42.00％C、6.04％H和27.99％N；元素分析测定值：41.84％C、6.24％H和28.06％N。质谱：201.2(MH⁺)。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：3.40d，2H，J(3′，2′)＝5.4(H-3′)；3.72m，1H(H-2′)；4.01dd，1H，J(1′b，2′)＝6.2，J(gem)＝10.9(H-1′b)；4.10dd，1H，J(1′a，2′)＝4.4，J(gem)＝10.9(H-1′a)；4.73brs，1H和5.02brs，1H(OH)；5.09s，1H(H-5)；5.99brs，2H和6.07brs，2H(NH₂).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：63.14(C-3′)；67.16(C-1′)；70.28(C-2′)；76.64(C-5)；163.19和166.27(C-2，C-4)；170.62(C-6).

    将该化合物(8.0g，40mmol)、三苯甲基氯(36.4g，131mmol)和4-二甲基氨基吡啶(2g)在吡啶(160mL)中的混合物在50℃下搅拌15小时，在搅拌条件下，缓慢倾入水(2L)中。搅拌淤浆1小时，倾析，再加入水(2L)搅拌，然后，过滤，用水洗涤。将沉淀物转移至氯仿(600mL)中，用MgSO₄干燥，蒸发，与甲苯(3×100mL)真空共馏。将所得树胶溶解在最少量乙醚中，剧烈搅拌，将其滴加至石油醚(1L)中。滤出沉淀物，用石油醚洗涤，干燥。得到33.4g(91.5％)6-[2-羟基-3-(三苯甲氧基)丙氧基]-2，4-二-(三苯甲基氨基)嘧啶，熔点：138℃。对于C₆₄H₅₄N₄O₂(911.1)，元素分析理论值：6.15％N；元素分析测定值：5.96％N。用60％NaH(5.4g，3.5当量)在四氢呋喃(300mL)中处理该三苯甲基衍生物(27.3g，30mmol)和对甲苯磺酰氧基甲基膦酸二异丙酯(15.75g，45mmol)。将混合物在室温搅拌3天，用乙酸中和。真空除去溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(800mL)中，用水(3×200mL)萃取。蒸发有机相至干，在80％乙酸水溶液(300mL)中回流残余物30分钟，冷却，并真空蒸发。加入水(300mL)，混合物用乙醚(4×100mL)萃取。真空除去水相中的挥发物，并置于酸型Dowex 50×8柱(200mL)上。用水洗涤该柱直至产生具有UV吸收的酸性液滴，然后用2.5％氨水洗脱。收集UV-吸收氨水洗脱液，真空蒸发至干，用乙醇(3×100mL)共馏残余物，用P₂O₅真空干燥过夜。加入乙腈(100mL)和溴化三甲基硅烷(30mL)，在排出湿气的条件下静置混合物过夜。真空蒸发挥发物后，向残余物中加入水(200mL)，然后加入浓氨水碱化反应。蒸发该溶液至干，在基本上相同条件下，将残余物在Dowex 50×8柱(200mL)上去离子化。将UV-吸收氨水洗脱液置于真空，用最少量水溶解残余物，并用氨水碱化至pH10。将该溶液置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(200mL)(乙酸盐形式)上。用水洗涤该柱直至产生UV-吸收洗脱液滴，然后用乙酸进行线性梯度洗脱(各自为0-0.3M，1.51)。收集主要UV-吸收馏份，真空蒸发，残余物与水(2×100mL)共馏。将残余物从水中结晶，得到3.8g(40.6％)2，4二氨基-6-[(RS)-3-羟基-2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶一水合物。白色针状晶体，熔点：213℃。对于C₈H₁₅N₄O₆P·H₂O(312.2)，元素分析理论值：30.78％C、5.49％H、17.94％N和9.92％P；元素分析测定值：30.98％C、5.52％H、17.99％N和9.82％P。质谱：295.0(MH⁺)。

     ¹H NMR(D2O+NaOD)：3.48dd，1H，J(P，CHb)＝9.8，J(gem)＝12.1(P-CHb)；3.59dd，1H，J(P，CHa)＝8.9，J(gem)＝12.1(P-CHa)；3.61dd，1H，J(3′b，2′)＝6.8，J(gem)＝12.9(H-3′b)； 3.70m，1H(H-2′)；3.71dd，1H，J(3′a，2′)＝3.6，J(gem)＝12.9(H-3′a)；4.11dd，1H，J(1′b，2′)＝5.0，J(gem)＝10.7(H-1′b)；4.14dd，1H，J(1′a，2′)＝4.6，J(gem)＝10.7(H-1′a)； 5.36s，1H(H-5)；¹³C NMR(D2O+NaOD)：60.62(C-3′)；65.58(C-1′)；68.03d，J(P，C)＝149.4(P-C)；76.63(C-5)；79.89d，J(P，C)＝10.7(C-2′)；162.63 and 166.54(C-2，C-4)；170.78(C-6).

    (b)2，4-二氨基-6-[(S)-3-羟基-2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶.

    将由1，2：5，6-二异亚丙基-D-甘露糖醇新近制得的(S)-2，2-二甲基-4-羟基甲基-1，3-二氧戊环(40g，0.3mol)真空蒸馏，并滴加至NaH(0.3mol)的四氢呋喃(600mL)悬浮液中。搅拌混合物30分钟，加入2，4-二氨基-6-氯嘧啶(36.2g，0.25mol)。在氩气气氛下搅拌回流反应混合物12小时，用乙酸中和。过滤浆料，用四氢呋喃洗涤，真空蒸发滤液至干。在氯仿中的硅胶柱(600mL)上提纯，从乙酸乙酯-石油醚中结晶后，得到2，4-二氨基-6-(S)-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基甲氧基)嘧啶。收率46.0g(76.6％)。将在0.25M H₂SO₄(800mL)中的该化合物(43.3g，0.18mol)在室温下静置过夜。用饱和氢氧化钡溶液中和混合物，过滤，蒸发滤液至干。将残余物从90％乙醇中重结晶(加入乙醚直至浑浊)，得到32.0g(89％)2，4-二氨基-6-(S)-(2，3-二羟基丙氧基)嘧啶，  熔点：149℃。对于C₇H₁₂N₄O₃(200.2)，元素分析理论值：42.00％C、6.04％H和27.99％N；元素分析测定值：41.94％C、6.35％H和27.75％N。质谱：201.2(MH⁺)。NMR光谱与外消旋化合物相同。

    在80℃，将该化合物(32.0g，0.16mmol)、三苯甲基氯(140g，0.5mol)和4-二甲氨基吡啶(3g)在吡啶(500mL)中的混合物搅拌24小时，搅拌下缓慢倾入水(5L)中。搅拌浆料1小时，倾析，再加入水(2L)搅拌之后，过滤并用水洗涤。将沉淀物转移至氯仿(2L)中，用MgSO₄干燥，蒸发，并与甲苯(3×200mL)真空共馏。将所得树胶溶解在最少量乙醚中，在剧烈搅拌下滴加至石油醚(2.5L)中。滤出沉淀物，用石油醚洗涤，空气干燥过夜.真空干燥，得到99.5g(69％)6-(S)-[2-羟基-3-(三苯甲氧基)丙氧基]-2，4-二-(三苯甲基氨基)嘧啶。对于C₆₄H₅₄N₄O₂(911.1)，元素分析理论值：6.15％N；元素分析测定值：5.96％N。用60％NaH(14.4g，0.36mol)在新鲜的无水四氢呋喃(600mL)中处理该三苯甲基衍生物(99.5g，0.11mol)和对甲苯磺酰氧基甲基膦酸二异丙酯(42g，0.12mol)。在室温搅拌混合物3天，用塞力特硅藻土垫过滤，滤液用乙醇(20mL)处理。真空除去溶剂，在80％乙酸水溶液(500mL)中回流残余物30分钟，在室温静置过夜。滤出结晶产物，用80％乙酸洗涤，真空蒸发滤液。加入水(700mL)，混合物用乙醚(4×200mL)萃取。真空浓缩水相，并置于酸型Dowex 50×8柱(250mL)上。用20％甲醇水溶液洗涤该柱直至流出具有UV-吸收的酸性液滴，然后用在20％甲醇水溶液中的2.5％氨水洗脱。收集UV-吸收氨水洗脱液，真空蒸发至干，残余物与乙醇(3×100mL)共馏，用P₂O₅真空干燥过夜。加入乙腈(200mL)和溴化三甲基硅烷(50mL)，在排除湿气的条件下静置混合物过夜。真空蒸发挥发物后，向残余物中加入水(300mL)，然后加入浓氨水碱化反应。蒸发溶液至干，在相同条件下，将残余物在Dowex 50×8柱(250mL)上去离子化。将UV吸收氨水洗脱液置于真空中，将残余物溶解在最少量水中，用氨水碱化至pH10。将该溶液置于预先用水洗涤的Dowex 1×2柱(乙酸盐形式)(250mL)上。用水洗涤该柱直至洗出UV-吸收洗脱液，然后，用乙酸进行线性梯度洗脱(各为0-0.3M，2L)。将主要UV-吸收馏份真空蒸发，残余物与水(2×100mL)共馏。从水中重结晶，得到13.8g(40％)2，4-二氨基-6-(S)-[3-羟基-2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶一水合物。白色针状晶体，熔点：对于C₈H₁₅N₄O₆P·H₂O(312.2)，元素分析理论值：30.78％C、5.49％H、17.94％N和9.92％P；元素分析测定值31.00％C、5.70％H、17.79％N和9.75％P。质谱：295.0(MH⁺)。NMR光谱与外消旋化合物相同。

    实施例13

    

    2-氨基-4-羟基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    用30分钟将4-羟基甲基-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环(15mL，0.12mol)滴加至NaH(60％的石蜡油分散液，4.8g，0.12mol)的四氢呋喃(250mL)搅拌悬浮液中。在室温搅拌1小时后，加入2-氨基-4，6-二氯嘧啶(16.4g，0.1mol)，回流混合物直至原料基本消失(在硅胶板上进行TLC，1∶9甲醇-氯仿体系)。冷却混合物，并加入乙酸中和，用塞力特硅藻土过滤，用四氢呋喃洗涤并真空蒸发。残余物用乙醚滗析两次(各为100mL)，溶解在氯仿(100mL)中，用短硅胶柱过滤(用1L氯仿洗涤)。真空蒸发滤液，将残余物溶解在热乙酸乙酯中，向热溶液中小心地加入等体积乙醚，然后加入石油醚直至浑浊。过滤收集在冰箱中结晶的产物，用乙醚/石油醚混合物(1∶1)洗涤并真空干燥。得到20.5g(79％)2-氨基-4-氯-6-[2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基甲氧基]嘧啶，熔点：152℃。对于C₁₀H₁₄ClN₃O₃(259.7)，元素分析理论值：46.25％C、5.43％H、13.65％Cl和16.18％N；元素分析测定值：46.45％C、5.46％H、13.90％Cl和15.95％N。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.28s，3H and 1.33s，3H(CH₃)；3.71dd，1H，J(3′b，2′)＝6.1，J(gem)＝8.4(H-3′b)；4.05dd，1H，J(3′a，2′)＝6.6，J(gem)＝8.4(H-3′a)；4.22dd，1H，J(1′b，2′)＝6.3，J(gem)＝11.2(H-1′b)；4.28dd，1H，J(1′a，2′)＝4.5，J(gem)＝11.2(H-1′a)；4.35m，1H(H-2′)；6.10s，1H(H-5)；7.08brs，2H(NH₂).¹³CNMR(CD₃SOCD₃)：25.48和26.76(CH₃)；65.82和66.84(C-1′，C-3′)；73.35(C-2′)；94.48(C-5)； 109.05(C_iPr)；160.21(C-2)；162.95(C-4)； 170.48(C-6).

    将该化合物(13g，50mmol)、DABCO(12g)和K₂CO₃(21.5g)在水(300mL)中的混合物回流搅拌3小时。冷却至室温后，搅拌下分批加入Dowex 50×8(酸型)使pH～6，以分解碳酸盐和中和DABCO。然后，加入浓氨水使悬浮液稍成碱性，过滤，用水洗涤并将滤液真空蒸发。将树脂再悬浮在稀(1∶20)氨水(300mL)中，过滤，随后树脂用沸水(4×200mL)洗涤。将滤液和洗液真空蒸发。通过与乙醇共馏来干燥上述两种残余物，并用氯仿萃取。滤出半晶体固体。用氯仿洗涤，并在硅胶(50mL)上用甲醇溶液吸收。将该物料加到在氯仿中的短柱(150mL)上，用氯仿-甲醇混合物(9∶1)洗脱产物，并从乙醇中结晶(加入乙醚直至浑浊)，得到8.2g(68％)2-氨基-4-羟基-6-[(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基]嘧啶，熔点：258℃。对于C₁₀H₁₅N₃O₄(241.2)，元素分析理论值：46.25％C、5.43％H、13.65％Cl和16.18％N；元素分析测定：46.45％C、5.46％H、13.90％Cl和15.95％N。质谱：242(M+H)。

     ¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.27s，3Hand 1.32s，3H(CH₃)；3.67dd，1H，J(3′b，2′)＝6.2，J(gem)＝8.4(H-3′b)； 4.02dd，1H，J(3′a，2′)＝6.6，J(gem)＝8.4(H-3′a)； 4.05dd，1H，J(1′b，2′)＝6.1，J(gem)＝11.0(H-1′b)；4.10dd，1H，J(1′a，2′)＝4.6，J(gem)＝11.0(H-1′a)； 4.30qd，1H，J(1′a，2′)＝4.6，J(2′，1′)～J(2′，3′)＝6.3(H-2′)；4.78s，1H(H-5)；6.67brs，2H(NH₂)，10.47brs，1H(NH).¹³CNMR(CD₃SOCD₃)：25.54和26.78(CH₃)；65.83(C-3′)；66.70(C-1′，)；73.63(C-2′)；79.99(C-5)；108.94(C_iPr)；164.25和155.69(C-2，C-6).

    实施例14

    2-氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]-4-羟基嘧啶

    将2-氨基-4-氯-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(5.7g)、DABCO(3.6g)和K₂CO₃(9.0g)在水(100mL)中的混合物搅拌回流150分钟，冷却并加入Dowex 50×8(H⁺-型)酸化。用浓氨水将悬浮液碱化，搅拌5分钟后，过滤，树脂用50％甲醇水溶液(200mL)洗涤。蒸发滤液至干，加入乙醇(50mL)，将混合物蒸发至干。将残余物在硅胶柱色谱(150mL)上用氯仿-乙醇梯度洗脱，得到晶体2-氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]-4-羟基嘧啶，熔点：154℃，收率78％。对于C₁₃H₂₄N₃O₆P(349.3)，元素分析理论值：44.70％C、6.92％H、12.03％N和8.37％P；元素分析测定值：44.58％C、7.02％H、11.95％N和8.53％P。¹H NMR(CD₃SOCD₃)：1.24d，6H和1.23 d，6H，J(CH₃，CH)＝6.2(4×CH₃)；3.74m，2H(H-2′)；3.76d，J(CH₂-P)＝8.3(CH₂-P)；4.19m，2H(H-1′)；4.59m，2 H(P-OCH)；4.75s，1H(H-5)；6.65bs，2H，2H(NH₂)；10.45s，1H(OH).¹³C NMR(CD₃SOCD₃)：23.87d，2C，J(CH₃，P)＝4.9.和24.01d，2C，J(P，C)＝3.9(CH₃)；65.03d，J(P，C)＝164.6(P-C)； 65.04(C-1′)；70.37d，2C，J(P，C)＝6.3)(P-OC)；70.87d，J(P，C)＝11.7(C-2′)；79.95(C-5)；155.68(C-4)；164.25(C-2)；171.01 (C-6).

    用溴化三甲基硅烷(10mL)在乙腈(80mL)中处理该产物过夜，真空蒸发，残余物用水(50mL)处理。10分钟后，加入浓氨水碱化反应并将混合物蒸发.将残余物在Dowex 50×8柱(100mL)上去离子化，蒸发UV-吸收氨水洗脱液至干。通过加入浓氨水将其溶解在最少量热水中，用浓HCl酸化至pH3-3.5。收集沉淀，用水和乙醇洗涤，真空干燥，得到0.7g 2-氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]4-羟基-嘧啶，熔点：227℃。对于C₇H₁₂N₃O₆P(265.16)，元素分析理论值：31.71％C、4.56％H、15.85％N和11.68％P；元素分析测定值：31.55％C、4.62％H、16.15％N和11.51％P。

    实施例15

    

    2，4-二氨基-5-溴-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶

    在室温下，将在DMF(40mL)中的2，4-二氨基-6-[2-(二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶(4.3g，12.3mmol)与溴的CCl₄(0.3M，50mL)溶液一起搅拌3小时，用三乙胺碱化并蒸发。在氯仿-乙醇体系中，将粗产物在硅胶柱(150mL)上提纯，并从乙酸乙酯-石油醚中结晶，得到3.9g(11.9mmol)二酯，在乙腈(50mL)中用溴化三甲基硅烷(20mL)处理该二酯过夜，真空蒸发并用氨水分解。在Dowex 50(100mL柱)上去离子后，用乙酸进行梯度洗脱(0-0.5M和1L)，通过Dowex 1×2柱(100mL)色谱提纯氨水洗脱液残余物。将主要馏份蒸发并从水中结晶，得到3.1g(84％)标题化合物，熔点：218℃。对于C₇H₁₂BrN₄O₅P(343.07)，元素分析理论值：24.51％C、3.53％H、23.29％Br、16.33％N和9.03％P；元素分析测定值：24.56％C、3.55％H、23.51％Br、16.07％N和8.89％P。

    用2-氨基-6-[2-二异丙基膦酰基甲氧基)乙氧基]-4-羟基嘧啶重复该反应，得到5-卤代类似物。

    实施例16

    根据J.Balzarini et al.，″9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine(PMEA)effectively inhibits retrovirus replication invitro and  simian immunodeficiency virus infection in rhesusmonkeys″AIDS 5：21-28，1991.和J.Balzarini，et al.，″Differential antiherpesvirus and antiretrovirus effects ofthe(S)and(R)enantiomers of acyclic nucleoside phosphonates：potent and selective in vitro and in vivo antiretrovirusactivities of(R)-9-(2-phosphonomethoxypropy)-2，6-diaminopurine″Antimicrobial Agents and Chemotherapy.37：332-338，1993中公开的一般方法，测定本发明化合物的抗病毒活性。

    结果列于表1a，其中，较高效力表示为较低绝对值。

    实施例17

    病毒。MSV、1型HIV(HIV-1)(III_B和Ba-L株)、HIV-2(ROD株)和FIV(Petaluma株)的来源已被公开(Balzarini et.al.，AIDS 5：21-28，1991；De Clercq et.al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.137：590-594，1971；Egberink et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87：3087-3091，1990；Hartmann et.al.，Antiviral Chem.Chemother.5：13-19，1994；Popovic et.al.，Science 224：497-500，1984)。由被病毒感染的MT-4细胞培养物的上清液得到HIV-1(III_B)和HIV-2(ROD)原液。使HIV-1_BaL在人类原代M/M中扩张，收集其上清液，过滤，在-80℃贮藏备用。用于该研究的病毒原液的特性为2.1×10⁸HIV-RNA基因组/ml(相当于35ng的p24抗原)和在其它原代M/M培养物中通过病毒滴定法测定的5,000倍组织培养半感染剂量50％/ml(TCID₅₀/ml)。临床HIV-1分离物L1S、L6S和L6S/PMEA的分离和特性已被报道(Thormar et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3283-3287，1995；Van Laethemet.al.，AIDS 15：553-561，2001)。HIV-1/L1S临床分离物来自未用NRTI(核苷反转录酶抑制剂)或ANP治疗的患者，并在没有任何药物的选择性压力下培养。因此，其不含有对于用NRTI-或ANP-治疗的患者所特有的明显突变。HIV-1/L6S临床分离物来自药物治疗的个体并在没有任何药物的选择性压力下培养。作为NRTI-治疗患者的特征，在其RT中含有S68G、K70T、V75I、F77L、F116Y和Q151M突变。HIV-1/L6S/PMEA是在增加PMEA浓度(adefovir)下，在对11次传代病毒培养后分离出的HIV-1/L6S临床分离物。除了上述HIV-1/L6S突变外，在其反转录酶(RT)中还获得了PMEA-特征的K65R突变。

    放射化学试剂。[甲基-³H]胸腺嘧啶核苷(比放射性：42Ci/mmole)、[5-³H]尿苷(比放射性：26Ci/mmole)和[4，5-³H]亮氨酸(比放射性：52Ci/mmole)购自Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire，U.K.)。

    化合物.在该研究中使用了下述化合物：

    1、2，4-二氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    2、2，4-二氨基-6-{[2-(膦酰基甲氧基)乙基]-硫基}嘧啶；

    3、4-氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    4、2-氨基-4-羟基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    5、2-氨基-4-羟基-6-{[2-(膦酰基-甲氧基)乙基]硫基}嘧啶；

    6、2-氨基-4-二甲基氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)-乙氧基]嘧啶；

    7、2-氨基-4-环丙基氨基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    8、4-氨基-2-甲硫基-6-[2-(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    9、2-氨基-4-甲基-6-[2(膦酰基甲氧基)乙氧基]嘧啶；

    10、2，4-二氨基-6-(S)-[2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶；

    11、2，4-二氨基-6-(R)-[2-(膦酰基甲氧基)丙氧基]嘧啶；

    PMEA，9-[(2-膦酰基-甲氧基)乙基]腺嘌呤；

    (R)-PMPA，(R)-9-[(2-膦酰基甲氧基)-丙基]腺嘌呤。

    体外抗病毒试验。在感染5天后的MT-4细胞培养物中，基于用台盼蓝染料染色测定细胞活力，或者，在感染4-5天后的CEM细胞培养物中，基于显微镜测定病毒诱导的巨细胞形成，来测定抗HIV-1-和HIV-2-诱导的细胞病变活性。以100CCID₅₀将HIV-1和HIV-2加入细胞培养物中。

    通过密度离心(Lymphoprep；Nycomed Pharma，AS Diagnostics，Oslo，Norway)分离来自健康供体的周围血液单核细胞(PBMC)，并用植物血球凝集素(PHA)(Sigma Chemical Co.，Bornem，Belgium)刺激3天。用PBS洗涤活化的细胞(PHA-刺激的胚细胞)，按AIDS临床试验小组原始记录所述进行病毒感染。简而言之，在试验化合物的系列稀释液存在下，将PBMC(2×10⁵/200孔)平皿接种，并用1000CCID₅₀/mL的HIV株感染。感染4天后，除去125μl被感染培养物上清液，并用150μl含有合适浓度试验化合物的新鲜介质代替。平皿接种细胞7天后，通过酶联免疫吸附测定(NEN，Paris，France)来检测培养物上清液中的p24抗原。

    如下所述制备和提纯人类原代巨噬细胞(M/M)。利用菲可梯度，分离来自健康HIV-1-阴性供体的周围血液单核细胞(PBMC)，并按1.8×10⁶细胞/孔接种至48-孔板的1mL RPMI 1640中，所述RPMI 1640含有20％热-灭活的无内毒素和支原菌的胎牛血清(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，UT)、4mM L-谷酰胺(Life Technologies)、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Life Technologies)(下文称作完全介质)。平皿接种并在富含5％CO₂的潮湿气氛中37℃培养PBMC 5天后，用温热的RPMI-1640反复洗涤，小心地除去粘连细胞，剩下的单层粘连细胞最后在完全介质中培养。通过细胞荧光测定表明，在上述条件下处理的细胞＞97％M/M。用化合物处理巨噬细胞30分钟，然后用300TCID₅₀/mlHIV-l_BaL攻击。在病毒攻击2小时后，洗涤M/M，除去病毒接种物，需要时，替换含有合适化合物浓度的完全介质，然后在整个实验期间培养M/M。用各种化合物浓度一式三份进行试验，同时一式六份进行阳性对照组试验。因此，每当改变介质就替换化合物。感染14天后收集上清液，用于通过分析HIV-1-p24抗原来评估病毒产量。

    对于抗FIV试验，将10⁵CrFK细胞接种至24-孔组织培养板上。在各种药物浓度的条件下，用2ml培养介质/孔培养细胞，所述培养介质含有2.5％胎牛血清。一式三份进行试验。在37℃培养1小时后，用FIV感染细胞。使病毒与培养液接触1天，然后除去介质并加入含有合适药物浓度的新介质。6天后，通过抗原捕捉试验来检验FIV p24抗原的存在。

    在感染6天后，用显微镜检验试验化合物对MSV-诱导的鼠胚胎纤维细胞C3H/3T3细胞培养物转化的抑制效力。将MSV以75转化灶单位加入到细胞培养物中。用于抗反转录病毒评估的详细方法已有详细报道(Balzarini et al.，AIDS 5：21-28，1991；Balzarini et al.，Antimicrob.Agents Chemother.37：332-338，1993和De Clercq etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.137：590-594，1971)。

    体内抗-MSV活性。按已公开的方法(Balzarini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：332-336，1989；Balzarini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4961-4965，1991和Balzarini et al.，Antimicrob.Agents Chemother.37：332-338，1993)，评估化合物对MSV-诱导的肿瘤形成的引发的抑制效力和评估MSV-接种小鼠的存活。简而言之，分别将2-3天大的NMRI小鼠在左后腿皮下接种MSV，并在病毒感染前4小时(第1天)用单剂量试验化合物进行腹膜内给药，然后在2、3、4和5天用单剂量试验化合物腹膜内给药。对于tenofovir[(R)-PMPA]、adefovir(PMEA)、1(指定为PMEO-2，4-二-NH₂-Pym)、2(指定为PMES-2，4-二-NH₂-Pym)和11(指定为(R)PMPO-2，4-二-NH₂-Pym)，药物计量是50、20、8、4和/或2mg/kg/天。未发现最高剂量试验化合物的毒性。每天记录在病毒接种部位MSV-诱导的肿瘤的出现和生长以及感染长达30天的小鼠存活率。

    开链式核苷膦酸酯的体外抑制细胞效应和抗代谢效力。现已报道了有关试验化合物对CEM细胞生长抑制作用的检测方法(Balzarini etal.，AIDS 5：21-28，1991)。50％抑制细胞浓度(CC₅₀)被定义为：将存活细胞数降低50％的化合物浓度。为了测定试验化合物的MT-4细胞毒性，在存在或不存在不同浓度试验化合物的条件下，在37℃，将5×10⁴MT-4细胞在96-孔小平板的孔中培养5天。通过台盼蓝排除法，根据显微镜计数的存活细胞数计算CC₅₀值。

    同时还在微量培养板中测定在不溶于甲醇的CEM细胞碎片中掺和的[甲基-³H]胸腺嘧啶核苷、[³H]尿苷和[³H]亮氨酸。向每个孔中加入10⁵CEM细胞、5.9pmol(0.25μCi)[甲基-³H]胸腺嘧啶核苷、38pmol(1.0，μCi)[³H]尿苷和19pmol(1.0μCi)[4，5-³H]亮氨酸以及给定量的试验化合物。在CO₂控制的潮湿气氛中，将细胞在37℃培养20小时。在培育期结束后，将孔内容物(200μl)转移至安装在微孔3025取样歧管仪上的25-mm玻璃纤维过滤器(type A/G；Gelman InstrumentCo.，Ann Arbor，MI)上。过滤器用冷PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤两次、10％冷三氯乙酸洗涤两次、5％冷三氯乙酸洗涤两次、冷乙醇洗涤一次和冷乙醚洗涤一次。然后在60℃干燥过滤器10分钟，并在基于甲苯的闪烁中检测放射活性。

    开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物在CEM细胞培养物中的抗-HIV-1活性。有效的抗反转录病毒活性的先决条件是在嘧啶环的C-2上存在氨基，同时在C-4上存在氨基(即，化合物1、2和11)或羟基(即，化合物4)(表1)。这些6-PMEO和6-PMPO取代的嘧啶结构产生了EC₅₀为0.80-2.0μg/ml的抗-HIV活性。在C-2上没有氨基(即，化合物3或8)或在C-4上存在二甲基氨基或甲基或环丙基氨基(即，分别为化合物6、9和7)会导致抗反转录病毒活性完全消失(表1)。一般，硫醚衍生物的活性是相应醚衍生物(即，化合物2与化合物1相比)活性的5-10倍分之一，或甚至完全失活(即，化合物5)。有趣的是，新的嘧啶ANP的抗反转录病毒活性在其抗HIV-1作用中具有显著的对映异构特异性。(R)-6-PMPO嘧啶衍生物11较其相应的(S)-6-PMPO嘧啶衍生物(10)具有对所述病毒更显著的抑制作用(表1)。以(S)-对映体而突出的剩余抗病毒活性可能是由于其掺有来自手性原料的(R)-对映体(1-2％)。

    即使在100μg/mL浓度下测得任何细胞毒性，大多数化合物的细胞毒性是低的，但化合物4却是明显的例外(对CEM细胞的CC₅₀：2.5μg/mL)。抗病毒活性最高的6-PMEO-2，4-二-NH₂嘧啶衍生物(化合物1)对CEM细胞的CC₅₀为11μg/mL，而其相应的硫醚类似物2和(R)-6-PMPO-2，4-二-NH₂嘧啶衍生物11的CC₅₀值为大约60μg/ml(表1)。有趣的是，在CEM细胞培养物中，化合物1的5-溴-衍生物在2.5μg/mL具有抗HIV-1活性，且在100μg/mL无毒性。在12小时培养期间，在200μg/mL浓度下，化合物1、化合物2和化合物11对[³H]dThd、[³H]Urd和[³H]leu结合到TCA-不溶CEM细胞材料中都不具有抑制作用。而且，在该药物浓度下，PMEA和(R)-PMPA对大分子合成也没有抑制作用(数据未列出)。

    开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物在几种病毒/细胞系统中的抗逆转录病毒活性。使用6-PMEO衍生物1和4、6-PME硫醚(6-PMES)2和(R)-6-PMPO衍生物11，评估其体外抗几种逆转录病毒模型的抑制活性(表2)。结果，试验化合物在CEM细胞培养物中对HIV-1(III_B)的抗病毒活性值(表1)与在CEM细胞中对HIV-2(ROD)、在MT-4细胞培养物中对HIV-1和HIV-2以及在猫科Crandell肾细胞中对FIV的抗病毒活性值非常接近。因此，化合物1对HIV的EC₅₀值为0.29-0.80μg/mL，化合物11的EC₅₀值为1.3-3.0μg/mL。这些数值接近于参照化合物PMEA(adefovir)(EC₅₀：0.96-2.0μg/mL)和(R)-PMPA(tenofovir)(EC₅₀：0.36-0.52μg/mL)的EC₅₀测定值。如果评估6-PMEO和6-(R)-PMPO衍生物抗初级细胞中的HIV-1[PBL中的HIV-1(III_B)和单核细胞/巨噬细胞(M/M)中的HIV-1(Ba-L)]活性，其抗反转录病毒效力甚至更加显著。实际上，与EC₅₀值为1.9和0.33μg/mL的参照化合物PMEA和(R)-PMPA相比，化合物1和11抑制PBL中病毒的EC₅₀值分别为0.07和0.12μg/mL。正如使用PMEA和(R)-PMPA可以测得的那样，6-PMEO和(R)-6-PMPO衍生物对M/M中的HIV-1(Ba-L)具有更高的抑制作用。通常，与在CEM细胞中相比，化合物在MT-4细胞中的毒性较低，且在单核细胞/巨噬细胞中在100μg/mL浓度下化合物无毒。

    现已表明，在细胞培养物和新生小鼠中，PMEA和(R)-PMPA对莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MSV)具有显著的抑制活性，因此，也对6-PMEO和(R)-6-PMPO新衍生物的体外抗MSV活性进行评估。化合物1、11和4对MSV-诱导的C3H细胞转化具有高抑制活性。EC₅₀值低至0.05-0.15μg/mL(表2)。

    天然核苷和核碱基对开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物在细胞培养物中的抗HIV活性的作用。现已知道，诸如dThd和dCyd的天然核苷的存在能够影响(即，降低)诸如3’-叠氮基-3-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT，齐多夫定)和2’，3’-二脱氧胞苷(ddC，扎西它宾)的嘧啶核苷类似物的抗-HIV活性(Balzarini et al.，Textbook of AIDS Medicine，chapter 49，Broder，S.，T.C.Merigan，and D.Bolognesi，eds.Williams&Wilkins，Baltimore，Maryland，pp.751-772，1994；Balzarini et al.，Antimicrob.Agents Chemother.37：332-338，1993)。因此，为了评估天然核苷和核碱基的存在是否会影响新的6-PMEO和(R)-6-PMPO嘧啶衍生物的抗-HIV活性，对亚毒性浓度的嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(dThd)和2’-脱氧胞苷(dCyd)、嘌呤核苷腺甙(Ado)和鸟苷(Guo)以及核质基质腺嘌呤(Ade)的效力进行了测定(表3)。没有一种天然核苷和核碱基对试验化合物在CEM细胞培养物中的抗HIV-1活性具有任何可检测到的影响。在所有情况下，化合物的抗反转录病毒活性得以完全保存，对于参照化合物PMEA、(R)-PMPA和PMEG的情况也是如此(表3)。

    开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物在新生NMRI小鼠体内抗MSV-诱导的肿瘤形成的效力。使用6-PMEO衍生物1和其硫醚类似物2以及(R)-6-PMPO衍生物11，在新生NMRI小鼠体内，评估其对MSV-诱导的肿瘤形成和相关死亡的抑制效果(表4)。用PMEA(adefovir)和(R)-PMPA(tenofovir)作为参照化合物。在新的6-PMEO和(R)-6-PMPO衍生物中，化合物1被证明是最有效的能抑制新生NMRI小鼠的MSV-诱导的肿瘤形成和相关死亡的化合物(表4)。在50和20mg/kg剂量下，至少能防止80％小鼠形成肿瘤，且剩余的生长了肿瘤的小鼠在感染后能存活30天以上。当剂量低至2mg/kg时，化合物1仍能防止5％小鼠形成肿瘤，并具有15％长期存活率。化合物1具有与PMEA和(R)-PMPA相当的抑制肿瘤形成和抑制相关的动物死亡的能力(表4)。相反，相应的硫醚衍生物2在所有试验剂量条件下均不能抑制肿瘤形成，且在8-50mg/kg剂量条件下长期存活率为20％。(R)-6-PMPO衍生物11抑制肿瘤形成和相关动物死亡的能力介于所测定的化合物1和2之间。以与剂量有关的方式给药，所有药物都迟延了MSV-诱导的肿瘤形成。化合物1具有与(R)-PMPA和PMEA相当的抑制效力。化合物11次于化合物1，并且，化合物2仅在50mg/kg剂量下才能明显迟延肿瘤形成。正如上文针对肿瘤形成所描述的那样，以与剂量有关的方式给药也能迟延相关的动物死亡，并且，化合物1至少与参照药物PMEA和(R)-PMPA迟延死亡的效力相同。

    在CEM细胞培养物中，突变的HIV-1株对开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物的灵敏度。使用化合物1、2和11，评估其对HIV-1(III_B)株的抑制活性，所述HIV-1(III_B)株在RT中含有非核苷RT抑制剂(NNRTI)-特定的L100I、K103N、Y181C和Y188H突变。所有三种化合物都对所述突变型病毒株保留了完全活性(数据未列出)。还评估了这三种化合物对临床分离物HIV-1/L1S、HIV-1/L6S和HIV-1/L6S/PMEA的抑制效果(表5)。用PMEA和(R)-PMPA作为参照化合物。对上述三种病毒株，化合物1保留了明显的抗病毒活性。化合物2，尤其是化合物11，抗HIV-1/L6S/PMEA分离物的活性明显降低，PMEA和(R)-PMPA同样如此。因此，在HIV-1/L6S/PMEA中存在的多-NRTI抗性突变(S68G、K70T、V75I、F77L、F116Y和Q151M)和PMEA-特征的K65R突变对化合物1和PMEA的抗病毒效力(EC₅₀增加约3.6-4.5倍)没有明显影响，同时更明显地降低了对其它ANP的灵敏度(表5)。

    表1a

    抗病毒活性

    (EC₅₀g/mL)

      编号  HSV-1  (KOS)  HSV-2  (G)  HSV-1  TK-  VMW  1837  CMV VZV  MSV  HIV-1  HIV-2  AD-  169 Davis TK+ OKA  TK+  YS TK-  07/1  TK-  YS/R H-3404  6.5  24  9.6  ＞50  ＞50  1.2  1.1  2.5  1.6  0.035±  0.002  0.8±  0  0.43±  0.32 H-3408  29  ≥80  48  ＞50  ＞50  7.5  7  20  15  1.70  5.5±  2.1  3.0±  1.4 H-3415  ＞80  ＞80  ＞80  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞40  ＞100  ＞100 H-3418  ＞16  ＞16  ＞16  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  12.6±           7.6  ＞100  ＞100 H-3427  ＞400  ＞400  ＞400  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  139±  11  ＞100  ＞100 H-3435  240  ＞80  240  ＞50  ＞50  ＞20  ＞50  ＞50  ＞50  ＞40  ＞100  ＞100 H-3444  240  ＞400  240  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  4.26±  0.75  56.7±  37.9  80±  34.6 H-3445  ＞400  ＞400  ＞400  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  107±  10  ＞100  ＞100 H-3453  ＞400  ＞400  ＞400  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  89.4±  37.6  ＞100  ＞100 H-3560  ＞80  ＞80  ＞80  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  ＞50  6.1  51  33 H-3567  16  48  9.6  ＞50  ＞50  3.8  5.9  6.3  5.7  0.05  1.9  1.3 H-3574  9.6  9.6  9.6  14  16  1.1  0.9  0.6  0.08  ＞0.8

    表1.开链式嘧啶核苷膦酸酯在HIV-1感染的CEM细胞培养物中的抗反转录病毒活性和抑制细胞活性

    

     化合物编号嘧啶类似物  R₁  R₂  Y  Z    EC₅₀^a    (μg/ml)    HIV-1    (CEM)  CC₅₀^b  (μg/ml)  (CEM)    1PMEDAP  NH₂  NH₂  O  H    0.80    11    2PMEDAP  NH₂  NH₂  S  H    5.5    64    3PMEA  H  NH₂  O  H    ＞100    ＞100    4PMEG  NH₂  OH  O  H    2.2    2.5    5PMEG  NH₂  OH  S  H    ＞100    ＞100    6PMEDAP  NH₂  N(CH₃)  ₂  O  H    ＞100    ＞100    7PMEDAP  NH₂  NH-Cp^c  O  H    ＞100    ＞100    8PMEA  SCH₃  NH₂  O  H    ＞100    ＞100    9PME-6-Me-MAP  NH₂  CH₂  O  H    ＞100    ＞100    10(5)-PMPDAP  NH₂  NH₂  O  CH₃    51    ＞100    11(R)-PMPDAP  NH₂  NH₂  O  CH₃    1.8    62    参照药物    PMEA    (adefovir)    (R)-PMPA    (tenofovir)    0.96    0.36    16    125

     ^a50％有效浓度，或者，在CEM细胞培养物中将HIV-1(III_B)诱导的细胞病变抑制50％所需的化合物浓度。

     ^b50％抑制细胞浓度，或者，抑制50％CEM细胞增殖所需的化合物浓度。

     ^cCP，环丙基。

    表2.6-PMEO和(R)-6-PMPO衍生物在不同细胞类型中的抗逆转录病毒活性

      化合物代号 EC₅₀^a，d (μg/ml)  HIV-1 (III_B) (CEM) HIV-2 (ROD) (CEM) HIV-1 (III_B) (MT-4) HIV-2 (ROD) (MT-4) HIV-1 (III_B) (PBL) HIV-1 (BaL) (M/M) FIV (CrFK) MSV (C3H) 1 0.9±0.4 0.66±0.19 0.34±0.03 0.29 0.07±0.02 0.002±0.001 0.25±0.01 0.16±0.04 2 4.6±3.1 3.0±1.4 2.5±0.3 2.9 - - 0.97± 0.40 1.7±0.9 11 1.9±0.5 1.3±0.4 3.0±0.4 1.6±0.6 0.12±0.01 0.005±0.0 0.66±0.14 0.05±0.01 4 1.4±0.7 1.4±1.2 1.9±0.4 2.1 - - - 0.08±0.03 PMEA 0.96±0.24 1.9±1.1 1.3±1.1 1.9 0.55±0.41 0.006 0.46±0.19 0.62±0.27 (R)- PMPA 0.36±0.24 0.43±0.41 0.46±0.006 0.52 0.09±0.03 0.003±0.001 0.13 1.4±0.9

      化合物代号 CC₅₀^b，c，d (μg/ml) CEM MT-4 PBL M/M CrFK C3H 1 11±2.0 46±7.4 2.2±0.8 ＞100 11 ＞40(200) 2 64±9.8 ≥100 - - 42 ＞40(200) 11 62±25 ≥100 9.6±2.5 ＞100 ＞100 ＞40(200) 4 2.5±0.2 10±2.2 - - - ≥16 PMEA 16±9.1 28±12 1.7±0.4 ＞100 18 ＞40(200) (R)-PMPA 125±26 72±12 ＞100 ＞100 ＞100 ＞200

     ^a50％有效浓度，或者，在CEM和MT-4细胞中抑制50％HIV诱导的细胞病变(巨细胞形成)或在PBL和M/M中抑制50％p24抗原生成或抑制50％MSV-诱导的C3H细胞转化所需的化合物浓度。

     ^b50％抑制细胞浓度，或者，抑制50％细胞增殖(CEM)或降低50％细胞活力(MT-4、PBL、M/M)所需的化合物浓度。

     ^c最小抑制浓度，或者，在显微镜下可见细胞形态改变所需的化合物浓度。符号“＞”表示在所述浓度下没有明显毒性可记录。圆括号中的数值表示观察到形态毒性的化合物浓度。

     ^d数据是2-4个独立实验的平均值(±SD)。没有SD值的数据是一式两份进行单个实验的结果。

    表3.天然核苷和核碱基对6-PMEO和(R)-PMPO衍生物的抗病毒活性的作用

      化合物代号 EC₅₀^a，b (μg/ml) Upon addition of as such dThd (10μM) dCyd (1mM) Ado (400μM) Guo (10μM) Ade (100μM) 1 0.77±0.25 0.35±0.07 0.55±0.35 0.63±0.29 0.65±0.21 0.26±0.16 2 1.9±0.75 1.4±0.21 2.1±1.7 4.4±2.8 1.9±0.49 3.3±3.2 11 1.2±0.25 0.83±0.35 1.1±0.51 1.5±0.70 0.77±0.38 0.35±0.17 4 1.4±0.71 1.0±0.3 2.4±1.9 1.4±0.93 1.9±0.92 1.7±1.2 PMEA 0.94±0.24 1.4±0.4 2.1±0.19 1.6±0.4 1.0±0.8 1.9±1.3 (R)-PMPA 0.57±0.26 0.43±0.0 0.53±0.26 0.46±0.23 0.43±0.0 1.6±1.6 PMEG ＞0.05 ＞0.25 ＞0.25 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

     ^a50％有效浓度，或者，在CEM细胞培养物中抑制50％HIV-1(III_B)诱导的细胞病变所需的化合物浓度。

     ^b数据表示至少2或3个独立实验的平均值(±SD)。

    表4.开链式嘧啶核苷膦酸酯在新生NMRI小鼠体内的抗-MSV活性

      化合物 剂量 (mg/kg)^a 实验用小鼠 的总数 未发育肿瘤 的小鼠数(％) 长期存活数 (％) (＞30天) 1 (PMEO-2，4-di-NH₂-Pym) 50 20 8 2 19 20 18 20 84 80 44 5 100^b 100 89 15 2 (PMES-2，4-di-NH₂-Pym) 50 20 8 2 10 10 10 8 0 0 0 0 20 20 20 0 11 (PMPO-2，4-di-NH₂-Pym) 20 8 2 10 20 18 20 15 0 40^c 40 5 PMEA 100 20 8 4 10 29 30 20 100^d 89 44 5 _^d 94 77 35 (R)-PMPA 50 20 8 2 10 28 27 28 100 92 65 0 100 100 83 31

     ^a表示在MSV感染前2小时施用的药物剂量和在感染后的随后4天内再施用4次的日剂量。在对照MSV-感染的小鼠中，肿瘤发育的平均天数为4.5天，而在MSV-感染的小鼠中，动物死亡的平均天数为12.3天。

     ^b在给定剂量(50mg/kg)下，可能是由于药物毒性导致16％小鼠过早死亡(＜24天)，但没有肿瘤形成的征兆。过早死亡不用于计算长期存活百分数。

     ^c在给定剂量(20mg/kg)下，可能是由于药物毒性导致50％小鼠过早死亡(＜6天)，但没有肿瘤形成的征兆。过早死亡不用于计算长期存活百分数。

     ^d可能是由于药物毒性导致所有小鼠在6天前死亡。在死亡前所有小鼠都未发现肿瘤形成。

    表5.开链式嘧啶核苷膦酸酯类似物对临床HIV-1分离物的抑制活性

       化合物代号    抗性倍数^a    HIV-1/L1S^b    HIV-1/L6S^c    HIV-1/L6S/PMEA^d  1    0.8    1.5    3.6  2    2.1    1.4    14  11    1.9    3.5    30  PMEA    2.0    2.7    7.3  (R)-PMPA    2.3    11    54

     ^a在CEM细胞培养物中测得的对实验室HIV-1/III_B株的抗性倍数。

     ^b来自与NRTI或ANP无关的患者且在RT中不含NRTI-或ANP-特定的突变的临床分离物。

     ^c来自用药物治疗的患者的临床分离物。RT中含有S68G、K70T、V75I、F77L、F116Y和Q151M突变。

     ^d在PMEA存在下培养的HIV-1/L6S分离物，除了含有c中所述的其它NRTI-特定的突变外，还含有K65R。