发明实施方式
I.一般方法
除非另有说明,本发明的实施将使用本领域内的分子生物学(包括重
组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、及免疫学的常
规技术。这些技术在文献中有充分说明,所述文献如分子克隆:实验室手
册(Molecular Cloning:4 Laboratory Manual),第二版(Sambrook等,
1989)和分子克隆:实验室手册,第三版(Sambrook和Russel,2001),
(联合和单独地在本文中称为“Sambrook”);寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait,ed.,1984);动物细胞培养(Animal
Cell Culture)(R.I.Freshney,ed.,1987);实验免疫学手册(Handbook of
Experimental Immunology)(D.M.Weir & C.C.Blackwell,eds);哺乳动
物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.
M.Miller & M.P.Calos,eds.,1987);现代分子生物学方法(Current
Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,包括直至
2001年的增刊);PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain
Reaction),(Mullis et al.,eds.,1994);现代免疫学方法(Current Protocols in
Immunology)(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);免疫实验手册(The
Immunoassay Handbook)(D.Wild,ed.,Stockton Press NY,1994);生物缀
合技术(Bioconjugate Techniques)(Greg T.Hermanson,ed.,Academic
Press,1996);免疫分析方法(Methods of Immunological Analysis)(R.
Masseyeff,W.H.Albert,和N.A.Staines,eds.,Weinheim:VCH Verlags
gesellschaft mbH,1993);Harlow和Lane(1988)抗体,实验室手册
(Antibodies,A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Publications,
New York,及Harlow和Lane(1999)利用抗体,实验室手册(Using
Antibodies:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY(联合和单独地在本文中称为“Harlow和Lane”);Beaucage et
al.eds.,现代核酸化学方法(Current Protocols in Nucleic Acid
Chemistry)John Wiley & Sons,Inc.,New York,2000);以及Agrawal,ed.,
用于寡核苷酸和类似物的方法,合成及性质(Protocols for Oligonucleotides
and Analogs,Synthesis and Properties)Humana Press Inc.,New Jersey,
1993)。
II.定义
除非另有说明或从上下文显见,本文中所用的单数形式“a”、“an”
和“the”包括复数形式。例如,可从上下文显见,“a”嵌合免疫调制化
合物(“CIC”)可包括一种或多种CIC。同样,以单数形式提及的CIC
组成元件(即,核酸结构部分或非核酸间隔体结构部分)可包括多个元件。
例如,CIC中的“核酸结构部分”的表述也可表示CIC中的两个或多个“核
酸结构部分”。
本文中可互换使用的术语″多核苷酸″、″寡核苷酸″和“核酸”包括单
链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链
RNA(dsRNA)、修饰的寡核苷酸和寡核苷或其组合。核酸可为线性或环状
构型,或寡核苷酸可同时包含线性和环状区段。核酸为核苷的聚合物,其
中核苷通过例如磷酸二酯键或其它键如硫代磷酸酯键连接。核苷由与糖键
接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或它们的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞
嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或它们的衍生物)碱基组成。在DNA中这四种核苷单
元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸为核
苷的磷酸酯。
术语″3_通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同
一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的3′(下游)。
术语″5_通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一个区域或位置位于此同
一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的5′(上游)。
当一个元件(如区域、部分(portion)、非核酸间隔体结构部分、核
酸结构部分或序列)与另一个元件(如区域、部分(portion)、非核酸间
隔体结构部分、核酸结构部分或序列)直接毗连时,则两者“邻近”。
术语“CIC-抗原缀合物”是指其中CIC和抗原相连接的复合体。所
述缀合物的连接包括共价和/或非共价连接。
术语“抗原”指的是可被抗体或T细胞抗原受体特异性识别和结合
的物质。抗原可包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、复合糖、糖、神经节苷
脂、脂类和磷脂;它们的部分和组合。抗原可以是天然的或者是合成的。
适于与CIC一起施用的抗原包括能够引起B细胞或T细胞抗原特异性应
答的任何分子。优选的是,抗原能引起特异性针对此抗原的抗体应答。半
抗原包括在“抗原”范围内。半抗原是一种低分子量的化合物,它自身不
具有免疫原性,但当它与含有抗原决定簇的免疫原性分子缀合时则可产生
免疫原性。为使小分子产生抗原性,可能需要对小分子进行半抗原化。优
选地,本发明抗原包括肽、脂类(如固醇、脂肪酸和磷脂)、多糖(如用
于流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)疫苗中的那些多糖)、神经节苷
脂和糖蛋白。
″佐剂″是指这样的物质,当其加入免疫原性剂如抗原中时可非特异增
强或加强受者宿主暴露于该混合物后对该免疫原性剂的免疫应答。
术语″肽″为具有足以实现生物应答如抗体产生或细胞因子活性的长
度和组成的多肽,而不管该肽是否为半抗原。一般,肽长至少为6个氨基
酸残基。术语″肽″还包括修饰的氨基酸(天然或非天然存在的),此类修饰
包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化(pegylation)、脂化和甲基化。
″抗原肽″可包括纯化的天然肽、合成肽、重组肽、粗肽提取物、或部
分纯化的或未纯化的活性状态的肽(例如,属于减毒或灭活的病毒、细胞、
微生物的一部分的肽)、或此类肽的片段。″抗原肽″或″抗原多肽″因此指
显示出一种或多种抗原特性的多肽的全部或部分。这样,如″Amb a1抗
原多肽″或″Amb a1多肽抗原″为来自Amb a1的显示出抗原特性(即特异
性结合抗体或T细胞受体)的氨基酸序列,不管其是否为全长序列、序列的
一部分和/或序列的修饰物。
″递送分子″或″递送载体″为利于、允许和/或增加CIC、CIC-抗原混
合物或CIC-抗原缀合物递送至特定位点和/或在特定时间递送的化学结构
部份。递送载体可以或不可以额外刺激免疫应答。
″针对抗原的变态反应″是指这样的免疫应答,其通常的特征在于嗜
酸性粒细胞(常在肺中)和/或抗原特异性IgE的产生以及它们所导致的影
响。如本领域熟知的那样,IgE结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受
体。当随后暴露于IgE所识别的抗原时,该抗原将与肥大细胞和嗜碱性粒
细胞上的IgE交联,引起这些细胞脱粒,包括但不限于释放组胺。应理解
并认识到在本发明一些方法的应用中,术语″针对抗原的变态反应″、″变
态反应″和″变应性疾病″同等地适用。而且,应理解并认识到本发明的方
法包括那些同样适用于防止变态反应及治疗已存在的变应性疾病的方法。
如此处所用,术语″变应原″是指暴露于对象后可引起变态反应的抗原
或分子的抗原性部分,通常为蛋白质。一般地对象对变应原具变应性,这
可以如通过水疱和潮红试验或任一本领域已知的方法指示。即使对象中只
有一小群在暴露于分子后显示出变应性(例如IgE)免疫应答,该分子也被称
为变应原。许多分离的变应原为本领域公知。它们包括但不限于此处表1
中所提供的变应原。
术语″脱敏″是指给显示出对变应原具敏感性的对象施用渐增剂量的
变应原的方法。用于脱敏的变应原剂量的实例为本领域公知,参见如
Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31:111-127。
″抗原特异的免疫治疗″是指涉及到抗原并可对免疫应答产生抗原特
异性调制作用的任何免疫治疗形式。在变态反应中,抗原特异性免疫治疗
包括但不限于脱敏治疗。
术语″微载体″是指不溶于水的微粒组合物,其尺寸小于约150、120
或100μm,更通常小于约50-60μm,并可以小于约10μm或甚至小于约5μm。
微载体包括″毫微载体″,其为尺寸小于约1μm,优选地小于约500nm的
微载体。微载体包括固相粒子如由生物相容的天然聚合物、合成聚合物或
合成共聚物形成的粒子,但此处定义的微载体及其它本领域公知的可生物
降解材料可包括或不包括由琼脂糖或交联琼脂糖形成的微载体。固相微载
体由在哺乳动物生理条件下不易蚀的和/或不可降解的聚合物或其它材料
形成,如聚苯乙烯、聚丙烯、硅石、陶瓷、聚丙烯酰胺、金、胶乳、羟基
磷灰石以及铁磁性和顺磁性材料。可生物降解的固相微载体可由在哺乳动
物生理条件下可降解的聚合物(如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)及其共聚物,如
聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯))或易蚀的聚合物(例如,聚(原酸酯如3,9-二亚乙
基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)),或聚(酐)如癸二酸的聚(酐))
形成。微载体也可为液相(例如,基于油或酯的液相),如脂质体、无抗原
的iscom(免疫刺激复合体,其为胆固醇、磷脂和具有佐剂活性的皂甙的稳
定复合体)或在水包油或油包水乳液中的微滴或微胶粒。可生物降解的液相
微载体通常掺入可生物降解的油,它们中的一些为本领域公知,包括鲨烯
和植物油。微载体一般为球状,但偏离球状的微载体也是可接受的(如椭
圆形、棒状等)。鉴于微载体的不可溶性,固相微载体可从水和基于水的(含
水的)溶液中过滤出来(例如,使用0.2微米滤器)。
术语″不可生物降解的″如此处所用是指在正常的哺乳动物生理条件
下不被降解或腐蚀的微载体。通常,如果微载体在正常的人血清中37℃孵
育72小时后不被降解(即其质量或平均聚合物长度的损失小于5%),则认
为它不可生物降解。
如果微载体在正常的哺乳动物生理条件下可降解或易蚀,则认为它是″
生物可降解的″。通常,如果微载体在正常的人血清中37℃孵育72小时后
被降解(即其质量或平均聚合物长度至少损失5%),则认为它可生物降解。
术语″CIC/微载体复合体″或″CIC/MC复合体″是指CIC和微载体的
复合体。复合体的成分可共价或非共价连接。非共价连接可通过任何非共
价结合力介导,包括疏水作用、离子(静电)键、氢键和/或范德华引力。当
为疏水连接时,该连接通常通过与CIC共价连接的疏水结构部分(如胆固
醇)来实现。
″个体″或″对象″为脊椎动物,如鸟,并优选为哺乳动物,例如人。哺
乳动物包括但不限于人、非人灵长类、农畜、体育用动物、实验动物、啮
齿类动物(例如,大鼠和小鼠)和宠物。
物质的″有效量″或″足够量″是足以达到期望的生物学效果如有益结
果(包括临床结果)的量,因而″有效量″取决于应用它的背景。在施用可调
制针对共施用抗原的免疫应答的组合物的情况下,CIC和抗原的有效量为
足以实现调制作用的量,其中所述调制作用是与单独施用抗原时所达到的
免疫应答相比而言的。有效量可在一次施用或多次施用中施与。
术语″共施用″如此处所用是指在足够接近的时间内施用至少两种不
同的物质以调制免疫应答。优选地,共施用是指同时施用至少两种不同的
物质。
″刺激″免疫应答如Th1应答是指增强该应答,这可通过引发该应答和
/或加强该应答产生。同样地,″刺激″细胞因子或细胞类型(如CTL)是指使
细胞因子或细胞类型的量或水平升高。
″IgE相关病症″为生理学疾病,其特征部分地在于升高的IgE水平,
这可为持续性的或可为非持续性的。IgE相关病症包括但不限于变态反应
和变应性反应、变态反应相关病症(如下所述)、哮喘、鼻炎、结膜炎、风
疹、休克、膜翅目昆虫叮咬引起的变态反应和药物变态反应、以及寄生虫
感染。该术语也包括这些病症的相关表现。通常,在此类病症中IgE为抗
原特异的。
″变态反应相关病症″是指由抗原特异性IgE免疫应答的结果导致的疾
病。此类结果可包括但不限于低血压和休克。过敏反应是变态反应相关病
症的一个例子,在过敏反应期间,组胺释放入循环,引起血管舒张及毛细
血管通透性增加,结果导致循环中血浆的显著丢失。过敏反应可为全身性
发生,整个身体都经历相关的影响,也可为局部发生,反应局限于特异的
靶组织或器官。
术语″病毒性疾病″如此处所用是指病毒作为致病因子的疾病。病毒性
疾病的实例包括乙型肝炎、丙型肝炎、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)
和带状疱疹。
如此处所用及本领域所熟知的,″治疗″为用于获得有益或所需结果(包
括临床结果)的方法。为了本发明的目的,有益或所需临床结果包括但不限
于减轻或改善一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定(即不加重)疾病的
状态、防止疾病的扩散、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和疾病状态、以
及缓解(部分或全部)疾病,无论该结果是可检测的或是不可检测的。″治疗
″也可指与不接受该治疗时的预期存活相比延长存活。
疾病或病症的″减轻″是指与不治疗该疾病相比,疾病或病状的程度和
/或不想要的临床表现得以减轻和/或疾病进展的时程减慢或延长。尤其在变
态反应中,正如本领域技术人员熟知的,减轻可通过调制针对变应原的免
疫应答发生。而且,减轻不一定会在施用一剂后发生,它往往在施用一连
串的剂量后产生。因此,足以减轻应答或病症的量可一次或多次施用。
由CIC和抗原“引发”的″抗体效价″或″抗体量″是指施用CIC和抗
原后在某一时间点所测定到的指定抗体的量。
″Th1相关抗体″为其产生和/或增高与Th1免疫应答相关的抗体。如
IgG2a为小鼠Th1相关抗体。为了本发明目的,Th1相关抗体的测定可为
对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言,Th1相关抗体的测定可能需
要对IgG1和/或IgG3进行测定。
″Th2相关抗体″为其产生和/或增高与Th2免疫应答相关的抗体。如
IgG1为小鼠Th2相关抗体。为了本发明目的,Th2相关抗体的测定可为
对一种或多种此类抗体的测定。如对人而言,Th2相关抗体的测定可能需
要对IgG2和/或IgG4进行测定。
″抑制″或″遏制″功能或活性如细胞因子产生、抗体产生或组胺释放是
指与除了目的条件或参数外相同的条件比较或备选地与另一条件比较时功
能或活性的降低。例如,与如仅用抗原时诱导的组胺释放相比,抑制组胺
释放的包含CIC和抗原的组合物可减少组胺释放。作为另一实例,与如仅
用抗原时产生的抗体的程度和/或水平相比,抑制抗体产生的包含CIC和
抗原的组合物可降低抗体的程度和/或水平。
当涉及药物组合物时,如本文所用的“按照GMP标准”制备或配制
是指将组合物配制成无菌、等渗的,并且使其完全符合美国食品药品管理
局的所有生产质量管理(GMP)规定。
如本文所用的术语“免疫原性”具有本领域中的普通含义,是指这样
一种药剂(如,多肽),当将它注射进入人或动物体中时它能引发适应性
免疫应答。免疫应答可以是B细胞(体液)的和/或T细胞(细胞)的。
所有范围都旨在包括终端值。因此,具有“2至7个核苷酸”或具有
“2个和7个之间个数的核苷酸”的聚合物包括具有2个核苷酸的聚合物
和具有7个核苷酸的聚合物。在说到下限和独立选择的上限时,应理解上
限高于下限。
III.嵌合免疫调制化合物
本发明提供可用于,特别是,调制个体如包括人类在内的哺乳动物中
的免疫应答的嵌合免疫调制化合物(“CIC”)。本发明部分地基于这样
的发现,即一些包含共价结合到非核酸间隔体结构部分上的核酸结构部分
的嵌合分子具有免疫调制活性,尤其是在人类细胞中。令人惊奇的是,甚
至当核酸结构部分具有的序列在作为单独的多核苷酸提供时不显示明显的
免疫调制活性,这种活性也是明显的。
因此,本发明提供用于调制免疫应答——包括治疗和预防人和其他动
物的疾病——的新药剂和方法。
下列各节描述了本发明CIC的结构和性质,以及其成分——核酸结构
部分和非核酸间隔体结构部分的结构和性质。
1.CIC的核心结构
本发明CIC包含一个或多个核酸结构部分和一个或多个非核酸间隔体
结构部分。具有各种结构的CIC都在考虑之列。举例来说,示例性CIC
具有下式I-VII所示的核心结构。式I-III显示用于“线性CIC”的核心
序列。式IV-VI显示用于“分支CIC”的核心序列。式VII显示用于“单
间隔体的CIC”的核心结构。
在下列的每个式中,“N”表示核酸结构部分(取向为5’→3’或3’→
5’方向),“S”表示非核酸间隔体结构部分。单划线(“-”)表示一个
核酸结构部分与一个非核酸间隔体结构部分之间形成的共价键。双划线(“-
-”)表示一个非核酸间隔体结构部分与至少两个核酸结构部分之间形成的
共价键。三划线(“---”)表示一个非核酸间隔体结构部分与多个(即,
至少3个)核酸结构部分之间形成的共价键。下标用于表示于不同位置处
的核酸结构部分或非核酸间隔体结构部分。然而,用下标区别的不同核酸
结构部分并不表示这些核酸结构部分必定具有不同的结构或序列。同样,
用下标区别的不同的间隔体结构部分并不表示这些间隔体结构部分必定具
有不同结构。如在下文的式II中,N1和N2表示的核酸结构部分可具有相
同或不同的序列,S1和S2表示的间隔体结构部分可具有相同或不同的结
构。
A.
线性CIC
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2 (I)。
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2-S2-N3 (II)。
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A (III),
其中A是1至大约100的整数,[Nv-Sv]表示与非核酸间隔体结构部分缀合
的核酸结构部分的A次额外重复。下标“v”表示N和S在每个“[Nv-Sv]”
的重复中是独立地选择的。“A”有时为1至大约10,有时为1至3,有
时正好是1、2、3、4或5。在一些实施方案中,A是处于下限为1、2、3、
4或5而独立选择的上限为10、20、50或100的范围(如3至10)中的整
数。
在本发明的一些实施方案中,CIC具有如式I、II或III所示的结构。
然而,根据本发明,在一些实施方案中,线性CIC包含,但不必限于,式
I-III提供的结构。也就是说,式I、II和III定义了这样一个核心结构,在
该核心结构中非核酸间隔体结构部分与不超过两个的核酸结构部分共价结
合。然而,在许多实施方案中,可以考虑将其它的化学结构部分(如,磷
酸、单核苷酸、其它的核酸结构部分、烷基、氨基、含硫基团或二硫基团
或连接基团,和/或间隔体结构部分)共价结合在核心结构的末端。例如,
如果CIC中所有核酸结构部分均是5’-TCGTCGA-3’,并且间隔体结构部
分选自六聚乙二醇(“HEG”)、硫代磷酸酯连接的HEG多聚体和丙三
醇,那么具有如式I所示核心结构的CIC包括所有下式:
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-OH (Ia)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-PO4 (Ib)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Ic)
HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Id)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ie)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-(HEG)4-TCGTCGA (If)
(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ig)
PO4-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ih)
TCGTCGA-(HEG)15-T (Ii)
(TCGTCGA-HEG)2-丙三醇-HEG-TCGTCGA (Ij)
TCGTCGA-HEG-T-HEG-T (Ik)
很明显这类含有如式I所示核心结构的CIC中包括了含有如式II或
III所示核心结构的CIC。
在一些实施方案中,一个或多个间隔体包含连接在一起的较小单元
(如,HEG、TEG、丙三醇、C3烷基等)。在一个实施方案中,所述连
接是酯连接(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其他连接,参见如下所述。
在某些实施方案中,CIC的末端结构共价连接在一起(如,核酸结构
部分至核酸结构部分;间隔体结构部分至间隔体结构部分,或核酸结构部
分至间隔体结构部分)从而形成环状构象。
B.
分支CIC
在一个实施方案中,CIC包含核心结构
[Nv]A---Sp (IV),
其中Sp是与“A”个独立选择的核酸结构部分Nv共价结合的多价间隔体,
并且A至少为3,如正好是3、4、5、6或7或是大于7。在多种实施方案
中,A是3至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,A是处于
下限为约3、5、10、50或100而独立选择的上限为约5、7、10、50、100、
150、200、250或500的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A
大于约500。
在一个相关的实施方案中,CIC包含核心结构
[Sv-Nv]A---Sp (V),
其中Sp是与“A”个独立选择的元件,即Sv-Nv(包含共价结合到核酸结构
部分的间隔体结构部分)共价结合的多价间隔体,并且A至少为3。在多
种实施方案中,A是3至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,
A是处于下限为5、10、50或100而独立选择的上限为10、50、100、250
或500的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A大于500。在
一个相关实施方案中,CIC包含核心结构:
(S1-N1)-Sp--(Nv)A (VI)
其中Sp是与“A”个独立选择的核酸结构部分Nv及至少一个和间隔体结
构部分S1结合的核酸结构部分N1共价结合的多价间隔体,且其中A至少
为2。在一个实施方案中,A是2。在多个实施方案中,A是3、4、5或3
至100(包括3和100)的整数。在一些实施方案中,A是处于下限为5、
10、50或100而独立选择的上限为10、50、100、150、200、250或500
的范围中的整数。同样可考虑在一些实施方案中,A大于500。在本发明
的一些实施方案中,CIC具有如式I、II或III所示的结构。然而,根据本
发明,分支CIC可包含,但不限于,式IV、V和VI所提供的结构。即,
式IV、V和VI定义了这样的核心结构,该结构中一个多价间隔体结构部
分(Sp)与至少三个(3)核酸结构部分共价结合。可以考虑,在一些实
施方案中,将其他的化学结构部分(如,磷酸、单核苷酸、其他核酸和/
或间隔体结构部分)共价结合在核心结构的末端。例如,如果CIC中所有
的核酸结构部分均是5’-TCGTCGA-3’,并且所有间隔体结构部分都是丙
三醇或HEG,那么具有如式IV所示核心结构的CIC则包括:
(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA (IVa)
(TCGTCGA-HEG)2-丙三醇-TCGTCGA (IVb)
(TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA (IVc)
[(TCGTCGA)2-丙三醇-TCGTCGA]2-丙三醇-TCGTCGA (IVd)
很明显,举例来说,这类含有如式IV所示核心结构的CIC中包括了
含有如式V或VI所示核心结构的CIC。在本发明优选的实施方案中,CIC
包含至少两个不同(即不同序列)的核酸结构部分。
在一些实施方案中,一个或多个间隔体包含连接在一起的较小单元
(如,HEG、TEG、丙三醇、C3烷基等)。在一个实施方案中,所述连
接是酯连接(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)。
C.
单间隔体的CIC
在本发明的一个不同方面,CIC含有这样的结构,在此结构中存在与
单个间隔体结构部分共价缀合的单个核酸结构部分,即,
N1-S1 (VII)
在一个实施方案中,S1具有包含多个较小单元(如,HEG、TEG、丙
三醇、1′,2′-二脱氧核糖,C2烷基至C12烷基亚单元等)的多聚体
(multimer)的结构,其中所述较小单元一般通过酯键(如磷酸二酯或硫
代磷酸酯)连接,见如下所述。实例参见如下所示的式VIIa。多聚体可以
是杂聚体(heteromer)或均聚体(homomer)。在一个实施方案中,间隔
体是单体单元(如,HEG、TEG、丙三醇、1′,2′-二脱氧核糖,C2烷基
至C12烷基接头等)通过酯键(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接而成的杂
聚体。实例参见如下所示的式VIIb。
例如,如果核酸结构部分是5’-TCGTCGA-3’,且间隔体结构部分是
硫代磷酸酯连接的六聚乙二醇的多聚体[“(HEG)15”],则具有如式VII所示
核心结构的CIC包括:
TCGTCGA-(HEG)15 (VIIa)
同样,如果核酸结构部分是5’-TCGTCGA-3’,间隔体结构部分是六
聚乙二醇和丙基亚单元交替通过硫代磷酸酯键连接而成的多聚体,则具有
如式VI所示核心结构的CIC包括:
TCGTCGA-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG (VIIb)。
2.CIC的免疫调制活性
本发明的CIC具有免疫调制活性。如本文中所用的术语“免疫调制,”
“免疫调制活性,”或“调制免疫应答”包括免疫刺激和免疫抑制作用。
根据本发明进行免疫调制的免疫应答一般将朝向“Th1型”免疫应答转移
而背离“Th2型”免疫应答。通常认为Th1型应答是细胞免疫系统(如
细胞毒性淋巴细胞)应答,而Th2型应答一般是“体液的”或基于抗体的
应答。Th1型免疫应答的通常特征是针对抗原的“延迟型超敏”反应。Th1
型应答可在生化水平上通过增加的Th1相关细胞因子(如IFN-γ、IFN-
α、IL-2、IL-12和TNF-β,以及IL-6,尽管IL-6也可与Th2型应答相
关)的水平进行检测。Th2型免疫应答通常与高水平的抗体生成,包括IgE
生成、没有或少量的CTL生成以及Th2相关细胞因子如IL-4和IL-5的表
达有关。
本发明的免疫调制作用可通过体外(in vitro)、体内(in vivo)和/或
离体(ex vivo)测定(试验)进行识别。可例举的能够指示免疫调制活性
的可测量免疫应答包括,但不限于,抗原特异性抗体的生成、细胞因子的
分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B
淋巴细胞等的激活或扩增。实例参见WO 97/28259;WO 98/16247;WO
99/11275;Krieg等(1995)Nature 374:546-549;Yamamoto等(1992)
J.Immunol.148:4072-4076;Ballas等(1996)J.Immunol.
157:1840-1845;Klinman等(1997)J.Immunol.158:3635-3639;Sato等(1996)
Science 273:352-354;Pisetsky(1996)J.Immunol.156:421-423;Shimada等
(1986)Jpn.J.Cancer Res.77:808-816;Cowdery等(1996)J.Immunol.
156:4570-4575;Roman等(1997)Nat Med.3:849-54;Lipford等(1997)Eur.
J.Immunol.27:2340-2344;WO 98/55495,WO 00/61151,Pichyangkul等
(2001)J.Imm.Methods 247:83-94。还可参见下文中的实施例。为举例说明
而不是限制,下文中对某些有用试验进行描述。
试验一般通过使细胞、组织、动物体等接触测试样本或向它们施用测
试样本(如,包含CIC、多核苷酸和/或其他试剂的测试样本)并测量应答
来进行。含有CIC或多核苷酸的测试样本可以为多种不同的形式或浓度,
只要本领域普通技术人员认为其适于此试验类型即可。例如,为进行基于
细胞的试验,CIC或多核苷酸的常用浓度为20μg/ml或10μg/ml或2μ
g/ml。通常情况下,为进行这种试验,通过测量260nm的吸光度并利用0.5
OD260/ml=20μg/ml进行转换来确定浓度。这可对测试样本中的总核酸量
进行标准化并且举例来说,当间隔体结构部分在260nm没有明显的吸光度
时,这是可应用的。作为替代的方案,浓度或重量可利用本领域已知的其
他方法进行测量。如果需要的话,核酸结构部分的量可通过测量260nm的
吸光度来确定,而CIC重量可利用CIC的分子式来计算。这种方法有时
用在CIC中的间隔体结构部分所占重量与核酸结构部分所占重量的比率较
高(即,大于1)的情况下。
同样可以理解,阳性和阴性对照在免疫调制活性试验中是有用的。对
于免疫调制活性而言,适宜的阳性对照是具有序列
5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:2)的免疫调制
性硫代磷酸酯DNA,但对本领域普通技术人员来说其他适宜的具有免疫调
制活性的阳性对照也是显而易见的。一种适用的阴性对照是无测试药剂
(即,只有赋形剂或介质,对某些体外试验来说,也称为“只有细胞”)。
作为替代的方案,具有序列5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’
(SEQ ID NO:3)的硫代磷酸酯DNA在一些实施方案中用作阴性对照。
其他阴性对照可由技术人员在此处的公开和常规试验设计的指导下来设
计。
一类有用的试验是“细胞因子应答试验”。一个用于免疫调制活性的
示例性试验测定人外周血单核的细胞(“PBMC”)的细胞因子应答(如在
Bohle等,[1999] Eur.J.Immunol.29:2344-53;Verthelyi等[2001]J.
Immunol.166:2372-77中的描述)。在此试验的一个实施方案中,从一名或
多名健康人类志愿者采集外周血并分离出PBMC。一般来说,血液利用肝
素化注射器经静脉穿刺进行采集,之后铺在FICOLL_(Amersham
Pharmacia Biotech)垫上并离心。然后从FICOLL_的界面收集PBMC并
以冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞以2×106细胞/mL的浓度
在RPMI 1640(含有10%热灭活的人AB血清、50单位/mL青霉素、50μ
g/mL链霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需
氨基酸(NEAA))中并且在测试样本或对照存在或不存在下重新悬浮和培
养24小时(如,在48-或96孔培养板中)。
从每个孔中收集无细胞培养液并检测IFN-γ和/或IFN-α浓度。如果
由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-γ量显著地大于(如,至少大
约3倍大于,通常至少大约5倍大于)由PBMC在缺少测试化合物时,或
者,在一些实施方案中,在有无活性对照化合物(如
5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3))存在时所
分泌的量,即检测出免疫调制活性。相反,如果由接触过测试化合物的
PBMC分泌的IFN-γ量不显著地大于(如,少于2倍大于)由PBMC在
缺少测试化合物时,或者,作为替代,在有无活性对照化合物(如,
5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3))存在时所
分泌的量,则测试化合物不具有免疫调制活性。
如果测定IFN-α浓度,由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-α
量常常显著地大于(如,对于IFN-α,有时至少大约2倍或至少大约3倍
大于)由PBMC在缺少测试化合物下,或者,在一些实施方案中,在有无
活性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID
NO:3))存在下所分泌的量。在一些实施方案中,显著增加的IFN-α分
泌水平比对照高至少约5倍,至少约10倍,或甚至至少约20倍。相反,
如果由接触过测试化合物的PBMC分泌的IFN-α量不显著地大于(如,
少于2大于)由PBMC在缺少测试化合物下,或者,作为替代,在有无活
性对照化合物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID
NO:3))存在下所分泌的量,则测试化合物不具有免疫调制活性。
如下文实施例中的举例说明,施用某些CIC可导致IFN-α和IFN-γ
两者的显著分泌,而施用其他CIC对IFN-α分泌的影响较小或者,相反
地,对IFN-γ分泌的影响较小。实例参见实施例49。
另一类有用的试验是细胞增殖试验,如B细胞增殖试验。药剂(如,
CIC)对B细胞增殖的影响可利用本领域已知的多种试验中的任一种进行
确定。实施例41中提供了B细胞增殖试验的一个实例。
考虑到供体的差异,如在基于细胞的试验如细胞因子和增殖试验中,
优选利用来自多个不同供体的细胞(如PBMC)开展试验。一般供体的数
目至少为2(如,2),优选至少为4(如,4),有时至少为10(如,10)。
如果在测试化合物存在下IFN-γ的分泌量(如,在至少一半,优选至少75
%,最优选至少85%被测健康供体中)与测试化合物不存在,或者,在一
些实施方案中,存在无活性对照化合物(例如,上述对照化合物)时的分
泌量相比高至少约3倍或至少约5倍,则检测到免疫调制活性。
体外试验还可利用如下文实施例42中所述的小鼠细胞或在其他哺乳
动物细胞中进行。
可例举的体内试验参见实施例43、44和46(小鼠)以及实施例45(非
人灵长类)中所述。
除非另有说明或显而易见,在下文实施例中描述的细胞因子试验基本
上按照实施例28中所述的操作方法采用人类PBMC来实施。举例来说,
利用多孔板或其他多室的分析材料,可同时检测大量的测试化合物。如需
要,这些试验可利用本领域熟知的计算机控制的自动机械装置来进行。
3.核酸结构部分
本发明的CIC含有一个或多个核酸结构部分。如本文所用的术语“核
酸结构部分”是指核苷酸单体(即,单核苷酸)或核苷酸聚合物(即,含
至少2个连续核苷酸)。如本文所用,核苷酸包括(1)连接到糖的嘌呤或
嘧啶碱基,其中糖通过酯键连接到磷酸基团上,或(2)碱基和/或糖和/或
磷酸酯被类似物替代而形成的核苷酸类似物,参见下文。如果CIC中含有
一个以上核酸结构部分,这些核酸结构部分可以是相同或不同的。
下面三节对核酸结构部分的特征,如在该结构部分中序列或序列基序
的长度、存在和位置进行了描述,还描述了(无意于限制本发明)核酸结
构部分和含有此结构部分的CIC的性质和结构。
A.
长度
通常,核酸结构部分长度为1至100个核苷酸,但在一些实施方案中
此结构部分可以更长。在一些实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构
部分的长度小于8个核苷酸(即,1、2、3、4、5、6、或7个核苷酸)。
在多个实施方案中,核酸结构部分(如小于8个核苷酸长的核酸结构部分)
为至少2个核苷酸长,通常至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或
至少7个核苷酸长。在其他实施方案中,核酸结构部分长至少10个、至少
20个、或至少30个核苷酸。
如下文实施例中所示,仅含有七聚体、六聚体、五聚体、四聚体和三
聚体核酸结构部分的CIC在免疫调制活性的试验(如实施例36和37)中
是有活性的。因此,可考虑在一些实施方案中,CIC包含至少一个短于8
个核苷酸长的核酸结构部分。在一些实施方案中,CIC中的所有核酸结构
部分都短于8个核苷酸(如,具有处于如下范围中的长度,所述范围的下
限为2、3、4、5或6个核苷酸,独立选择的上限为5、6、或7个核苷酸,
其中上限大于下限)。如在一个实施方案中,CIC中指定的核酸结构部分
(包括此CIC中所有的核酸结构部分)可以是6或7个核苷酸长。在一个
实施方案中,CIC含有两个间隔体结构部分和一个插入其中的长度小于8
个碱基(如,5、6、或7个碱基长)的核酸结构部分。
在含多个核酸结构部分的CIC中,这些核酸结构部分的长度可以考虑
相同或不同。在一个实施方案中,CIC中的一个或多个或多数(如,至少
约2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、至少约75%)或所
有的核酸结构部分的长度为小于8个核苷酸,在一些实施方案中为小于7
个核苷酸,在一些实施方案中为小于6个核苷酸,在一些实施方案中为2
至6个核苷酸,在一些实施方案中为2至7个核苷酸,在一些实施方案中
为3至7个核苷酸,在一些实施方案中为4至7个核苷酸,在一些实施方
案中为5至7个核苷酸,在一些实施方案中为6至7个核苷酸。
如下文中的更详细讨论,常常CIC中至少一个核酸结构部分包括序列
CG,如TCG或此处所述的含CG的基序。在一个实施方案中,至少一个
核酸结构部分包含含CG的核酸基序并且小于8个核苷酸长(如,具有如
上所述的小于8个核苷酸的特定长度)。在一个相关实施方案中,CIC中
没有一个长于8个核苷酸的核酸结构部分含有序列“CG”或任选地序列
“TCG”或“ACG”(即,CIC中所有含序列CG的核酸结构部分都小于
8个核苷酸长)。在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分不含
有CG序列。
B.
序列和基序(motifs)
如上文指出,一个具体的核酸结构部分可具有多种长度。在一个实施
方案中,核酸结构部分小于8个核苷酸长。在一个实施方案中,核酸结构
部分有8个核苷酸长或更长。在多个实施方案中,本发明CIC中至少一个
核酸结构部分含有如下所述的序列。
在下文的式中,所有序列都采取5’→3’的方向并使用下列缩写:B=5-
溴胞嘧啶;bU=5-溴尿嘧啶;a-A=2-氨基-腺嘌呤;g=6-硫代-鸟嘌呤;t
=4-硫代胸腺嘧啶;H=含有吸电子基团(如5位的卤素)的修饰的胞嘧
啶。在多个实施方案中,下文涉及的序列中的胞嘧啶(C)被N4-乙基胞嘧
啶或N4-甲基胞嘧啶或5-羟基胞嘧啶替换。在多个实施方案中,式中的鸟
苷(G)被7-脱氮杂鸟苷替换。
在迄今被测的CIC中,CG的存在与细胞因子诱导活性相关。因此,
在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分包含至少一个5’-胞嘧啶,
鸟嘌呤-3’(5’-CG-3’)序列。所述胞嘧啶在C-5位没有被甲基化,并且优选
在任何位置上都未被甲基化。
在一个实施方案中,一个或多个核酸结构部分包含3至7个碱基。在
一个实施方案中,核酸结构部分包含3至7个碱基并且具有序列
5’-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3’,或5’-TCG[(X)2-4]-3’,或5’-TCG(A/T)
[(X)1-3]-3’,或5’-TCG(A/T)CG(A/T)-3’,或5’-TCGA CGT-3’,或5’-
TCG TCGA-3’,其中每个X都是独立地选择的核苷酸。在一些实施方案
中,CIC包含至少3个、至少10个、至少30个或至少100个具有前述序
列的核酸结构部分。
在一个实施方案中,核酸结构部分包含序列5’-胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟
嘌呤-3’(5’-TCG-3’),如(非限制)3聚体TCG,4聚体TCGX(如
TCGA),5聚体TCGXX(如TCGTC和TCGAT),6聚体TCGXXX、
XTCGXX和TCGTCG,及7聚体TCGXXXX、XTCGXXX,XXTCGXX
和TCGTCGX,其中X是任意碱基。常常,至少一个核酸结构部分含有序
列5’-胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤,腺嘌呤-3’(5’-TCGA-3’),如含有序列
5’-TCGACGT-3’。
在一些实施方案中,核酸结构部分包含序列5′-ACGTTCG-3′;
5′-TCGTCG-3′;5′-AACGTTC-3′;5′-AACGTT-3′;5′-TCGTT-3′;
5′-CGTTCG-3′;5′-TCGTCGA-3′;5′-TCGXXX-3′;5′-XTCGXX-3′;
5′-XXTCGX-3′;5′-TCGAGA-3′;5′-TCGTTT-3′;5′-TTCGAG-3′;
5′-TTCGT-3′;5′-TTCGC-3′;5′-GTCGT-3′;
5′-ATCGT-3′;5′-ATCGAT-3′;5′-GTCGTT-3′;5′-GTCGAC-3′;
5′-ACCGGT-3′;5′-AABGTT-3′;5′-AABGUT-3′,5′-TCGTBG-3′其中X
是任意核苷酸。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列5’-X1X2CGX3X4-3’,其
中X1是0至10个核苷酸;X2是空缺或是A、T或U;X3是空缺或是A;
且X4是0至10个核苷酸。在一个实施方案中,此核酸结构部分在3’末端
缀合到间隔体结构部分上。在一些实施方案中,X1是0至5个核苷酸,或
者是0至2个核苷酸;且X4是0至5个核苷酸,或者是0至2个核苷酸。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有如下所示的序列:5’-嘌呤,嘌呤,C,
G,嘧啶,嘧啶-3’;5’-嘌呤,嘌呤,C,G,嘧啶,嘧啶,C,G-3’;或5’-嘌呤,嘌呤,C,G,
嘧啶,嘧啶,C,C-3’;例如(皆沿5’→3’方向),GACGCT;GACGTC;GACGTT;
GACGCC;GACGCU;GACGUC;GACGUU;GACGUT;GACGTU;AGCGTT;
AGCGCT;AGCGTC;AGCGCC;AGCGUU;AGCGCU;AGCGUC;AGCGUT;
AGCGTU;AACGTC;AACGCC;AACGTT;AACGCT;AACGUC;AACGUU;
AACGCU;AACGUT;AACGTU;GGCGTT;GGCGCT;GGCGTC;GGCGCC;
GGCGUU;GGCGCU;GGCGUC;GGCGUT;GGCGTU,AACGTT,AGCGTC,
GACGTT,GGCGTT,AACGTC,GACGTC,GGCGTC,AACGCC,AGCGCC,
GACGCC,GGCGCC,AGCGCT,GACGCT,GGCGCT,GGCGTT,和
AACGCC.
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:5’-嘌呤,嘌呤,胞嘧啶,鸟
嘌呤,嘧啶,嘧啶,胞嘧啶,胞嘧啶-3’或者5’-嘌呤,嘌呤,胞嘧啶,鸟嘌呤,嘧啶,嘧
啶,胞嘧啶,鸟嘌呤-3’。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列(皆沿5’-3’方向)
AACGTTCG;AACGTTCC;AACGUTCG;AABGTTCG;AABGUTCG
和/或AABGTTBG。
在多个实施方案中,核酸结构部分含有基序
5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:4),其中X1是T、G、C或B,X2
是T、G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U,而且此序列不是
5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:5)或5’-GGAACGTTCG-3’(SEQ ID
NO:6)。实例包括(皆沿5’→3’方向):
TGAACGUTCG(SEQ ID NO:7);TGACCGTTCG(SEQ ID NO:8);
TGATCGGTCG(SEQ ID NO:9);TGATCGTTCG(SEQ ID NO:10);
TGAACGGTCG(SEQ ID NO:11);GTAACGTTCG(SEQ ID NO:12);
GTATCGGTCG(SEQ ID NO:13);GTACCGTTCG(SEQ ID NO:14);
GAACCGTTCG(SEQ ID NO:15);BGACCGTTCG(SEQ ID NO:16);
CGAACGTTCG(SEQ ID NO:17);CGACCGTTCG(SEQ ID NO:18);
BGAACGTTCG(SEQ ID NO:19);TTAACGUTCG(SEQ ID NO:20);
TUAACGUTCG(SEQ ID NO:21)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO:22).
在多个实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:23);
5’-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:24);
5’-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:25);
5’-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:26);
5’-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:27);
5’-TCGTCGAa-ACGUTCGTTAACGUTCG-3’(SEQ ID NO:28);
5’-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3(SEQ ID NO:29);
5’-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:30);
5’-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:31);
5’-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:32);
5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’(SEQ ID NO:33);
5’-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:34);
5’-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:35);
5’-CTTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:36);
5’-CTGTGATCGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:37);
5’-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:38);
5’-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:39);
5’-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:40);
5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:41);
5’-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:42):
5’-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:43);
5’-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:44);
5’-TBGTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:45);
5’-TCGTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:46);
5’-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:47);
5’-TBGTBGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:48);
5’-TCGTBGACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:49);
5’-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:50);
5’-CTTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:51);
5 ’-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3 ’(SEQ ID NO:52).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-X1X2AX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:53),其中X1是T、G、C或B,X2
是T、G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案
中,此核酸结构部分不是5’-TGAABGTTCG-3’(SEQ ID NO:54)。实例包
括(皆沿5’-3’方向):TGAABGUTCG(SEQ ID NO:55)
TGACBGTTCG(SEQ ID NO:56);TGATBGGTCG(SEQ ID NO:57);
GTATBGGTCG(SEQ ID NO:58);GTACBGTTCG(SEQ ID NO:59);
GAACBGTTCG(SEQ ID NO:60);GAAABGUTCG(SEQ ID NO:61);
BGACBGTTCG(SEQ ID NO:62);CGAABGTTCG(SEQ ID NO:63);
BGAABGTTCG(SEQ ID NO:64);BGAABGUTCG(SEQ ID NO:65);
TTAABGUTCG(SEQ ID NO:66);TUAABGUTCG(SEQ ID NO:67)和
TTAABGTTCG(SEQ ID NO:68).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TGACTGTGAABGUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:69);
5’-TCGTCGABGTTCGTTAABGTTCG-3’(SEQ ID NO:70);
5’-TGACTGTGAABGUTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:71);
5’-TGACTGTGAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:72);
5’-TCGTCGGAAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:73);
5’-TCGTBGAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO:74).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:75),其中X1是T、C或B,X2是T、
G、A或U,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方案中,此
式不是5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:5)。
在其他实施方案中,核酸结构部分含有序列:
5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:76);
5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO:77);
5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO:78);
5’-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:79);
5’-TGACTGTGAACGbUTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:80);
5’-TGACTGTGAABGTTCGTUATGA-3’(SEQ ID NO:81);
5’-TGACTGTGAABGTTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO:82);
5’-CTGTGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:83);
5’-TBGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:84);
5’-TCGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:85);
5’-TGACTGTGAACGtTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:86);
5’-TGACTGTGAACgTTCgAGATGA-3’(SEQ ID NO:87);
5’-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3’(SEQ ID NO:88);
5’-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3’(SEQ ID NO:89);
5’-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:90);
5’-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:91);
5’-CTGTCAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:92);
5’-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:93);
5’-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:94);
5’-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:95);
5’-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:96).
在一些实施方案中,关于上述公开的任一序列,核酸结构部分还包含优选位于
上述序列的5’端的一个、两个、三个或三个以上TCG和/或TBG和/或THG序列。
此TCG和/或TBG可以与或可以不与所示序列直接相邻。例如,在一些实施方案
中,核酸结构部分包括下列任一序列:5’-TCGTGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:97);
5’-TCGTCGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:98);5’-TBGTGAACGTTCG-3’(SEQ
ID NO:99);5-TBGTBGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:100);
5’-TCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:101).
在一些实施方案中,此额外的TCG和/或TBG序列紧位于所涉及序列
的5′与之相邻。在其他的实施方案中,分开一或两个碱基。
在一些实施方案中,核酸结构部分具有序列:
5’-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:102),其中w是1-2,y是0
-2,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGAACGTTCG(SEQ ID NO:103);
TCGTCGAACGTTCG(SEQ ID NO:1O4);TCGTGAACGTTCG(SEQ ID
NO:105);TCGGTATCGGTCG(SEQ ID NO:106);TCGGTACCGTTCG(SEQ
ID NO:107);TCGGAACCGTTG(SEQ ID NO:108);TCGGAACGTTCG(SEQ
ID NO:109);TCGTCGGAACTTCG(SEQ ID NO:110);TCGTAACGTTCG
(SEQ ID NO:111);TCGACCGTTCG(SEQ ID NO:112);TCGTCGACCGTTCG
(SEQ ID NO:113);TCGTTAACGTTCG(SEQ ID NO:114).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
5’-(TBG)zNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:115),其中z是1-2,y是0
-2,B是5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有:
TBGTGAACGTTCG(SEQ ID NO:116);TBGTBGTGAACGTTCG(SEQ ID
NO:117);TBGAACGTTCG(SEQ ID NO:118);TBGTBGAACGTTCG(SEQ ID
NO:100);TBGACCGTTCG(SEQ ID NO:119);TBGTBGACCGTTCG(SEQ ID
NO:120).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
5’-TCGTBGNyAX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:121),其中y是0-2,B是
5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些
实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGTBGTGAACGTTCG(SEQ ID NO:122);TCGTBGAACGTTCG(SEQ ID
NO:123);TCGTBGACCGTTCG(SEQ ID NO:124).
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
5’-(TCG)wNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:125),其中w是1-2,y是0
-2,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些实施方
案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:TCGGAAABGTTCG(SEQ ID
NO:126)或TCGAABGTTCG(SEQ ID NO:127)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:5’-(TBG)
zNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:128),其中z是1-2,y是0-2,B是
5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些
实施方案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:
TBGAABGUTCG(SEQ ID NO:129)或TBGAABGTTCG(SEQ ID
NO:130)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有任一个如下序列:
5’-TCGTBGNyAX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:131),其中y是0-2,B是
5-溴胞嘧啶,N是任意碱基,X3是T、A或C,X4是T、G或U。在一些
实施方案中,此核酸结构部分含有任一个如下序列:
TCGTBGAABGUTCG(SEQ ID NO:132)或TCGTBGAABGTTCG(SEQ
ID NO:133)。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:AACGTTCC,
AACGTTCG,GACGTTCC,GACGTTCG。
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
GGCGTTCG;GGCGCTCG;GGCGTCCG;GGCGCCCG;GACGTTCC;
GACGCTCC;GACGTCCC;GACGCCCC;AGCGTTCC;AGCGCTCC;
AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTTCC;AACGCTCC;AACGTCCC;
AACGCCCC;GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;
GACGTTCG;GACGCTCG;GACGTCCG;GACGCCCG;AGCGTTCG;
AGCGCTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;AACGTTCG;AACGCTCG;
AACGTCCG;AACGCCCG;GACGCTCC;GACGCCC;AGCGTTCC;
AGCGCTCC;AGCGTCCC;AGCGCCCC;AACGTCCC;AACGCCCC;
GGCGTTCC;GGCGCTCC;GGCGTCCC;GGCGCCCC;GACGCTCG;
GACGTCCG;GACGCCCG;AGCGTTCG;AGCGTCCG;AGCGCCCG;
AACGTCCG;AACGCCCG.
在一些实施方案中,核酸结构部分含有序列:
(5’→3’)TCGTCGA;TCGTCG;TCGTTT;TTCGTT;TTTTCG;ATCGAT;
GTCGAC;GTCGTT;TCGCGA;TCGTTTT;TCGTC;TCGTT;TCGT;TCG;
ACGTTT;CCGTTT;GCGTTT;AACGTT;TCGAAAA;TCGCCCC;
TCGGGGG.
在一些实施方案中,核酸结构部分含有具有如下序列的RNA:
AACGUUCC,AACGUUCG,GACGUUCC,和GACGUUCG。
在一些实施方案中,核酸结构部分具有这样的序列,该序列包含如在
共同转让的共同待决美国专利申请09/802,685(于2002年3月7日公布为
美国申请公开号20020028784A1和2001年9月20日公布为WO
01/68077)、09/802,359(2001年9月20日公布为WO 01/68144),和共
同待决的美国申请系列号10/033,243中,或在PCT公布WO 97/28259;
WO 98/16247;WO 98/55495;WO 99/11275;WO 99/62923;及WO
01/35991中所述的序列或序列基序。该核酸结构部分也可具有这样的序列,
该序列包含任一或几个以前报道如果作为长度大于(常常实质上大于)8
个核苷酸的多核苷酸进行施用时与免疫刺激活性相关的序列,参见
Kandimalla等,2001,Bioorg.Med.Chem.9:807-13;Krieg等(1989)J.
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98/55609和WO 99/11275。也参见Elkins等(1999)J.Immunol.162:
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WO 99/62923。还参见Zimmermann等(1998)J.Immunol.160:3627-3630;
Krieg(1999)Trends Microbiol.7:64-65及美国专利号5,663,153、5,723,335
和5,849,719。还可参见Liang等(1996)J.Clin.Invest.98:1119-1129;
Bohle等(1999)Eur.J.Immunol.29:2344-2353和WO 99/56755。还可参
见WO 99/61056;WO 00/06588;WO 00/16804;WO 00/21556;WO
00/54803;WO 00/61151;WO 00/67023;WO 00/67787及美国专利号
6,090,791。在一个实施方案中,CIC中至少一个核酸结构部分包含TG序
列或富含嘧啶(如,富含T或富含C)的序列,如PCT公开WO 01/22972
所述。
在一些实施方案中,核酸结构部分与“如下”六聚体之一或多个不同:
5′-GACGTT-3′,5′-GAGCTT-3′,5′-TCCGGA-3′,
5′-AACGTT-3′,5′-GACGTT-3′,5′-TACGTT-3′,5′-CACGTT-3′,
5′-AGCGTT-3′,5′-ATCGTT-3′,5′-ACCGTT-3′,5′-AACGGT-3′,
5′-AACGAT-3′,5′-AACGCT-3′,5′-AACGTG-3′,5′-AACGTA-3′和
5′-AACGTC-3′。
在一些实施方案中,CIC包含至少3个、至少10个、至少30个或至
少100个具有上述序列的核酸结构部分。
C.
核酸结构部分的序列:异质性和位置效应
在含有多个核酸结构部分的CIC中,核酸结构部分可以考虑是相同的
也可以是不同的。
在一个实施方案中,CIC中所有的核酸结构部分具有相同的序列。在
一个实施方案中,CIC包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5
个或至少6个或更多个不同序列的核酸结构部分。在一个实施方案中,CIC
包含少于10个的不同核酸结构部分。在一个实施方案中,CIC中每个核酸
结构部分具有不同的序列。
在一些实施方案中,单个核酸结构部分包含上述§3(B)中所列的序
列基序的一个以上重复,或者包含两个或两个以上不同的序列基序。在单
个核酸结构部分内这些基序可以相邻,重叠,或被核酸结构部分内的其他
核苷酸碱基分开。在一个实施方案中,核酸结构部分包括一个或多个回文
序列区。对单链寡核苷酸来说,术语“回文序列(palindromic)”指的是
在该寡核苷酸与一个互补序列复合形成双链分子时将呈回文结构的序列。
在另一个实施方案中,CIC中的一个核酸结构部分相对于第二核酸结构部
分具有回文或部分回文的序列。在本发明的一个实施方案中,CIC的一个
或多个核酸结构部分的序列不具回文结构。在本发明的一个实施方案中,
CIC的一个或多个核酸结构部分的序列不包括大于四个碱基,任选地大于
6个碱基的回文序列。
如上所述,在多个实施方案中,CIC中一个或多个(如全部)的核酸
结构部分包含5’-CG-3’序列,或者,包含5’-TCG-3’序列。在一个实施方
案中,此核酸结构部分的长度为5、6或7个碱基。在一个实施方案中,此
核酸结构部分具有式5′-TCG[(X)2-4]-3′或5′-TCG(A/T)[(X)1-3]或
5′-TCG(A/T)CG(A/T)-3′或5′-TCGACGT-3′(其中每个X都是独立地选
择的核苷酸)。在一个实施方案中,前述的核酸结构部分是5-引发(prime)
结构部分。
在一个实施方案中,核酸结构部分包含序列5’-TCGTCGA-3’。在一
个实施方案中,核酸结构部分包含选自如下的序列(皆沿着5’→3’方向):
TCGXXXX,TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGACGT,
TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,TCGATTT,
TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT,TTCGTTT,
TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT,TGTCGTT,TCGXXX,
TCGAXX,GTCGTT,GACGTT,ATCGAT,TCGTCG;TCGTTT;
TCGAGA;TTCGAG;TTCGTT;AACGTT;AACGTTCG;AACGUTCG,
ABGUTCG,TCGXX,TCGAX,TCGAT,TCGTT,TCGTC;TCGA,
TCGT,和TCGX(其中X是A、T、G或C;U是2’-脱氧尿苷,B是5-
溴-2’-脱氧胞苷)。
在一个实施方案中,核酸结构部分是具有序列TCGXXXX,
TCGAXXX,XTCGXXX,XTCGAXX,TCGTCGA,TCGACGT,
TCGAACG,TCGAGAT,TCGACTC,TCGAGCG,
TCGATTT,TCGCTTT,TCGGTTT,TCGTTTT,TCGTCGT,ATCGATT,
TTCGTTT,TTCGATT,ACGTTCG,AACGTTC,TGACGTT或
TGTCGTT的7-聚体;或者是具有序列TCGXXX,TCGAXX,TCGTCG,
AACGTT,ATCGAT,GTCGTT或GACGTT的6-聚体;或者是具有序列
TCGXX,TCGAX,TCGAT,TCGTT或TCGTC的5-聚体;或者是具有序
列TCGA,TCGT或TCGX的4-聚体;或者是具有序列TCG的3-聚体;
其中X是A,T,G或C。
在一个实施方案中,CIC中至少约25%,优选至少约50%,或至少约
75%,有时全部的核酸结构部分包含至少一个前述序列。在一个实施方案
中,至少一个核酸结构部分不含有CG基序。在其他实施方案中,CIC中
至少约25%,有时至少约50%,有时至少约75%的核酸结构部分是不具
有CG基序或,可替换地,TCG基序的核酸结构部分。
序列或序列基序在CIC中的位置可影响此CIC的免疫调制活性,如
在下文实施例中所述。谈及一个序列基序在CIC的核酸结构部分中的位置
时,下列术语学是有用的:(1)在包含多个核酸结构部分的CIC中,带
游离5’-端的结构部分称为“5-引发结构部分”。应理解单个CIC可具有多
个5-引发结构部分。(2)在任何特定的核酸结构部分内,当此结构部分中
一个序列或基序的5’端没有核苷酸碱基时,则此序列或基序处于此结构部
分的“5-引发位置”。因此,在具有序列5’-TCGACGT-3’的结构部分中,
序列T、TC、TCG和TCGA处于“5-引发位置”,而序列GAC则不是。
举例来说,在核酸结构部分的“5-引发位置”含有序列TCG的CIC与除
了TCG基序定位不同外相类似的CIC相比可以更具有活性。CIC在“5-
引发结构部分”中,如在“5-引发结构部分”的“5-引发位置”具有TCG
序列可以使此CIC特别有活性。实例参见实施例38。带有游离5’-端的核
酸结构部分可用在式中位于此核酸结构部分碱基序列左侧的符号“5’F”来
表示(如,5’F-TACG-3’)。如此处所用,术语“游离5’端”在核酸结构
部分这一语境中具有通常的含义,即是指核酸结构部分的5’末端不与封端
基团或非核苷酸间隔体结构部分缀合。
免疫刺激活性还可受到CG基序在核酸结构部分(如,在5’-结构部分)
中的位置的影响。例如,在一个有用的实施方案中,CIC含有至少一个具
有序列5’-X-CG-Y-3’的核酸结构部分,其中X是0、1、或2个核苷酸,Y
是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或15个以上核苷酸长。
在一个实施方案中,5’-X-CG-Y-3’序列位于CIC的5’-结构部分中,如,
CIC的5’-引发位置。在一个实施方案中,CIC含有2、3或更多个具有式
5’-X-CG-Y-3’序列的核酸结构部分。例如,在一个实施方案中,CIC的所
有核酸结构部分都具有式5’-X-CG-Y-3’的序列。
同样,在核酸结构部分中含序列TCGA(如,包括TCGACGT的序
列)的CIC具有免疫调制活性,并且在IFN-α诱导中是有效的。在5-引
发结构部分(如在5-引发结构部分的5-引发位置)中的TCGA(如,包括
TCGACGT的序列)可使CIC特别有活性。参见实施例38和49。因此,
在一个实施方案中,CIC包含具有式(5’-N1-3’)-S1-N2(Ia)的核心结构,
其中N1具有序列5’-TCGAX-3’,X是0至20个核苷酸碱基,常是0至3
个碱基。在一个实施方案中,X是CGT。序列TCGTCGA在IFN-α诱导
中也是特别有效的。
另外,游离的(非缀合的)核酸5’端的存在能够影响免疫刺激活性。
实例参见实施例39。在多个实施方案中,本发明的CIC包含至少1、至少
2、至少3、至少4、或至少5个游离5’端。在一些实施方案中,游离5’端
的数目是1至10、2至6、3至5、或4至5。在一个实施方案中,游离5’
端的数目是至少约50或至少约100。
D.
“独立免疫调制活性”
核酸结构部分的一个性质是与核酸结构部分的核苷酸序列相关的“独
立免疫调制活性”。如上文所述,本发明人发现,令人惊奇地是,甚至当
CIC的所有核酸结构部分均不具有如果以单独多核苷酸形式呈递可显示出
相当的免疫调制活性的序列时,CIC仍显示出免疫调制活性。
在一些实施方案中,如下所述,CIC的核酸结构部分不具有“独立免
疫调制活性”,或其具有“次独立免疫调制活性”(即,与此CIC相比)。
核酸结构部分的“独立免疫调制活性”可通过测量具有核酸结构部分
的一级序列并具有相同的核酸主链(如,硫代磷酸酯,磷酸二酯,嵌合主
链)的独立多核苷酸的免疫调制活性来确定。例如,具有结构
“5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’”的CIC
包含三个核酸结构部分。举例来说,为测定CIC中第一个核酸结构部分的
独立免疫调制活性,首先利用常规方法合成一个具有相同序列(即,
5’-TCGTCG-3’)和相同主链结构(如,硫代磷酸酯)的测试多核苷酸,
再测定它的免疫调制活性(如果有的话)。免疫调制活性可利用能够指示
免疫应答的不同方面的标准试验,如上文§2所述的那些试验进行测定。
优选利用上文§2中所述的人PBMC试验。如上所述,考虑到供体的差异,
一般利用从多个供体获得的细胞进行该试验。如果在大多数供体中由接触
过多核苷酸的PBMC所分泌的IFN-γ量不显著大于(如,小于约2倍大
于)在没有测试化合物存在下或(在一些实施方案中)在无活性对照化合
物(如,5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’)(SEQ ID NO:3))存
在下的IFN-γ分泌量,则此多核苷酸不具有免疫调制活性(及相对应的核酸
结构部分不具有“独立免疫调制活性”)。
为比较CIC和独立多核苷酸的免疫调制活性,优选利用如上文§2中
所述的人PBMC试验测量免疫调制活性。一般来说,通过在相同条件下
(如,利用同种细胞),一般以约20μg/ml浓度,对两种化合物进行平行
测试来比较它们的活性。如上所述,浓度一般可通过测定260nm下的吸光
度并利用0.5OD260/ml=20μg/ml这一转换进行确定。这一操作可对试验样
本中的核酸总量进行标准化。作为替代的方案,浓度或重量可利用本领域
已知的其他方法测定。如果需要,核酸结构部分的量可通过测量260nm的
吸光度确定,而利用CIC的分子式可计算出CIC的重量。这种方法有时
用在CIC中间隔体结构部分所占重量相对于核酸结构部分所占重量的比率
较高(即,大于1)的情况下。
作为替代的方案,可使用3μM浓度,特别是当相比较的两种样本的
计算分子量差异超过20%时。
如果测试的多核苷酸具有的活性小于相比的CIC的活性,则CIC的
核酸结构部分可表征为具有“次免疫调制活性”。优选地,测试的多核苷
酸的独立免疫调制活性不超过CIC活性的约50%,更优选不超过CIC活
性的约20%,最优选不超过CIC活性的约10%,或在一些实施方案中,甚
至更少。
对于具有多个(如,多个不同)核酸结构部分的CIC,也可以测定相
应于此多个核酸结构部分的测试多核苷酸混合物的免疫调制活性(如果有
的话)。这一试验可利用总量等于所用CIC的量的测试多核苷酸(即,在
混合物中)来进行。作为替代的方案,在此试验中,混合物中每个测试多
核苷酸或每个不同的测试多核苷酸的量可等于CIC的量。如§2所述,考
虑到供体差异,优选利用来自多个供体的PMBC进行试验和分析。
在一个实施方案中,CIC中的一个或多个核酸结构部分(如,至少约
2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、或者全部核酸结构部分,
它们被单独测定或,作为替代的方案,被组合测定)不具有独立免疫调制
活性。在一个实施方案中,CIC中一个或多个的核酸结构部分(如,至少
约2个、至少约4个、或至少约25%、至少约50%、或者全部的核酸结构
部分,被单独测定或,作为替代的方案,被组合测定)相对于此CIC具有
次独立免疫调制活性。
在一个相关实施方案中,CIC包含一个或多个具有独立免疫调制活性
的核酸结构部分。例如,在一些实施方案中,全部或几乎全部(如,至少
90%,优选至少95%)的核酸结构部分具有独立免疫调制活性。例如,一
个含有多价间隔体的CIC可包含多于4个,经常多于10个,时常是至少
约20个,至少约50个,至少约100个,至少约400个或至少约1000个(如,
至少约2500个)具有独立免疫调制活性(如,具有序列5’-TGACTG
TGAACG TTC GAG ATG A-3’(SEQ ID NO:2))的核酸结构部分。
因此,在特定的CIC中,具有独立免疫调制活性的核酸结构部分的数
目可以是0、1、2或2以上、3或3以上、小于3、4或4以上、小于4、5
或5以上、小于5、至少10、至少约20、至少约50、至少约100、至少约
400或至少约1000、全部,或小于全部的CIC核酸结构部分。
E.
核酸结构部分的结构
CIC的核酸结构部分可包含相对于天然核酸的结构修饰。所述修饰包
括本领域已知的任一种可用于多核苷酸的修饰,但不限于3’OH或5’OH
基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖成分的修饰、以及磷酸酯基团的修饰。
下面对各种此类修饰进行说明。
核酸结构部分可以是DNA、RNA或混合的DNA/RNA、单链、双链
或部分双链,并且可包含其他的修饰多核苷酸。可考虑双链的核酸结构部
分和CIC,而且除非另有说明,术语“碱基(base)”或“核苷酸(nucleotides)”
的说法意指包括碱基对或碱基对核苷酸。核酸结构部分可包含天然存在的
或修饰的、非天然存在的碱基,并可包含修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例
如,磷酸酯的修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥
接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯,并且可以任意组合使用。也可使
用其它非磷酸酯连接。优选地,本发明的CIC和核酸结构部分包含硫代磷
酸酯主链。也可制备本领域公知的糖修饰,如2′-烷氧基-RNA类似物、2′-
氨基-RNA类似物和2 ′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体及此处描述的其
它糖修饰,并与任意磷酸酯修饰组合。碱基修饰的实例(以下进一步讨论)
包括但不限于向胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸电子结构部分(如5-溴胞嘧
啶,5-氯胞嘧啶,5-氟胞嘧啶,5-碘胞嘧啶)和向尿嘧啶的C-5和/或C-6添加
吸电子结构部分(如5-溴尿嘧啶,5-氯尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,5-碘尿嘧啶)。参
见如PCT公开号WO 99/62923。
核酸结构部分还可包含磷酸酯被修饰的核苷酸。包含修饰的磷酸酯键
或非磷酸酯键的核酸的合成也为本领域公知。综述参见《作为治疗剂的寡
核苷酸》(Oligonucleotides as Therapeutic Agents)(D.J.Chadwick和
G.Cardew编辑)John Wiley and Sons,New York,NY一书中的Matteucci
(1997)“寡核苷酸类似物:总览”(″Oligonucleotide Analogs:an
Overview″)。可与本发明核酸中的糖或糖类似物结构部分连接的磷衍生
物(或修饰的磷酸酯基)可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、
硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备及
它们向核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸中的掺入本身也是公知的并无需
在此详述。Peyrottes等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:
1841-1848;Chaturvedi等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:
2318-2323;和Schultz等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)24:
2966-2973。例如,硫代磷酸酯寡核苷酸的合成类似于上述天然寡核苷酸的
合成,除了氧化步骤用硫化步骤替换外(用于寡核苷酸和类似物的方法、合
成和特性(Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and
Properties)(Agrawal编辑)Humana Press一书中的Zon(1993)“寡核苷
硫代磷酸酯”(″Oligonucleoside Phosphorothioates″)165-190页)。同样,
其它磷酸酯类似物的合成如磷酸三酯的合成(Miller等人(1971)JACS 93:
6657-6665)、非桥接氨基磷酸酯的合成(Jager等人(1988)生物化学
(Biochem.)27:7247-7246)、N3′至P5′phosphoramidiates的合成(Nelson
等人(1997)JOC 62:7278-7287)和二硫代磷酸酯的合成(美国专利号
5,453,496)也已有描述。也可使用其它基于非磷的修饰核酸(Stirchak等人
(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)17:6129-6141)。具硫代磷酸酯主链
的核酸在注射入宿主后似乎更抗降解。Braun等人(1988)免疫学杂志(J.
Immunol.)141:2084-2089;和Latimer等人(1995)分子免疫学(Mol.
Immunol.)32:1057-1064。
用于本发明的核酸结构部分可包含核糖核苷酸(包含核糖作为唯一或
主要的糖成分)和/或脱氧核糖核苷酸(包含脱氧核糖作为主要的糖成分)。可
以在核酸结构部分中掺入修饰的糖或糖类似物。因此,糖结构部分除了核
糖和脱氧核糖外,还可为戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿
拉伯糖、木糖、来苏糖和糖″类似物″环戊基基团。糖可为吡喃型或呋喃型。
糖结构部分优选为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖的呋喃糖苷,
且糖可以以α或β端基异构构型和各杂环碱基连接。糖的修饰包括但不限
于2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基-或氨基
-RNA/DNA嵌合体。例如在CIC中糖的修饰包括但不限于2’-氨基-2’-脱氧
腺苷。这些糖或糖类似物以及相应″核苷″(其中此类糖或类似物与杂环碱
基(核酸碱基)连接)的制备本身是公知的,并无需在此描述,除非此类制
备可能涉及到任何具体的实施例。在制备CIC时也可进行糖修饰并与任何
磷酸酯修饰结合。
掺入核酸结构部分中的杂环碱基或核酸碱基可为天然存在的主要嘌呤
和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤,如上所述),
以及所述主要碱基的天然和合成的修饰物。
本领域技术人员将意识到包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似
物)的大量″合成的″非天然核苷在本领域中是现成的,并且只要满足本发
明的其它要求,核酸结构部分可包括不属于此主要五种天然核酸碱基成分
的一种或几种杂环碱基。但优选地,此杂环碱基是,但不限于,尿嘧啶-5-
基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、
4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基或2-
氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶-3-基,其中嘌呤通过9-位、嘧啶通过1-位、
吡咯并嘧啶通过7-位而吡唑并嘧啶通过1-位与核酸结构部分中的糖结构部
分连接。
核酸结构部分可包含至少一种修饰碱基。如此处所用,术语″修饰的碱
基″与″碱基类似物″同义,如″修饰的胞嘧啶″与″胞嘧啶类似物″同义。类
似地,″修饰的″核苷或核苷酸在此处定义为与核苷或核苷酸″类似物″同
义。碱基修饰的实例包括但不限于向核酸结构部分中的胞嘧啶的C-5和/
或C-6添加吸电子结构部分。优选地,该吸电子结构部分为卤素。此类修
饰的胞嘧啶可包括但不限于氮杂胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化
胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、5,6-二氢胞
嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-硝基胞嘧啶和任何其它嘧啶类似物或修饰的嘧啶。
碱基修饰的其它实例包括但不限于向核酸结构部分中的尿嘧啶的C-5和/
或C-6添加吸电子结构部分。优选地,该吸电子结构部分为卤素。此类修
饰的尿嘧啶可包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿
嘧啶。还可参见Kandimalla等,2001,Bioorg.Med.Chem.9:807-13。
碱基修饰的其它实例包括添加一个或多个含硫基团至碱基上,包括,
但不限于6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。
具有修饰碱基的核苷的制备和使用所述具有修饰碱基的核苷作为前体
进行的修饰寡核苷酸的合成已在例如美国专利4,910,300、4,948,882和
5,093,232中描述。这些具有修饰碱基的核苷经设计以致可通过化学合成掺
入寡核苷酸的末端或内部。此类存在于寡核苷酸末端或内部的具有修饰碱
基的核苷可作为连接肽或其它抗原的位点。糖结构部分被修饰的核苷也已
有描述(包括但不限于例如,美国专利4,849,513、5,015,733、5.118,800、
5,118,802)并可类似地使用。
4.非核酸间隔体结构部分
本发明的CIC化合物包含一个或多个与核酸结构部分共价结合的非核
酸间隔体结构部分。为方便起见,非核酸间隔体结构部分有时在本文中简
称为“间隔体”或“间隔体结构部分”。
间隔体一般具有从约50至约500,000(如约50至约50,000),有时
从约75至约5000,有时从约75至约500的分子量,在不同实施方案中此
间隔体与一个、两个、三个、或三个以上的核酸结构部分共价结合。有多
种试剂适用于连接核酸结构部分。例如,在科学文献中被称作“非核酸接
头”、“非核苷酸接头”、或“价平台分子(valency platform molecule)”
的多种化合物可用作CIC中的间隔体。如果说一个间隔体结构部分含有特
定间隔体成分(如,六聚乙二醇),则此间隔体包含该成分(或取代的衍
生物)作为间隔体的亚单元或部分。例如,实施例49中所示的间隔体可描
述为包含多糖成分、六聚乙二醇成分、和衍生的硫醚接头成分。如下所述,
在某些实施方案中,间隔体包含多个共价连接在一起的亚单元并且可以具
有均聚体结构或杂聚体结构。常常这些亚单元通过接头、磷酸二酯键、和/
或硫代磷酸酯酯键进行连接。参见下文实施例。包含多个此类单元或由它
们衍生得到的CIC非核苷酸间隔体结构部分可以称为“复合间隔体”。在
一个实施方案中,为举例说明而非限制目的,CIC包含复合间隔体,该间
隔体含有经磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯酯键连接在一起的任意两个或更
多个(如,3个或3个以上、4个或4个以上、或5个或5个以上)如下化
合物:低聚乙二醇单元(如,三聚乙二醇间隔体;六聚乙二醇间隔体;);
烷基单元(如,丙基间隔体;丁基间隔体;己基间隔体);分支间隔体(如,
2-(羟甲基)乙基间隔体;丙三醇间隔体;三倍增体(trebler)间隔体;对称
双倍增体(doubler)间隔体)。
应明了的是单核苷酸和多核苷酸不包括在非核酸间隔体的定义之内,
否则核酸结构部分和相邻的非核酸间隔体结构部分之间将无法区分。
本文描述了许多不同间隔体,但仅为举例说明起见并不限于此,。读
者应了解的是,为便于说明,间隔体结构部分(或间隔体结构部分的成分)
有时以间隔体结构部分或其成分的来源化合物的化学名称(如,六聚乙二
醇)来提及,并应理解CIC实际上包含这些化合物与核酸结构部分的缀合
物。正如本领域技术人员明了的(并如下文进一步详述的),非核酸间隔
体可以(并通常是)从间隔体结构部分前体形成,此前体包含允许一个或
多个核酸(如,寡核苷酸)可以偶联到间隔体结构部分前体上形成CIC的
反应基团且可以包含保护基团。间隔体前体上的反应基团可以是相同的或
不同的。
可例举的非核酸间隔体包括低聚-乙二醇(如,三聚乙二醇、四聚乙二
醇、六聚乙二醇间隔体,和其他含有多达约10个、约20个、约40个、约
50个、约100个或约200个乙二醇单元的聚合物)、烷基间隔体(如,丙
基、丁基、己基和其他C2-C12烷基间隔体,如一般为C2-C10烷基,
最常见为C2-C6烷基)、从丙三醇、季戊四醇、1,3,5-三羟基环己烷或1,3-
二氨基-2-丙醇衍生得到的对称或不对称间隔体(如,此处所述的对称双倍
增体和三倍增体间隔体结构部分)。任选地这些间隔体成分被取代。举例
来说,丙三醇和1,3-二氨基-2-丙醇可在1、2和/或3位进行取代(例如,
以下列的一个基团置换一个或多个与碳连接的氢),这是本领域普通技术
人员所了解的。同样,季戊四醇可以在任意的或全部的亚甲基位置被如下
任何基团取代。取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、和丙氧基)、
直链或支链烷基(如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12
烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、
酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br、或I)、酰胺,烷基酰胺(如C1-C12
烷基酰胺)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸酰卤、醚、磺酰卤、亚氨酸(imidate)
酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯
基、卤代乙酰基、烷基卤化物、磺酸烷基酯、NR1R2(其中R1R2是
-C(=O)CH=CHC(=O))(顺丁烯二酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、
半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞、α,β-不饱和砜。
在一个实施方案中,间隔体可含有一个或多个脱碱基核苷酸(即,缺
少核苷酸碱基但有糖和磷酸部分)。可例举的脱碱基核苷酸包括1’2’-二脱
氧核糖、1’-脱氧核糖、1’-脱氧阿拉伯糖以及它们的聚合物。
间隔体可包含此处所述的非核酸成分的均聚的或杂聚的低聚物和聚合
物(如,通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯酯键或,作为替代,酰胺键、酯键、
醚键、硫醚键、二硫键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键、二硫代磷酸酯键、
甲基磷酸酯键或其他键进行连接)。例如,在一个实施方案中,间隔体结
构部分含有经磷酸二酯键或硫代磷酸酯键缀合到低聚乙二醇如HEG上的
分支间隔体成分(如,丙三醇)(实例参见,C-94)。另一个例子是包含
与低聚乙二聚如HEG缀合的多价间隔体成分的间隔体。
其他适宜的间隔体包括取代的烷基、取代的聚二醇、任选取代的聚胺、
任选取代的聚醇、任选取代的聚酰胺、任选取代的聚醚、任选取代的聚亚
胺、任选取代的聚磷酸二酯(如聚(1-磷酸-3-丙醇)),等。任选的取代
基包括醇、烷氧基(如,甲氧基、乙氧基、和丙氧基),直链或支链烷基
(如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰
胺、磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br、或I)、酰
胺,烷基酰胺(如C1-C12烷基酰胺)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸酰
卤、醚、磺酰卤、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二
亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、磺酸烷基酯、NR1R2
(其中R1R2是-C(=O)CH=CHC(=O))(顺丁烯二酰亚胺)、硫醚、氰基、
糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞、α,β-不
饱和砜。
其他适用的间隔体可包括多环分子,如那些含有苯基或环己基环的多
环分子。间隔体可以是聚醚如聚磷酸丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇,双官
能(biofunctional)多环分子如双官能并环戊二烯、茚、萘、甘菊环、庚搭烯、
亚联苯基、不对称indacene、对称indacene、苊、芴、phenalene、菲、蒽、
荧蒽、acephenathrylene、醋蒽烯、苯并菲、芘、_、并四苯、噻蒽、异苯
并呋喃、色烯、呫吨、苯并氧硫杂环己二烯——它们可以是取代的或修饰
的,或可以是聚醚和多环分子的组合。多环分子可利用C1-C5烷基、C6
烷基、链烯基、羟烷基、卤素或卤代烷基基团进行取代或多取代。含氮多
杂环分子(如,中氮茚)一般不是适用的间隔体。间隔体还可以是聚醇,
如丙三醇或季戊四醇。在一个实施方案中,间隔体包括(1-磷酸丙烷)3-
磷酸酯或(1-磷酸丙烷)4-磷酸酯(也称四磷酸丙二醇和戊磷酸丙二醇)。在
一个实施方案中,间隔体包括2,2’-亚乙基二氧基二乙胺(EDDA)的衍生
物。
其他可例举的用于CIC的非核酸间隔体包括如下文献中描述的“接
头”:Cload和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.(1991),113:6324;Richardson
和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.(1991),113:5109;Ma等,Nucleic Acids
Research(1993),21:2585;Ma等,Biochemistry(1993),32:1751;
McCurdy等,Nucleosides & Nucleotides(1991),10:287;Jaschke等,
Tetrahedron Lett.(1993),34:301;Ono等,Biochemistry(1991),30:9914;
和Arnold等,国际公开号WO 89/02439和EP0313219B1标题“用于核苷
酸探针的非核酸连接试剂”;Salunkhe等,J.Am.Chem.Soc.(1992),114:
8768;Nelson等,Biochemistry 35:5339-5344(1996);Bartley等,
Biochemistry 36:14502-511(1997);Dagneaux等Nucleic Acids Research
24:4506-12(1996);Durand等,Nucleic Acids Research 18:6353-59(1990);
Reynolds等,Nucleic Acids Research,24:760-65(1996);Hendry等
Biochemica et Biophysica Acta,1219:405-12(1994);Altmann等,Nucleic
Acids Research,23:4827-35(1995),和美国专利号6,117,657(Usman等)。
适宜的间隔体结构部分可为CIC提供电荷和/或疏水性,提供有利的
药物代谢动力学性质(如,提高的稳定性、血液中更长的滞留时间),和/
或导致CIC靶向特定细胞或器官。可对间隔体结构部分进行选择或修饰以
使CIC适合所需要的药物代谢动力学性质、特定免疫应答的诱导或适用于
所需要的施用方式(如,口服)。
在包含一个以上间隔体结构部分的CIC中,间隔体可以是相同或不同
的。因此,在一个实施方案中CIC中全部非核酸间隔体结构部分具有相同
结构。在一个实施方案中,CIC包含具有至少2种、至少3种、至少4种、
至少5种、或至少6种或更多种不同结构的非核酸间隔体结构部分。
在本发明考虑的一些实施方案中,规定CIC的间隔体结构部分不包括
某些结构。因此,在本发明的一些实施方案中,间隔体不是脱碱基核苷酸
或脱碱基核苷酸的聚合物。在本发明的一些实施方案中,间隔体不是低聚
(乙二醇)(如,HEG、TEG等)或聚(乙二醇)。在一些实施方案中间
隔体不是C3烷基间隔体。在一些实施方案中间隔体不是烷基或取代的间
隔体。在一些实施方案中间隔体不是多肽。因此,在一些实施方案中,免
疫原性分子,如蛋白质或多肽不适于作为间隔体结构部分的成分。然而,
如下文所述,可考虑在某些实施方案中,CIC是“蛋白质样的CIC”,即,
包含含有多肽(即,氨基酸的低聚物或聚合物)的间隔体结构部分。例如,
如下文所述,在一些实施方案中,多肽抗原可作为平台(多价间隔体)缀
合多个核酸结构部分。然而,在一些实施方案中,间隔体结构部分不是蛋
白质样的和/或不是抗原(即,间隔体结构部分,如果从CIC中分离出来,
不是抗原)。
适宜的间隔体结构部分不会使将其作为组成成分的CIC不溶于水溶液
(如,PBS,pH7.0)。因此,间隔体的定义排除了微载体或毫微载体。
此外,低溶解性的间隔体结构部分,如十二烷基间隔体(当作为二醇前体
1,12-二羟基十二烷测定时,溶解性<5mg/ml)不是优选的,这是因为它
能减少CIC的亲水性和活性。优选地是,间隔体结构部分在例如作为二醇
前体测定时具有远大于5mg/ml的溶解性(如,溶解性至少约20mg/ml、
至少约50mg/ml、或至少约100mg/ml)。检测间隔体结构部分水溶性时所
用的间隔体结构部分的形式一般是最紧密相关的无活性且无保护的间隔体
前体分子。例如,C-19包含这样一个间隔体结构部分,其中包括在C-1和
C-12位置上有硫代磷酸酯二酯键的十二烷基基团,从而使该间隔体结构部
分连接到核酸结构部分。在这种情况下,检测二醇形式的十二烷基间隔体
(1,12-二羟基十二烷)的水溶解性,发现小于5mg/ml。具有较高水溶性(在
以它们的二醇前体进行检测时)的间隔体可导致具有更大免疫刺激性的
CIC。这类较高水溶性的间隔体包括,不限于,丙烷-1,3-二醇、丙三醇、
丁烷-1,4-二醇、戊烷-1,5-二醇、己烷-1,6-二醇、三聚乙二醇、四聚乙二醇
和HEG。
A.
带电荷的多单元间隔体结构部分
CIC的电荷可由核酸结构部分中的磷酸酯、硫代磷酸酯、或其他基团
以及非核酸间隔体结构部分中的基团来提供。在本发明的一些实施方案中,
非核酸间隔体结构部分带有净电荷(如,在pH7测定时带有净正电荷或净
负电荷)。在一个有用的实施方案中,CIC具有净负电荷。在一些实施方
案中,CIC间隔体结构部分的负电荷可通过衍生此处所述的间隔体亚单元
增加其电荷来得到增加。例如,丙三醇可共价结合两个核酸结构部分,而
余下的醇可与活化的亚磷酰胺反应,然后经过氧化或硫化作用分别形成磷
酸酯或硫代磷酸酯。在某些实施方案中,由CIC非核酸间隔体结构部分提
供的负电荷(即,在有一个以上间隔体时的电荷总量)大于由CIC的核酸
结构部分提供的负电荷。电荷可根据分子式计算出来或通过实验方法,如
通过毛细管电泳来测定(Li,ed.,1992,毛细管电泳,原理、操作和应用
(Electrophoresis,Principles,Practice and Application),Elsevier Science
Publishers,Amsterdam,The Netherlands,pp202-206)。
如上文所述,适宜的间隔体可以是较小非核酸(如,非核苷酸)化合
物的聚合物,这些化合物参见本文所述的那些,它们本身可作为间隔体,
其中包括一般称为非核苷酸“接头”的化合物。此类聚合物(即,“多单
元间隔体”)可以是杂聚体或均聚体,并且常包含通过酯键(如,磷酸二
酯或硫代磷酸酯)连接的单体单元(如,HEG、TEG、丙三醇、1′,2′-双
脱氧核糖等)。因此,在一个实施方案中间隔体含有非核苷酸单元(如,2
至约100个单元、或者2至约50,如2至约5,或者如约5至约50,如约
5至约20个单元)的聚合物(如,杂聚物)结构。
为举例说明,含有多单元间隔体的CIC包括
5′-TCGTCG-(C3)15-T
5′-TCGTCG-(丙三醇)15-T
5′-TCGTCG-(TEG)8-T
5′-TCGTCG-(HEG)4-T
其中(C3)15是指经硫代磷酸酯连接的15个丙基接头;(丙三醇)15是指经
硫代磷酸酯连接的15个丙三醇接头;;(TEG)8是指经硫代磷酸酯连接的
8个三聚乙二醇接头;(HEG)4是指经硫代磷酸酯连接的4个六聚乙二醇接
头。应该明了,某些多单元间隔体具有净负电荷,并且负电荷量可通过增
加如酯连接的单体单元的数目来增加。
B.
多价间隔体结构部分
在某些实施方案中,间隔体结构部分是多价的非核酸间隔体结构部分
(即,“多价间隔体”)。如本文中所用,含多价间隔体的CIC包含与三
(3)个或更多个核酸结构部分共价结合的间隔体。在本领域中多价间隔体
有时称为“平台分子(platform molecules)”。多价间隔体可以是聚合物
或非聚合物。可例举的适宜分子包括丙三醇或取代的丙三醇(如,2-羟甲
基丙三醇、乙酰丙酰基-丙三醇);四氨基苯、七氨基-β-环糊精、1,3,5-三
羟基环己烷、季戊四醇和季戊四醇衍生物、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮
杂环十四烷(Cyclam)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)、聚乙烯亚
胺、1,3-二氨基-2-丙醇和取代衍生物(如,“对称双倍增体”)、[丙基氧
基甲基]乙基化合物(如“三倍增体”)、聚乙二醇衍生物如所谓的“Star
PEG”和“bPEG”(实例参见Gnanou等,1988,Makromol.Chem.189:2885;
Rein等,1993,Acta Polymer 44:225,Merrill等,美国专利号5,171,264;
Shearwater Polymers Inc.,Huntsville AL)、树状体和多糖。
树状体(Dendrimer)是本领域已知的,是以化学方法定义的球状分
子,一般通过多官能单体的逐步反应或反复反应以得到一个分支结构来制
备(实例参见Tomalia等,1990,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:138-75)。
许多树状体是已知的,如以胺封端的聚氨基胺、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺
树状体。可例举的适用于本发明的树状体包括“密集星形(dense star)”
聚合物或“星爆形(starburst)”聚合物,如在美国专利号4,587,329;
5,338,532;和6,177,414中所述的那些聚合物,其中包括所谓“聚(氨基胺)
(“PAMAM”)树状体”。此外其他适用于本发明的多聚体间隔体分子
包括以化学方法定义的非聚合的价平台分子,如在美国专利5,552,391;和
PCT申请PCT/US00/15968(以WO 00/75105公布);PCT/US 96/09976(以
WO 96/40197公布),PCT/US 97/10075(以 WO 97/46251公布);
PCT/US 94/10031(以WO 95/07073公布);和PCT/US 99/29339(以WO
00/34231公布)中公开的那些分子。许多其他合适的多价间隔体也可利用并
且它们将是本领域的技术人员所已知的。
使核酸结构部分缀合到平台分子上可通过多种方式实现,典型地涉及
到一个或多个交联剂以及核酸结构部分和平台分子上的官能团。连接基团
可利用标准合成化学技术添加到平台上。连接基团可利用标准合成技术添
加到核酸结构部分上。
本发明实施中可使用具有各种效价的多价间隔体,在多个实施方案中
CIC的多价间隔体与约3至约400个核酸结构部分,有时约100至约500
个、有时约150至约250个、有时3-200个、有时3至100个、有时3-
50,时常3-10,并有时多于400个核酸结构部分结合。在许多不同实施
方案中,多价间隔体与多于10、多于25、多于50、多于100或多于500
个的(可以相同或不同的)核酸结构部分缀合。应该理解的是,在某些实
施方案中,当CIC含有多价间隔体时,本发明提供的是一组分子结构略有
差异的CIC。例如,当利用具有高效价的树状体、多糖或其他多价间隔体
制备CIC时,可产生稍具异质性的分子混合物,即,包含不同数量的(在
或主要在可测定的范围内)核酸结构部分被连接到此多价间隔体结构部分
上形成的分子。如果树状体、多糖等被用作多价间隔体的元件,则核酸结
构部分可直接或间接连接到此元件(如,树状体)。例如,CIC可包含通
过低聚乙二醇元件连接到树状体的核酸结构部分(其中树状体+低聚乙二
醇构成间隔体结构部分)。应该认识到核酸结构部分可与一个以上间隔体
结构部分缀合,如在上文§III(1)B中所述。
经衍生能够连接核酸结构部分的多糖可用作CIC中的多价间隔体。适
宜的多糖可以是天然多糖或合成多糖。可例举的多糖包括,如葡聚糖、
mannin、脱乙酰壳多糖、琼脂糖和淀粉。举例来说,可利用mannin,因
为在免疫学相关的细胞类型,如单核细胞和肺泡巨噬细胞上有mannin(甘
露糖)受体,所以此多糖间隔体结构部分可用于靶向特定细胞类型。在一
个实施方案中,多糖是交联的。一个适宜的化合物是表氯醇交联的蔗糖(如,
FICOLL_)。FICOLL_是通过用表氯醇交联蔗糖得到高分支的结构而合
成的。例如,如实施例49所示,氨基乙基羧甲基-ficoll(AECM-Ficoll)
可利用Inman,1975,J.Imm.114:704-709的方法制备。在含多糖的CIC中
核酸结构部分的数目可以是如此处针对于CIC(如,多价CIC)所述的任
何范围。例如,在一个实施方案中,多糖包含约150至约250个核酸结构
部分。这样,AECM-Ficoll可与异双官能(heterobiofunctional)交联剂,如
6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯进行反应,再缀合到经巯
基衍生的核酸结构部分上(参见Lee等,1980,Mol.Imm.17:749-56)。其
他多糖可进行类似修饰。
5.CIC的合成
根据本说明书和本领域知识,利用常规方法制备CIC是本领域技术人
员力所能及的。用于制备核酸结构部分(如,寡核苷酸和修饰的寡核苷酸)
的技术是已知的。合成核酸结构部分可利用的技术包括,但不限于酶学方
法和化学方法以及酶学和化学方法的组合。例如,含磷酸二酯键的DNA
或RNA可通过化学方法来合成,即通过将适当的核苷亚磷酰胺依次偶联
到生长中的3’-末端附着于载体上的寡核苷酸的5’-羟基上,然后经氧化作
用使中间体亚磷酸三酯变成磷酸三酯来合成。可用于DNA合成的固相载
体包括可控多孔玻璃(Applied Biosystems,Foster City,CA),聚苯乙烯珠基
体(Primer Support,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)和TentGel
(Rapp Polymere GmbH,Tubingen,Germany)。一旦合成所需要的寡核苷
酸序列,可将此寡核苷酸序列从载体上除下,磷酸三酯基团经脱保护变成
磷酸二酯而核苷碱基利用氨水或其他碱进行脱保护。
举例来说,含磷酸二酯键的DNA或RNA多核苷酸(核酸结构部分)
一般通过反复重复下列步骤进行合成:a)从3’与固相载体结合的核苷或
核酸的5’-羟基上去除保护基团,b)将活化的核苷亚磷酰胺偶联到此5’-
羟基上,c)氧化亚磷酸三酯为磷酸三酯,和d)给未反应的5’-羟基基团
加帽。含硫代磷酸酯键的DNA或RNA可按如上所述进行制备,除了将氧
化步骤换成硫化步骤。一旦合成所需要的寡核苷酸序列,可将此寡核苷酸
序列从载体上除下,磷酸三酯基团脱保护变成磷酸二酯而核苷碱基利用氨
水或其他碱进行脱保护。实例参见Beaucage(1993)PROTOCOLS FOR
OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS,SYNTHESIS AND
PROPERTIES(Agrawal,ed.)一书中的″寡脱氧核糖核苷酸的合成″
Humana Press,Totowa,NJ;Warner等(1984)DNA 3:401;Tang等
(2000)Org.Process Res.Dev.4:194-198;Wyrzykiewica等(1994)Bioorg.
& Med.Chem.Lett.4:1519-1522;Radhakrishna等(1989)J.Org Chem.
55:4693-4699和美国专利号4,458,066。能自动合成具有特定序列的核酸结
构部分的可编程设备已普遍存在。实例包括Expedite 8909自动DNA合成
仪(Perseptive Biosystem,Framington MA)、ABI 394(Applied Biosystems,
Inc.,Foster City,CA)、和Oligo Pilot II(Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway,NJ)。
举例来说,利用含有酸不稳定性5’-保护基团和3’-亚磷酰胺且碱基被
保护的核苷(单体),多核苷酸可沿着3’到5’方向进行组装。可例举的此
类单体包括5’-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙
基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺,其中可例举的被保护核苷包括,但不限于N6-
苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、N2-异丁酰基鸟苷、胸苷和尿苷。在
此情况下,所用的固相载体包含3’-连接的被保护核苷。作为替代方案,多
核苷酸可利用含有酸不稳定3’-保护基团和5’-亚磷酰胺的碱基被保护核苷
沿着5’到3’方向进行组装。可例举的此类单体包括3’-O-(4,4′-二甲氧基三
苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺,其中
可例举的被保护核苷包括,但不限于N6-苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、
N2-异丁酰基鸟苷、胸苷和尿苷(Glen Research,Sterling,VA)。在此情况下,
所用的固相载体包含5’-连接的被保护核苷。可分离或利用重组方法合成或
化学方法合成环状核酸成分。化学合成可利用文献中描述的任一种方法进
行,实例参见Gao等(1995)Nucleic Acids Res.23:2025-2029和Wang
等(1994)Nucleic Acids Res.22:2326-2333。
根据待制备的特定CIC的不同,核酸结构部分和间隔体结构部分可通
过多种方法缀合。添加特定间隔体结构部分的方法是本领域已知的,例如
在上文引用的参考文献中对此方法进行了描述。实例参见Durand等,
Nucleic Acids Research 18:6353-59(1990)。间隔体结构部分和核酸结构部
分之间的共价连接可以是多种连接形式中的任一种,其中包括磷酸二酯键、
硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、亚磷酰胺键、磷
酸三酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键和其他类型的键。如上所述,
可任选地利用活化末端的基团修饰间隔体结构部分前体以便与核酸偶联。
可例举的被活化的间隔体结构部分参见图1,其中已加入适于自动合成时
使用的保护基团。其他的间隔体结构部分前体包括,例如但不限于,(1)
HOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OH,其中n=0、1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、
40、41、42、43、44或45或大于45;(2)HOCH2CHOHCH2OH;(3)HO(CH2)nOH
,其中n=1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或11。
在一个实施方案中,所利用的间隔体结构部分前体包括第一和第二反
应基团以允许逐步与核酸结构部分进行缀合,其中第一反应基团具有能够
使其有效偶联到核酸生长链的末端的特性,而第二反应基团能够逐步地进
一步延伸CIC中混合的核苷酸和非核苷酸结构部分的生长链。利用与核酸
结构部分合成所用相同的亚磷酰胺型化学使间隔体结构部分和核酸结构部
分进行结合,这常常是方便的。例如,借助利用亚磷酰胺化学的自动DNA
合成仪(如,Expedite 8909;Perseptive Biosystems,Framington,MA)(参见
Beaucage,1993,同上引文;Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,同
上引文)可方便地合成本发明的CIC。然而,本领域技术人员将明了,如
果需要,也可人工实施自动DNA合成仪所进行的相同(或等价)合成步
骤。结果产生的核酸和间隔体前体之间的连接可以是硫代磷酸酯键或磷酸
二酯键。在此类合成中,典型地,间隔体(或多聚体间隔体的间隔体亚单
元)的一个末端利用4,4’-二甲氧基三苯甲基进行保护,而另一末端包含亚
磷酰胺基团。
许多具有有用的保护基团和反应基团的间隔体已※上市,例如:
三聚乙二醇间隔体或“TEG间隔体”9-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)
三聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,
22825 Davis Drive,Sterling,VA);
六聚乙二醇间隔体或“HEG间隔体”18-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)
六聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,
Sterling,VA);
丙基间隔体3-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基-1-O-[(2-氰乙基)
N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA);
丁基间隔体4-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)丁氧基-1-O-[(2-氰乙基)
N,N-二异丙基亚磷酰胺](Chem Genes Corporation,Ashland Technology
Center,200 Homer Ave,Ashland,MA);
己基间隔体:6-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)己氧基-1-O-[(2-氰乙基)
N,N-二异丙基亚磷酰胺](Biosearch Technologies,Novoto,CA)
2-(羟甲基)乙基间隔体或″HME间隔体″1-(4,4′-二甲氧基三苯
甲基氧基)-3-(乙酰丙酰氧基)-丙氧基-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷
酰胺];还称为″不对称分支″间隔体(参见图.2)(Chem Genes Corp.,
Ashland Technoklgy Center,Ashland MA.);
″脱碱基核苷酸间隔体″或″脱碱基间隔体″5-O-(4,4′-二甲氧基三
苯甲基)-1,2-二脱氧核糖-3-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen
Research,Sterling,VA);
″对称分支间隔体″或″丙三醇间隔体″1,3-O,O-二-(4,4′-二甲氧基
三苯甲基)丙三醇-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Chem Genes,
Ashland,MA)(参见图2);
″三倍增体间隔体″(参见图.2)2,2,2-O,O,O-三[3-O-(4,4′-二甲氧基三
苯甲基氧基)丙氧基甲基]乙基-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺]
(Glen Research,Sterling,VA);
″对称双倍增体间隔体″(参见图.2)1,3-O,O-二[5-O-(4,4′-二甲氧基三
苯甲基氧基)戊酰氨基]丙基-2-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺]
(Glen Research,Sterling,VA);
″十二烷基间隔体″12-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基)十二烷氧基
-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research,Sterling,VA)。
这些和大量其他被保护的间隔体结构部分前体(如,含有DMT和亚
磷酰胺基保护基团)可购买获得或可利用本文公开的用于制备CIC的常规
方法进行合成。可根据厂商说明书对仪器进行程序化以依照所需要的顺序
添加核苷酸单体和间隔体。
在DNA合成仪上“原位(in situ)”制取CIC需要经保护的核苷和
经保护的间隔体单体,两者都含有反应性的或可激活的官能团。间隔体结
构部分的反应形式和/或受保护形式可称作“间隔体前体成分”。偶联之后
间隔体前体中的反应基团形成稳定的键而间隔体前体上的保护基团在所得
的CIC间隔体结构部分中被除去,这是本领域技术人员明了的。保护基团
一般在逐步合成CIC的过程中被除去,以允许反应在此位点进行。如果其
他反应基团上有保护基团的话,这些保护基团可在逐步合成CIC之后被去
除(如在图2结构3中所示用于制备C-25的间隔体前体上的乙酰丙酰基基
团)。
可例举的一个不具其他反应官能团的间隔体前体是18-O-(4,4′-二甲
氧基三苯甲基)六聚乙二醇-1-O-[(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺],其
包含保护基团——4,4′-二甲氧基三苯甲基基团和反应基团——(2-氰乙基)
N,N-二异丙基亚磷酰胺基团。在DNA合成仪上利用亚磷酰胺化学制取
CIC的过程中,间隔体前体中的(2-氰乙基)N,N-二异丙基亚磷酰胺基团
被弱酸,如1H-四唑激活,并且与核苷碱基受保护的核酸结构部分的游离
5’-羟基反应形成亚磷酸三酯。然后亚磷酸三酯基团经氧化或硫化作用分别
形成稳定的磷酸三酯或硫代磷酸三酯基团。所得到的三酯基团在CIC的剩
余合成中是稳定的并保持此形式直到最后的脱保护。间隔体前体上的4,4′-
二甲氧基三苯甲基基团将被除去以便偶联另一个间隔体前体或激活的核苷
单体,所述核苷单体将成为下一个核酸结构部分的一部分。经过偶联反应
和氧化或硫化反应之后,此基团也分别地变成稳定的磷酸三酯或硫代磷酸
三酯基团。受保护的CIC完成组装后,CIC可以从固相载体上切下来,磷
酸三酯或硫代磷酸三酯基团上的氰乙基基团被去除,而且核苷碱基保护被
去除。在此实例中,CIC包含其中包括连接核酸结构部分的稳定的磷酸二
酯键或硫代磷酸二酯键的间隔体结构部分。间隔体前体的反应性亚磷酰胺
基团和被保护的羟基基团都在间隔体结构部分中转变成稳定的磷酸二酯键
或硫代磷酸二酯键。由于间隔体的每一末端的反应都是独立的,所以一个
键可以是磷酸二酯而另一个键是硫代磷酸二酯,或其任意的组合。具有其
他磷酸酯修饰,如二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和氨基磷酸酯的CIC也可通
过这种方法利用具有适当反应基团的间隔体前体、恰当的助剂及为该类连
接设计的方案来制取。这些方案与所述用于制取具有修饰的磷酸酯键的核
酸结构部分的那些方案相似。
虽然利用亚磷酰胺化学对制取某些CIC是方便的,但是应该知道本发
明的CIC不局限于通过任一种特定的合成和制备方法制取的化合物。例如,
含有与DNA合成和脱保护条件不相容的基团——如(但不限于)肼或顺
丁烯二酰亚胺的核酸结构部分,可通过使含有氨基接头的核酸结构部分与
适当的异双官能交联剂——如SHNH(烟酸琥珀酰亚胺基肼)或磺基
-SMCC(4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]-环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)
进行反应来制取。
使蛋白质、肽、寡核苷酸和小分子以各种组合进行缀合的方法在文献
中有描述,并且这些方法可以经改进用于实现含反应性连接基团的核酸结
构部分与间隔体结构部分前体的缀合。实例参见,生物缀合技术
(Bioconjugate Techniques),Greg T.Hermanson,Academic Press,Inc.,
San Diego,CA,1996。在一些实施方案中,先合成核酸结构部分,然后利
用标准的合成化学技术加入反应性连接基团(如,氨基、羧基、含硫基团、
二硫基等)。反应性连接基团(被认为可形成最终间隔体结构部分中的一
部分)可与其他非核酸化合物(如,不限于,在上文§4中列出的化合物)
缀合,以形成间隔体结构部分的一部分。利用核酸合成的标准方法将反应
性连接基团加到核酸上,这一过程可使用本领域已知的多种试剂进行。实
例包括含有保护的氨基、羧基、巯基、二硫基、醛基、二醇基、二烯基和
亚磷酰胺基的试剂。一旦这些化合物通过活化的亚磷酰胺基团掺入核酸并
被去保护后,它们就分别为核酸提供了氨基、羧酸、醛、二醇、二烯或硫
醇反应活性。可例举的用于使含反应性连接基团的核酸结构部分与含反应
基团的间隔体结构部分前体缀合的反应基团如下所示。
核酸反应基团
间隔体结构部分前体反应基团
形成的稳定连接
巯基 顺丁烯二酰亚胺、卤代乙酰基 硫醚键
顺丁烯二酰亚胺 巯基 硫醚键
巯基 吡啶二硫化物 二硫键
吡啶二硫化物 巯基 二硫键
胺 NHS或其他活性酯 酰胺键
胺 羧基 酰胺键
羧基 胺 酰胺键
醛、酮 肼、酰肼 腙、酰肼键
肼、酰肼 醛、酮 腙、酰肼键
二烯 亲双烯体 脂肪族环或杂环环
反应性连接基团和间隔体前体反应形成稳定键并且两个(或多个)核
酸结构部分之间的整个原子基团被定义为间隔体结构部分。例如,所合成
的其上通过硫代磷酸酯基团连接有巯己基基团的核酸结构部分可与含有一
个(或多个)顺丁烯二酰亚胺基团的间隔体前体进行反应,形成硫醚键。
此CIC的间隔体结构部分包括来自核酸结构部分上的接头的硫代磷酸酯基
团和己基基团、新形成的硫醚键以及原来为间隔体前体的一部分的间隔体
其余部分。
虽然线性CIC可利用这些缀合策略制取,但是这些方法最常用于制备
分支结构的CIC。此外,可制备具有几个正交反应基团的间隔体前体分子
以允许添加一种以上核酸结构部分(如,不同序列基序)。
在一个实施方案中,对具有缀合有一种以上核酸结构部分的多价间隔
体的CIC进行制备。例如,含有两个顺丁烯二酰亚胺基团(它可以与含疏
基的多核苷酸反应)和两个活化的酯基团(它可以与含氨基的核酸反应)
的平台已有描述(实例参见PCT/US 94/10031,公布为WO 95/07073)。
这两种活化基团可彼此独立进行反应。这就产生包含总计4个核酸结构部
分——每种序列2个——的CIC。
多价间隔体中含有两种不同核酸序列的CIC也可利用对称分支间隔
体、如上所述方法和常规的亚磷酰胺反应(如,利用人工操作或自动化操
作方法)进行制备。对称分支间隔体包含一个亚磷酰胺基团和两个相同的
并可被同时除去的保护基。例如在一种方法中,第一核酸合成出来后偶联
到对称分支间隔体上,之后从间隔体上除去保护基。然后在间隔体上合成
另两个(同序列)核酸(每一步骤中使用的试剂量为合成单个核酸结构部
分时所用量的两倍)。在下文实施例15中对这一方法进行了详细说明。
可利用类似方法将三个不同的核酸结构部分(以下称核酸I、II、III)
连接到一个多价平台(如,不对称分支间隔体)上。此操作利用自动DNA
分析仪来实行是最方便的。在一个实施方案中,不对称分支间隔体包含一
个亚磷酰胺基团和两个可独立地被除去的正交保护基。首先,合成核酸I,
将不对称分支间隔体偶联到核酸I,然后在选择性去除保护基中的一个之
后加上核酸II。核酸II被去保护并进行加帽,之后除去间隔体上的另一个
保护基。最后,合成核酸III。在下文实施例17中对这一方法进行了详细
说明。
不同长度的亲水接头可用于如连接核酸结构部分和平台分子。多种适
宜的接头是已知的。适宜的接头包括,不限于:乙二醇的直链低聚物或聚
合物。此类接头包括式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2的接头,
其中n=0-200,m=1或2,R1=H或保护基如三苯甲基,R2=H或烷基
或芳基,如4-硝基苯基酯。这些接头可用于使含巯基反应基团的分子如
haloaceyl、maleiamide等(通过硫醚)与含有氨基基团的另一个分子(经
酰胺键)连接起来。连接的顺序可以变化,即,硫醚键可在酰胺键形成之
前或之后形成。其他有用的接头包括磺基-SMCC(4-[N-顺丁烯二酰亚胺基
甲基]-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)Pierce Chemical Co.product
22322;磺基-EMCS(N-[ε-顺丁烯二酰亚胺基己酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)
Pierce Chemical Co.product 22307;磺基-GMBS(N-[γ-顺丁烯二酰亚胺
基丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product 22324
(Pierce Chemical Company,Rockford,IL),及通式为顺丁烯二酰亚胺基
-R-C(O)NHS酯的相似化合物,其中R=烷基、环烷基、乙二醇聚合物
等。
特别有用的共价连接核酸结构部分和多价间隔体的方法参见上文所引
用参考文献和实施例中的描述。
因此,一方面,本发明提供一种方法用于制备对调制哺乳动物免疫应
答有用的CIC,此方法通过共价地连接多核苷酸和化合物,从而得到包含
核酸结构部分和间隔体结构部分区域并且具有免疫调制活性的嵌合化合
物。在不同实施方案中,核酸区可以具有此处所述的任何核酸结构部分的
结构和序列,间隔体区可以具有此处所述的任何间隔体结构部分的结构。
经常,存在一个以上连接步骤,如连接至少重复进行一次以使两个多核苷
酸共价连接到一个或两个间隔体上,而通常连接至少重复两次或三次。此
方法还包括使CIC与可药用赋形剂混合形成组合物。在一个实施方案中,
组合物是无菌的,如适用于给人类患者施用,如按照GMP标准生产或配
制。在一个实施方案中,使CIC和如此处所述微载体和/或抗原联合。也
可考虑,在一些实施方案中,本发明的CIC制剂中不含有下列物质的一种
或多种:(i)胶态分散系统,(ii)脂质体,(iii)微载体,(iv)多肽,
(v)抗原,和(vi)内毒素。
6.蛋白样CIC
在某些实施方案中,多肽——如蛋白质抗原或抗原片断被用作多价间
隔体结构部分,多个核酸结构部分可以直接地或经接头共价缀合到此间隔
体上形成“蛋白样CIC”。此多肽可以是抗原或免疫原——针对它可产生
所需的适应性免疫应答,或者可以是载体(如,白蛋白)。蛋白样CIC一
般包含至少一个、通常几个或多个核酸结构部分,所述核酸结构部分(a)
长度是2个至7个,更常见4个至7个核苷酸,或者2个至6个、2个至5
个、4个至6个或4个至5个核苷酸和/或(b)具有次独立免疫调制活性或
不具有独立免疫调制活性。在参阅本公开的基础上,制备蛋白样CIC的方
法对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如,利用本领域已知的方法
可以使核酸共价缀合到多肽间隔体结构部分,包括核酸结构部分的3’或5’
末端(或核酸结构部分内部的适当修饰碱基)和带有适当反应基团(如,
可与胞嘧啶残基的N4氨基基团直接反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯)的多肽
之间的连接。再例举一例,多肽可通过掺入到核酸结构部分中的胺、巯基
或羧基连接到核酸结构部分的游离5’末端。或者,如此处所述,多肽可缀
合到间隔体结构部分上。此外,在一端含有被保护的胺、巯基或羧基并包
含亚磷酰胺的连接基团可被共价连接到多核苷酸的羟基基团上,然后在去
保护后,该官能团可用于CIC与肽的共价连接。
7.纯化
本发明的CIC可利用任何常规方法,如高效液相色谱、电泳、核酸亲
和层析、分子大小排阻层析和离子交换层析进行纯化。在一些实施方案中,
CIC是实质上纯的,举例来说,按重量计至少约80%纯、常常按重量计至
少约90%纯、更常见地是至少约95%纯、最常见是至少约85%纯。
8.组合物
在多种实施方案中,本发明的组合物包含一个或多个CIC(即,单一
CIC或两个或多个CIC的组合),其中所述CIC任选地与另一免疫调制
剂——如肽、抗原(如下所述)和/或另外的佐剂联合。本发明的组合物可
包含CIC和可药用赋形剂。“可药用”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与
制剂中的其他成分相容并且对受体无害。可药用赋形剂在本领域是熟知的,
其包括无菌水、等渗溶液如盐水和磷酸缓冲盐水以及其他本领域已知的赋
形剂。实例参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(19th
edition,1995,Gennavo,ed.)。佐剂(可例举的一个实例是明矾)是本领域
已知的。可制备具有其他免疫治疗剂——如细胞因子和抗体的CIC制剂。
在一些实施方案中,组合物是等渗和/或无菌的,如适用于给人类患者施用,
如按照GMP标准生产或配制。
A.
CIC/MC复合体
CIC可以以CIC/微载体(CIC/MC)复合体的形式进行施用。因此,
本发明提供了含CIC/MC复合体的组合物。
CIC/MC复合体包含结合在微载体表面的CIC(即,CIC不是被包裹
在MC中),并优选每一微载体结合有多个CIC分子。在某些实施方案中,
不同CIC的混合物可与一种微载体复合,这样该微载体将结合有一种以上
的CIC。CIC和MC之间的键可为共价或非共价的(例如,由离子键和/
或疏水作用介导)。本领域技术人员理解可以修饰或衍生CIC,并且可以
选择和/或修饰微载体的组成以适应期望用于形成CIC/MC复合体的结合
类型。
共价结合的CIC/MC复合体可用本领域公知的任何共价交联技术连
接。一般,对CIC部分进行修饰,以掺入额外结构部分(如游离胺、羧基
或巯基)或掺入修饰的(如硫代磷酸酯)核苷酸碱基,从而提供CIC部分可与
微载体连接的位点。复合体中CIC和MC部分之间的连接可发生在CIC
的3′或5′端,或发生在CIC内部经合适修饰的碱基处。通常也修饰微载体
以掺入通过其可形成共价连接的结构部分,但也可利用正常存在于微载体
上的官能团。通过将CIC与微载体在允许共价复合体形成的条件下(如在
存在交联剂时或通过使用包含可与CIC形成共价键的活化结构部分的活化
微载体)孵育,可形成CIC/MC。
大量的交联技术为本领域所公知,并包括与氨基、羧基和巯基反应的
交联剂。对本领域技术人员显而易见的是:交联剂和交联法的选择取决于
CIC和微载体的构型及所期望的CIC/MC复合体的最终构型。交联剂可为
同双官能(homobifunctional)交联剂或异双官能交联剂。当使用同双官能
交联剂时,交联剂利用CIC和MC上的相同部分(如当CIC和MC均包含
一个或多个游离胺时,可使用醛交联剂来共价连接CIC和MC)。异双官能
交联剂利用CIC和MC上的不同部分(如顺丁烯二酰亚胺基-N-羟基琥珀酰
亚胺酯可用于共价连接CIC上的游离巯基和MC上的游离胺),并且其在
使微载体间最少键合方面是优选的。在大多数情况下,优选通过在微载体
上的第一交联结构部分和在CIC上的第二交联结构部分来交联,其中第二
交联结构部分不存在于微载体上。产生CIC/MC复合体的一种优选方法是
通过与异双官能交联剂孵育来活化微载体,然后将CIC与活化的MC在适
于反应的条件下孵育而形成CIC/MC复合体。交联剂可在两个反应性结构
部分之间掺入″间隔臂″,或交联剂中的两个反应性结构部分可直接连接。
在一个优选的实施方案中,CIC部分包含至少一个游离巯基(如由5′-
巯基修饰的碱基或接头提供)用于交联微载体,同时微载体包含游离氨基。
可以使用与这两个基团反应的异双官能交联剂(如包含顺丁烯二酰亚胺基
团和NHS-酯的交联剂),诸如4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸
琥珀酰亚胺基酯活化MC,然后共价交联CIC以形成CIC/MC复合体。
非共价CIC/MC复合体可通过任何非共价结合或相互作用连接,其中
非共价结合或相互作用包括离子(静电)键、疏水相互作用、氢键、范德华
引力、或两种或多种不同相互作用的组合,当利用结合对连接CIC和MC
时通常就是这样。
优选的非共价CIC/MC复合体一般通过疏水或静电(离子)相互作用或
它们的组合(例如,通过CIC和连接至MC上的多核苷酸之间的碱基配对)
而复合。由于多核苷酸主链的亲水特性,依赖疏水相互作用形成复合体的
CIC/MC复合体通常需要修饰复合体的CIC部分以掺入高度疏水结构部
分。优选地,疏水结构部分为生物相容的、非免疫原性的并天然存在于该
组合物欲施用的个体体内(例如,该疏水结构部分可在哺乳动物,尤其是人
体内找到)。优选的疏水结构部分的实例包括脂类、类固醇类、固醇类如胆
固醇和萜类。当然,将疏水结构部分连接至CIC的方法取决于CIC的构
型和疏水结构部分的特性。可在CIC中的任何适宜位点添加此疏水结构部
分,优选地在5′或3′端添加;在将胆固醇结构部分添加至CIC时,优选地
使用常规化学反应将该胆固醇结构部分添加至CIC的5′端(参见如Godard
等人(1995),欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)232:404-410)。优选地,
用于通过疏水键连接的CIC/MC复合体中的微载体由疏水材料如油滴或疏
水聚合物制成,但也可使用经修饰掺入了疏水结构部分的亲水材料。当该
微载体为脂质体或其它包含腔的液相微载体时,在制备MC后通过混合
CIC和MC而形成CIC/MC复合体,从而避免在MC制备过程中对CIC
的包裹。
通过静电结合的非共价CIC/MC复合体一般利用多核苷酸主链的高负
电荷。因此,用于非共价结合的CIC/MC复合体中的微载体通常在生理
pH(如约pH 6.8-7.4)下为带正电荷的。微载体可本身就具有正电荷,但使
用一般不具有正电荷的化合物制备的微载体可通过衍生或修饰而成为带正
电荷的。例如,可衍生用于制备微载体的聚合物,以添加带正电荷的基团,
如伯胺。或者,可在生产过程中将带正电的化合物掺入微载体制剂中(例如,
在聚(乳酸)/聚(羟基乙酸)共聚物的生产过程中可使用带正电荷的表面活性
剂,以在所得的微载体粒子上赋予正电荷)。见,例如,下文实施例28和
34。
通过核苷酸碱基配对连接的非共价CIC/MC复合体可用常规方法制
备。通常,用包含结合有,优选地共价结合有至少部分互补于CIC的多核
苷酸(″捕捉多核苷酸″)的微载体制备碱基配对的CIC/MC复合体。CIC和
捕捉核苷酸之间的互补片段优选至少有6、8、10或15个相邻碱基对,更
优选至少20个连续碱基对。捕捉核苷酸可通过本领域公知的任何方法结合
至MC,且优选共价结合至CIC的5′或3′端。
在其它实施方案中,可使用结合对连接CIC/MC复合体中的CIC和
MC。结合对可为受体和配体、抗体和抗原(或表位)、或任何其它以高亲和
性结合的结合对(例如,Kd小于约10-8)。一类优选的结合对为生物素和链
亲和素或为生物素和亲和素,它们可形成紧密的复合体。当使用结合对介
导CIC/MC复合体的结合时,用结合对中的一员衍生CIC,一般通过共价
键合衍生,且用结合对中的另一员衍生MC。这两种衍生化合物的混合将
导致CIC/MC复合体的形成。
许多CIC/MC复合体的实施方案不包括抗原,而某些实施方案排除与
疾病或病症相关的抗原,其中所述疾病或病症为CIC/MC复合体的治疗目
标。在另外的实施方案中,CIC还结合一个或多个抗原分子。抗原可以以
多种方式(包括共价和/或非共价相互作用)与CIC/MC复合体中的CIC部分
偶联,或者,抗原可与微载体连接。CIC上结合有抗原的CIC/MC复合体
中,抗原与CIC的连接可通过本文中描述的技术和本领域公知的技术来实
现。
B.共施用的抗原
在一些实施方案中,CIC与抗原共施用。任何抗原都可与CIC共施用,
和/或用于包含CIC和抗原的组合物的制备。
在一些实施方案中,抗原为变应原。重组变应原的实例在表1中提供。
许多变应原的制备在本领域是熟知的,包括但不限于豚草花粉变应原
Antigen E(Amb aI)(Rafnar等人(1991)生物化学杂志(J Biol.Chem.)266:
1229-1236)、草变应原Lol p1(Tamborini等人(1997)欧洲生物化学杂志
(Eur.J.Biochem.)249:886-894)、主要尘螨变应原Der pI和Der PII
(Chua等人(1988)实验医学杂志(J.Exp.Med.)167:175-182;Chua等人
(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91:124-129)、家猫变应原Fel dI
(Rogers等人(1993)分子免疫学(Mol.Immunol.)30:559-568)、白桦花粉
Bet v1(Breiteneder等人(1989)EMBO J8:1935-1938)、柳杉变应原Cry j1
和Cry j2(Kingetsu等人(2000)免疫学(Immunology)99:625-629)和来
自其它树木花粉的蛋白质抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.
Invest.Suppl.204:17-31)的制备。已报导了用于体内施用的来自草花粉的
蛋白质抗原的制备。
在一些实施方案中,变应原为食物变应原,包括但不限于花生变应原
如Ara hI(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409:213-216);胡桃变
应原如Jug rI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101:807-814);
巴西坚果变应原如白蛋白(Pastorello等人(1998)J Allergy Clin.Immunol.
102:1021-1027);虾变应原如Pen aI(Reese等人(1997)Int.Arch.Allergy
Immunol.113:240-242);卵变应原如类卵粘蛋白(Crooke等人(1997)免疫
学杂志(J.Immunol.)159:2026-2032);奶变应原如牛β-乳球蛋白(Selot
等(1999)临床与实验变态反应(Clin.Exp.Allergy)29:1055-1063);鱼变
应原如小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J Immunol.50:619-625;
Galland等人(1998)J Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.706:63-71.)。在一
些实施方案中,变应原为胶乳变应原,包括但不限于Hev b7(Sowka等人
(1998)欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem.)255:213-219)。表1列出了
可使用的变应原的名单。
表1
重组变应原
组别
变应原
参考文献
动物:
甲壳动物
虾/龙虾
原肌球蛋白
Pan sI
Leung等人(1996)J.Allergy Clin.Immunol.98:954-961
Leung等人(1998)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.7:12-20
昆虫
蚂蚁
Soli2(毒液)
Schmidt等人,J Allergy Clin Immunol.,1996,98:82-8
蜜蜂
磷脂酶
A2(PLA)
透明质酸酶
(Hya)
Muller等人,J Allergy Clin Immunol,1995,96:395-402
Forster等人,J Allergy Clin Immunol,1995,95:1229-35
Muller等人,临床与实验变态反应(Clin Exp Allergy),1997,27:
915-20
Soldatova等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:691-8
蟑螂
Bla g Bd9OK
Bla
g4(calycin)
谷胱甘肽S转
移酶
Per a3
Helm等人,J Allergy Clin Immunol,1996,98:172-180
Vailes等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:274-280
Arruda等人,生物化学杂志(J Biol Chem),1997,272:20907-12
Wu等人,分子免疫学(Mol Immunol),1997,34:1-8
尘螨
Der p2(主要变
应原)
Der p2变体
Der f2
Der p10
Tyr p2
Lynch等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:562-4;Hakkaart
等人,Clin Exp Allergy,1998,28:169-74;Hakkaart等人,Clin
Exp Allergy,1998,28:45-52;Hakkaart等人,Int Arch Allergy
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Mueller等人,生物化学杂志(J Biol Chem),1997,272:26893-8
Smith等人,J Allergy Clin Immunol,1998,101:423-5
Yasue等人,临床与实验免疫学(Clin Exp Immunol),1998,113:
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Yasue等人,细胞免疫学(Cell Immunol),1997,181:30-7
Asturias等人,Biochim Biophys Acta,1998,1397:27-30
Eriksson等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998
大胡蜂
抗原5aka Dol
mV(毒液)
Tomalski等人,Arch Insect Biochem Physio,1993,22:303-13
蚊子
Aed aI(唾液
腺苷三磷酸双
磷酸酶)
Xu等人,Int Arch Allergy Immunol,1998,115:245-51
黄蜂
抗原5,透明质
酸酶和磷脂酶
(毒液)
King等人,J Allergy Clin Immunol,1996,98:588-600
哺乳动物
猫
Fel dI
Slunt等人,J Allergy Clin Immunol,1995,95:1221-8
Hoffmann等人(1997)J Allergy Clin Immunol 99:227-32
Hedlin Curr Opin Pediatr,1995,7:676-82
奶牛
Bos d
2(dander;
lipocalin)
β-乳球蛋白
(BLG,主要牛
奶变应原)
Zeiler等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:721-7
Rautiainen等人Biochem Bioph.Res Comm.,1998,247:746-50
Chatel等人,分子免疫学(Mol Immunol),1996,33:1113-8
Lehrer等人Crit Rev Food Sci Nutr,1996,36:553-64
狗
Can fI和Can
f2.
唾液lipocalin
Konieczny等人,免疫学(Immunology),1997,92:577-86
Spitzauer等人,J Allergy Clin Immunol,1994,93:614-27
Vrtala等人,免疫学杂志(J Immunol),1998,160:6137-44
马
Equ c1(主要变
应原,lipocalin)
Gregoire等人J Biol Chem,1996,271:32951-9
小鼠
小鼠尿蛋白
(MUP)
Konieczny等人,免疫学(Immunology),1997,92:577-86
其它哺乳
动物变应
原
胰岛素
Ganz等人J Allergy Clin Immunol,1990,86:45-51
Grammer等人,J Lab Clin Med,1987,109:141-6
Gonzalo等人,变态反应(Allergy),1998,53:106-7
干扰素
干扰素α2c
Detmar等人Contact Dermatis,1989,20:149-50
软体动物
topomyosin
Leung等人J Allergy Clin Immunol,1996,98:954-61
植物
变应原:
大麦
Hor v9
Astwood等人Adv Exp Med Biol,1996,409:269-77
桦
花粉变应原,
Bet v4
rBet v1 Bet
v2:
(抑制蛋白)
Twardosz等人Biochem Bioph.Res Comm.,1997,239:197
Pauli等人,J Allergy Clin Immunol,1996,97:1100-9
van Neerven等人Clin Exp Allergy,1998,28:423-33
Jahn-Schmid等人Immunotechnology,1996,2:103-13
Breitwieser等人Biotechniques,1996,21:918-25
Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64
巴西坚果
球蛋白
Bartolome等人Allergol Immunopathol,1997,25:135-44
樱桃
Pru aI(主要变
应原)
Scheurer等人,分子免疫学(Mol Immunol),1997,34:619-29
玉米
Zml3(花粉)
Heiss等人FEBS Lett,1996,381:217-21
Lehrer等人Int Arch Allergy Immunol,1997,113:122-4
草
Phl p1,Phl p2,
Phl p5(梯牧草
花粉)
Hol 15绒毛草
花粉
早熟禾变应原
Cyn d7狗牙
草
Cyn d12 (一种
抑制蛋白)
Bufe等人Am J Respir Crit Care Med,1998,157:1269-76
Vrtala等人,免疫学杂志(J Immunol)1998年6月15日,160:
6137-44
Niederberger等人J Allergy Clin Immun.,1998,101:258-64
Schramm等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998,252:
200-6
Zhang等人,免疫学杂志(J Immunol),1993,151:791-9
Smith等人Int Arch Allergy Immunol,1997,114:265-71
Asturias等人,Clin Exp Allergy,1997,27:1307-13
Fuchs等人,J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64
柳杉
Jun a2(阿希
刺柏,
Juniperus
ashei)
Cry j1,Cry j2
(孔雀杉,
Cryptomeria
japonica)
Yokoyama等人Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,275:
195-202
Kingetsu等人Immunology,2000,99:625-629
杜松
Jun o2(花粉)
Tinghino等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:772-7
胶乳
Hey b7
Sowka等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1998,255:
213-9
Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:3 56-64
山靛
(Mercuri
alis)
Mer aI(抑制
蛋白)
Vallverdu等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:3 63-70
芥(黄色)
Sin aI(种子)
Gonzalez de la Pena等人Biochem Bioph.Res Comm.,1993,190:
648-53
油籽油菜
Bra rI花粉变
应原
Smith等人Int Arch Allergy Immunol,1997,114:265-71
花生
Ara hI
Stanley等人Adv Exp Med Biol,1996,409:213-6
Burks等人J Clin Invest,1995,96:1715-21
Burks等人Int Arch Allergy Immunol,1995,107:248-50
草地早熟
禾
Poa p9
Parronchi等人,欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol),1996,26:
697-703
Astwood等人Adv Exp Med Biol,1996,409:269-77
豚草
Amb aI
Sun等人Biotechnology Aug,1995,13:779-86
Hirschwehr等人J Allergy Clin Immunol,1998,101:196-206
Casale等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:110-21
黑麦
Lol pI
Tamborini等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem),1997,249:
886-94
胡桃
Jug rI
Teuber等人J Allergy Clin Immun.,1998,101:807-14
小麦
变应原
Fuchs等人J Allergy Clin Immunol,1997,100:356-64
Donovan等人,电泳(Electrophoresis),1993,14:917-22
真菌
曲霉属
(Aspergil
lus)
Asp fI,Asp f
2,Asp f3,Asp f
4,rAsp f 6
锰超氧化物歧
化酶(MNSOD)
Crameri等人Mycoses,1998,41 Suppl1:56-60
Hemmann等人,欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol),1998,28:
1155-60
Banerjee等人J Allergy Clin Immunol,1997,99:821-7
Crameri Int Arch Allergy Immunol,1998,115:99-114
Crameri等人Adv Exp Med Biol,1996,409:111-6
Moser等人J Allergy Clin Immunol,1994,93:1-11
Mayer等人Int Arch Allergy Immunol,1997,113:213-5
Blomia
变应原
Caraballo等人Adv Exp Med Biol,1996,409:81-3
青霉属
(Penicilli
nium)
变应原
Shen等人,临床与实验变态反应(Clin Exp Allergy),1997,27:
682-90
裸盖菇属
(Psilocyb
e)
Psi c2
Horner等人Int Arch Allergy Immunol,1995,107:298-300
在一些实施方案中,抗原来自感染物,包括原生动物、细菌、真菌(包
括单细胞和多细胞)和病毒感染物。合适的病毒抗原的实例于文中描述并
为本领域公知。细菌包括流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、分枝结核
杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和百日咳杆菌(Bordetella pertussis)。
原生动物感染物包括疟原虫、利什曼原虫、锥虫和血吸虫。真菌包括白色
念珠菌(Candida albicans)。
在一些实施方案中,抗原为病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不限于HIV
蛋白如HIV gag蛋白(包括但不限于膜锚定(MA)蛋白、核心壳(CA)蛋白和
核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳
(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、肝炎e蛋白
(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。讨论流感接种的文献包括Scherle
和Gerhard(1988),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:
4446-4450;Scherle和Gerhard(1986),实验医学杂志(J.Exp.Med.)164:
1114-1128;Granoff等(1993),疫苗(Vaccine)11:S46-51;Kodihalli等人
(1997),病毒学杂志(J.Virol.)71:3391-3396;Ahmeida等人(1993),疫苗
(Vaccine)11:1302-1309;Chen等人(1999),疫苗(Vaccine)17:653-659;
Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41:251-257;Koide等人
(1995),疫苗(Vaccine)13:3-5;Mbawuike等人(1994),疫苗(Vaccine)
12:1340-1348;Tamura等人(1994),疫苗(Vaccine)12:310-316;Tamura
等人(1992)欧洲免疫学杂志(Eur.J Immunol.)22:477-481;Hirabayashi
等人(1990),疫苗(Vaccine)8:595-599。抗原多肽的其它实例为组或亚组
特异性抗原,许多感染物的这些抗原多肽是已知的,其中所述感染物包括
但不限于腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、
乳头状瘤病毒(papilloma virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial
virus)和痘病毒(poxviruse)。
许多抗原肽和蛋白质是公知的,并在本领域中是现成的;其它的可用
常规技术鉴定。对于通过免疫抵抗肿瘤形成或治疗已存在的肿瘤,免疫调
制肽可包括肿瘤细胞(活的或辐射过的)、肿瘤细胞提取物或肿瘤抗原的蛋
白质亚单位如Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)、神经节苷酯、人乳脂
肪球(HMFG)、粘蛋白(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、
gp100、前列腺特异抗原(PSA)和酪氨酸酶。基于免疫的避孕疫苗可通过包
括与CIC共施用的精子蛋白而形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta
1307:263。
减毒和灭活病毒适用于本文中作为抗原。这些病毒的制备为本领域熟
知并且许多可通过商业途径获得(参见如Physicians′Desk Reference(1998)
第52版,Medical Economics Company,Inc.)。例如,脊髓灰质炎病毒(polio
virus)可以以1POL_(Pasteur Merieux Connaught)和ORIMUNE_(Lederle
Laboratories)获得,甲肝病毒可以以VAQTA_(Merck)获得,麻疹病毒
(measles virus)可以以ATTENUVAX_(Merck)获得,腮腺炎病毒
(mumps virus)可以以MUMPSVAX_(Merck)获得,及风疹病毒(rubella
virus)可以以MERUVAX_II(Merck)获得。此外,如HIV-1、HIV-2、单
纯疱疹病毒、乙肝病毒、轮状病毒(rotavirus)、人和非人乳头状瘤病毒
和脑慢病毒(slow brain virus)的减毒和灭活病毒可提供肽抗原。
在一些实施方案中,抗原包含病毒载体,如痘苗病毒、腺病毒和金丝
雀痘病毒载体。
抗原可从它们的来源中用本领域公知的纯化技术分离,或更方便地,
可用重组方法产生。
抗原肽可包括纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、粗蛋白提取物、
减毒或灭活病毒、细胞、微生物或此类肽的片段。免疫调制肽可为天然肽,
或为化学或酶法合成的肽。本领域公知的任何化学合成法均适用。液相肽
合成可用于构建中等大小的肽,或肽的化学构建可采用固相合成来进行。
Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362:833-839。也可
使用蛋白水解酶来偶联氨基酸而产生肽。Kullmann(1987)Enzymatic
Peptide Synthesis,CRC Press,Inc。或者,可通过使用细胞的生物化学机器
或通过从生物源分离来获得肽。可采用重组DNA技术产生肽。Hames等
人(1987),转录和翻译:实用方法(Transcription and Translation:A
Practical Approach),IRL Press。也可用标准技术如亲和层析分离肽。
优选地,抗原为肽、脂类(如除胆固醇外的固醇类、脂肪酸和磷脂)、
多糖(如那些用于流感嗜血杆菌疫苗中的多糖)、神经节苷脂和糖蛋白。
它们可通过本领域公知的几种方法获得,包括使用化学和酶法分离和合成。
在某些情况下,例如对于许多固醇类、脂肪酸和磷脂,分子的抗原性部分
可通过商业途径得到。
用于本发明组合物和使用该组合物的方法中的病毒抗原的实例包括但
不限于HIV抗原。此类抗原包括但不限于那些来自HIV包膜糖蛋白的抗
原,其中所述HIV包膜糖蛋白包括但不限于gp160、gp120和gp41。许多
HIV基因和抗原的序列是公知的。例如Los Alamos National Laboratory
HIV Sequence Database收集、管理和注释HIV核苷酸和氨基酸序列。该
数据库通过互联网网址http://hiv-web.lanl.gov/可进入,并且每年公布,
参见Human Retroviruses and AIDS Compendium(如2000版)。
来自感染物的抗原可用本领域公知的方法获得,如从天然病毒或细菌
提取物获得、从感染物感染的细胞获得、从纯化的多肽获得、从重组产生
的多肽获得和/或以合成肽的形式获得。
CIC可以以多种方式与抗原一起施用。在一些实施方案中,CIC和抗
原以相互空间接近的方式施用。如下所述,可以以多种方式实现空间接近,
包括缀合、包囊化、添加至平台上或吸附至表面上。在一个实施方案中,
CIC和抗原以混合物的形式(例如,在溶液中)施用。特别可以考虑,在
某些实施方案中,CIC和免疫原或抗原不发生缀合。
在一些实施方案中,CIC与多肽如抗原连接。CIC部分可以以多种方
式,包括共价和/或非共价相互作用,通过核酸结构部分或非核酸间隔体结
构部分与缀合物的抗原部分连接。在一些实施方案中,连接通过反应基,
例如但不限于含硫基团、胺、羧基、醛、肼、腙、二硫基等实现。
这些部分间的连接可在核酸结构部分的3′或5′末端,或在核酸结构部
分中间位置的适当修饰的碱基处进行。例如,如果抗原为肽并包含合适的
反应基团(如N-羟基琥珀酰亚胺酯),则它可直接与胞嘧啶残基的N4氨基反
应。根据CIC中胞嘧啶残基的数量和位置,可在一个或多个残基处实现特
异性偶联。
或者,可将诸如本领域所公知的修饰寡核苷掺入CIC的末端或内部位
置。它们可包含被封闭的官能团,当去封闭后,这些官能团可与多种可能
存在于或结合在目的抗原上的官能团反应。
当抗原为肽时,缀合物的该部分可通过固相载体化学连接至核酸结构
部分或间隔体结构部分。例如,可将CIC的核酸结构部分添加至已在载体
上预合成的多肽部分上。Haralambidis等人(1990)核酸研究(Nucleic Acids
Res.)18:493-499;和Haralambidis等人(1990)核酸研究(Nucleic Acids
Res.)18:501-505。
或者,可以合成CIC使其通过从核酸结构部分的3′-端延伸出的可切
割接头连接固相载体。当CIC从载体上化学切割下来后,在核酸结构部分
的3’-端留下一个末端巯基或末端氨基基团(Zuckermann等人(1987)核酸
研究(Nucleic Acids Res.)15:5305-5321;和Corey等人(1987)科学
(Science)238:1401-1403;Nelson等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids
Res.)17:1781-1794)。氨基修饰的CIC与肽的氨基的缀合可如Benoit等
人(1987)Neuromethods 6:43-72中所述进行。巯基修饰的CIC与肽的羧基
的缀合可如Sinah等人(1991),寡核苷酸类似物:实用方法(Oligonucleotide
Analogues:A Practical Approach),IRL Press中所述进行。携带有附加
的顺丁烯二酰亚胺的核酸结构部分或间隔体与肽的半胱氨酸残基的硫醇侧
链的偶联也已有描述。Tung等人(1991)Bioconjug Chem.2:464-465。
缀合物的肽部分可通过已经掺入(例如,通过游离的5’-端、3’-端,通
过修饰的碱基,等等)核酸结构部分或间隔体的胺、巯基或羧基基团连接
至核酸结构部分的游离5’-端。
方便地,一端包含被保护的胺、巯基或羧基且包含亚磷酰胺的连接基
团可与CIC的羟基共价结合。Agrawal等人(1986)核酸研究(Nucleic Acids
Res.)14:6227-6245;Connolly(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:
4485-4502;Kremsky等人(1987),核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:
2891-2909;Connolly(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:3131-3139;
Bischoff等人(1987)Anal.Biochem.164:336-344;Blanks等人(1988),核酸
研究(Nucleic Acids Res.)16:10283-10299;以及美国专利号4,849,513、
5,015,733、5,118,800和5,118,802。去保护后,这些胺、巯基和羧基官能
团可用于使CIC与肽共价连接。Benoit等人(1987);和Sinah等人(1991)。
CIC-抗原缀合物也可通过非共价相互作用如离子键、疏水相互作用、
氢键和/或范德华引力而形成。
非共价连接的缀合物可包括非共价相互作用,如生物素-链亲和素复合
体。生物素基团可例如连接至CIC的修饰碱基上。Roget等人(1989),核
酸研究(Nucleic Acids Res.)17:7643-7651。将链亲和素部分掺入肽部分
将允许链亲和素缀合的肽和生物素化寡核苷酸形成非共价结合复合体。
也可通过涉及到CIC和抗原内的残基如带电荷氨基酸的离子相互作
用,或通过使用包含有可与寡核苷酸和抗原均发生相互作用的带电荷残基
的接头部分来产生非共价连接。例如,非共价缀合可以在通常带负电荷的
CIC和肽中带正电荷的氨基酸残基如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨
酸残基之间发生。
CIC和抗原间的非共价缀合可通过与DNA相互作用的分子中的DNA
结合基序而实现,其中该分子为DNA的天然配体。例如,此类DNA结合
基序可在转录因子和抗DNA抗体中找到。
CIC与脂的连接可通过标准方法形成。这些方法包括但不限于合成寡
核苷酸-磷脂缀合物(Yanagawa等人(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19:
189-192)、寡核苷酸-脂肪酸缀合物(Grabarek等人(1990)生物化学年鉴
(Anal.Biochem.)185:131-135;和Staros等人(1986)生物化学年鉴
(Anal.Biochem.)156:220-222)、和寡核苷酸-固醇缀合物。Boujrad等人
(1993),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:5728-5731。
寡核苷酸与寡糖的连接可通过标准的已知方法形成。这些方法包括但
不限于合成寡核苷酸-寡糖缀合物,其中寡糖为免疫球蛋白的一部分。
O′Shannessy等人(1985),应用生物化学杂志(J.Applied Biochem.)7:
347-355。
用于将肽和其它分子连接至寡核苷酸上的其它方法可在美国专利号
5,391,723;Kricka(编辑),非同位素DNA探针技术(Nonisotopic DNA Probe
Techniques),Academic Press一书中的Kessler(1992),“核酸的非放射
性标记法”(″Nonradioactive labeling methods for nucleic acids″);和
Geoghegan等人(1992)Bioconjug.Chem.3:138-146中找到。
CIC可以以其它方式与抗原紧密联结。在一些实施方案中,CIC和抗
原通过包囊化而紧密联结。在其它实施方案中,CIC和抗原通过与平台分
子连接而紧密联结。″平台分子″(也称为″平台″)为包含允许CIC和抗原附
着的位点的分子。在其它实施方案中,CIC和抗原通过吸附在表面,优选
载体粒子上而紧密联结。
在一些实施方案中,本发明的方法使用了包囊剂(或包含此包囊剂的
组合物),其中所述包囊剂可维持CIC和第一抗原的紧密联结,直至该复
合体到达靶。优选地,包含CIC、抗原和包囊剂的组合物为佐剂水包油乳
剂、微粒子和/或脂质体形式。更优选地,包封有CIC的佐剂水包油乳剂、
微粒子和/或脂质体为约0.04μm至约100μm大小的颗粒形式,优选地其大
小为任一以下范围:约0.1μm至约20μm;约0.15μm至约10μm;约0.05μm
至约1.00μm;约0.05μm至约0.5μm。
胶体分散体系如微球、珠、大分子复合体、毫微胶囊和基于脂的体系
如水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体可有效地包封含有CIC的组
合物。
包囊组合物还可包含多种成分中的任何成分。这些成分包括但不限于
明矾、脂类、磷脂、脂膜结构(LMS)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物如多肽、
糖肽和多糖。
适用作包囊成分的多肽包括本领域公知的任何多肽,并包括但不限于
脂肪酸结合蛋白。修饰的多肽可包含如下多种修饰中的任何修饰,所述修
饰包括但不限于糖基化、磷酸化、肉豆蔻基化、硫酸化和羟化。如此处所
用,合适的多肽为能保护含有CIC的组合物以保留其免疫调制活性的多肽。
结合蛋白的实例包括但不限于白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋
白。
其它合适的聚合物可为制药领域公知的任何聚合物,其包括但不限于
天然存在的聚合物(如葡聚糖、羟乙基淀粉和多糖)和合成的聚合物。天
然存在的聚合物的实例包括蛋白质、糖肽、多糖、葡聚糖和脂类。其它聚
合物可为合成的聚合物。适用于本发明的合成聚合物的实例包括但不限于
聚烷基二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化多元醇(POP)如聚氧乙基化丙三醇
(POG)、聚三亚甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚异丁烯酸羟乙基酯、
聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷
酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的聚合物也可为直链
或支链的、取代或未取代的均聚物、两种或多种不同的合成单体的共聚物
或嵌段共聚物。
用于本发明包囊组合物中的PEG可购自化学供应商或用本领域公知
的技术合成。
术语″LMS″如此处所用是指这样的层状脂粒子,其中极性脂的极性头
部基团面向界面的水相排列以形成膜结构。LMS的实例包括脂质体、微胶
粒、螺旋体(即通常的圆柱状脂质体)、微乳、单层脂质体、多层脂质体等。
可用于施用CIC的一种胶体分散体系为脂质体。用脂质体包封的抗原
免疫小鼠,脂质体表现出可促进针对抗原的Th1-型免疫反应。Aramaki
等人(1995),疫苗(Vaccine)13:1809-1814。如此处所用,″脂质体″或″
脂质小泡″为被至少一个且可能多于一个的双层脂膜包裹的小泡。可以从磷
脂、糖脂、脂类、类固醇如胆固醇、相关分子或其组合通过本领域公知的
任何技术人工制备脂质体,所述技术包括但不限于超声处理、挤出或从脂-
去污剂复合体中去除去污剂。脂质体也可任选地包含其它成分如组织靶向
成分。应理解″脂膜″或″脂双层″不一定仅由脂类组成,只要膜的总体结构
为两个亲水表面夹着一个疏水核的片层,″脂膜″或″脂双层″还可包含任何
合适的其它成分,所述成分包括但不限于胆固醇和其它类固醇、溶于脂的
化学物质、任何长度的蛋白质以及其它两亲性分子。对膜结构的综合讨论
参见J.Kendrew(1994)的分子生物学百科全书(The Encyclopedia of
Molecular Biology)。合适的脂类参见如Lasic(1993)″Liposomes:from
Physics to Applications″Elsevier,Amsterdam。
用于制备含有包含CIC的组合物的脂质体的方法为本领域公知。脂质
小泡可通过本领域公知的任何合适技术制备。方法包括但不限于微囊化、
微流化、LLC法、醇注射、氟利昂注射、″发泡″法、去污剂透析、水合作
用、超声处理和反相蒸发。综述见Watwe等人(1995)Curr.Sci.68:715-724。
可组合多种技术以提供具最理想性质的小泡。
本发明包括含有组织或细胞靶向成分的LMS的用途。此类靶向成分
为LMS中的成分,当此LMS施用于完整的动物、器官或细胞培养物时,
该成分可促进LMS优先积聚在特定组织或细胞位点而非其它组织或细胞
位点。靶向成分通常从脂质体外部来接近,因此其优选结合在外表面或插
入外部的脂双层中。靶向成分尤其可为肽、较大肽的区域、细胞表面分子
或标记物的特异性抗体或其抗原结合片段、核酸、糖类、复合糖的区域、
特异的脂、或与任一上述分子结合的小分子如药物、激素或半抗原。对细
胞类型特异性细胞表面标记物具特异性的抗体为本领域公知,并易于通过
本领域公知的方法制备。
可使LMS靶向治疗欲指向的任何细胞类型,如可调制和/或参与免疫
反应的细胞类型。此类靶细胞和器官包括但不限于APC如巨噬细胞、树突
细胞和淋巴细胞、淋巴结构如淋巴结和脾、以及非淋巴结构,尤其是那些
存在树突细胞的非淋巴结构。
本发明的LMS组合物还可包含表面活性剂。表面活性剂可为阳离子
的、阴离子的、两亲的或非离子的表面活性剂。表面活性剂的一种优选类
型为非离子表面活性剂;而尤其优选那些水溶性的。
在CIC和抗原通过与平台分子的连接而紧密联结的实施方案中,平台
可为蛋白样或非蛋白样(例如,合成的)价平台(valency platform)。适宜平台
的实例描述参见上文中有关用作CIC的间隔体结构部分的价平台的讨论。
抗原和价平台可通过常规方法连接。例如,多肽含有带官能团如氨基、羧
基或巯基基团的氨基酸侧链结构部分时,这些官能团可以作为多肽与平台
偶联的位点。如果多肽不包含这些基团,可将具有此类官能团的残基添加
至该多肽。此类残基可通过固相合成技术或重组技术掺入,这两种技术为
肽合成领域所熟知。当多肽具有糖侧链(或当抗原为糖)时,可通过常规
化学向其中掺入官能团氨基、巯基和/或醛基。例如,通过在氰基硼氢化钠
存在下使氧化糖与乙二胺反应,可掺入伯氨基基团;通过与半胱胺二盐酸
盐的反应然后用标准的二硫化物还原剂还原可掺入巯基;而醛基可在高碘
酸氧化后产生。如果平台分子不具有合适的官能团,也可以以类似方式衍
生平台分子以包含官能团。
在另一实施方案中,通过将CIC和抗原吸附至表面,例如毫微粒子或
微载体表面来实现两者的共施用。CIC和/或抗原可以通过非共价相互作用
(包括离子的和/或疏水的相互作用)吸附至表面。将多核苷酸和多肽吸附
至表面以便将所吸附的分子递送到细胞是本领域所熟知的。参见如Douglas
等人(1987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3:233-261;Hagiwara等人
(1987)In Vivo 1:241-252;Bousquet等人(1999)Pharm.Res.16:141-147;
和Kossovsky等人,美国专利5,460,831。优选地,含有吸附表面的材料是
可生物降解的。
总之,毫微粒子的特征如表面电荷、粒子大小和分子量取决于聚合过
程中的聚合条件、单体浓度和稳定剂的存在(Douglas等人,1987,同上引
文)。载体粒子的表面可通过如表面包被来修饰,以允许或促进CIC和/或
抗原的吸附。吸附了CIC和/或抗原的载体粒子可进一步用其它物质包被。
此类其它物质的添加如此处所述可例如在将粒子施用于对象后延长粒子的
半衰期,和/或可将粒子靶向特定的细胞类型或组织。
可吸附CIC和抗原的毫微结晶表面已有描述(参见如美国专利
5,460,831)。毫微结晶核心粒子(直径为1μm或更小)可以用促进多肽、多核
苷酸和/或其它药剂吸附的表面能量修饰层包被。如在美国专利5,460,831
中所述,例如核心粒子可以用促进寡核苷酸吸附的表面包被,接下来用抗
原制品包被,其中所述抗原制品为例如脂-抗原混合物形式。此类毫微粒子
为毫微米大小粒子的自我组装复合体,一般为0.1μm级,其带有CIC内层
和抗原外层。
另一吸表面为通过聚合烷基氰基丙烯酸酯而制备的毫微粒子。烷基氰
基丙烯酸酯可在酸化的水性介质中通过阴离子聚合法而聚合。根据聚合条
件,这些小粒子趋向于具有20至3000nm的尺寸,并且可制备具有特定
表面特征和特定表面电荷的毫微粒子(Douglas等人,1987,同上引文)。例如,
在存在疏水阳离子如氯化四苯鏻或季铵盐如溴化十六烷基三甲基铵时,寡
核苷酸可被吸附至聚异丁基氰基丙烯酸酯和聚异己基氰基丙烯酸酯毫微粒
子上。寡核苷酸吸附在这些毫微粒子上似乎是通过核酸链的带负电荷磷酸
基团和疏水阳离子之间形成的离子对介导的。参见如Lambert等人(1998),
生物化学(Biochimie)80:969-976,Chavany等人(1994)Pharm.Res.11:
1370-1378;Chavany等人(1992)Pharm.Res.9:441-449。多肽也可吸附在
聚烷基氰基丙烯酸酯毫微粒子上。参见如Douglas等人,1987;Schroeder
等人(1998)肽(Peptides)19:777-780。
另一吸表面为通过丙二酸亚甲酯聚合而制备的毫微粒子。例如,如
Bousquet等人,1999所述,多肽吸附至聚(丙二酸亚甲酯2.1.2)毫微粒子上
似乎最初是通过静电力然后是通过疏水力稳定来实现的。
C.其它佐剂
CIC也可与佐剂联用。与仅包含CIC和抗原的组合物所导致的免疫应
答相比,抗原与CIC和佐剂联合施用可导致对抗原的免疫应答增强,并由
此导致增强的免疫应答。佐剂为本领域公知,其包括但不限于水包油乳液、
油包水乳液、明矾(铝盐)、脂质体和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀
粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合适的佐剂还包括但不限于MF59、
DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆
菌细胞壁制品、单磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性
剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激复合体
(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344:873-875中描述的
那些免疫刺激复合体、以及基于脂的佐剂和本文描述的其它佐剂。对于兽
医用及在动物体内产生抗体,可使用弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)
的促有丝分裂成分。
IV.本发明方法
本发明提供了调制个体免疫应答的方法,其中个体优选地为哺乳动物,
更优选地为人,该方法包括施与个体此处所述的CIC。免疫调制可包括刺
激Th1-型免疫应答和/或抑制或降低Th2-型免疫应答。CIC以足以调制免
疫应答的量施用。如本文所述,免疫应答的调制可为对体液和/或细胞免疫
应答的调制,并且该调制可用本领域的标准技术及按此处所述测定。
许多个体适于接受本文所述的CIC。优选地(但非必需),个体为人。
在某些实施方案中,个体患有与Th2-型免疫应答相关的病症,例如(不
限于)变态反应或变态反应-诱导的哮喘、特应性皮炎、嗜酸性胃肠炎症、
嗜酸性食管炎和变应性支气管肺曲霉病。CIC的施用将导致免疫调制,提
高一种或多种与Th1-型应答相关的细胞因子的水平,这可导致与个体的变
应原应答相关的Th2-型应答特征的减少。对患有Th2-型应答相关病症的
个体的免疫调制可导致减轻或改善一个或多个疾病症状。如果病症为变态
反应或变态反应-诱导的哮喘,一个或多个症状的改善包括减轻一个或多个
以下症状:鼻炎、变应性结膜炎、循环IgE水平、循环组胺水平和/或对′
抢救性′吸入疗法(例如,通过计量给药吸入器或喷雾器而施用的吸入舒喘
灵)的需要。
在进一步的实施方案中,接受本发明免疫调制治疗的个体为接受疫苗
的个体。疫苗可为预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗包含与个体可能
有危险罹患的病症相关的一个或多个表位(例如,分枝结核杆菌抗原作为疫
苗用于预防结核病)。治疗性疫苗包含与影响个体的特定病症相关的一个或
多个表位,如结核病患者体内的分枝结核杆菌或牛结核分枝杆菌(M.bovis)
表面抗原、在产生变态反应的个体体内使个体产生变应性的抗原(即变态反
应脱敏疗法)、来自癌症患者的肿瘤细胞(例如,在美国专利号5,484,596中
所述)、或癌症患者的肿瘤相关抗原。CIC可以与疫苗联用(例如,与疫苗
一同注射或同时但分别注射)或CIC可分开施用(例如,在疫苗施用前或后
至少12小时)。在某些实施方案中,疫苗的抗原是CIC的一部分,该抗原
共价或非共价连接至CIC。与接受不包含CIC的疫苗的个体比较,对接受
疫苗的个体施用CIC治疗导致对疫苗的免疫应答移向Th1-型。向Th1-型
应答的偏移可通过如下来识别,即,出现对疫苗中抗原的迟发型超敏(DTH)
反应、升高的IFN-γ和其它Th1-型应答相关细胞因子、特异针对疫苗中
抗原的CTL的产生、特异针对疫苗中抗原的IgE水平的下降或减少、特
异针对疫苗中抗原的Th2-相关抗体的减少、和/或对疫苗中抗原具有特异性
的Th1-相关抗体的升高。在治疗性疫苗的情况下,CIC和疫苗的施用也可
导致疫苗所欲治疗的病症的一种或多种症状得以改善。正如本领域技术人
员显而易见的,改进的确切症状和改进的方式取决于所欲治疗的病症。例
如,当治疗性疫苗针对结核病时,用CIC与疫苗治疗导致咳嗽、胸膜或胸
壁痛、发烧和/或本领域公知的其它症状减轻。当疫苗为用于变态反应脱敏
疗法中的变应原时,所述治疗导致变态反应症状的减轻(例如,鼻炎、变应
性结膜炎减轻、循环IgE水平和/或循环组胺水平降低)。
本发明的其它实施方案涉及对已患有疾病或病症如癌症或感染性疾病
的个体的免疫调制治疗。癌症是有吸引力的进行免疫调制的靶标,因为大
多数癌表达肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原,这些抗原在体内其它细胞
上不存在。刺激针对肿瘤细胞的Th1-型应答将导致免疫系统通过直接和/
或旁观者方式杀伤肿瘤细胞,导致肿瘤细胞减少和/或症状减轻。将CIC
施用给患有癌的个体可导致刺激针对肿瘤细胞的Th1-型免疫应答。此免疫
应答通过细胞免疫系统的细胞(如CTL)或体液免疫系统的成分的直接作
用,或通过对免疫系统(包括巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞)的靶向细胞
的邻近细胞产生旁观者效应来杀伤肿瘤细胞。参见如Cho等人(2000),自
然生物技术(Nat.Biotechnol.)18:509-514。在治疗已经存在的疾病或病
症时,CIC可以与其它免疫治疗剂,如细胞因子、佐剂和抗体联用。例如,
CIC可以作为治疗方案的一部分给药,所述治疗方案包括施用结合肿瘤细
胞展示抗原的结合剂。结合剂的实例包括多克隆和单克隆抗体。靶抗原的
实例包括CD20、CD22、HER2和本领域已知的或有待将来发现的其它抗
原。不期望受理论的束缚,CIC被认为可以增强对结合剂相关肿瘤细胞的
杀伤作用(例如,通过增强抗体依赖性细胞毒性和/或效应子功能)。结合
剂可以任选地用例如可破坏结合剂所结合的细胞的放射性同位素或毒素标
记。CIC可以与该药剂联合(例如,同时)或在之前或之后(例如,施用
该药剂之前或之后不到24小时)给药。例如,在癌症的情况下,CIC可以
与已知或怀疑可用于治疗癌症的化疗剂联合施用。再如,CIC可以与放疗
或基因疗法等联合施用。此CIC可以是本文所述任何CIC。
根据本发明的免疫调制治疗也可用于患有感染性疾病的个体,其中感
染性疾病尤其是抵抗体液免疫应答的感染性疾病(例如,由分枝杆菌感染和
胞内病原体引起的疾病)。免疫调制治疗可用于治疗由细胞病原体(如细菌
或原生动物)或亚细胞病原体(如病毒)引起的感染性疾病。可将CIC治疗施
与患有分枝杆菌疾病的个体,其中所述疾病如结核病(例如,分枝结核杆菌
和/或牛结核分枝杆菌感染)、麻风病(即麻风分枝杆菌(M leprae)感染)或海
分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)感染。CIC治疗也可
用于治疗病毒性感染,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、
丙肝病毒、疱疹病毒尤其是单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒感染。由胞内寄生
虫引起的疾病也可受益于CIC治疗,所述疾病如疟疾(例如,间日疟原虫
(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、恶性疟原虫(P.falciparum)
和/或三日疟原虫(P.malariae)引起的感染)、利什曼病(例如,杜氏利什曼原
虫(Leishmania donovani)、热带利什曼原虫(L.tropica)、墨西哥利什
曼原虫(L.mexicana)、巴西利什曼原虫(L.braziliensis)、秘鲁利什曼
原虫(L.peruviana)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、L.chagasi和/或埃
塞俄比亚利什曼原虫(Leishmania aethiopica)引起的感染)、以及弓形体
病(即鼠弓形体(Toxoplasmosis gondii)引起的感染)。CIC治疗也可用于治
疗寄生虫病如血吸虫病(即由血吸虫属血吸虫如埃及血吸虫
(S.haematobium)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、日本血吸虫(S.japonicum)
和湄公血吸虫(S.mekongi)引起的血吸虫感染)和枝睾吸虫病(即由华支睾
吸虫(Clonorchis sinensis)引起的感染)。将CIC施与患有感染性疾病的
个体可导致感染性疾病的症状改善。在一些实施方案中,感染性疾病非病
毒性疾病。
本发明还提供了升高或刺激个体的至少一种Th1-相关细胞因子的方
法,其中所述Th1-相关细胞因子包括IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ和IFN-
α。在某些实施方案中,本发明提供了升高或刺激个体体内的IFN-γ的方
法,所述个体尤其是需要增高IFN-γ水平的个体,其方式是通过给个体施
用有效量的CIC使IFN-γ升高。需要增高IFN-y水平的个体为那些患有
一般对施用IFN-γ有反应的病症的个体。此类病症包括许多炎症,包括但
不限于溃疡性结肠炎。此类病症也包括许多纤维化病症,包括但不限于特
发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射引发的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血
吸虫病引发的肝纤维化)、肾纤维化以及其它可通过施用IFN-γ而改善的
疾病。施用本发明的CIC将导致IFN-γ水平升高,并导致响应IFN-γ的
病症的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定和/或病症发展
得以防止(例如,减轻或消除额外的损伤或症状)。本发明的方法可与组成
疾病护理标准的其它疗法联用,如在IPF中与施用抗炎剂诸如全身皮质类
固醇疗法(如考的松)联合。
在某些实施方案中,本发明提供了升高个体体内的IFN-α的方法,所
述个体尤其是需要增高IFN-α水平的个体,其方式是通过给个体施用有效
量的CIC从而升高IFN-α水平。需要增高IFN-α的个体为那些患有对施
用IFN-α(包括重组IFN-α)有反应的病症的个体,此类病症包括但不
限于病毒性感染和癌症。
施用本发明的CIC可导致IFN-α水平升高,并导致响应IFN-α的病
症的一种或多种症状得以改善、一种或多种症状得以稳定或病症的发展得
以防止(例如,减轻或消除额外的损伤或症状)。本发明的方法可与组成疾
病护理标准的其它疗法联用,如对于病毒性感染可与施用抗病毒剂联合。
基于本公开显而易见的是,CIC的间隔体组成可以影响CIC施用所引
起的免疫应答。实际上所有测试的间隔体(除了十二烷基外)均可以用于
CIC中有效地诱导人PBMC中的IFN-γ。然而,已经观察到线性CIC的
间隔体组成对IFN-α的诱导有不同影响。例如,含有如HEG、TEG或
C6间隔体的CIC与含有C3、C4或脱碱基间隔体的CIC相比倾向于在
PBMC中造成更高的IFN-α诱导(和减少的B细胞增殖)(参见,例如,
下文实施例34)。
本发明还提供了降低患有IgE-相关病症的个体体内的IgE水平,尤其
是血清IgE水平的方法,其方式是向个体施用有效量的CIC。在此类方法
中,CIC可单独施用(如,无抗原)或与抗原如变应原联合施用。IgE相关病
症是通过降低IgE水平可改善的疾病、病症或一组症状。IgE的降低将导
致IgE-相关病症的症状得以改善——此类症状包括变态反应症状(如鼻炎、
结膜炎)、对变应原的敏感性降低、发生变态反应的个体的变态反应症状
减轻或变态反应的严重程度降低。
本发明的方法包括以CIC/微载体复合体形式施用CIC的实施方案。
在一些实施方案中,本发明提供了刺激个体产生CTL的方法,该方法
包括给个体施用有效量的CIC从而提高CTL的产生。
对本领域技术人员显而易见的是,对于施用CIC治疗的特定适应症,
本发明的方法可与其它疗法联用。例如,CIC疗法可与抗疟疾药如氯喹联
用施与疟疾患者、可与杀利什曼原虫药如戊烷脒和/或别嘌呤醇联用施与利
什曼病患者、可与抗分枝杆菌药如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇联用施与
结核病患者、或可与变应原脱敏疗法联用施与特应性(变态反应)患者。
A.施用和评估免疫反应
如此处所述,CIC可与药剂和/或免疫原性剂和/或其它免疫刺激剂联
合施用,并可与其生理可接受载体组合。
例如,本发明CIC或组合物可以和其它免疫治疗剂如细胞因子、佐剂
和抗体联合施用。CIC可以与该药剂联合给药(例如,同时,或之前或之
后(例如,该药剂给药之前或之后不超过24小时)。CIC可以是此处所述
任何CIC。
如所有的免疫刺激性组合物一样,特定的CIC制剂的免疫学有效量和
施用方法可根据个体、欲治疗的疾病和为本领域技术人员显而易见的其它
因素的不同而不同。待考虑的因素包括共施用抗原的存在、CIC是否与佐
剂或递送分子联合施用或与它们共价连接、施用途径和欲施用的免疫给药
次数。此类因素为本领域公知,并且不用过多试验而对它们作出确定也属
于本领域技术人员的技术范围。合适的剂量范围是能为针对抗原的免疫应
答提供所需调制的剂量范围。通常,剂量由施用于患者的CIC的量而不是
由CIC的总量来确定。CIC的有用剂量范围(以递送的CIC的量给出)
可以例如大约为下列任一个:1至500μg/kg,100至400μg/kg,200至
300μg/kg,1至100μg/kg,100至200μg/kg,300至400μg/kg,400至500μg/kg。
施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除率和施用途
径。
特定的CIC制剂的有效量和施用方法可以根据患者个体和疾病阶段及
本领域技术人员明了的其它因素而改变。具体应用时的施用途径对本领域
技术人员是显而易见的。施用途径包括但不限于局部的、皮肤的、经皮肤
的、经粘膜的、表皮的、肠胃外的、肠胃的以及鼻咽的和肺的(包括经支
气管的和经肺泡的)施用途径。合适的剂量范围为这样的剂量范围,其可
提供足够的含有CIC的组合物,以致通过测定血液水平达到约1-10μM的
组织浓度。施与每一患者的绝对量取决于药理学特性如生物利用度、清除
率和施用途径。
如此处所述,APC和具有高浓度APC的组织为CIC的优选靶。因此,
将CIC施用至APC以相对高的浓度存在的哺乳动物皮肤和/或粘膜处是优
选的。
本发明提供了适用于局部应用的CIC制剂,包括但不限于生理可接受
的植入物、软膏、霜剂、洗剂和凝胶。局部施用可以例如通过其中分散有
递送系统的敷料或绷带来施用、或将递送系统直接施用入切口或开放性伤
口、或通过定向于目标位点的经皮肤施用装置来施用。其中分散有CIC的
霜剂、洗剂、凝胶或软膏适于用作局部软膏或伤口充填剂。
优选的皮肤施用途径为那些侵害最小的途径。这些方式中优选经皮递
送、表皮施用和皮下注射。在这些方式中,由于预计皮内组织中存在较高
浓度的APC,优选表皮施用。
经皮施用通过应用可使CIC透过皮肤并进入血流的霜剂、洗剂、凝胶
等来实现。适于经皮施用的组合物包括但不限于直接应用于皮肤或掺入保
护性载体如经皮载置(所谓″贴剂″)中的可药用混悬液、油、霜剂和软膏。
合适的霜剂、软膏等的实例可例如在Physician′s Desk Reference中找到。
对于经皮递送,离子电渗是一合适的方法。离子电渗递送可通过市售
的贴剂而完成,其中贴剂可以通过未破损皮肤持继递送它们的产物几天或
更长时间。该方法的使用使得药物组合物能以相对大的浓度受控递送、并
允许输注组合药物及同时使用吸收促进剂。
用于该方法中的示例性贴剂产品是Los Angeles,CA的General
Medical Company的商标为LECTRO PATCH的产品。该产品通过电子方
式维持贮库电极在中性pH并能适应于提供改变浓度的剂量以及连续地和/
或周期性地给药。贴剂的准备和使用应按照与LECTRO PATCH产品在一
起的、厂商印制的说明书进行;这些说明书在此引用作为参考。其它封闭
式贴剂体系也是合适的。
对于经皮肤递送,低频超声递送也是一合适的方法。Mitragotri等人
(1995)科学(Science)269:850-853。低频超声频率(约1MHz)的应用允许
治疗组合物(包括那些具有高分子量的治疗组合物)的总体受控递送。
表皮施用基本上涉及机械刺激或化学刺激最外层表皮,而且所述刺激
将足以激发对该刺激的免疫应答。具体而言,该刺激应足以将APC吸引至
刺激位点。
一个示例性的机械刺激方式使用多个直径非常狭窄的短齿,其可用于
刺激皮肤并将APC吸引至刺激位点以摄取从齿的末端转移出的CIC。例
如,法国Lyon的Pasteur Merieux生产的MONO-VACC旧结核菌素试验
包含适于导入包含CIC的组合物的装置。
该装置(由Swiftwater,PA的Connaught Laboratories,Inc.在美国供销)
由在一端具有注射器推进器和在另一端具有齿盘的塑料容器组成。齿盘上
固定着具有一定长度的多个直径狭窄的齿,以致其恰好能刮搔表皮的最外
层细胞。MONO-VACC试剂盒中的每个齿都包被有旧结核菌素;在本发
明中,每个针都包被有CIC制剂的药物组合物。该装置的使用优选按照包
括在该装置产品中的、厂商所写的说明书进行。在此实施方案中也可使用
的类似装置为目前用于实施变态反应试验的那些。
表皮施用CIC的另一合适方法是使用化学品,该化学品能刺激表皮的
最外层细胞,因此激发可吸引APC至该区域的足够的免疫应答。一个实例
为角质裂解剂,如由Noxema Corporation以商标NAIR卖出的市售局部
脱毛霜中使用的水杨酸。该方法也可用于实现粘膜的上皮施用。化学刺激
剂也可与机械刺激物联合应用(例如,如果MONO-VACC类齿也包被有化
学刺激剂,则存在此联合应用)。CIC可悬于还包含化学刺激剂的载体中或
与该化学刺激剂共施用。
肠胃外的施用途径包括但不限于电注射(离子电渗)或直接注射如直接
注射入中央静脉、静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注
射。适用于肠胃外施用的CIC制剂通常配制在USP水或注射用水中,并
且还可包含pH缓冲剂、盐填充剂、防腐剂和其它可药用赋形剂。用于肠
胃外注射的CIC可配制在可药用无菌等渗溶液如注射用盐水和磷酸盐缓冲
盐水中。
胃肠施用途径包括但不限于吞咽和直肠途径。本发明包括适于胃肠施
用的CIC制剂,包括但不限于用于吞咽给药的可药用粉剂、片剂或液体及
用于直肠施用的栓剂。对本领域技术人员显而易见的是:片剂或栓剂还将
包含可药用固体如淀粉,以填充组合物。
鼻咽的和肺的施用可通过吸入实施,并包括递送途径如鼻内途径、经
支气管途径和经肺泡途径。本发明包括适于吸入施用的CIC制剂,包括但
不限于用于形成气雾的液态悬浮剂及用于干粉吸入递送系统的粉剂。对于
吸入施用CIC制剂,适用的装置包括但不限于喷雾器、蒸发器、雾化器和
干粉吸入递送装置。
递送途径的选择可用于调制所引发的免疫应答。例如,当流感病毒载
体通过肌内或表皮(基因枪)途径施用时,IgG效价和CTL活性是相同的;
但是,肌肉接种主要产生IgG2a,而表皮途径主要产生IgG1。Pertmer等
人(1996),病毒学杂志(J.Virol.)70:6119-6125。因此,本领域技术人员
可利用本发明免疫调制性多核苷酸的不同施用途径所引发的免疫原性的轻
微差别。
上述组合物和施用方法旨在描述而不用于限制本发明CIC制剂的施用
方法。制备各种组合物和装置的方法在本领域技术人员的能力范围内,在
此不再详述。
针对CIG的免疫应答可以按任何本领域公知的方法进行分析(定性和
定量分析),包括但不限于测定抗原特异性的抗体产生(包括测定特异的抗
体+亚类)、特异淋巴细胞群如CD4+T细胞、NK细胞或CTL的活化、细
胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10或IL-12的产生和/
或组胺的释放。测定特异性抗体应答的方法包括酶联免疫吸附试验
(ELISA),并且为本领域熟知。特定类型淋巴细胞如CD4+T细胞数目的测
定可例如用荧光激活的细胞分选法(FACS)完成。细胞毒性和CTL试验可
例如如Raz等人(1994),美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
91:9519-9523和Cho等人(2000)所述进行。细胞因子浓度可例如通过
ELISA测定。这些和其它用于评估针对免疫原的免疫应答的试验为本领域
熟知。参见如细胞免疫学中的选择方法(Selected Methods in Cellular
Immunology)(1980)Mishell和Shiigi编辑,W.H.Freeman and Co.。
优选地,刺激,即引发和/或增强Th1-型应答。关于本发明,对Th1-
型免疫应答的刺激可通过体外或离体测定用CIC处理的细胞的细胞因子产
生并与未用CIC处理的对照细胞相比来确定。确定细胞的细胞因子产生的
方法包括那些本文中描述的方法及本领域公知的任何方法。响应CIC处理
产生的细胞因子的类型表明了细胞产生的是偏向Th1-型或Th2-型的免疫
应答。如此处所用,术语″偏向于Th1-型的″细胞因子产生是指在存在刺激
剂时Th1-型免疫应答相关细胞因子的产生与缺乏刺激时此类细胞因子的
产生相比,前者可测量地升高。此类偏向于Th1-型的细胞因子的实例包括
但不限于IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反,″偏向于Th2-型的细胞
因子″是指那些与Th2-型免疫应答相关的细胞因子,其包括但不限于
IL-4、IL-5和IL-13。可用于测定CIC活性的细胞包括免疫系统的细胞、
分离自宿主的原代细胞和/或细胞系,优选地为APC和淋巴细胞,甚至更
优选地为巨噬细胞和T细胞。
对Th1-型免疫应答的刺激也可在使用CIC处理的宿主中测定,并且
可用本领域公知的任何方法测定,包括但不限于:(1)与接触过抗原的或接
触过抗原并被攻击过的、未用CIC处理的对照比较,在CIC处理的宿主
中抗原攻击前后测定到IL-4或IL-5的水平降低;或检测到较低(或甚至没
有检测到)IL-4或IL-5水平;(2)与接触过抗原的、或接触过抗原并被攻
击过的未用CIC处理的对照比较,在CIC处理的宿主中抗原攻击前后
IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)的水平升高;或检测到较高的IL-12、
IL-18和/或IFN(α、β或γ)水平;(3)与未用CIC处理的对照比较,在
CIC处理的宿主中产生″偏向于Th1-型的″抗体;和/或(4)与接触过抗原的
或接触过抗原并被攻击过的、未用CIC处理过的对照比较,在CIC处理
的宿主中抗原攻击前后检测到抗原特异性IgE的水平降低;或检测到较低
(或甚至没有检测到)抗原特异性IgE的水平。这些测定中的许多可通过使
用此处描述的方法或任何本领域公知的方法体外或离体测量由APC和/或
淋巴细胞,优选地由巨噬细胞和/或T细胞产生的细胞因子来实现。这些测
定中的一些测定可通过使用此处描述的方法或任何本领域公知的方法测量
抗原特异性抗体的类和/或亚类来实现。
应答CIC处理所产生的抗原特异性抗体的类和/或亚类表明细胞产生
的是偏向于Th1-型或偏向于Th2-型的免疫应答。如此处所用,术语″偏向
于Th1-型的″抗体产生是指与Th1-型免疫应答相关的抗体(即Th1-相关抗
体)的产生可测定地升高。可测定一种或多种Th1相关抗体。此类偏向于
Th1-型的抗体的实例包括但不限于人IgG1和/或IgG3(参见如Widhe等人
(1998)Scand.J Immunol.47:575-581和de Martino等人(1999)
Ann.Allergy Asthma Immunol.83:160-164)和鼠IgG2a。相反,″偏向于
Th2-型的抗体″是指那些与Th2-型免疫应答相关的抗体,其包括但不限于
人IgG2、IgG4和/或IgE(参见如Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))
以及鼠IgG1和/或IgE。
由于施用CIC而发生的对偏向于Th1-型的细胞因子的诱导可导致增
强的细胞免疫应答,如那些由NK细胞、细胞毒杀伤细胞、Th1辅助细胞
和记忆细胞实施的免疫应答。这些应答用在抗病毒、真菌、原生动物寄生
虫、细菌、变应性疾病、哮喘及肿瘤的预防性或治疗性疫苗接种上尤其有
益。
在一些实施方案中,Th2应答被抑制。Th2应答的抑制可通过如Th2
相关细胞因子(诸如IL-4和IL-5)水平的降低及应答变应原的IgE的降低
和组胺释放的减少来确定。
V.本发明试剂盒
本发明提供了试剂盒。在某些实施方案中,本发明的试剂盒包含一个
或多个含有CIC的容器。试剂盒还可包含一套有关CIC的预期治疗应用(例
如,免疫调制、改善感染性疾病的症状、升高IFN-γ水平、升高IFN-α
水平、或改善IgE-相关病症)的适当说明书,通常为书面说明书。
试剂盒可包含包装在任何方便合适的包装中的CIC。例如,如果CIC
为干燥制剂(例如,冷冻干燥的或干粉),通常使用带弹性塞的小瓶,这样
通过弹性塞注入液体可容易地将CIC重悬。带有无弹性可摘取封口(如封
口玻璃)的安瓿或带有弹性塞的安瓿最适用于CIC的液体制剂。也可考虑
使用与特定的装置如吸入器、鼻施用装置(如喷雾器)或输注装置如微型泵
组合应用的包装。
有关CIC的应用的说明书通常包括针对预期治疗的剂量、给药方案及
施用途径的信息。CIC的容器可为单位剂量、大包装(如多剂量包装)或亚
单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书一般为书写在标签或包装插入物
(如,包括在试剂盒中的纸片)上的书面说明书,但可机读的说明书(如在磁
盘或光存储盘上携带的说明书)也可接受。
在一些实施方案中,试剂盒还包含抗原(或包含一种或多种抗原),该
抗原可与或不与CIC包装在同一容器(制剂)中。文中已描述了抗原。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒包含以CIC/微载体复合体
(CIC/MC)形式存在的CIC,并还可包含一套涉及该CIC/MC复合体的预
期治疗应用(例如,免疫调制、改善感染性疾病的症状、升高IFN-γ水平、
升高IFN-α水平、或改善IgE-相关病症)的说明书,通常为书面说明书。
在一些实施方案中,本发明的试剂盒包含用于产生CIC/MC复合体的
材料,通常包括分开装有CIC和MC的容器,但在某些实施方案中提供的
是用于产生MC的材料而不是预形成的MC。CIC和MC优选以如下形式
提供,所述形式允许所提供的CIC和MC在混合后可形成CIC/MC复合
体。当CIC/MC复合体通过非共价键连接时,优选这种配置。当CIC和
MC待通过异双官能交联剂交联时;当CIC或MC以″活化″形式(例如,
连接在异双官能交联剂上,这样可获得与CIC反应的结构部分)提供时,
也优选这种配置。
对于包含液相MC的CIC/MC复合体,试剂盒优选地包含一个或多个
容器,容器中含有用于产生液相MC的材料。例如,对于水包油的乳液
MC,CIC/MC试剂盒可包含一个或多个含有油相和水相的容器。乳化容
器中的内容物以产生MC,然后其可与CIC混合,优选地与已修饰而掺入
了疏水结构部分的CIC混合。此类材料包括用于产生水包油乳液的油和水,
或者包括含有冷冻干燥的脂质体成分(如磷脂、胆固醇和表面活性剂的混合
物)的容器加上含有水相(例如,可药用的水性缓冲液)的一个或多个容器。
VI.实施例
提供下列实施例来举例阐述而非限制本发明。
实施例1:多核苷酸和嵌合化合物的结构
表2显示的是实施例涉及的多核苷酸和嵌合分子的结构。″HEG″是六
聚乙二醇间隔体结构部分;″TEG″是三聚乙二醇;″C3″是丙基间隔体结
构部分;″C4″是丁基间隔体;″C6″是己基间隔体;″C12″是十二烷基间
隔体;“HME”是2-羟甲基乙基;″abasic″或″ab″是1′2′-二脱氧核糖。其
他间隔体见本说明书和附图中的描述。
除在表2和特定实施例中特别指出之处外,所有核苷酸连接及核酸结
构部分和间隔体结构部分间的连接都是硫代磷酸酯。例如,在包含具有多
个HEG或C3单元的复合(多亚单元)间隔体结构部分的CIC(如,C-13,
C-14,C-15,C-15,C-91,C-92,C-36,C-37,和C-38)中,C3或HEG单元
以硫代磷酸酯接头连接。类似地,所示的分支CIC(如,C-93,C-94,C-95,
C-96,C-97,C-98,C-100,C-101,C-103,C-104,C-121,C-122,C-123,C-124,
C-125,C-126,C-127,C-129,C-130)在间隔体的分支亚单元和线性亚单元之
间包含硫代磷酸酯接头。所示的其他分支CIC(如,C-26,C-99,C-102,
C-105,和C-137)是通过缀合策略制备的,具有如实施例中所述的连接基
团。
表2还包括具有末端连接基团(如,HS(CH2)6-和HO(CH2)6SS(CH2)6)的
CIC(如,C-128,C-106,C-113),此末端连接基因可用于连接这些CIC分子
和分支的间隔体部分以构建分支CIC。实例参见实施例18。这些连接基团
利用硫代磷酸酯键连接到CIC。
表2
测试化合物和多核苷酸
化合物
指定编号
结构
P-1
5’-TCGTCGA-3’
![]()
C-37
5’-TCGTCGA-3’-(HEG)4-3’-AGCTGCT-5’
C-38
5’-TCGTCGA-3’-(HEG)4-5’-TCGTCGA-3’
C-39
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-40
5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-TCGA-3’
C-41
5’-TCGTTTT-3’-HEG-5’-TCGTTTT-3’-HEG-5’-TCGTTTT-3’
C-42
5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TCGTCGT-3’
C-43
5’-TCGTC-3’-HEG-5’-TCGTC-3’-HEG-5’-TCGTC-3’-HEG-5’-TCGTC-3’
C-44
5’-TCGT-3’-HEG-5’-TCGT-3’-HEG-5’-TCGT-3’-HEG-5’-TCGT-3’-HEG-5’-
TCGT-3’
C-45
5’-TCGAGAT-3’-HEG-5’-TCGAGAT-3’-HEG-5’-TCGAGAT-3’
C-46
5’-TTCGTTT-3’-HEG-5’-TTCGTTT-3’-HEG-5’-TTCGTTT-3’
C-47
5’-TCGTCGT-3’-HEG-5’-TGTCGTT-3’-HEG-5 ’-TGTCGTT-3’
C-48
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-49
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-GGGGGG-3’
C-50
5’-TCGAACG-3’-HEG-5’-TCGAACG-3’-HEG-5’-TCGAACG-3’
C-51
5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’
C-52
5’-CGTTCGA-3’-HEG-5’-CGTTCGA-3’-HEG-5’-CGTTCGA-3’
C-53
5’-TGACTGTGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
C-54
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
C-55
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-56
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’
C-57
5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
C-58
5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-59
5’-AGATGAT-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’
C-60
5’-AGATGAT-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-61
5’-TCCATTT-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TGACGTT-3’
C-62
5’-TGACGTT-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCCATTT-3’
C-63
5’-TCGACTC-3’-HEG-5’-TCGAGCG-3’-HEG-5’-TTCTCTT-3’
C-64
5’-CTGTGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:83)-HEG-5’-
CTGTGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:83)
C-65
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-3’-AGCTGCT-5’
C-66
5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:41)-HEG-5’-
TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:41)
C-67
5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO:41)-HEG-3’-
GTAGAGCTTGCAAGCTGCT-5’(SEQ ID NO:41)
C-68
5’-TCG-3’-HEG-5’-T-3’
C-69
5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’-HEG-5’-TCGAT-3’
C-70
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-
AGAT-3’
C-71
5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-TCGACGT-3’-HEG-5’-
TCGACGT-3’
C-72
5’-TCCTCCA-3’-HEG-5’-ACCTTAG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’(无CG)
C-73
5’-ACGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTCGA-3’
C-74
5’-TCGATTT-3’-HEG-5’-TCGATTT-3’-HEG-5’-TCGATTT-3’
C-75
5’-TTCGATT-3’-HEG-5’-TTCGATT-3’-HEG-5’-TTCGATT-3’
C-76
5’-TTTCGAT-3’-HEG-5’-TTTCGAT-3’-HEG-5’-TTTCGAT-3’
C-77
5’-TTTTCGA-3’-HEG-5’-TTTTCGA-3’-HEG-5’-TTTTCGA-3’
C-78
5’-TCGCTTT-3’-HEG-5’-TCGCTTT-3’-HEG-5’-TCGCTTT-3’
C-79
5’-TCGGTTT-3’-HEG-5’-TCGGTTT-3’-HEG-5’-TCGGTTT-3’
C-80
5’-ACGATTT-3’-HEG-5’-ACGATTT-3’-HEG-5’-ACGATTT-3’
C-81
5’-ATCGAT-3’-HEG-5’-ATCGAT-3’-HEG-5’-ATCGAT-3’
C-82
5’-ATCGATT-3’-HEG-5’-ATCGATT-3’-HEG-5’-ATCGATT-3’
C-83
5’-AACGTT-3’-HEG-5’-AACGTT-3’-HEG-5’-AACGTT-3’
C-84
C397:5’-GsGs-3’-C3-5’-TGC-3’-C3-5’-ATCGAT-3’-C3-5’-GCA-3’-C3-5’-
GGsGsGsGsG-3’(s=硫代磷酸酯键,其它键是磷酸二酯键)
C-85
5’-GsGs-3’-C3-5’-TCGTGC-3’-C3-5’-ATCGAT-3’-C3-5’-GCACGA-3’-C3-5’-
GGsGsGsGsG-3’(s=硫代磷酸酯键,其它键是磷酸二酯键)
C-86
5’-TGCTGCA-3’-C3-5’-AGCTTGC-3’-C3-5’-AGATGAT-3’(No CG)
C-87
5’-GsGsGsGs-3’-C3-5’-ATCGAT-3’-C3-5’-TGATGCATCA-3’-C3-5’-
ATCGAT-3’-C3-5’-GsGsGsGsGsG-3’(s=硫代磷酸酯键,其它键是磷酸
C-88
5’-TCCA-3’-C3-5’-TGACGTT-3’-C3-5’-CCTGATGCT-3’
C-89
5’-TGACTGTGA-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-AGATGAT-3’
C-90
5’-TCGTCGA-3’-C3-5’-TCGTCGA-3’-C3-5’-TCGTCGA-3’
C-91
5’-TCG-3’-(ab)3-5’-T-3’
C-92
(ab)-5’-TCG-3’-(ab)2-5’-T-3’
C-93
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGTCGA-3’(磷酸二酯)
C-94
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-95
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-3’-AGCTGCT-5’
C-96
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’
C-97
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGA-3’
C-98
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)3-trebler-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGA-3’
C-99
TMEA-(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’)3(SEQ ID NO:139)(见
Ex.23)
C-100
(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’
TCGACGT-3’
C-101
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCGACGT-3’
C-102
Starburst Dendrimer_-(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’)x
(X范围=3-16)(SEQ ID NO:2)(见Ex.24)
C-103
(5’-TCGTCGA-3’-TEG)2-丙三醇-TEG-5’-TCGTCGA-3’
C-104
(5’-TCGTCGA-3’-C3)2-丙三醇-C3-5’-TCGTCGA-3’
C-105
TMEA-(S-(CH2)3-3’-TAGTAGA-5’-HEG-3’-GCTTGCA-5’-HEG-3’-
AGCTGCT-5’)3(见Ex.23)
C-106
HO(CH2)6SS(CH2)6-5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID
NO:140)
C-107
HS(CH2)6-5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:141)
C-110
HO(CH2)6SS(CH2)6-5’-TCGTCG-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-
3’
C-111
HS(CH2)6-5’-TCGTCG-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-3’
C-112
HO(CH2)6SS(CH2)6-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-
AGATGAT-3’
C-113
HS(CH2)6-5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
C-114
5’-TCGTCGA-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-3’-C3-
(CH2)3SS(CH2)3OH
C-115
5’-TCGTCGA-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-3’-C3-(CH2)3SH
C-116
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-
(CH2)3SS(CH2)3OH
C-117
5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-(CH2)3SH
C-118
5’-TCGTCGA-3’-HEG-C3-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
C-119
5’-TCGA-3’-HEG-5’-TCGA-3’-HEG-5’-TCGA-3’-HEG-5’-TCGA-3’-HEG-5’-
TCGA-3’
C-120
5’-TCGTCG-3’-C6-5’-ACGTTCG-3’-C6-5’-AGATGAT-3’
C-121
(5’-AACGTT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTT-3’
C-122
(5’-TCAACGTT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-TCAACGTT-3’
C-123
(5’-TCGTCGA-3’-HFG-HEG)2-丙三醇-HEG-HEG-5’-TCGTCGA-3’
C-124
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-对称doubler-HEG-5’-TCGACGT-3’
C-125
(5’-TCGACGT-3’-HEG)3-trebler-HEG-5’-TCGACGT-3’
C-126
((5’-TCGACGT-3’-HFG)2-丙三醇-HEG)2-丙三醇-HFG-5’-TCGACGT-3’
C-127
(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-AACGTTC-3’
C-128
HO(CH2)6SS(CH2)6-5’-TCGTCGA-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-
AGATGAT-3’
C-129
((5’-TCGACGT-3’-HEG)2-丙三醇-HEG)2-丙三醇-HEG-5’-T-3’
C-130
(5’-TCGACGT-3’-HEG)3-trebler-HEG-5’-T-3’
C-131
5’-TCGTCGA-3’-C4-5’-ACGTTCG-3’-C4-5’-AGATGAT-3’
C-132
5’-TCGTCGA-3’-C6-5’-ACGTTCG-3’-C6-5’-AGATGAT-3’
C-133
5’-TCGTCGA-3’-TEG-5’-ACGTTCG-3’-TEG-5’-AGATGAT-3’
C-134
5’-TCGTCGA-3’-PEG-5’-ACGTTCG-3’-PEG-5’-AGATGAT-3’
[PEG=(CH2CH2O)45]
C-135
5’-TCGACGT-3’-HEG-(CH2)3SS(CH2)3OH
C-136
5’-TCGACGT-3’-HEG-(CH2)3SH
C-137
(5’-TCGACGT-3’-HEG)x-Ficoll400(X范围=150-250,平均185)
参见实施例49
实施例2:合成具有线性结构和六聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-10。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是六聚乙二醇(HEG),后者通过硫代磷酸酯键连接到
核酸结构部分。
C-10:5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′
C-10分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosvstems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺
(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。(对
本领域普通的技术人员来说显然的是,本文有时(如在CIC合成的上下文
中)所用的术语“核苷单体”或“间隔体结构部分”指的是这样的前体试
剂——如果利用如此处公开的合成方法使其脱保护并连接到其他成分上后
可生成CIC的核酸和非核酸结构部分)。将HEG间隔体前体置于仪器的
辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和
HEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′与载体结合的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、
加帽步骤、利用0.05M的3H-1,2-苯并二硫杂环戊烷-3-酮1,1-二氧化物
(Beaucage试剂)进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。完成组装后,将
脱掉三苯甲基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应
16小时对碱基脱保护。此化合物利用制备性聚丙烯酰胺电泳进行纯化,在
Sep-pak Plus柱(Waters,Milord,MA)上脱盐,再以2.5体积的95%乙醇从
1M氯化钠水溶液中沉淀出来。将分子溶于Milli Q水中,从260nm下的
吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。通过毛细管凝胶电
泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成
和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试验,Bio Whittaker),结
果显示内毒素水平<5EU/mg化合物(即,基本上无内毒素)。
C-8,C-21,C-22,C-23,C-24,C-32和M-1以及其他线性HEG-CIC
类似地进行合成。
实施例3:合成具有线性结构和丙基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-11。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是丙基(C3),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部
分。
C-11:5′-TCGTCG-3′-C3-5′-ACGTTCG-3′-C3-5′-AGATGAT-3′
C-11分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自
Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C3间
隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺
序加入核苷酸单体和C3间隔体,并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行
合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C3间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C3间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
C-9和其他含C3的CIC类似地进行合成。
实施例4:合成具有线性结构和丁基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-17。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是丁基(C4),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部
分。
C-17:5′-TCGTCG-3′-C4-5′-ACGTTCG-3′-C4-5′-AGATGAT-3′
C-17分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-丁基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自
ChemGenes,Ashland,MA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C4间隔
体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序
加入核苷酸单体和C4间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合
成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C4间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C4间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例5:合成具有线性结构和三聚乙二醇间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-18。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是三聚乙二醇(TEG),后者经硫代磷酸酯键连接到核
酸结构部分。
C-18:5′-TCGTCG-3′-TEG-5′-ACGTTCG-3′-TEG-5′-AGATGAT-3′
C-18分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作方案进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-三聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺
(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将
TEG间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需
要的顺序加入核苷酸单体和TEG间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方
向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加TEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加TEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例6:合成具有线性结构和十二烷基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-19。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是十二烷基(C12),后者经硫代磷酸酯键连接到核酸
结构部分。
C-19:5′-TCGTCG-3′-C12-5′-ACGTTCG-3′-C12-5′-AGATGAT-3′
C-19分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-十二烷基-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺
(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将
C12间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需
要的顺序加入核苷酸单体和C12间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方
向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加C12间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加C12间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例7:合成具有线性结构和脱碱基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-20。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是1′,2′-二脱氧核糖(脱碱基,abasic),后者经硫代
磷酸酯键连接到核酸结构部分。
C-20:
5′-TCGTCG-3′-abasic-5′-ACGTTCG-3′-abasic-5′AGATGAT-3′
C-20分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体——
5′-O-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-1′,2′-二脱氧核糖-3′-O-(N,N-二异丙基)
2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,
终浓度0.05M。将脱碱基间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进
行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和脱碱基间隔体并使核酸结
构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加脱碱基间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加脱碱基间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例8:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体的嵌
合化合物
合成具有如下所示结构的C-29。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的六聚乙二
醇(HEG),而3′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的三聚乙
二醇(TEG)。
C-29:
5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-29分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可
控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构
部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰
乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓
度0.05M。将HEG间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化
以便以所需要的顺序加入核苷单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿着
3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例9:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体的嵌
合化合物
合成具有如下所示结构的C-30。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,间隔体结构部分和5′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部
分的六聚乙二醇(HEG),而3′-末端基团是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构
部分的三聚乙二醇(TEG)。
C-30:
HEG-5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-30分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可
控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构
部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰
乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓
度0.05M。将HEG间隔体前体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程
序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HEG间隔体并使核酸结构部
分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
7.添加HEG间隔体
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
实施例10:合成具有线性结构和六聚乙二醇及三聚乙二醇间隔体并
具有磷酸二酯键的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-31。核酸结构部分是具有磷酸二酯键的
DNA,间隔体结构部分和5′-末端基团是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分
的六聚乙二醇(HEG),而3′-末端基团是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分
的三聚乙二醇(TEG)。
C-31:
HEG-5′-TCGTCG-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-3′-TEG
C-31分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol磷酸二酯
DNA的厂商操作程序进行合成。作为固相载体用于合成的三聚乙二醇-可
控多孔玻璃来自Glen Research(Sterling,VA)。将核苷单体和间隔体结构
部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰
乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙腈,终浓
度0.05M。将HEG间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化
以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HEG间隔体并使核酸结构部分沿
着3′至5′方向进行合成。
1.利用三聚乙二醇固相载体
2.合成5′-AGATGAT-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
7.添加HEG间隔体
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、
加帽步骤、氧化步骤和最后的加帽步骤组成。完成组装后,将脱掉三苯甲
基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱
基脱保护。此化合物利用制备性聚丙烯酰胺电泳进行纯化,在Sep-pak Plus
萃取柱(Waters,Milford,MA)上脱盐,再用2.5体积的95%乙醇从1M氯
化钠水溶液中沉淀出来。将此化合物溶于Milli Q水中,从260nm下的吸
光度确定其产量。最后,将此化合物冻干形成粉末。通过毛细管凝胶电泳、
电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物进行表征以确证其组成和纯
度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试验,Bio Whittaker),结果
显示内毒素水平<5EU/mg化合物。
实施例11:合成具有线性结构和2-(羟甲基)乙基间隔体的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-25。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是2-(羟甲基)乙基(HME),后者经硫代磷酸酯键连
接到核酸结构部分。
C-25:
5′-TCGTCG-3′-HME-5′-ACGTTCG-3′-HME-5′-AGATGAT-3′
C-25分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体
1-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-3-O-乙酰丙酰基-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA)溶解于无水乙腈,
终浓度0.05M。将HME间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程
序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和HME间隔体并使核酸结构部
分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加HME间隔体
4.合成5′-ACGTTCG-3′结构部分
5.添加HME间隔体
6.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。在
用氨进行处理的过程中乙酰丙酰基基团被除去。
实施例12:合成具有线性结构和带负电荷的间隔体结构部分的嵌合化
合物
合成具有如下所示结构的C-13。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的丙基(C3)聚合物。
C-13:5′-TCGTCG-3′-(C3)15-5′-T-3′
C-13分子在Perseptive Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上
利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单
体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶解于无水乙
腈,终浓度0.1M。将C3间隔体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程
序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C3间隔体并使核酸结构部分
沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.添加15个C3间隔体
3.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、
加帽步骤、在9∶1乙腈:吡啶中用0.02M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)
进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。组装完成后,将带有三苯甲基的
化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱基脱
保护。此化合物利用0.1M醋酸三乙基铵中的逐渐增加的乙腈梯度在
Hamilton PRP-1柱上通过HPLC进行纯化。将纯化的化合物浓缩至干燥,
用80%醋酸水溶液处理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后用2.5体
积95%乙醇从1M氯化钠水溶液中将此化合物沉淀两次。将此化合物溶于
Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干
形成粉末。
通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物
进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL试
验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5EU/mg化合物。
C-14,C-15和C-16类似地合成。
实施例13:合成具有线性结构和带负电荷的间隔体结构部分的嵌合
化合物
合成具有如下所示结构的C-38。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的六聚乙二醇(HEG)。
C-38:5′-TCGTCGA-3′-(HEG)4-5′-TCGTCGA-3′
C-38分子按照实施例2中所述进行合成。间隔体结构部分前体是4,
4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰
胺(来自Glen Research,Sterling,VA)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
3.添加4个HEG间隔体
4.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2
中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例14:合成具有线性结构和通过3’-末端连接两个核酸结构部分
的带负电荷间隔体结构部分的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-37。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接的六聚乙二醇(HEG)。
C-37:5′-TCGTCGA-3′-(HEG)-3′-AGCTGCT-5′
C-37分子按照实施例2中所述进行合成,但合成中利用了5′-结合载
体的核苷和3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异
丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)来合成第一个核酸
结构部分。间隔体结构部分前体是4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇
-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,
VA)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用5′-结合载体的“T”固相载体
2.用3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺合成3′-AGCTGC-5′结构部分(5′至3′合成)
3.添加4个HEG间隔体
4.用5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺合成5′-TCGTCGA-3′结构部分(3′至5′合成)
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2
中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例15:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-27。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是丙三醇,后者经硫代磷酸酯键连接到核酸结构
部分。
C-27:(5′-TCGTCGA-3′)2-丙三醇-5′-AACGTTC-3′
C-27分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA时的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体1,
3-二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基
亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的对称分支亚磷酰胺,图2)溶
解于无水乙腈,终浓度0.05M。将丙三醇间隔体置于仪器上的辅助单体位
置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和丙三醇间隔
体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“C”固相载体
2.合成5′-AACGTT-3′结构部分
3.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
4.同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的程序进行,除了在
步骤4中由于同时构建两个核酸链所以合成循环中每种试剂的递送量加
倍。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在加入该对称分支亚磷酰胺之后
合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍后合
成的序列可以是相同或不同的。
按照实施例2中所述对分支化合物进行纯化和表征。
C-28类似合成。
实施例16:合成具有分支结构且全部核酸结构部分通过3′-末端连接的
嵌合化合物。
合成具有如下所示结构的C-95。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键
的DNA,而间隔体结构部分是丙三醇和HEG,它们经硫代磷酸酯键连接
到核酸结构部分。
C-95:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)2-丙三醇-HEG-3′-AGCTGCT-5′
C-95分子按照实施例2中所述进行合成,但第一个核酸结构部分利
用5′-结合载体的核苷和3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-
(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)合成。分
支间隔体结构部分的前体是1,3-二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三
醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA
的对称分支亚磷酰胺,图2)。合成通过实施下列步骤来完成:
1.利用5′-结合载体的“T”固相载体
2.用3′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5′-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺合成3′-AGCTGC-5′结构部分(5′至3′合成)
3.添加HEG间隔体
4.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
5.同时添加两个HEG间隔体
6.用5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3′-O-(N,N-二异丙
基)2-氰乙基亚磷酰胺同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分(3′至5′合
成)
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的程序进行,除了在
步骤5和6中由于同时构建两个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是
双倍量。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在该对称分支亚磷酰胺加入
之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍
后合成的序列可以是相同或不同的。
利用如实施例12中所述的HPLC对此化合物进行纯化。按照实施例2
中所述对此化合物进行表征及内毒素含量测定。
实施例17:合成具有分支结构且含有三个不同核酸结构部分的嵌合
化合物。
合成具有如下所示结构的C-35。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三
醇。
![]()
C-35分子按照实施例2中所述进行合成。将核苷单体和间隔体结构
部分前体1-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-3-O-乙酰丙酰基-丙三醇-2-O-(N,
N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的不对称
分支亚磷酰胺,图2)溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将丙三醇间隔体
置于仪器上辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核
苷酸单体和丙三醇间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“T”固相载体
2.合成5′-AGATGA-3′结构部分
3.添加基于丙三醇的不对称分支亚磷酰胺
4.在二甲氧基三苯甲基端合成5′-AACGTTC-3′结构部分
5.脱三苯甲基并对AACGTTC结构部分加帽。
6.除去乙酰丙酰基保护基团
7.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
合成基本上按照实施例2中所述进行,但是在步骤4之后,使
5′-AACGTTC-3′结构部分脱三苯甲基并用乙酸酐/N-甲基咪唑进行加帽以
将此核酸结构部分封端。下一步,在3∶2吡啶:乙酸/pH 5.1中用0.5M水
合肼处理5分钟除去乙酰丙酰基保护基团。含化合物的固相载体用无水乙
腈充分洗涤,并利用实施例2中所述的方案添加5′-TCGTCGA-3′结构部
分。
按照实施例2中所述对此分支化合物进行纯化和表征。
实施例18:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
如图3所示合成C-36。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的DNA,
间隔体结构部分基于STARBURST_树状体。合成带有5′-C6-二硫化物间
隔体(巯基修饰剂C6 S-S,Glen Research,Sterling,VA产品编号
10-1926-xx)的核酸结构部分,此二硫化物间隔体一经还原可提供能够与树
状体上的顺丁烯二酰亚胺基团反应的巯基。
5′-C6-二硫化物-TCGTCGA(4)的合成:
5′-C6-二硫化物-TCGTCGA可以使用Perseptive Biosystems Expedite
8909自动DNA合成仪并利用合成1μmol硫代磷酸酯DNA的厂商操作程
序进行合成。将核苷单体和巯基修饰剂C6 S-S(Glen Research,Sterling,
VA)溶解于无水乙腈,终浓度0.1M。将巯基修饰剂置于仪器的辅助单体
位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和巯基修饰
剂并使核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCG-3′结构部分
3.添加巯基修饰剂前体(S-三苯甲基-6-巯基己基-(2-氰乙基)-(N,N-二
异丙基)亚磷酰胺)。
此合成循环由脱三苯甲基步骤、偶联步骤(亚磷酰胺单体加1H-四唑)、
加帽步骤、在9∶1乙腈:吡啶中用0.02M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮
(ADTT)进行的硫化步骤和最后的加帽步骤组成。组装完成,将带有三苯甲
基的化合物从可控多孔玻璃上切离下来并用浓氨水58℃反应16小时对碱
基脱保护。此化合物利用0.1M醋酸三乙基铵中的乙腈的递增梯度在
Hamilton PRP-1柱上通过HPLC进行纯化。将纯化的化合物浓缩至干燥,
用80%醋酸水溶液处理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后以2.5体
积95%乙醇从1M氯化钠水溶液中将此化合物沉淀两次。将此化合物溶于
Milli Q水中,从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将此化合物冻干
形成粉末。
通过毛细管凝胶电泳、电喷射质谱分析法、和RP-HPLC对此化合物
进行表征以确证其组成和纯度。此外,还进行内毒素含量测试试验(LAL
试验,Bio Whittaker),结果显示内毒素水平<5EU/mg化合物。
5 ′-巯基-C6-TCGTCGA(5)的合成:
利用三(2-羧乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)将二硫化物
修饰的核酸(4)还原成硫醇。使核酸以20mg/ml的浓度溶解于含有0.1M
磷酸钠/0.15M氯化钠/pH 7.5的缓冲液中。在另一小瓶中,使TCEP以
0.17M的浓度溶解于0.1M磷酸钠/0.15M氯化钠/pH 7.5中。将5当量
TCEP加入核酸中并轻轻混合。此溶液在40℃孵育120分钟,然后通过分
子大小排阻层析(Pharmacia P2柱)进行纯化产生5′-巯基-C6-TCGTCGA
(5)。
顺丁烯二酰亚胺修饰的STARBURST_树状体(7)的合成:
具有不同数目(4,8,16,32,64等)胺的STARBURST_树状体可从
Aldrich(Milwaukee,WI)获得。将具有四个氨基基团的STARBURST_树
状体(6)以0.2M的浓度溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中。然后加入三乙基胺
(10当量)和4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰
亚胺基酯(磺基-SMCC;Pierce,Rockford,IL,8当量)并对溶液进行搅拌2
小时或直到反应完成,这一点可利用薄层层析(TLC;10%甲醇/二氯甲烷)
来确定。反应用水淬灭30分钟之后在真空状态下除去DMF。将剩余物溶
解于二氯甲烷,用饱和重碳酸钠水溶液洗涤两次再用水进行洗涤。使有机
相经过MgSO4干燥、过滤、并在真空状态下浓缩至干。产物经硅胶层析纯
化产生出
7。
STARBURST_树状体-(5′-TCGTCGA-3′)4(8)的合成:
将顺丁烯二酰亚胺修饰的STARBURST_树状体(6)溶解于DMSO
(5mg/ml)并向此溶液中滴加以10mg/ml浓度溶于0.1M磷酸钠/0.15M
氯化钠/pH 7.5中的纯化5′-C6-巯基-TCGTCGA(5)(10当量)。所得混合物
在40℃下搅拌过夜。通过分子大小排阻层析(Sephadex G-25)纯化缀合物产
生出化合物
8。
实施例19:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-94。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三
醇。
C-94:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)2-丙三醇-HEG-5′-TCGTCGA-3′
C-94分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作程序进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分前体[1,3-
二-(4,4′-O-二甲氧基三苯甲基)-丙三醇-2-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基
亚磷酰胺(来自ChemGenes,Ashland,MA的对称分支亚磷酰胺,图2)和
4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰
胺(来自Glen Research,Sterling,VA)]溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。
将丙三醇和HEG间隔体置于仪器上辅助单体位置。对仪器进行程序化以
便以所需要的顺序加入核苷酸单体、HEG间隔体和丙三醇间隔体并使核酸
结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGTCGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.添加基于丙三醇的对称分支亚磷酰胺
5.同时添加两个HEG间隔体
6.同时合成两个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的方案进行,除了在
步骤5和6中由于同时构建两个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是
双倍量。如图2所示的对称分支亚磷酰胺要求在加入该对称分支亚磷酰胺
之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核酸序列与稍
后合成的序列可以是相同或不同的。
此分支化合物通过实施例12中所述HPLC进行纯化并按照实施例2
中所述进行表征。
C-96和C-101类似地进行合成。
C-103和C-104也通过相同方法合成,但其中分别利用三聚乙二醇
或丙基间隔体代替六聚乙二醇间隔体。
实施例20:合成具有分支结构的嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-98。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键的
DNA,而间隔体结构部分是经硫代磷酸酯键连接到核酸结构部分的丙三
醇。
C-98:(5′-TCGTCGA-3′-HEG)3-三倍增体-HEG-5′-AACGTTC-3′-
HEG-5′-TCGA-3′
C-98分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商操作方案进行合成。将核苷单体和间隔体结构部分[三倍增体
亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)和4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-
六聚乙二醇-O-(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,
Sterling,VA)]溶解于无水乙腈,终浓度0.05M。将三倍增体和HEG间隔
体置于仪器的辅助单体位置。对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入
核苷酸单体、HEG间隔体和三倍增体间隔体并使核酸结构部分沿着3′至5′
方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“A”固相载体
2.合成5′-TCGA-3′结构部分
3.添加HEG间隔体
4.合成5′-AACGTTC-3′结构部分
5.添加HEG间隔体
6.添加三倍增体亚磷酰胺(参见图2)
7.同时添加三个HEG间隔体
8.同时合成三个5′-TCGTCGA-3′结构部分
此分支化合物的制备按照与实施例2中所述同样的方案进行,但是在
步骤7和8中由于同时构建3个核酸链所以输入合成循环中的每种试剂是
三倍的量。如图2所示的对称三倍增体亚磷酰胺要求在加入该对称三倍增
体亚磷酰胺之后合成的核酸序列必须是相同的,但在它加入之前合成的核
酸序列与稍后合成序列可以是相同或不同的。
此分支化合物通过实施例12中所述HPLC进行纯化并按照实施例2
中所述进行表征。
实施例21:合成具有六聚乙二醇间隔体和3′-巯基接头的线性嵌合化合
物
首先合成含3′-巯基接头的CIC并以其二硫化物衍生物的形式进行纯
化。然后还原二硫基产生出反应性巯基基团。举例来说,为合成C-116,
首先按照实施例2所述合成C-8,但此合成中以3′-巯基修饰剂C3S-S CPG
(Glen Research,Sterling,VA)代替“T”固相载体作为固相载体。
C-116:5′-TCGTCGA-3′-HEG-5′-ACGTTCG-3′-HEG-5′-AGATGAT-
3′-(CH2)3SS(CH2)3OH
应明了,C-116可表示为[C-8]-3′-二硫化物。此CIC通过如实施12
中所述的HPLC进行纯化。此化合物按照实施例2所述进行表征。
利用三(2-羧基乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)将C-116
还原成硫醇。使C-116以30.5mg/ml的浓度(0.8ml,24.4mg;3.14umol)溶
解于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/1mM EDTA/pH 7.4缓冲液中。在另
一瓶中,使TCEP以0.167M的浓度溶解于100mM磷酸钠/150mM氯
化钠/1mM EDTA/pH 7.4缓冲液中。将5当量(100ul,4.8mg,17umol)的
TCEP储液加入到CIC溶液中。轻轻混合此溶液,在40℃孵育120分钟,
并在Sephadex G-25柱(5ml,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)上
纯化产生出C-117(13.2mg)。应明了,C-117可表示为[C-8]-3′-巯基。此
CIC通过如实施12中所述的HPLC进行纯化。
C-115类似地从C-114合成出来。
实施例22:合成具有丙基间隔体和5′-巯基接头的线性嵌合化合物
首先合成含5′-巯基接头的CIC并以其二硫化物衍生物的形式进行纯
化。然后还原二硫基产生出反应性巯基基团。化合物C-110(如下)可表示
为5′-二硫化物-C-11。化合物C-111可表示为5′-巯基-C-11.
C-110:HO(CH2)6SS(CH2)6-5′-TCGTCG-3′-C3-5′-ACGTTCG-3′-C3-5′
-AGATGAT-3′
C-110按照实施例3中所述进行合成,但合成中利用巯基修饰剂C6S-S
(Glen Research,Sterling,VA)进行最后的偶联。此CIC通过实施例12中
所述的HPLC进行纯化。按照实施例2中所述对此化合物进行表征。按照
实施例22中所述利用三(2-羧基乙基膦)盐酸盐(TCEP;Pierce,Rockford,IL)
将C-110还原成硫醇。
C-107,C-113和P-16类似地进行合成。
实施例23:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
C-105按照图4所示进行合成。三(2-顺丁烯二酰亚氨基乙基)胺
(TMEA,Pierce,Rockford,IL)以浓度4.3mg/ml溶解于二甲基甲酰胺
(DMF)。将TMEA溶液(12ul,52ug,1.0当量)添加到溶于100mM磷酸
钠/150mM氯化钠/1mM EDTA/pH 7.4缓冲液中的C-117溶液(237ul,
4.0mg,4.0当量)中并充分混合。此溶液在室温下放置过夜之后在Superdex
200柱(24ml,Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)上在10mM磷酸钠
/141mM氯化钠/pH 7.0缓冲液中进行纯化。产品经真空干燥,溶于0.4ml
的Milli Q水中,并用1.0ml的95%乙醇进行沉淀。在-20℃冷冻1小
时后,混合物离心(14K RPM下2分钟),小心去除上清液。将沉淀溶于
0.35ml的Milli Q水并测定C105的浓度(分离出0.4mg)。按照实施例
2中所述对此化合物进行分析。
C-99类似地进行合成。
实施例24:通过缀合策略合成分支结构的嵌合化合物。
A.顺丁烯二酰亚氨基-STARBURST树状体_2代的合成
含有16个羟基基团的STARBURST树状体_2代以20%甲醇溶液的
形式购自Aldrich(Milwaukee,WI)。树状体(191ul,38.2mg,11.7umol)经
真空干燥,重新溶于200ul的DMF中并再次经过真空干燥以除去最后的
微量甲醇。为制备顺丁烯二酰亚氨基-树状体,在单独的玻璃瓶中将N-(对顺
丁烯二酰亚氨基苯基)异氰酸酯(PMPI,50mg,233.5umol)溶于200ul的
DMF,然后快速将其添加到树状体中。涡旋混合物直到树状体被溶解。将
溶液置于旋转式混合仪上室温下过夜。溶液经真空浓缩,溶于20%甲醇/
二氯甲烷(1ml),并在7.5g硅胶柱(70-230目,60A)上在20%甲醇/二氯甲
烷中进行纯化。顺丁烯二酰亚氨基-树状体产物在第一个级分(由于存在残
余的DMF)中从柱上洗脱下来并且不含PMPI副产物。此产物经浓缩变成
棕褐色固体(10mg,13%产率)。
B.STARBURST树状体_-(5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA)X=3-16
(SEQ ID NO:2)(C-102)的合成
顺丁烯二酰亚氨基-树状体(5.7mg)溶于二甲基亚砜(DMSO)形成
浓度2.5mg/ml的储液。将顺丁烯二酰亚氨基-树状体储液(100ul,0.25mg,
0.0375umol)加入到溶于100mM磷酸钠/150mM氯化钠/1mMEDTA/pH
7.4缓冲液的C-107(9.1mg,1.2umol)的溶液(0.7ml)中。将溶液置于旋转混
合仪上室温下过夜,产物在Superdex 200柱(24ml,Amersham
Pharmacia,Piscataway,NJ)上在10mM磷酸钠/141mM氯化钠/pH 7.0缓冲
液中进行纯化。产物在10.4分钟在空隙体积中洗脱(1.3mg)。经在1.2%琼
脂糖E-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上的分析发现此化合物是多种高
分子量物质的混合物,其代表着树状体上多核苷酸的不同载荷量。C-102
跑电泳呈现为1kb至大于15kb(与双链DNA标记分子比较的有效大小)
的产物的混合物。
实施例25:合成具有丙基间隔体和混合的磷酸二酯键/硫代磷酸酯键
的线性嵌合化合物
合成具有如下所示结构的C-84。核酸结构部分是具有硫代磷酸酯键
(以小写字母“s”表示)或磷酸二酯键(所有其他的键)的DNA,间隔
体结构部分是经磷酸二酯键连接到核酸结构部分的丙基(C3)。
C-84:5′-GsGs-3′-C3-5′-TGC-3′-C3-5′-ATCGAT-3′-C3-5′-GCA-3′-C3-
5′-GGsGsGsGsG-3′(其中小写字母″s″表示硫代磷酸酯键而其他键是磷酸
二酯键)
C-84分子由TriLink BioTechnologies(SanDiego,CA)在Perseptive
Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上利用合成1μmol硫代磷酸酯
DNA的厂商方案进行合成。利用大写字母为碱基安排硫代磷酸酯键程序,
利用小写字母为碱基安排磷酸二酯键程序,辅助位置含有丙基间隔体亚磷
酰胺。
将核苷单体和间隔体结构部分前体4,4′-O-二甲氧基三苯甲基-丙基-O-
(N,N-二异丙基)2-氰乙基亚磷酰胺(来自Glen Research,Sterling,VA)溶
解于无水乙腈,终浓度0.05M。将C3间隔体置于仪器上辅助单体位置。
对仪器进行程序化以便以所需要的顺序加入核苷酸单体和C3间隔体并使
核酸结构部分沿着3′至5′方向进行合成。
1.利用3′-结合载体的“G”固相载体
2.合成5′-GGsGsGsGsG-3′
3.添加C3间隔体
4.合成5′-GCA-3′
5.添加C3间隔体
6.合成5′-ATCGAT-3′
7.添加C3间隔体
8.合成5′-TGC-3′
9.添加C3间隔体
10.合成5′-GsGs-3′
合成、脱保护、后处理、以及分析都按照实施例2中所述来进行。
C-85和C-87类似地进行合成。
实施例26:合成含有少于8个核苷酸的寡核苷酸
在Perseptive Biosystems Expedite 8909自动DNA合成仪上合成含有
少于8个碱基的并且含有硫代磷酸酯键的多核苷酸。此多核苷酸利用0.1M
乙酸三乙基铵中的乙腈递增梯度在Polymer Labs PLRP-S柱上通过
RP-HPLC进行纯化。纯化的多核苷酸浓缩至干燥,用80%醋酸水溶液处
理去除4,4’-二甲氧基三苯甲基基团,然后用3体积异丙醇从0.6M乙酸
钠水溶液/pH 5.0中将此化合物沉淀两次。将此多核苷酸溶于Milli Q水中,
从260nm下的吸光度确定其产量。最后,将多核苷酸冻干成粉末。按照实
施例2中所述对此多核苷酸进行表征,并测定内毒素含量。
实施例27:制备可生物降解的阳离子微载体
如下制备阳离子聚(乳酸,羟基乙酸)微载体(cPLGA)。将本身粘度为
0.41dl/g(0.1%,氯仿,25℃)的0.875g聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)50∶50
聚合物(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)以10%w/w的浓度与0.3g
DOTAP一起溶解于7.875g二氯甲烷中。然后将澄清的有机相在500ml
PVA水溶液(0.35%w/v)中用实验室混合器(Silverson L4R,Silverson
Instruments)室温下以4000转/分钟均化30分钟而乳化。然后用通过混合
器套管的循环热水升高系统温度至40℃。同时,将搅拌速率降低至1500
转/分钟,并维持这些条件2小时以萃取和蒸发二氯甲烷。用循环冷水将微
球体悬液冷却至室温。
室温下8000转/分钟离心(Beckman Instruments)10分钟分离微载体并
通过温和的浴内超声处理将其重悬于去离子水中。该离心洗涤再重复两次,
以从粒子表面去除过量的PVA。将粒子的最终离心沉淀悬于约10ml水中,
并过夜冷冻干燥。鉴定干燥阳离子微载体粉末的大小和表面电荷:平均大
小(所称重的数目,μ)=1.4;ζ电位(mV)=32.4。
实施例28:CIC对人类细胞的免疫调制
试验的进行旨在评定(1)含有间隔体结构部分的嵌合分子和(2)多核苷
酸的免疫调制活性。
嵌合化合物和多核苷酸按照上述方法或通过常规硫代磷酸酯化学进行
合成。多核苷酸P-6和P-7由Hybridon Specialty Products(Milford MA)
合成。免疫调制活性通过此处所述的常规试验来测定。
用肝素化注射器通过静脉穿刺从自愿者收集外周血。将血液置于
FICOLL_(Amersham Pharmacia Biotech)垫层上并离心。收集位于
FICOLL_分界处的PBMC,然后用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次。在48
孔板(实施例29-32)或96-孔板(实施例33-40)中以2×106个细胞/mL在含
10%热灭活的人AB血清加上50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、
300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需氨基酸(NEAA)
的RPMI 1640中重悬细胞并于37℃培养。
细胞在不存在测试样本时、在存在20μg/ml(0.5OD/ml)测试样本时或
在存在与100μg/ml cPLGA(如果利用)预混合的20μg/ml测试样本时培
养24小时。然后从每孔收集无细胞培养基并检测IFN-γ和IFN-α浓度。
SAC(Pansorbin CalBiochem,1/5000稀释物)用作阳性对照。SAC内容物
是金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)(cowan)细胞物质。
利用BioSource International,Inc.的CYTOSCREENTM ELISA试剂
盒,按照厂商操作说明书对IFN-γ和IFN-α进行检测。
在人PBMC试验中,IFN-γ的背景水平可随着供体的不同而不同,甚
至是明显不同。IFN-α的水平在非刺激条件下一般显示出低的背景水平。
在下面的实施例29-40中给出了此类试验的结果。
在每个所示实验中,“只有培养基”和″P-7″是阴性对照。″P-7″以前
已被证实不具有免疫调制活性。SAC和″P-6″是阳性对照。“P-6″以前已
被证明具有明显的免疫调制活性。
实施例29:CIC的免疫调制活性
本实施例表明四种不同的CIC具有显著的免疫调制活性,这由对
IFN-γ和IFN-α分泌的刺激作用而证实(表3)。正如所意料,P-7不具有活
性。此外,P-1,一种含有TCG的7聚体,不具有活性。有趣地是,具有
HEG和丙基间隔体结构部分的CIC显示出不同程度的对IFN-α分泌的刺
激作用。虽然两种类型的CIC都刺激IFN-α分泌,但含HEG的CIC的效
果更显著。
表3
IFN-γ(pg/ml)
IFN-α(pg/ml)
测试化合物
供体1
供体2
平均值
供体1
供体2
平均值
只有培养基
8
0
4
0
0
0
P-7
410
51
231
0
0
0
SAC
2040
1136
1588
393
43
218
P-6
2180
669
1425
401
39
220
|
P-1
8
0
4
0
0
0
C-8
1916
696
1306
1609
44
827
C-9
2157
171
1164
142
0
71
C-10
1595
952
1273
1662
50
856
C-11
2308
270
1289
119
0
59
实施例30:多核苷酸的活性
本实施例表明多核苷酸P-1,P-2,P-3,P-4和P-5不具有免疫调制活性
(表4)。这些多核苷酸具有C-10和C-11的核酸结构部分的序列,如在实
施例29中所示C-10和C-11具有免疫调制活性。
表4
IFN-γ(pg/ml)
IFN-α(pg/ml)
测试化合物
供体3
供体4
平均值
供体3
供体4
平均值
只有培养基
0
3
2
0
18
9
P-7
3
8
5
0
31
15
SAC
1179
2000
1589
50
969
510
P-6
99
223
161
28
106
67
|
P-1
1
4
2
0
32
16
P-3
1
3
2
0
32
16
P-4
0
3
1
0
58
29
P-5
0
3
2
0
57
29
P-2
0
4
2
0
40
20
实施例31:多核苷酸混合物的活性
本实施例表明多核苷酸P-1和P-3的混合物及P-1、P-3、P-4和P-5
的混合物不具有免疫调制活性(表5)。这些多核苷酸具有C-10和C-11
的核酸结构部分的序列,而该C-10和C-11具有免疫调制活性。所述混合
物包含等量的每种多核苷酸,总浓度为20μg总多核苷酸/ml。
表5
测试化合物
IFN-γ(pg/ml)
IFN-α(pg/ml)
只有培养基
供体5
供体6
平均值
供体5
供体6
平均值
3
52
28
20
20
20
P-7
7
66
37
20
94
57
SAC
903
284
593
458
8215
4337
P-6
73
1170
621
54
482
268
|
(P-1)+(P-3)
3
36
19
20
40
30
(P-1)+(P-3)+(P-4)+(P-5)
1
99
50
70
65
68
C-10
102
806
454
91
1700
896
C-11
25
792
409
76
175
126
实施例32:CIC的免疫调制活性
本实施例在利用与实施例29和31不同的供体的试验中表明C-10和
C-11的免疫调制活性(表6)。
表6
IFN-γ(pg/ml)
IFN-α(pg/ml)
测试化合物
供体7
供体8
平均值
供体7
供体8
平均值
只有培养基
1
0
1
0
0
0
P-7
2
2
2
0
0
0
SAC
594
1100
847
22
303
163
P-6
15
367
191
4
59
32
|
C-10
23
198
111
46
539
293
C-11
5
419
212
6
56
31
实施例33:CIC的免疫调制活性
本实施例在利用与实施例29不同的供体的试验中表明C-8和C-9的
免疫调制活性(表7)。P-2,一种含TCG的6聚体,不具有活性。
表7
IFN-γ
IFN-α
供体
9
供体
10
供体
11
供体
12
平均
值
供体
9
供体
10
供体
11
供体
12
平均
值
只有培养基
17
1
1
10
7
4
2
2
15
6
|
P-7
5
2
3
2
3
0
3
1
5
2
SAC
380
688
159
73
325
2246
364
1129
1029
1192
P-6
66
20
72
23
45
12
28
12
12
16
|
P-2
2
3
1
2
2
0
2
1
4
2
C-8
312
35
31
28
102
58
30
18
49
39
C-9
134
7
56
30
56
8
10
1
15
8
实施例34:CIC的免疫调制活性
表8中所示试验证明本发明几种CIC,即以各种不同短核酸结构部分和
各种不同间隔体结构部分为特征的CIC的免疫调制活性。表8还表明化合
物M-1,即具有混合的HEG/核酸结构但缺少任何5′-C,G-3′序列(参见表2)
的化合物,以及某些其他化合物(C-19)未显示活性。具有cPLGA的CIC
制剂显著增强了对IFN-α的诱导。在一些情况下,IFN-γ水平也提高了。
数字″28---″表示各个供体。
表8
浓度 IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 ug/ml 28065 28066 28067 28068 平均值 28065 28066 28067 28068 平均值
只有细胞 0 96 2 1 2 25 0 4 0 6 3
P-6 20 439 12 28 906 346 14 17 45 126 50
P-7 20 397 1 8 15 105 0 8 0 3 3
P-2 20 79 1 1 0 20 0 3 0 0 1
P-3 20 94 27 1 0 31 0 0 5 0 1
P-4 20 93 1 1 1 24 0 0 9 0 2
P-2+P-3+P-4 20总共;6.7每个 99 0 1 0 25 0 0 8 0 2
C-8 20 1000 19 56 419 373 123 6 96 358 146
C-9 20 1000 8 57 510 394 13 0 22 64 25
C-10 20 1000 9 51 559 405 116 6 107 340 142
C-17 20 1000 6 32 459 374 21 0 22 95 34
C-18 20 1000 102 27 695 456 51 9 16 162 59
C-19 20 84 8 1 2 24 0 1 0 13 4
C-20 20 354 13 16 505 222 21 5 13 64 26
C-21 20 653 16 24 960 413 227 24 183 769 300
C-23 20 438 5 6 238 172 52 3 19 137 53
C-24 20 337 2 4 116 115 28 0 8 67 26
C-25 20 541 6 19 337 226 11 0 22 79 28
M-1 20 157 1 40 2 50 0 0 3 0 1
C-27 20 475 3 24 226 182 3 0 24 16 11
C-28 20 1082 5 42 410 385 3 0 29 52 21
PLGA 0 55 1 1 5 16 0 2 12 10 6
P-6+PLGA 20 975 191 287 573 506 388 194 565 2000 787
P-7+PLGA 20 19 27 6 11 15 0 5 0 0 1
P-2+PLGA 20 357 138 104 443 261 982 708 2100 2336 1532
P-3+PLGA 20 134 1 1 4 35 307 0 0 0 77
P-4+PLGA 20 19 1 0 3 6 34 5 0 0 10
P-2+P-3+P-4 20总共;6.7每个 122 4 14 70 53 1820 0 435 106 590
+PLGA
C-8+PLGA 20 527 280 245 357 352 2395 538 4380 4625 2985
C-9+PLGA 20 334 139 343 456 318 1093 130 1686 2045 1239
C-10+PLGA 20 619 152 557 420 437 2049 369 3515 3586 2380
C-17+PLGA 20 508 184 587 355 408 1914 240 2729 2774 1914
C-18+PLGA 20 732 108 355 448 411 2188 375 3513 7141 3304
C-19+PLGA 20 1000 780 730 466 744 5997 3753 14359 7079 7797
C-20+PLGA 20 1055 256 270 488 517 1044 191 1265 2000 1125
C-21+PLGA 20 682 874 390 481 607 2468 784 3372 4962 2897
C-23+PLGA 20 216 161 120 377 219 789 189 1573 2000 1138
C-24+PLGA 20 236 47 188 707 295 31 20 772 340 291
C-25+PLGA 20 427 179 289 499 348 414 87 1082 1335 730
M-1+PLGA 20 7 1 3 5 4 0 0 8 5 3
C-27+PLGA 20 888 205 235 466 448 136 44 388 259 207
C-28+PLGA 20 860 88 489 415 463 216 73 401 520 303
SAC 0 1000 339 511 355 551 284 156 1544 350 583
从表8可明显看出,供体28065在IFN-γ试验中显示出高背景。给出
的数值“1000”表示测量值超出试验灵敏度的范围。
实施例42:CIC对小鼠细胞的免疫调制
在鼠脾细胞上检测多核苷酸和嵌合化合物的免疫调制活性。免疫调制
作用通过测量分泌到培养基中的细胞因子进行评估。培养基上清液中的细
胞因子水平通过酶联免疫吸咐试验(ELISA)进行测定。
利用标准技术对细胞进行分离和制备。收获8至20周龄BALB/c小鼠
的脾并且利用标准切片方法(teasing)及用BioWhittaker Inc.的ACK裂
解缓冲液处理分离出脾细胞。本实验中合并四个脾。分离的细胞在补充有
2%热灭活胎牛血清(FCS)、50μM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素和2mM
L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中进行洗涤并以大约7×105个细胞/ml
重悬浮于10%FCS/RPMI(含有10%热灭活FCS、50μM 2-巯基乙醇、
1%青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基)。
细胞培养物通过将大约7×105个细胞/孔的细胞一式三份地接种于
96孔平底微量滴定板的100μl 10%FCS/RPMI中建立,平板接种后让细胞
休息至少1小时。与所示的测试化合物(在所示浓度下)在37℃孵育24
小时。收获细胞上清液并在-80℃冷冻。通过ELISA测定细胞产生的细胞
因子,结果如表9所示。
表9
测试化合物
剂量
IL-6
IL-12
IFNγ
P-6
5.0μg/ml
1.0μg/ml
0.1μg/ml
9311
5760
121
5374
4565
1665
2505
2175
187
C-10
5.0μg/ml
1.0μg/ml
0.1μg/ml
3342
1761
9
2329
1738
122
199
104
9
C-11
5.0μg/ml
1.0μg/ml
0.1μg/ml
10098
11814
458
4279
4914
3359
3342
3220
960
P-7
5.0μg/ml
1.0μg/ml
9
7
177
143
23
30
SAC
734
1343
18843
只有培养基
9
124
9
实施例35:含有3核苷酸核酸结构部分的CIC的活性以及cPLGA对
活性的增强
本实施例显示几种CIC在有和没有cPLGA存在下利用人PBMC测
定的免疫调制活性。有趣地是,磷酸二酯型的C-30(C-31)作为单独的CIC
是无活性的,但当与cPLGA配制在一起时就具有很好的活性。实际上,
一般趋势是仅包含磷酸二酯键的CIC(C-31,C-36,和C-93)作为单独的
CIC是无活性的,但当与cPLGA配制在一起时其活性显著增加。
C-32,一种只含有三聚体核酸结构部分的CIC,单独使用时具有
活性并且当与cPLGA配制在一起时显示出更大活性。参见表10。
表10
IFN-γ(pg/ml)
IFN-α(pg/ml)
刺激物
28089
28090
28098
28099
平均值
28089
28090
28098
28099
平均值
只有细胞
P-6
P-7
C-10
C-21
C-22
C-8
C-9
C-29
C-30
C-31
C-32
C-33
C-93
C-28
PLGA
P-6+PLGA
P-7+PLGA
C-10+PLGA
C-21+PLGA
C-22+PLGA
C-8+PLGA
C-9+PLGA
C-29+PLGA
C-30+PLGA
C-31+PLGA
C-32+PLGA
C-33+PLGA
C-93+PLGA
C-28+PLGA
SAC
0 0
84 255
0 4
35 44
61 68
31 15
62 52
12 7
63 50
0 6
0 0
0 5
0 0
0 0
14 15
15 2
606 144
121 3
804 373
1138 454
772 244
668 332
1036 330
825 477
97 233
256 327
454 192
171 186
427 628
683 306
195 489
0
745
0
174
218
110
205
150
12
0
11
0
0
183
16
3277
91
1501
1612
1271
1863
1536
447
1597
259
249
1707
2252
101
4 1
125 302
2 1
140 98
124 118
91 62
116 109
10
177 110
20 9
2 0
35 13
3 1
3 1
45 64
10 11
160 1047
5 55
301 745
630 958
357 661
506 842
683
341 795
41 205
406 647
57 240
96 176
323 771
224 866
306 273
25 79 33 28 41
0 62 105 105 68
0 27 19 37 21
17 61 187 304 142
56 157 286 466 241
0 46 97 247 97
21 124 314 362 205
10 67 39
75 92 359 332 214
134 29 52 47 65
158 26 62 29 69
285 31 46 59 106
56 22 34 30 36
0 30 25 29 21
0 64 42 67 43
8 38 39 49 33
197 103 340 91 183
7 85 36 47 44
523 256 509 1317 651
1347 1020 1001 2302 1418
619 386 604 1339 737
1005 683 934 1680 1075
308 363 335
909 711 855 1419 973
44 116 49 33 60
696 912 1028 1361 999
281 289 218 131 230
658 1220 1764 1304 1237
990 1738 2681 4000 2352
136 155 141 70 126
67 239 92 70 117
实施例36:含5′TCG的CIC的免疫调制活性
本实施例显示由包含不同核酸结构部分的CIC产生的免疫调制作用
(参见表11)。一般来说,含5′-TCG-3′(C-8、C-21、C-50、C-51、等)
或5′-NTCG(C-46)(其中N是任何核苷)的序列比其他含CG的CIC(C-24,
C-52)有更大活性。另外,尽管大多数CIC诱导显著量的IFN-γ,但对IFN-
α诱导来说结果变异较大,这说明IFN-α诱导对基序的要求可能比IFN-
γ诱导对基序的要求更加严紧。尤其,含5′-TCGA-3′的CIC(C-50,C-51,
C-45)比含5′-TCGT-3′的CIC(C-41,C-42,C-52)产生更多的IFN-α。
除C-8和C-21(包含基序5′-TCGTCGA-3′)以外,最佳IFN-α诱导是
由在5′位置具有TCGA的CIC产生的。
仅含有六聚体(C-22)、五聚体(C-43)、和四聚体(C-44)核酸结构部分
的CIC被发现如果单独利用可诱导出IFN-γ。此外,这些CIC中的每个
CIC以及仅含有三聚体核酸结构部分的C-32当与cPLGA配制在一起时诱
导出相当大量的IFN-γ和IFN-α。C-39,一种具有两个六聚体核酸结构部
分的CIC,单独利用时是有活性的。而C-40,一种具有一个六聚体和一个
四聚体核酸结构部分的CIC,在本实验中是无活性的。这两种CIC当与
cPLGA配制在一起时都显示出显著的活性。
表11
IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 28042 28043 28044 28045 平均值 28042 28043 28044 28045 平均值
只有细胞 15 4 3 5 7 0 44 9 0 13
P-6 495 1189 925 212 705 27 85 36 21 42
P-7 66 76 26 13 45 0 11 22 20 13
C-8 468 939 1000 234 660 20 51 32 5 27
C-24 148 156 312 26 161 0 0 8 0 2
C-21 790 1519 1198 177 921 57 72 79 15 56
C-42 198 1067 4000 37 1326 0 29 24 0 13
C-41 174 1075 841 45 534 0 3 23 0 7
C-45 590 1466 984 253 823 62 123 152 14 88
C-46 399 814 480 63 439 24 73 26 3 31
C-17 112 537 142 17 202 20 0 0 0 5
C-50 1324 1292 509 192 829 36 137 193 35 100
C-51 795 1349 1114 411 917 112 245 240 36 158
C-52 238 214 212 28 173 0 3 35 48 22
M-1 45 29 7 3 21 0 0 13 2 4
C-22 206 343 736 40 331 12 18 67 30 32
C-43 128 536 566 16 312 0 14 20 0 8
C-44 238 359 484 51 283 0 12 60 1 18
C-32 91 19 78 17 51 0 0 8 0 2
C-39 343 488 281 137 312 31 187 46 36 75
C-40 26 55 20 23 31 0 26 31 2 15
PLGA 192 82 55 3 83 0 0 0 8 2
P-6+PLGA 1382 1538 2581 178 1420 106 387 371 38 226
P-7+PLGA 152 324 174 12 166 0 2 0 2 1
C-8+PLGA 1367 2547 1490 286 1423 2182 2193 716 211 1325
C-24+PLGA 1017 1380 1362 52 953 0 31 65 0 24
C-21+PLGA 4000 1204 1870 325 1850 2959 2024 886 191 1515
C-42+PLGA 1515 1417 2190 372 1374 425 1081 295 69 468
C-41+PLGA 710 1940 1910 496 1264 535 1987 534 119 794
C-45+PLGA 1380 2292 1920 634 1557 2408 4000 1693 642 2186
C-46+PLGA 2201 2352 1432 472 1614 502 1309 257 100 542
C-47+PLGA 3579 4000 1137 161 2219 46 271 30 0 87
C-50+PLGA 2969 1209 1465 402 1511 1548 2818 1242 327 1484
C-51+PLGA 2018 4000 1000 463 1870 1837 3241 1154 536 1692
C-52+PLGA 1172 1726 1551 117 1142 12 34 34 0 20
M-1+PLGA 215 159 23 3 100 0 1 0 0 0
C-22+PLGA 4000 2975 1085 136 2049 325 1186 226 42 445
C-43+PLGA 2210 2594 1354 194 1588 358 1293 402 49 526
C-44+PLGA 1452 4000 2006 276 1934 986 4000 1768 192 1736
C-32+PLGA 2211 4000 2759 133 2276 204 1142 771 12 532
C-39+PLGA 1800 4000 2275 274 2087 2167 4000 2613 736 2379
C-40+PLGA 1438 498 1813 160 977 2758 4000 1556 370 2171
SAC 1618 1271 1053 123 1016 285 110 57 0 113
实施例37CIC的免疫调制活性
本实施例显示的是对另一些线性CIC(一些同时含有硫代磷酸酯键(PS)
和磷酸二酯键(PO))和分支CIC进行的免疫调制测试试验(表12和13)。
对比C-94(一种分支CIC)和C-21(含有相同核酸结构部分的线性CIC)
表明,分支CIC诱导出的IFN-α比线性CIC的多四倍。每种CIC与cPLGA
配制在一起后,诱导的IFN-γ和IFN-α量都显著增加。磷酸二酯型的C-94
和C-93只有在配制时才具有活性。C-87显示可明显地诱导IFN-α。
表12
IPN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 28042 28043 28044 28045 平均值 28042 28043 28044 28045 平均值
只有细胞 11 4 0 13 7 8 2 3 64 19
P-6 324 1036 529 653 636 9 34 22 108 43
P-7 34 19 48 35 34 0 0 4 54 15
C-8 623 753 646 604 656 78 25 52 256 103
C-53 39 27 38 26 32 0 0 0 5 1
C-49 367 433 767 353 480 30 8 100 88 57
C-84 29 23 69 232 88 0 0 5 222 57
C-85 17 13 315 134 120 0 0 28 24 13
C-94 443 198 1417 888 736 302 252 664 1855 768
C-93 8 1 41 17 17 7 3 81 61 38
C-21 572 460 4000 1644 1669 146 94 191 349 195
C-9 691 268 590 1306 714 39 0 11 64 29
PLGA 9 5 59 72 36 7 0 98 112 54
P-6+PLGA 601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511
P-7+PLGA 13 13 46 65 34 5 0 0 43 12
C-8+PLGA 284 551 1781 3113 1432 595 396 1013 2259 1066
C-53+PLGA 21 12 217 210 115 19 0 0 42 15
C-49+PLGA 1471 1219 4000 2061 2188 904 460 4000 1040 1601
C-84+PLGA 235 232 291 956 428 1777 914 4000 3641 2583
C-85+PLGA 313 294 554 1167 582 2116 921 4000 2413 2362
C-94+PLGA 2412 755 4000 3379 2637 1883 1640 4000 4000 2881
C-93+PLGA 880 316 869 1251 829 778 471 2045 988 1071
C-21+PLGA 4000 690 4000 2533 2806 712 577 2572 1571 1358
C-9+PLGA 1451 763 4000 1804 2005 389 199 397 477 366
表13
IFN-g IFN-a
(pg/ml) (pg/ml)
刺激物 28218 28219 28220 28221 平均值 28218 28219 28220 28221 平均值
只有细胞 5 5 5 5 5 32 32 32 32 32
P-6 13 7 25 141 47 32 32 32 32 32
P-7 5 5 5 5 5 32 32 32 32 32
C-87 83 24 38 977 281 3075 32 4269 265 1910
C-94 15 39 44 269 92 32 167 633 412 311
SAC 2552 621 1383 647 1301 483 105 32 452 268
实施例38:CIC中序列基序的位置效应
本实施例描述了对多种CIC(其中一些在前面的实施例中在不同的供
体中进行过检测)的免疫调制测试试验并举例说明核酸序列在CIC中的位
置效应。
被检测的CIC包括在核酸结构部分中含有两个不同的含CG的核酸
序列(TCGTCGA和ACGTTCG)并含有一个不含CG序列的核酸结构
部分(AGATGAT)的CIC。在含CG的核酸序列中,含TCGTCGA序列
的CIC将比仅含ACGTTCG序列的CIC具有更大的活性。在这两者中,
具有TCGTCGA的CIC确有更大活性。可利用本实施例中所用CIC的一
般结构,N1-S1-N2-S2-N3来说明基序在CIC内的位置。将活性最大的基序
TCGTCGA放置在N1位置导致产生出活性最大的CIC(C-8,C-56)。放置
在N2位置也赋予了活性。例如,在N2位置具有TCGTCGA的C-57与在
N3位置具有TCGTCGA的C-58相比活性稍大。在N1位具有ACGTTCG
序列的CIC,虽然比具有TCGTCGA序列的相似CIC活性小,但却比在
N1位具有AGATGAT序列的CIC活性大(C-57和C-58与C-59和C60
相比较)。在本实验中,C-61包含其中含有CG基序但不含TCG基序的核
酸结构部分,当与cPLGA配制一起时诱导IFN-γ。参见表14。
表14
IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 28156 28157 28158 28159 平均值 28156 28157 28158 28159 平均值
只有细胞 125 3 4 5 34 3 3 1 8 4
P-6 1132 872 207 231 611 52 484 7 32 144
P-8 255 20 31 31 84 16 9 24 8 14
C-8 1612 742 340 197 723 102 755 61 160 270
C-9 1162 729 192 329 603 26 142 78 20 67
C-23 733 576 202 295 452 26 235 59 169 122
C-54 297 378 88 218 245 8 96 8 13 31
C-55 511 566 55 186 329 9 5 63 3 20
C-56 1223 543 203 563 633 98 415 57 131 175
C-57 419 323 67 262 268 5 52 61 42 40
C-58 404 288 59 84 209 13 30 29 23 24
C-60 304 209 26 38 144 5 22 3 1 8
C-61 92 179 35 63 92 3 0 47 0 13
PLGA 43 63 5 11 30 85 246 0 3 83
P-6+PLGA 1070 2643 251 496 1115 582 2948 418 359 1077
P-8+PLGA 95 115 26 34 67 43 8 2 23 19
C-8+PLGA 1083 1862 269 1129 1086 4000 4877 857 1573 2827
C-9+PLGA 814 1412 307 992 881 1398 1778 418 483 1019
C-23+PLGA 825 865 182 1423 824 1020 1621 240 597 869
C-54+PLGA 838 1150 157 1751 974 752 1265 147 278 611
C-55+PLGA 1048 960 247 2356 1153 505 801 78 211 399
C-56+PLGA 792 604 321 4000 1429 4000 4000 852 2433 2821
C-57+PLGA 1027 814 101 3056 1250 555 1476 10 252 573
C-58+PLGA 804 1065 135 1021 756 179 932 3 139 313
C-60+PLGA 650 858 56 1014 645 71 118 32 50 68
C-61+PLGA 1265 1508 238 864 969 4 80 1 63 37
SAC 780 1184 83 659 677 208 55 6 34 76
本实验还比较了两种分支CIC的免疫调制活性:C-94在分支的丙三
醇成分和核酸结构部分之间具有HEG结构部分,而C-28具有直接连接到
丙三醇间隔体的核酸结构部分。参见表15。有趣地是,尽管两种分支CIC
对IFN-γ的诱导作用相似,但含HEG间隔体的CIC对IFN-α的诱导作
用却高得多。包含三个通过5-末端连接到顺丁烯二酰亚氨基活化的三乙基
胺间隔体上的P-6序列的分支CIC(C-99),当与cPLGA配制在一起时只诱
导IFN-γ而不诱导IFN-α。一般来说,最大IFN-α产量是利用如下CIC
产生出来的,此CIC具有通过分支结构连接的核酸结构部分,并具有多个
未连接的或“游离的”核酸结构部分5′-末端,且包括可在核酸结构部分之
间提供构象灵活性和间距的间隔体。
表15
IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 110 112 119 120 平均值 110 112 119 120 平均值
只有细胞 44 24 20 28 29 20 200 2 2 56
P-6 1508 344 144 104 525 50 172 234 72 132
P-7 124 24 16 40 51 2 32 474 2 128
C-8 1152 540 136 48 469 196 30 264 42 133
C-59 256 52 28 40 94 2 6 2 2 3
C-63 1536 376 80 60 513 294 38 464 228 256
C-50 1096 264 52 48 365 716 84 838 636 569
C-51 1528 240 52 40 465 1408 72 2200 622 1076
C-45 880 192 52 36 290 446 130 1074 428 520
C-41 512 100 32 32 169 58 2 182 6 62
C-42 1508 204 56 56 456 250 26 156 36 117
C-46 1224 400 68 36 432 58 2 208 48 79
C-52 472 48 40 28 147 2 2 292 2 75
C-39 604 116 108 32 215 674 26 444 250 349
C-40 180 12 4 20 54 6 198 152 2 90
C-94 5168 284 104 120 1419 1608 144 2610 878 1310
C-28 5564 52 44 60 1430 38 4 56 26 31
C-99 276 12 16 40 86 22 4 86 2 29
PLGA 32 8 72 120 58 10 2 60 92 41
P-6+PLGA 1640 968 960 2300 1467 948 260 1298 1470 994
P-7+PLGA 72 16 32 316 109 14 14 22 2 13
C-8+PLGA 1948 1220 1188 2384 1685 6674 1138 2130 2650 3148
C-59+PLGA 680 824 620 1828 988 234 2 76 278 148
C-63+PLGA 1208 1580 2340 2092 1805 4148 738 2796 2298 2495
C-50+PLGA 812 3684 1432 992 1730 3768 1414 4161 3402 3186
C-51+PLGA 1240 11216 2896 924 4069 5244 1260 5104 6148 4439
C-45+PLGA 2736 3024 3056 2472 2822 5532 1544 5474 4206 4189
C-41+PLGA 3168 1808 16000 3656 6158 3542 746 2074 2094 2114
C-42+PLGA 1612 2032 10212 1908 3941 3462 1030 2118 2054 2166
C-46+PLGA 3048 2012 3720 3608 3097 2372 638 2372 2682 2016
C-52+PLGA 1032 1236 2344 1724 1584 64 20 252 206 136
C-39+PLGA 2024 1332 8228 1244 3207 3764 846 3078 2658 2587
C-40+PLGA 1360 1244 5364 1864 2458 2362 684 3794 2616 2364
C-94+PLGA 2668 3188 8840 3396 4523 5658 1838 8000 6346 5461
C-28+PLGA 2104 2568 3572 1320 2391 302 2 284 198 197
C-99+PLGA 768 672 5316 472 1807 114 80 344 260 200
实施例39分支CIC的活性
本实施例证明,具有多个游离5′末端并具有由HEG间隔体提供的构
象灵活性的分支CIC,相对于具有HEG间隔体的线性CIC(C-94与C-21
比较以及C-96和C-23比较)或未加入(HEG)间隔体的分支CIC(C-94
与C-28比较以及C-96和C-27比较)来说,诱导出更多的IFNα。给
C-96再添加一个HEG间隔体和一个4碱基的核酸结构部分引起IFNα诱
导减少(C-96与C-97比较)。参见表16。
对含有三聚体5′-TCG-3′基序的两种CIC的免疫调制活性进行了检测
(C-91和C-68)。两种CIC本身都不具有活性,但C-91在与cPLGA
配制在一起后具有显著活性。
缀合有多个P-6序列的亲水性含聚酰胺的STARBURST树状体
_(C-102)与单独的P-6序列就等量的P-6(基于每条链的P-6链)相比,它
具有显著更大的IFN-α活性。这一结果证实,利用与上述不同的组合物和
合成方法,在柔性亲水核心上以多聚体方式递送含5′-CG-3′的核酸结构部
分显著提高对IFN-α的诱导。
表16
IFN-g IFN-a
(pg/ml) (pg/ml)
刺激物 28185 28186 28187 28188 平均值 x4 28185 28186 28187 28188 平均值 x2
只有细胞 5 1 13 1 5 20 36 4 32 4 19 38
P-6 205 17 148 8 94 378 120 41 4 4 42 84
P-7 0 4 19 2 6 25 4 25 5 31 16 32
C-8 154 25 123 9 78 311 196 31 202 4 108 217
C-94 181 61 384 17 161 644 1895 239 136 13 571 1142
C-28 162 24 75 5 66 266 14 4 0 4 6 11
C-21 244 37 125 7 103 413 443 64 1 4 128 256
C-23 42 14 29 3 22 88 83 27 59 55 56 112
C-27 49 3 21 3 19 75 4 4 39 4 13 25
C-96 163 22 195 12 98 392 2550 446 118 40 788 1577
C-97 259 16 125 5 101 405 307 71 4 2 96 192
C9 189 24 95 11 80 319 25 16 4 146 48 95
C-86 1 4 30 5 10 40 7 4 4 31 11 22
C-91 3 4 6 7 5 20 9 46 37 4 24 48
C-68 0 4 2 1 2 7 4 13 25 4 11 23
C-102 158 43 101 6 77 307 1880 187 109 4 545 1090
PLGA 10 4 13 4 8 30 4 4 0 4 3 6
P-6+ 315 64 128 39 137 546 710 116 78 4 227 454
PLGA
P-7+ 7 3 15 2 7 27 4 4 4 9 5 10
PLGA
C-8+ 319 127 242 24 118 712 1599 646 601 35 720 1441
PLGA
C-94+ 391 118 280 34 206 823 6761 19553 3949 207 7618 15235
PLGA
C-28+ 395 65 175 13 162 649 84 145 15 13 64 128
PLGA
C-21+ 333 49 177 20 145 579 3581 3169 1340 64 2038 4077
PLGA
C-23+ 199 67 102 15 96 382 599 250 110 21 245 490
PLGA
C-27+ 292 170 95 14 142 570 54 58 4 39 39 78
PLGA
C-96+ 400 186 244 41 218 872 27504 5572 2464 173 8928 17857
PLGA
C-97+ 356 177 124 39 174 696 2264 668 285 48 816 1632
PLGA
C-9+ 384 82 93 19 145 579 479 451 193 35 290 579
PLGA
C-86+ 11 3 84 4 25 101 33 4 4 4 11 22
PLGA
C-91+ 161 101 114 1 94 377 880 494 316 4 423 847
PLGA
C-68+ 31 8 24 4 17 67 14 51 4 4 18 37
PLGA
C-102+ 774 132 380 7 323 1293 2094 397 221 26 684 1369
PLGA
SAC 195 22 274 15 127 506 73 4 151 102 82 165
实施例40
本实验检测一系列CIC的活性,这些CIC中包含六聚体核酸基序
5′-TCGTCG-3′和连接到此核酸结构部分3’-末端的多个间隔体(C-13,C-14,
C-15和C-16)。参见表17。这些CIC如果单独使用都没有活性,然而当
配制在cPLGA上时则全部具有显著的活性。
表17
IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)
刺激物 28057 28058 28059 28060 平均值 28057 28058 28059 28060 平均值
只有细胞 1 2 1 39 11 0 0 0 0 0
P-6 83 103 1230 85 375 621 396 145 123 321
P-7 1 2 3 4 2 0 0 0 0 0
C-13 2 3 12 5 6 31 0 249 0 70
C-14 3 1 1 3 2 0 0 0 0 0
C-15 5 3 0 1 2 0 0 0 0 0
C-16 1 2 0 6 2 0 0 0 0 0
PLGA 40 32 49 254 94 35 222 41 0 74
P-6+PLGA 2000 2000 2000 452 1613 2000 2000 1747 403 1537
P-7+PLGA 40 271 16 40 92 0 527 161 108 199
C-13+PLGA 2000 262 221 168 663 5865 7994 5912 1437 5302
C-14+PLGA 2000 359 732 2000 1273 3937 6871 6371 2953 5033
C-15+PLGA 2000 585 2000 258 1211 2991 6282 4138 1731 3786
C-16+PLGA 172 207 277 71 182 1842 2529 2333 1362 2017
SAC 673 2000 2000 2000 1668 920 2000 387 146 863
实施例41:CIC在B-细胞增殖试验中的作用
从两名正常受试者的乙酰肝素化血液中分离出人PBMC。将一些
PBMC保存而将剩余的与CD19+MACS珠(Miltenyi Biotec)一起孵育。
然后使这些细胞通过一个磁体,经正选择分离出CD19+B细胞。经FACS
分析确定,这一群体具有>98%CD19+。然后B细胞以1×105/200μl/孔的
浓度在96-孔圆底培养板中进行培养。在一些情况下,还对PBMC进行培
养,但以2×105/200μl/孔浓度进行。细胞以2μg/ml多核苷酸或CIC进行刺
激(三次重复)。培养期是37℃下48小时。培养期结束后,用3H-胸苷(1
μCi/孔)脉冲培养板,并再孵育8小时。然后,利用标准液体闪烁技术收
获培养板并以每分钟计数(cpm)收集数据。
实验A:实验A的结果(表18)证明多核苷酸(P-6)和含有5′-C,G-3′
基序的CIC(C-8,C-9,C-21,C-28)可引起B细胞增殖。对照化合物,P-7
和M-1,以及七聚体多核苷酸P-1几乎不至完全不引起B细胞增殖。分支
CIC(C-28)及含有丙基间隔体的CIC(C-9),与含有六聚乙二醇间隔
体的CIC(C-8和C-21)相比,引起了更大的B细胞增殖。PBMC的
增殖反映出B细胞的增殖。
表18
供体146
供体147
两者的
平均值
细胞类型
刺激
cpm1
cpm2
cpm3
平均值
cpm1
cpm2
cpm3
平均值
B细胞
只有细胞
538
481
795
605
482
360
296
379
492
B细胞
P-6
29280
33430
30056
30922
35729
18032
21166
24976
27949
B细胞
P-7
4858
5810
7079
5916
4364
4066
2774
3735
4825
B细胞
P-1
761
608
721
697
569
460
687
572
634
B细胞
C-8
23815
30066
22969
25617
20914
22370
23659
22314
23966
B细胞
C-9
35365
42705
45231
41100
55543
49035
44985
49854
45477
B细胞
C-21
28467
16074
19258
21266
17604
18851
19887
18781
20024
B细胞
M-1
1514
2815
1173
1834
1679
1667
1436
1594
1714
B细胞
C-28
50999
54630
46418
50682
65593
51040
50357
55663
53173
|
PBMCs
只有细胞
2744
2303
2284
2444
1301
2402
2143
1949
2196
PBMCs
P-6
22067
23740
28099
24635
26436
23830
17531
22599
23617
PBMCs
P-7
7620
8362
9686
8556
9783
9841
10476
10033
9295
PBMCs
P-1
9724
3041
2425
5063
1706
1960
324
1330
3197
PBMCs
C-8
47202
40790
44811
44268
38845
39733
27981
35520
39894
PBMCs
C-9
55348
24857
39953
40053
88106
65413
90665
81395
60724
PBMCs
C-21
30338
22685
22383
25135
28819
530
37088
22146
23641
PBMCs
M-1
8753
5203
4496
6151
1034
3298
1674
2002
4076
PBMCs
C-28
94977
121595
84977
100516
103916
91439
100905
98753
99635
实验B:实验B(表19)评价了间隔体组成以及CIC结构(线性对比
分支)对B细胞增殖的影响。含有丙基、丁基、脱碱基、和羟甲基乙基间
隔体的线性CIC,与含有六聚乙二醇间隔体或三聚乙二醇间隔体的相应
CIC(比较C-10,C-11,C-17,C-18,C-20,C-25)相比,倾向于诱导更大的
B细胞增殖。十二烷基间隔体使得CIC(C-19)无活性。值得注意的是,B
细胞增殖数据不一定反映如上所示的细胞因子数据,尤其是在B细胞增殖
和IFN-α诱导之间存在差异。
表19
增殖试验
121 194
样品
细胞
刺激物
cpm1
cpm2
cpm3
平均值
cpm1
cpm2
cpm3
平均值
两者的平均值
1 B细胞
2 B细胞
3 B细胞
4 B细胞
5 B细胞
6 B细胞
7 B细胞
8 B细胞
9 B细胞
10 B细胞
11 B细胞
12 B细胞
13 B细胞
14 B细胞
15 B细胞
16 B细胞
17 B细胞
只有细胞
P-6
P-7
C-8
C-9
C-10
C-11
C-22
C-94
C-28
C-17
C-18
C-19
C-20
C-23
C-24
C-25
451 757 297
19996 15031 19804
1623 1821 2901
2604 12078 17696
21938 35400 23877
15142 14136 16158
30367 30412 18528
17147 14014 6844
11418 14406 11110
35393 26954 26780
27975 30426 9895
17085 14653
858 1099 926
31276 30851 28532
10628 16221 20087
8206 6789 2799
34360 35016 26480
502
18277
2115
10793
27072
15145
26436
12668
12311
29709
22765
15869
961
30220
15645
5931
31952
203 228 151 194
13678 12732 9003 11804
1992 1593 1686 1757
9333 9391 7602 8775
13660 16717 17866 16081
7480 5458 5943 6294
16967 20898 11253 16373
6472 5540 3894 5302
7361 8505 5349 7072
21588 13691 15691 16990
17467 14890 10518 14292
10028 12217 10538 10928
371 403 312 362
18082 18705 17481 18089
8730 6532 9596 8286
3979 3407 3468 3618
16060 19509 17384 17651
348
15041
1936
9784
21576
10720
21404
8985
9692
23350
18529
13398
662
24155
11966
4775
24802
实施例43:用CIC进行鼻内处理之后在小鼠肺中免疫相关基因的诱
导
对C-9、C-23和P-6(阳性对照)在小鼠肺中诱导75种不同基因的
mRNA表达的能力进行了研究。所评价的基因包括编码细胞因子、趋化因
子、细胞表面分子、转录因子、金属蛋白酶和其他分子的基因。本研究利
用来自Jackson Labs(Bar Harbor,ME)的6-8周龄雌性BALB/c小鼠在
Northview Pacific实验室(Hercules,CA)进行。在轻度isoflorine麻醉下,
以50uL盐水中的20ug C-9、C-23、P-6(阳性对照)或P-7(阴性对照)对
每组5只小鼠进行鼻内处理。早先实验证明大多数基因的最佳诱导时间是
在处理后6小时。因此,在6小时收获肺并在液氮中速冻并贮藏在-80℃以
备后用。总RNA利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,CA)分离
出来。RNA样本用DNAse处理(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)
并利用Superscipt II RNase H-逆转录酶(Invitrogen,Rockville MD)转化为
cDNA,如在Scheerens et al.,2001,Eur.J.ofImmunology 31:1465-74中所
述。合并每组的cDNA样本,在每个合并的样本中利用实时定量PCR(ABI
Prism 5700,Perkin Elmer Applied Biosystems)和syber green(Qiagen Inc.)
测定75个基因的mRNA表达。除目的基因之外,在每个样本中,还测定
了管家基因(HPRT或泛素)的mRNA表达。为了校正每个样本中的RNA
量,所有数据都相对于管家基因的表达进行计算。如图5所示选出最大上
调的基因,数据表示为超过对照处理(P-7)小鼠中的应答的诱导倍数。此数
据证明C-9、C-23和P-6可有效地诱导包括IL-6、IL-12p40、IFN-α、
IP-10和IL-10在内的多种基因的表达。然而,用C-9处理小鼠,与C-23或
P-6处理组相比,诱导出显著更高的IFN-αmRNA表达。
实施例44:CIC的体内活性
体内研究通过在小鼠(10只/组)后颈部皮下注射20ug(200ul体积)
的P-6(阳性对照)、P-7(阴性对照)、C-9、C-23、P-1或P-11来进行。
2小时后收集血样。对于LPS阳性对照组来说,小鼠经腹膜内注射200ul体
积,并在1.5小时后(即,在LPS诱导的TNF-α活性峰处)收集血样。
使血液凝结并制备血清于-80℃贮藏直至试验开始。利用检测TNF-α的
Biosource cytoscreen试剂盒和检测mIL-6和mIL-12的Pharmingen抗体
对血清细胞因子进行测定。所有样本都一式两份地进行测试。
P-6和两种CIC(C-9和C-23)每个都诱导IL-12 p40、IL-6和TNF-
α,而对照寡核苷酸(P-7)是无活性的(图6A-C)。在本实验中,CIC C-23比
C-9和P-6更有效。正如所预计的,六聚体(P-11:5′-AACGTT)和七聚体
(P-1:5′-TCGTCGA)是无活性的。
实施例45:灵长类动物针对抗原和CIC的免疫应答
检测了狒狒对存在CIC时施用的乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫反应。
HBsAg为酵母中产生的重组HBsAg。在研究开始时,狒狒的组(每组
8只)中包括雄性和雌性狒狒,体重范围为8-31kg(组平均体重为13-16
kg)。
通过肌内注射(IM)1ml体积的20μg HBsAg免疫狒狒两次,间隔期为
两个月(第0和2月)。如下所列出的,一些组还接受了CIC(C-8或C-9)或
阳性对照(P-6)加HBsAg。
在免疫前和免疫后2周收集所有动物的血。如下测定抗HBsAg IgG效
价。用包被有来自人血浆的HBsAg的小珠,使用AUSAB EIA商业试剂盒
(Abbott Labs Cat.#9006-24和1459-05)分析狒狒血清样本。一组范围在
0-150mIU/ml的来自人血浆的HBsAg阳性和阴性标准品与试验样本一起
进行测试。生物素偶联的HBsAg和兔抗-生物素-HRP偶联的抗体用作检测
用的二级抗体复合体。该试验用邻苯二胺(OPD)显色,并在492nm处测定
吸光值,在600nm处扣除本底(Quantum II分光光度计,Abbott Labs)。
根据厂商确立的参数从标准曲线,应用样本的吸光值确定相应的抗HBsAg
浓度,以毫国际单位/ml(mIU/ml)表示。对于稀释的样本,以导致0-150
mIU/ml值的样本吸光度为基础来定量,然后乘以稀释系数可得到终浓度。
用具事前比较的单因素方差分析(α=0.05),通过方差分析(NCSS97
统计软件程序,Kaysville,UT)对对数变换数据进行统计学分析。认为p≤
0.05时具有显著性。
试验动物组如下进行免疫:
组1-20μg HBsAg;
组2-20μg HBsAg+1000μg P-6;
组3-20μg HBsAg+1000μg C-8;
组4-20μg HBsAg+1000μg C-9
研究结果如下面的表20所示。CIC或阳性对照P-6与HbsAg联合施
用,与单独施用HBsAg相比,提高了抗-HBsAg抗体的效价。在成对比较
中,组2、3、和4中检测到的免疫应答显著异于组1中检测到的免疫应答
(二次免疫后,对于组2为p<0.05,对于组3和4为p<0.005)。在组2、
3、和4之间没有发现统计学上的差异。
表20
狒狒的抗体应答(AUSAB EIA)
HBsAg+CIC
#
组号#
疫苗
抗HBsAg(mIU/ml)
第一次免疫后
第二次免疫后
|
B339
B340
B341
B342
B343
B344
B345
B346
1
HBV
(20ug)
0
0
0
0
0
0
0
0
7
63
15
80
55
50
28
24
平均值
标准差
0
0
40
26
B347
B348
B349
B350
B351
B352
B353
B354
2
HBV
(20ug)
P-6
(1000ug)
0
6
0
17
0
0
15
21
329
121
108
13,569
315
38
1,446
1,675
平均值
标准差
7
9
2200*
4,637
B379
B380
B381
B382
B383
B384
B385
B386
3
HBV
(20ug)
C-8
(1000ug)
2
0
0
125
0
52
0
0
184
3,038
41,706
3,718
250
13,750
11,626
79
平均值
标准差
22
45
9294**
14,121
B387
B388
B389
B390
B391
B392
B393
B394
4
HBV
(20ug)
C-9
(1000ug)
0
42
0
0
405
26
75
0
5,605
8,978
312
2,992
12,663
112
2.364
52
平均值
标准差
68
139
4135**
4.633
*p<0.05,**p<0.005与只有HBV(组1)相比
实施例46:由CIC-抗原缀合物引起的体内应答
本实施例显示通过CIC-抗原缀合物的施用在小鼠体内诱导出抗体-介
导的免疫应答。
如下所述,以两周的间隔期,通过皮内(尾部)途径用C-11/Amb a1
缀合物(如下所述合成)(1ug或10ug)、P-6/Amb a1(1ug)或Amb a1(1
ug),对10只小鼠/组进行两次免疫。从每次注射后两周获得的血清中测定
抗-Amb a1特异性IgG1和IgG2a的效价。第二次免疫之后于第6周对脾
细胞进行体外再刺激以确定Amb a1特异性IFNγ和IL-5应答。
经C-11-Amb a1缀合物免疫的小鼠显示出在使用P-6-Amb a1参照
物免疫时所观察到的特征性免疫应答模式,具体来说,从Th2向Th1-型
Amb a1特异性免疫应答转移。经C-11或P-6缀合物免疫的小鼠形成强
IgG2a应答并减少了IgG1应答。缀合物处理组还显示出IL-5应答停止而
IFNγ应答增加。此外,针对C-11-Amb a1缀合物的免疫应答显示出以剂
量依赖性方式增加,这可通过比较1ug和10ug剂量组来证明。
C-11-Amb a1缀合物引发的免疫应答与使用P-6-Amb a1时所观察到的性
质相似。
结果如表21-23所示。
一般方法
动物研究在Northview Pacific实验室(Hercules,CA)利用来自
Charles River实验室(Hollister,CA)的8-12周龄雌性BALB/c小鼠进行。
以2周为间隔,给10只鼠/组在尾部两次皮内(ID)注射下列一种物质:
C-11/Amb a1缀合物(1ug),C-11/Amb a1缀合物(10ug),P-6/Amb a1缀合
物(1ug)或Amb a1抗原(1ug)。在每次注射之后两周经眼眶后途径采
集血样并制备血清用于抗体测定。在第二次注射后6周,收获脾脏用于体
外再刺激试验以测定IFNγ和IL-5的细胞因子应答。脾脏进行单独的检
测。利用25和5ug/ml的Amb a1对5×105细胞/孔的细胞进行再刺激,
第4天收获上清液并在-80℃贮藏直至进行检测。体外试验用的对照包括
0.01%的SAC和分别为10ng/ml和1uM的PMA/IO。
小鼠抗-Amb a1 IgG1和IgG2a试验
在用1μg/ml Amb a1抗原以50μl/孔包被的96-孔圆底板中,通过
ELISA分析小鼠血清样本。山羊抗-小鼠IgG1(或IgG2a)生物素偶联抗体
用作二级抗体。利用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶偶联物进行检测。
试验用TMB显色并测定450nm的吸光度值,在650nm扣除本底
(Emax精确微量平板读数器,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。效价定
义为利用4-参数分析(Softmax Pro97,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)
给出0.5OD的ELISA吸光度值的血清稀释倍数的倒数。所有样本都一式
两份于两孔中在不同板上进行检测,以两个值的平均值作为效价值。
小鼠IL-5和IFN-γ试验
在包被有抗-细胞因子单克隆抗体的平板上通过捕获ELISA检测上清
液的IL-5和IFN-γ水平。生物素酰化的抗-细胞因子MAb用作二级抗体。
利用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物进行检测并以TMB显色试验。
从每个平板上测定的标准曲线计算出浓度。测定450nm的吸光度值,在
650nm扣除本底(Emax精确微量平板读数器,Molecular Devices,
Sunnyvale,CA)。所有样本都一式两份于两孔中在不同平板上进行检测,
以两个值的平均值作为浓度值。
用具事前比较的单因素方差分析(One-Way ANOVA with Planned
Comparions)(α=0.05),通过NCSS97程序(NCSS97统计软件,Kaysville,
Utah)对对数变换数据进行统计学分析。对于如下研究,认为p<0.05时具
有显著性。
C-11/Amb a1缀合物的合成
活化的C-11(C-111)的合成:
将5′-二硫化物-C-11(C-110)溶解于活化缓冲液(100mM磷酸钠/150
mM氯化钠/pH 7.5)并通过TCEP的还原作用激活。利用5ml Sephadex
G25柱(Pharmacia)以相同活化缓冲液为流动相纯化活化的CIC(C-111)。
以基线开始上升为起点,以0.5分钟间隔手动收集各级分。纯化后,各级
分的浓度利用A260来测定,且消光系数25.6OD/mg。
活化的Amb a1的合成:
通过如下方式对Amb a1进行激活:首先封闭其游离的巯基,然后加
入异官能交联剂。利用HiTrap G-25脱盐柱(Pharmacia Catalog#17-1408-
01)脱盐除去过量试剂。所得的活化Amb a1中每个被激活的蛋白有平均
9.3个位点。
C-11/Amb a1缀合物的合成:
使活化的C-11(C-111)和活化的Amb a1结合,所得的C-11/Amb a1
缀合物利用Superdex 200分子大小排阻层析柱(Pharmacia
Cat.#;17-1088-01;1cm×30cm)进行分级分离。制剂缓冲液(10mM磷酸
盐,150mMNaCl,pH 7.2)用作流动相。基线开始上升为起点,以1分钟
间隔收集各级分。
缀合物样本利用4-12%NuPAGE凝胶(Invitrogen,Catalog#NP0322)
和MOPS缓冲液(Invitrogen,Catalog#NP0001)通过SDS-PAGE进行
分析,同时利用BioSep SEC-S3000柱(Phenomenex,Catalog
#;OOH-2146-EO)通过分子大小排阻层析(SEC-HPLC)进行分析。
SDS-PAGE后,蛋白质通过考马斯蓝(GelCode,Pierce Catalog#24596)染
色观察。通过利用DNA-银染色(Pharmacia,Catalog#17-6000-30)确证
CIC的存在。SDS-PAGE和SEC-HPLC都用来限定合并标准,和用于表
征得到的合并物。蛋白质浓度利用二辛可宁酸(Bicinchoninic acid)法(BCA,
Sigma Catalog#BCA-1)进行测定。
表21
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性
IgG1和IgG2a抗-Amb a1效价
组别 动物 免疫
#
第一次免疫后2周
IgG1 IgG2a
第二次免疫后2周
IgG1 IgG2a
1 1 C-11/Amb a1
2 缀合物
3
4
5 (1ug)
6
7
8 ID
9
10
30 148
30 221
30 943
30 64
38 1,894
30 943
30 570
30 259
56 30
30 30
7,900 19,886
13,037 19,735
946 23,918
5,485 10,487
3,805 9,945
600 5,249
10,337 20,156
600 8,350
2,575 5,747
8,381 28,971
平均值
标准差
33** 510
8 599
5,367** 15,244*
4,400 8,285
2 11
12 C-11/Amb a1
13 缀合物
14
15 (10ug)
16
17
18 ID
19
20
51 345
30 667
77 445
30 1,662
30 67
30 450
55 1,137
99 1,119
99 8,227
30 1,613
8,982 27,877
201,008 612,739
6,739 86,672
22,578 121,770
190,835 88,745
5,971 17,600
29,646 105,398
70,159 183,152
80,052 250,206
6,235 63,616
平均值
标准差
53* 1,573
29 2,399
62,221 155,778*
75,298 174,925
3 21
22 P-6/Amb a1
23 参照缀合物
24
25 (1ug)
26
27
28 ID
29
30
30 37
1,422 303
485 265
170 1,182
903 2,027
88 2,298
33 321
30 55
113 89
30 39
3,437 65,306
15,652 6,198
84,927 177,281
37,379 56,074
38,121 76,572
32,499 240,098
3,011 24,404
24,307 20,796
43,060 19,586
37,116 7,317
平均值
标准差
330 662
475 862
31,951 69,363
23,568 78,697
4 31
32 Amb a1
33
34
35 (1ug)
36
37
38 ID
39
40
3,405 349
7,331 30
2,847 35
4,021 30
8,333 212
1,214 286
1,279 30
4,332 80
569 30
2,696 30
172,827 6,244
164,673 1,003
112,766 7,174
100,281 1,399
156,037 4,969
118,407 2,125
396,404 600
187,335 4,599
63,536 600
161,039 902
平均值
标准差
3,603** 111*
2,554 123
163,331** 2,962**
90,406 2,530
值30用于第一次免疫后值<30的样品
值600用于第二次免疫后值<600的样品
*p<0.05,**p<0.005与P-6/Amb a1相比
表22
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性
体外IFNγ应答(pg/ml)
![]()
值18用于<18的值
值不包括在计算中,因为只有培养基时的值>3个标准差+所有只有培养基时的值的平均值(即,2014pg/ml)
**p<0.005对于25μg/ml的再刺激而言与P-6/Amb a1值相比
表23
C-11/Amb a1缀合物在小鼠体内的活性
体外IL-5应答(pg/ml)
![]()
值24用于<24的值
值不包括在计算中,因为只有培养基时的值>3个标准差+所有只有培养基时的值的平均值(即,124pg/ml)
*p<0.05,**p<0.005对于25μg/ml的再刺激而言与P-6/Amb a1值相比
实施例47:间隔体结构部分对CIC活性的影响
本实施例显示不同间隔体结构部分对IFN-α诱导的影响。C-90(C3
CIC)和C-51(HEG CIC)的比较结果显示C-51诱导的IFN-α比C-90的
多8倍,尽管每种CIC诱导的IFN-γ量相近。同样,含不同接头的分支
CIC的比较结果显示出对于IFN-α的诱导,HEG(C-94)>TEG(C-103)>
C3(C-104)=无接头(C-28).
表24
IFN-g IFN-g
(pg/ml) (pg/ml)
刺激物 28234 28235 28236 28237 平均值 28234 28235 28236 28237 平均值
只有细胞 4 4 4 4 4 16 16 16 16 16
P-6 15 52 51 1167 321 58 16 16 74 41
P-7 13 4 7 4 7 62 16 16 16 28
C-90 7 118 497 1586 552 16 46 117 345 131
C-51 17 123 193 1580 478 16 77 352 3798 1061
C-71 30 168 448 1663 577 17 30 538 1665 563
C-101 14 205 627 2612 865 16 249 1354 8566 2546
C-96 21 239 354 1396 503 16 120 608 993 434
C-97 10 119 269 980 345 16 16 140 16 47
C-100 27 183 490 1907 652 16 16 398 193 156
C-88 5 21 17 477 130 95 16 212 111 109
C-33 23 86 247 2076 608 16 16 16 91 35
C-21 4 107 308 1645 516 16 16 73 678 196
C-28 10 14 88 1229 335 16 16 16 16 16
C-94 7 161 239 1116 381 16 118 548 3631 1078
C-103 21 44 250 1854 542 16 21 126 213 94
C-104 14 4 87 125 58 16 29 16 16 19
PLGA 4 31 18 10 16 16 122 157 35 83
P-6+PLGA 57 514 1052 3775 1350 16 694 1163 3444 1329
P-7+PLGA 4 4 11 13 8 16 16 16 16 16
C-90+PLGA 139 673 831 4618 1565 1175 696 4544 5103 2880
C-51+PLGA 88 644 1064 3748 1386 3257 2168 8000 8000 5356
C-71+PLGA 101 797 1254 3899 1513 3085 2244 8000 8000 5332
C-101+PLGA 110 659 879 6944 2148 4679 4488 8000 8000 6292
C-96+PLGA 143 1070 1167 5471 1963 4107 3237 6660 8000 5501
C-97+PLGA 68 737 988 5327 1780 4742 4216 8000 8000 6240
C-100+PLGA 176 1299 1742 7804 2755 1520 1092 4074 3777 2616
C-88+PLGA 102 512 1148 5055 1704 803 613 2409 6412 2559
C-33+PLGA 118 444 968 3947 1369 551 566 3514 6727 2840
C-21+PLGA 159 411 1089 4056 1429 1369 1561 5366 8000 4074
C-28+PLGA 28 131 1005 3868 1258 16 16 184 134 88
C-94+PLGA 174 623 1352 4034 1546 4145 4653 7197 8000 5999
C-103+PLGA 192 643 1388 5063 1822 895 1486 4456 5405 3061
C-104+PLGA 40 73 641 4930 1421 16 16 128 92 63
SAC 1845 1250 924 5350 2342 2374 327 1149 3744 1899
实施例48:评定对应于核酸结构部分序列的多核苷酸的独立免疫调
制活性
本实施例进一步例证了含有不具有独立免疫调制活性的核酸结构部
分的CIC的免疫调制活性。对与CIC核酸结构部分的序列对应的多核苷
酸的活性进行单独检测,或与游离间隔体组合后进行检测,并且与包含等
量核酸和间隔体的CIC的活性进行比较。例如,3uM的CIC C-101与9uM
P-14或9uM P-14和9uM六聚乙二醇及3uM丙三醇(由于C-101含有3
当量的P-14,3当量的六聚乙二醇,和1当量的丙三醇)的混合物进行比较。
在所有情况下,CIC都具有活性而短链多核苷酸,不论单独的或与间隔体
混合的,都是无活性的。参见表25。在浓度9uM检测单独间隔体的活性,
所有间隔体都是完全无活性的。
表25
IFN-g IFN-a
(pg/ml) (pg/ml)
刺激物 28250 28251 28252 28253 平均值 28250 28251 28252 28253 平均值
只有细胞 18 5 9 1 8 16 16 30 19 20
P-6 121 18 34 37 52 16 16 16 16 16
P-7 104 1 39 1 36 16 16 16 16 16
丙基间隔体 13 1 1 1 4 16 16 16 16 16
丁基间隔体 8 5 1 1 4 16 16 16 16 16
三聚乙二醇 15 1 7 1 6 16 16 16 16 16
六聚乙二醇 12 1 1 15 7 16 16 16 35 21
丙三醇 16 12 2 1 8 16 16 16 16 16
C-51 135 45 164 167 128 181 246 95 1226 437
C-101 224 63 180 146 153 540 1472 509 2645 1291
P-14 10 34 11 10 16 16 16 16 16 16
P-14/HEG/丙三醇 14 19 10 10 13 16 16 16 16 16
C-21 122 51 155 203 133 31 69 41 264 101
C-94 340 60 287 128 204 245 645 323 1198 603
P-1 54 21 56 1 33 16 16 16 16 16
P-1/HEG/丙三醇 15 9 19 1 11 16 16 16 16 16
C-45 107 26 95 8 59 16 109 55 382 140
P-13 18 13 22 1 14 16 16 16 16 16
P-13/HEG 40 28 45 1 28 16 16 16 16 16
C-10 337 163 776 898 544 16 23 25 124 47
P-2 7 25 53 1 22 16 16 25 16 18
P-3 32 21 72 1 31 16 29 38 31 29
P-4 72 1 43 1 29 16 16 16 16 16
P-2/P-3/P-4/HEG 68 1 38 1 27 16 16 16 16 16
实施例49:(5′-TCGACGT-3′-HEG)平均=185-Ficoll400(C-137)的制备
A.顺丁烯二酰亚氨基-Ficoll400的制备
利用Inman(J.Immunology,1975,114:704-709)的方法制备氨基乙基
羧甲基(AECM)180-Ficoll400。平均每摩尔Ficoll(MW=400,000Da)有180
个氨基乙基基团。将溶于300ul DMSO的27.6mg(62.6umol)4-(N-顺丁
烯二酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯滴加到溶于1.0ml
0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.66)中的23.2mg(0.058
umol)AECM180-Ficoll400中,边加边不断搅拌。将反应混合物置于摇床上2
小时然后在Sephadex G-25柱上脱盐得到20mg顺丁烯二酰亚氨基
-Ficoll400。平均每摩尔Ficoll有大约165个顺丁烯二酰亚胺基团。
B.5′-TCGACGT-3′-HEG-(CH2)3-SH(C-136)的制备
利用合成C-116的类似方法合成出
5′-TCGACGT-3′-HEG-(CH2)3-SS-(CH2)3-OH(C-135)。向溶于0.4mL 0.1
M磷酸钠/150mM氯化钠/pH 7.5缓冲液的10mg(3.57umol)C-135中加
入溶于0.7ml同样缓冲液的5.7mg(20umol)TCEP。对混合物进行充分
涡旋之后置于40℃水浴中2小时。利用乙酸三乙基铵缓冲液(TEAA)/pH
7.0中的乙腈递增梯度通过RP-HPLC(Polymer Labs PLRP-S柱)对硫醇
(C-136)进行纯化并立即应用于下一步反应中。
C.(5′-TCGACGT-3′-HEG)x-Ficoll400(C-137)的制备
向溶于0.7ml 0.1M磷酸钠/pH 6.66的5.5mg(0.014umol)顺丁烯二
酰亚氨基-Ficoll400中加入溶于3.45mL约30%乙腈/TEAA/pH 7.0缓冲液
的6.8mg(2.5umol)C-136。将混合物置于摇床上室温过夜然后在Superdex
200柱(Pharmacia)上对产物进行纯化。利用分离产物的总重量和260nm
吸光度值计算,结果显示产物平均包含每摩尔Ficoll大约185个寡核苷酸。
还得到了含较低寡核苷酸荷载量的第二级分。
D.C-137活性
如表26中所示,基于多糖的CIC在细胞因子应答试验中具有引入注
意的活性,尤其显示出明显的IFN-α刺激作用。
表26
IFN-g(pg/ml) IFN-a(pg/ml)
刺激化合物 28313 28314 28315 28316 平均值 x4 28313 28314 28315 28316 平均值
只有细胞 1 9 11 11 8 32 31 122 100 98 88
P6 1 38 47 309 99 395 31 130 122 134 104
P7 1 11 12 20 11 43 31 176 107 121 109
C-137 1 22 13 54 22 90 3612 5468 624 4000 3426
SAC 87 77 56 4000 1055 4220 346 192 114 1172 456
***
虽然为了清楚和理解的目的,对前述发明以阐述和实施例方式较详细
地进行了描述,但对本领域技术人员来讲,显然可实施某些变化和改变。
因此,发明详述和实施例不构成对本发明范围的限制,本发明范围由所附
权利要求限定。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物为所有目的特此完整地并入
作为参考,就如同具体地单独指出每份出版物、专利或专利申请如此并入
作为参考一样。
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