多能性兔胚胎干(ES)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用 本发明涉及新的兔胚胎干(ES)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用。
基因打靶〔通过在胚胎干(ES)细胞中同源重组〕技术允许以所需的和规定的方式操纵基因(Capecchi,1989；Robertson,1987；Bradley,1987)。简要地说，将目的基因整合到质粒转移载体中，并通过用编码可选择标记的外源DNA置换其部分序列(失活)或通过突变的基因序列(靶诱变)来改变。然后这些已失活或突变的基因被导入ES细胞(每个细胞都具有发展成完整动物的潜力)。接着在体外筛选天然基因被失活的杂合体替代的ES细胞的克隆，筛选出的这些克隆被导入重新植入的正常胚胎中。此过程产生嵌合动物，这些动物筛选出来用于失活基因地种系传递。经过繁育和选择，于是产生了目的基因缺失(“敲除”)的转基因动物。
利用最近发展的技术使野生型或突变ES细胞和四倍体胚胎凝聚可以产生ES细胞完全衍化的小鼠(Nagy et al.,1993)。选择性地，ES细胞通过非同源重组，可以用于遗传物质的导入，允许在活着的动物中进行遗传改变的研究。
将转基因技术和ES细胞技术应用于基因功能的变化已经提供了一些重要人类疾病的动物模型(综述参见Wilson,1996；Rubin和Barsch,1996)。然而目前这项技术仅在小鼠中是成功的。尽管对于许多应用，小鼠是有用的，但是有一些明显的限制(例如大小限制和不能产生人类的疾病)限制了其潜在的应用。因此检测表型结果或功能丢失突变的较大动物模型将是非常有价值的。
确认的多潜能ES细胞已在许多其它物种中得到分离，包括仓鼠(Doetschman等，1988)，猪(Evans等，1990；Piedrahita等，1990；Notarianni等，1990；Talbot等，1993)，绵羊(Notarianni等，1990)，牛(Evans等；Saito等，1992)，水貂(Sukoyan等，1993)，兔(Graves和Moreadith,1993)，大鼠(Iannaccione等，1994)，人(Bongso等，1994)和灵长类(Thomson等，1995)。然而仅在小鼠和大鼠中已建立重新导入囊胚后在培养物中产生嵌合体的ES细胞，而到目前为止在兔和其它物种中的所有努力都已失败。
来自兔囊胚的新鲜的内细胞团(ICM)细胞已表明在注入受体囊胚后允许嵌合兔的产生(Gardner和Munro,1974；Moustafa,1974；Babinet和Bordenave,1980)，另外Yang等，(1993)已报道从新鲜分离的ICM及体外培养3天的ICM细胞中产生嵌合兔。
然而，为在ES细胞中通过同源重组允许基因打靶，能够在培养中保持更长时间并且具有已证明的产生嵌合动物潜能的细胞系对于产生目的遗传改变的后代是必需的。在本发明之前，除了小鼠和大鼠之外没有这样的别的动物的细胞系得到分离。
确认的多潜能的兔ES细胞的衍化以前由Grave和Moreadith报道过(1993)。在移出的胚胎连续传代以后出现了两种主要细胞类型。一种类型具有与滋养外胚层的初级赘疣相同的形态，细胞对胚胎的植入负责。第二种类型呈现典型的上皮样，被认为代表兔ES细胞(图1)。尽管这些确认的ES细胞能够产生胚胎样体(由代表外胚层，中胚层和内胚层的多种细胞类型组成)，但是它们在把上皮样细胞导入来源于新西兰白种(NZW)的囊胚后〔Grave和Moreadith,1993；Grave和Moreadith,未发表的结果(表1)〕，或者把细胞核转移进去核的新西兰白受精卵后(Du等，1995)不能产生嵌合兔。这表明用这些ES细胞不能产生嵌合体可能由于种的障碍。但是表1的数据表明从四个检测的上皮样细胞系中没有嵌合动物产生，每一个所测上皮样细胞系来自单个内细胞团。
表1：用确定的ES细胞系注射兔胚胎的结果(未发表的结果，Graves和Moreadith)细胞系(％)胚胎阶段#注射出生(％)嵌合体 GM3 GM4 GM8 GM4 囊胚 囊胚 桑椹胚 桑椹胚 46 24 84 14 29(63) 2(8) 6(7) 5(35) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 总数 168 42(25) 0(0)
Niemann和Strelchenko(1994)也试图分离并保持多潜能兔(加利福尼亚种)ES细胞，但尽管可以观察到确认的ES细胞(总共保持12代)与宿主囊胚(Chinchilla,Black Rex)内细胞团的凝聚，但是无证据证明有嵌合后代的产生，这些确认的ES细胞来自交配后4天收集的兔胚胎。因此，到目前为止，所有的产生稳定多潜能兔ES细胞(具有注射入受体囊胚后产生嵌合动物的表现的潜力)的努力已经失败。
因此本发明的目标是改进兔胚胎干(ES)细胞的衍生和保持，使之具有在注射进受体囊胚后产生嵌合兔的表现的潜能，因此能够产生野生型或遗传改变的后代(通过同源或非同源重组，使用例如基因或细胞核转移)。
目前发现通过分离交配后5.5天囊胚的内细胞团并在兔ES培养基中把它们培养在饲养细胞上，可以得到一个兔胚胎干(ES)细胞系，它含有至少70％，优选地80至90％未分化的细胞。
依据本发明的兔ES培养基包括高葡萄糖Dulbecco的修改的Eagle培养基，4mM L-谷氨酰胺，0.1mM2-巯基乙醇，148单位/ml青霉素G钠盐，148毫克/ml硫酸链霉素，4毫克/ml牛胰岛素，103单位/ml小鼠白血病抑制因子，20％胎牛血清、1.5％MEM非必需氨基酸溶液。
饲养细胞优选小鼠胚胎成纤维细胞，来自12.5天的小鼠胚胎，并以每10cm的佩特里细菌培养皿中3至4×106细胞密度使用。
优选使用一种改良的胰蛋白酶消化方法，它包括使用胰蛋白酶消化培养基，此培养基包含1％胶原酶，1％鸡血清和在磷酸盐缓冲液中的0.03％的胰蛋白酶-EDTA。因为小鼠胚胎成纤维细胞和滋养外胚层细胞在这个培养基中分离更慢，所以此培养基允许ES细胞选择性的传代。
根据本发明的细胞，由它们的下列特性识别：超过10次传代后三维克隆的形成、碱性磷酸酶阳性染色及细胞角蛋白18和波形蛋白的阴性染色。
本发明进一步涉及到ES细胞系在产生嵌合兔中的应用，例如接下来的注射进受体囊胚的囊胚注射或胚胎凝聚或核转移。
本发明的ES细胞系也可以通过同源或非同源重组用于基因改变或通过种系传递用于产生基因改变的兔。
根据本发明的细胞系的应用和分化可导致(新)基因的研究或分离。
因此，本发明导致了改进的多潜能ES细胞的衍生、在培养中超过几次传代的维持、以及在成功产生嵌合动物中的应用。
具有在注射进受体囊胚后产生嵌合兔的表现的潜力的兔ES细胞的衍生和维持，将允许在这些多潜能ES细胞中在同源或非同源重组之后产生能够种系传递靶突变的后代。此外，兔ES细胞的多潜能将允许它们分化成特定的细胞类型，以研究或分离新基因。
本发明将在下面的实施例中得到说明，而这些例子不是用来限制本发明的范围。在本发明的基础上，一些改变和改进对本领域的技术人员将是显而易见的。实施例1细胞培养条件
从ES细胞系GM3〔依照Grave和Moreadith(1993)(图1)所描述来自荷兰带种兔胚胎〕开始，形成了相对于Grave和Moreadith所描述的方法(1993)来说，稳定了未分化ES细胞的比例的细胞培养条件。这样在将ES细胞注射进新西兰白囊胚的囊胚腔后，就有可能第一次产生嵌合体，这一点将在例2中证明。
对细胞培养条件，小鼠胚胎成纤维(MEF)饲养细胞层的密度，用于衍化MEFS的小鼠胚胎的年龄进行一些改变，以及使用用来分离细胞以传代的胰蛋白酶消化培养基。
Grave和Moreadith(1993)使用的培养基包括高葡萄糖Dulbecco的修改的Eagle培养基，4mM L-谷氨酰胺，0.1mM 2-巯基乙醇，148单位/ml青霉素G钠盐，148毫克/ml硫酸链霉素。
根据本发明，可以改变或增加下列补充物：4μg/ml牛胰岛素、103单位/ml小鼠白血病抑制因子、20％胎牛血清、1.5％MEM非必需氨基酸溶液。
兔ES细胞(每10cm佩特里细菌培养皿中1.5至3×106个细胞)在用丝裂霉素停滞有丝分裂的小鼠胚胎成纤维细胞上长至接近亚饱和，每隔4-6天将ES细胞传代到新鲜制备的饲养细胞上(每个10cm培养皿中3至4×106个细胞)。每天用上述改进的培养基培养细胞。培养皿保存于39℃，含5％CO2的潮湿空气中。小鼠胚胎成纤维细胞来自12.5天的小鼠胚胎，并在第一代被使用。小鼠胚胎成纤维细胞增加的密度〔每个10cm培养皿3至4×106，对比于2至3×106(Graves和Moreadith,1993)〕与使用12.5天的胚胎一起，显著地降低了ES细胞的分化。
分化的降低证明是非常关键的，因为只有未分化的细胞保存了整合入受体胚胎内细胞团的能力，这是产生嵌合后代的前提条件。
此外，使用改进的选择性胰蛋白酶消化的方法允许将滋养外胚层细胞(可诱导ES细胞的分化)从培养物中清除。胰蛋白酶消化培养基包括0.1％胶原酶，1％鸡血清和存在于磷酸盐缓冲液中的0.03％胰蛋白酶-EDTA(Gibco目录号：25200)。选择性的胰蛋白酶消化培养基允许ES细胞的选择性传代，因为小鼠胚胎成纤维细胞和滋养外胚层细胞比ES细胞从培养皿上分离得更慢。实施例2嵌合体的产生
由Graves和Moreadith(1993)从荷兰带种胚胎中衍化，并保存在实施例1中的培养条件下的GM3细胞，如以下说明用于产生嵌合体后代。确认的ES细胞的上皮样克隆的囊胚注射，在注射进兔胚胎后，以前还从未产生过嵌合兔(表1)。在下面说明的进一步实验中，来源于12代的GM3细胞保存于改进的培养条件下，此条件稳定了碱性磷酸酶阳性，未分化的ES细胞的比例。
性成熟的新西兰白种雌兔以12小时的间隔连续6次皮下注射猪卵泡刺激激素(FSH-0.4,0.4,0.5,0.5,0.5,0.5mg)，并在FSH的最后一次剂量后10小时静脉内注射75 IU的人绒毛膜促性腺激素(h CG)来进行超速排卵。hCG注射后，雌兔与同种成熟雄兔交配。
交配后90小时，通过用在39℃，含5％CO2的潮湿空气中预平衡的补加了3％牛血清白蛋白(Cohn组分V)和5％抗生素/抗有丝分裂溶液(Gibco,Grand Island,NY)的Dulbecco的磷酸盐缓冲液冲洗子宫腔以从子宫角回收囊胚。
通过注射上皮样碱性磷酸酶阴性和三维生长的碱性磷酸酶阳性的ES细胞入新西兰白种囊胚的囊胚腔中产生嵌合体(表2)。用来自GM3细胞系的20至300个细胞注射总数为287个新西兰白种囊胚。在Zeiss倒置显微镜下，用差别干涉光在250x放大倍数下用GM3细胞进行囊胚注射。用日常应用于小鼠的Narashige显微操作器进行显微操作。
用小切口和尖玻璃吸管将用GM3细胞注射的5到10个胚胎重新植入受体新西兰白种每个子宫角的近端部分。此受体已在供体中注射hCG 14小时后接受了75 IU的hCG。在用开他敏/Xylazin混合物全身麻醉的情况下，进行重新植入过程。
此过程的结果是总的成活出生率为23％。因为使用的ES细胞系来自着色的荷兰带种，将GM3 ES细胞注射进来自非着色新西兰白种的囊胚中将在嵌合体中产生明显的外皮颜色。依据外皮颜色判断，得到具有一条或多条黑带的(黑带对荷兰带种是典型的)的三个嵌合动物。嵌合性的比例在10％至多于50％之间变化，依据荷兰带种着色外皮的贡献。这些嵌合体中一个是雄性(图2a)，一个是雌性(图2b)，另一个可能是雌雄同体。这些结果构成了以下原理的第一个证据，即通过将在培养中保持并大量传代(15至20次)的ES细胞系进行囊胚注射可以产生嵌合兔。回顾一下，嵌合性看来，如以下进一步详细说明的，归因于三维生长的碱性磷酸酶阳性ES细胞。
表2:ES细胞注射进新西兰白种囊胚的囊胚腔后嵌合体的产生#囊胚注射#传代的ES细胞#出生率(％)#嵌合体(％) 76 124 87 20-30 50-100 100-30022 30(41)15 31(25)18 6(7) 1(1) 1(1) 1(1)总数 287 67(23) 3(1)
括号中的百分率是相对注射囊胚的数目。
的确，在ES细胞注射进囊胚腔后，嵌合体形成的频率是低的-只有4％的成活出生动物。这也许是由于下面几个因素，包括1)由于ES细胞要导入的成熟囊胚中有显著的多余空间，导致ES细胞不经常整合入发育中的胚胎中，2)荷兰带种ES细胞系与新西兰白种囊胚固有的不相容性，或3)细胞系多潜能的丢失。通过将ES细胞直接导入发育中的内细胞团来试图提高将ES细胞转移到发育中内细胞团，整合入随后的胚胎的前提条件，的频率，并未导致更高的频率或嵌合体的形成。使用荷兰白种囊胚(通过天然点突变起源于荷兰带种)做为ES细胞注射的受体，这样去除了牵涉的物种障碍，也未产生嵌合体。
进一步试验揭示如Graves和Moreadith(1993)所述的在培养中保持的ES细胞缺乏嵌合体形成以及如实施例1所述从早期传代的GM3细胞开始培养的ES细胞的低频率，最可能是由于前者缺乏残余的多潜能ES细胞，后者残余的多潜能ES细胞的低百分数。这一点可以通过碱性磷酸酶染色揭示，碱性磷酸酶在未分化的细胞中存在，一旦分化则迅速消失(Benham等，1981)。10代以后碱性磷酸酶阳性细胞在原始细胞系中的存在少于1％(图1)，尽管此频率在此处描述的改进培养条件下可以得到维持。表明原来认为代表确认的ES细胞(Graves和Moreadith,1993)的扁平上皮样细胞类型(图1)大多数是碱性磷酸酶阴性，不能整合入受体囊胚的内细胞团，不能产生嵌合后代。所以按实施例3所述衍化新的ES细胞系。实施例3改进的ES细胞的衍化
如以下所述的，ES细胞衍生的改进方法得到发展，它和改进的细胞培养条件一起，允许产生在经过8至10代后包含超过80％的未分化的碱性磷酸酶阳性细胞的5个兔ES细胞系。
超速排卵的荷兰带种雌兔与荷兰带种雄兔交配。在交配后5.5天(而不是交配后4或5天)从子宫角冲出囊胚，用补加3％牛血清白蛋白(Cohn组分V)和5％(v/v)抗生素/抗有丝分裂溶液的Dulbecco的磷酸盐缓冲液洗。囊胚在兔ES培养基(如上所述)中，于39℃含5％CO2的培育箱中保存直至进一步操作。用酸化的磷酸盐缓冲液(pH2.5)和存在于磷酸盐缓冲液中的0.5％链霉蛋白酶除去囊胚的粘蛋白外膜和透明带。用两根针将内细胞团从周围的滋养外胚层细胞人工制备出来，逐个放入96孔培养皿中(与以相当于每个10cm培养皿3至4×106个细胞密度的12.5天、1代的小鼠胚胎成纤维细胞一起铺盘)。
移出的内细胞团每天用如上所述的改进的兔ES细胞培养基(其中小鼠白血病抑制因子被人或兔白血病抑制因子所替代)重新培养。2天以后，通过用弯成斜角的玻璃吸管轻轻使滋养外胚层赘疣离开下面的饲养细胞层，并通过将它吸入玻璃吸管中，很容易地将内细胞团赘疣从剩余的滋养外胚层细胞中分离出来。
只有以三维生长为特征的ES样的克隆随后在新培养皿中传代，4至5天后，用如上所述的胰蛋白酶消化培养基选择性消化96孔，这样允许ES细胞，而不是滋养外胚层细胞或小鼠胚胎成纤维细胞选择性传代。改进兔ES细胞典型的三维生长以前还未被注意，它明显是这类细胞系的一个新特征。只有用改进的培养条件，并使用5.5天的胚胎，三维未分化的ES细胞克隆才能在培养中高频率保持。为了在很高的密度下保持ES细胞，另一个防止分化和多潜能丢失的前提条件，ES细胞以4至5天的间隔逐渐地传代至稍大的培养皿中。饲养细胞在随后的培养皿上保持相每个10cm培养皿3至4×106个细胞的密度。
通过这个过程得到的兔ES细胞系(图3)比以前报道的任何兔ES变异体更类似于多潜能小鼠ES细胞系。主要特征是克隆三维生长，高折光率和小的核/质比。最重要的特征是10次传代后，ES细胞的80至90％仍保持未分化，这一点通过碱性磷酸酶阳性染色(图3b)，和人细胞角蛋白18和小鼠波形蛋白的阴性染色(分化已知的标记)证明，(Viebahn等，1988；Piedrahita等，1990)。这些特性形成了与以前确认的ES细胞系(通过碱性磷酸酶阳性染色判断，少于1％的细胞是未分化的)的主要差别(图1)。在连续传代的兔ES细胞中，未分化细胞比例的显著增长(从1％至80-90％)，应该显著增加通过ES细胞注射进囊胚，产生嵌合兔的效率，并允许带有靶遗传改变的嵌合兔的产生。参考文献
-Babinetc,Bordenave GR(1980)；来自免疫外科手术制备的内细胞团移植的嵌合兔。J.Embryol Exp Morphoi 60:429-440
-Benham FJ,Andrews FW,Knavles BB,Bronson DL,Harris H(1981)：在人睾丸畸胎瘤细胞系中碱性磷酸酶同功酶做为分化可能标记。Dev Bio 88:279-287
-Bongso A,Fong C-Y,Ng S-C,Ratman S(1994)：从人囊胚中分离并培养内细胞团。Hum Reprod 9:2110-2117
-Bradley A(1987)：嵌合小鼠的产生和分析。在畸胎瘤和胚胎干细胞中：一个实用的方法(Ed.Robertson EJ),IRI出版Ltd.,牛津，1987,PP.113-151。
-Capecchi MR(1989)：通过同源重组改变基因组。科学244:1288-1292。
-Doetschman T,Williams P,Maeda N(1988)：建立仓鼠囊胚衍生的胚胎干(ES)细胞。Dev Biol 127:224-227
-Du F,Giles JR,Foote RH,Graves KG,Yang X,MoreadithRW(1995)：确认的兔胚胎干细胞的核转移导致正常囊胚的发展。J Reprod Fert 104:219-223
-Evans MJ,Notarianni E,Laurie S,Moor RM(1990)：来自猪和牛囊胚的多潜能细胞系的衍生和初步特征。Theriogenology33:125-128
-Gardner RL,Munro AJ(1974)：嵌合兔的成功构建。自然250:146。
-Graves KH,Moreadith RW(1993)：来自预先植入的兔胚胎的确认的多潜能胚胎干细胞的衍生和特征。Mol Reprool Dev36:424-433
-Iannaccone PM,Taborn GU,Garton RL,Caplice MD,Brenin DR(1994)：来自能够产生嵌合体的大鼠的多潜能胚胎干细胞。Dev Biol 163:288-292
-Johnson LV,Calarco PG,Siebert LS(1977)：在预先植入小鼠胚胎中的碱性磷酸酶活性。J.Embroyol exp Morph 40:83-89
-Moustafa L(1974)：来自胚胎细胞移植的嵌合兔。Proc SocExp Biol 147:485-488
-Nagy A,J Rossant,R Nagy,W Abromow-Newerly,和Roder JC(1993)：来自早期代数的胚胎干细胞的完全细胞培养衍化小鼠的衍生。美国国家科学院院报90:8424-8428
-Nieman H,Strelchenko N(1994)：分离兔胚胎干细胞样细胞。Theriogenology 41∶265
-Notarianni E,Gallic,Laurie S,Moor RM,Evans MJ(1991)：来自猪和绵羊的多潜能胚胎细胞系的衍化。J Reprod FertSuppl 43:255-260
-Notarianni E,Lauries,Moor RM,Evans MG(1990)：来自猪囊胚的多潜能胚胎细胞系在培养中的维持和分化。J.ReprodFert 40:51-56
-Piedranita JA,Anderson GB,BonDurant RH(1990)：在胚胎干细胞的分离中：小鼠、猪、羊胚胎的比较行为。Theriogenology34:879-890
-Robertson EJ(1987)：胚胎衍化的干细胞系；在畸胎瘤和胚胎干细胞：一个实用的方法(Ed.Robertson EJ),IRI出版Ltd.，牛津，1987,PP.71-112。
-Rubin EM,Barsh GS(1996)：通过基因组的生物洞察：小鼠到人。J Clin Invest 97:275-280
-Saito S,Strelchenko N,Nieman H(1992)：超过几代培养的牛胚胎干细胞样细胞系。Roux Arch Dev Biol 201:134-141
-Strojeck M,Reed MA,Hoover JL,Wagner TE(1990)：一个用于培养来自猪囊胚的形态学上未分化的胚胎干细胞的方法。Theriogenology 33:901-913
-Sukoyan MA,Golubitsa AN,Zhelezova AI,Shilov AG,Vatolin SY,Maximovsky LP,Andreeva LE,Mc whir J,Pack SD,Bayborodin SI,Kerlkis AY,Kizilova HI,Serov OL(1992)：分离和培养来自美国水貂的囊胚衍化的干细胞系。Mol Reprod Dev33:418-431
-Talbot NC,Caird ER jr,Vernon GP,Powell AM,Nel ND(1993)：培养猪囊胚的猪外胚层细胞。In Vitro Cell Dev Biol29A:546-554
-Thomson JA,Kalishman J,Golos TG,During M,HarrisCP,Becker RA,Hearn JP(1995)：分离灵长类胚胎干细胞系。美国国家科学院院报92:7844-7848
-Viebahn C,Lane BE，和Ramackers FCS(1988)在兔胚胎的早期胚胎发生中细胞有蛋白和波形蛋白的表达。细胞组织研究253:553-562。
-Wilson JM(1996)：用于基因治疗的人类疾病动物模型。J.Clin Invest 97:1138-1141
-Yang X,Foote RH.(1998)：通过简单方法从桑椹胚中产生嵌合兔。Gamete Res 21:345-351图解图1：
由Graves和Moreadith衍化的兔ES细胞(GM3细胞系)
A)确认的ES细胞的相差显微镜检查揭示了扁平上皮样表型
B)确认的ES细胞碱性磷酸酶染色表明了非常低的(＜1％)的碱性磷酸酶阳性细胞(红色)的百分率。图2：
A)带有一条黑带的雄性嵌合体。
B)带有几条黑带的雌性嵌合体。
条带是荷兰带种的典型特征，GM3ES细胞系是由荷兰带种衍化而来。图3：
A)使用上述改进的细胞培养和ES衍生条件衍生的新的细胞系的相差显微检查。
B)使用上述改进的细胞培养和ES衍生条件衍生的兔ES细胞系的碱性磷酸酶染色。新的ES细胞系具有三维生长，高折光率和80至90％碱性磷酸酶阳性染色的特征。