一种快速鉴定西花蓟马的方法 【技术领域】
本发明属于昆虫鉴定技术领域，更具体地说，本发明涉及一种西花蓟马(包括其成虫、若虫及蛹)的快速鉴定方法。
背景技术
西花蓟马Frankliniella occidentalis是一种食性极杂的害虫，已记载的寄主有66科244种植物，其还是番茄斑萎病毒(TSWV)等多种植物病毒的媒介昆虫，因此该虫已被多个国家列为检疫性害虫。西花蓟马原产于北美，后广泛传播于欧洲、亚洲(日本、韩国等)、非洲(肯尼亚、南非等)、中南美洲(哥斯达黎加、哥伦比亚等)和大洋州(澳大利亚、新西兰)等地。我国于2003年在北京大棚辣椒上发现西花蓟马，后来国内部分地区也有发现该虫的报道。
由于蓟马体型小，形态鉴定时须先将虫体制成玻片标本，具有一定难度；其若虫和蛹的鉴定则更为困难。因此传统的形态鉴定不能完全满足口岸检验检疫快速验放通关的需求。当前，西花蓟马快速鉴定已成为一个迫切需要解决的难题。现有技术中尚未发现相关报道。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术的不足，填补西花蓟马快速鉴定方面的空白，提供一种快速鉴定西花蓟马的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明提供了一种快速鉴定西花蓟马的方法，该方法采用下述顺序的步骤：
(1)对西花蓟马Frankliniella occidentalis、花蓟马Frankliniellaintonsa、黄胸蓟马Thrips hawaiiensis、八节黄蓟马Thripsflavidulus、烟蓟马Thrips tabaci、大蓟马Megalurothrips distalis的形态鉴定；
(2)运用北京天根的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒推荐的方法对步骤(1)所述六种蓟马种类分别提取其总DNA；
(3)采用简并引物mtD-7.2F：5’-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCAT-T-3’，mtD-9.2R：5’-CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTCTG-3’分别对六种蓟马种类的总DNA进行PCR扩增，目的片段为mtDNA COI基因中地一部分，片段大小为450bp；
(4)针对所获得6段序列设计2对西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，建PCR快速鉴定方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.首次建立了西花蓟马PCR快速鉴定方法；与常规形态鉴定相比，本发明的鉴定方法具有快速、准确、特异性好等优点；
2.所述的特异性引物及PCR反应体系和反应程序能扩增出与预期片段；
3.对满足口岸检验检疫快速验放通关的需要，有效保护生态环境，具有重要意义。
【附图说明】
图1是运用西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR进行PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，1.西花蓟马 2.花蓟马 3.黄胸蓟马 4.八节黄蓟马 5.烟蓟马 6.大蓟马 7.空白对照；
图2是运用西花蓟马特异性引物F.OL2/F.OR进行PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，1.西花蓟马 2.花蓟马 3.黄胸蓟马 4.八节黄蓟马 5.烟蓟马 6.大蓟马 7.空白对照。
具体实施方法
下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细描述。但它并不是对本发明保护范围的限定。
实施例1
——应用西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR进行PCR鉴定
分别对西花蓟马、花蓟马、黄胸蓟马、八节黄蓟马、烟蓟马、大蓟马六种蓟马种类进行总DNA的提取，以西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR进行常规PCR扩增。PCR反应总体积为50μL，其中：10×PCR Buffer 5μL，25mMol/L MgCl2 4μL，2.5mMol/L dNTP 2μL，Taq聚合酶0.3μL(Takara，5U/μL)，20pmol F.OL1/F.OR各2μL，模板DNA 2μL，然后加无菌水止终体积50μL。反应条件为：95℃ 5Min；94℃ 50s，53℃ 40s，72℃ 50s，共35个循环；最后72℃延伸6Min。
PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1，西花蓟马总DNA经PCR扩增后，在271bp处可以看到与预期片段大小一致的目的条带(图1，泳道1)。而其余蓟马种类及阴性对照没有特异性扩增条带(图1，泳道2-7)。
实施例2
——应用西花蓟马特异性引物F.OL2/F.OR进行PCR鉴定
分别对西花蓟马、花蓟马、黄胸蓟马、八节黄蓟马、烟蓟马、大蓟马六种蓟马种类进行总DNA的提取，以西花蓟马特异性引物F.OL1/F.OR进行常规PCR扩增。PCR反应总体积为50μL，其中：10×PCR Buffer 5μL，25mMol/L MgCl2 4μL，2.5mMol/L dNTP 2μL，Taq聚合酶0.3μL(Takara，5U/μL)，20pmol F.OL2/F.OR各2μL，模板DNA 2μL，然后加无菌水止终体积50μL。反应条件为：95℃ 5Min；94℃ 50s，53℃ 40s，72℃ 50s，共35个循环；最后72℃延伸6Min。
PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1，西花蓟马总DNA经PCR扩增后，在222bp处可以看到与预期片段大小一致的目的条带(图2，泳道1)。而其余蓟马种类及阴性对照没有特异性扩增条带(图2，泳道2-7)。
所述的特异性引物为：
F.OL1：5’-TTTGTCAACTTTTTATCACTCTGGAC-3’
F.OL2：5’-TCCCTTCATTTAGCAGGT-3’
F.OR：5’-CGGATCAAAGAAGGATGTA-3’。