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肽的制造方法
    本发明涉及用于制造 Omiganan 肽及其中间产物的方法， 并且此外涉及在用于制 造 Omiganan 的方法中的新颖的中间产物。
     Omiganan 是 对 于 肽 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-N H2(SEQ ID NO 1) 的常见国际命名 (CID)， 它主要是以其五盐酸化物 (5HCl) 盐的形式被使 用。Omiganan 是一种阳离子的抗微生物的肽。最近的研究还显示了它可以在炎症应答中 起作用。Omiganan 在体外分析中证明了对抗多种微生物的一种快速杀菌活性， 这些微生物 移殖于皮肤中而且可以在炎症病变的致病中起作用。此外， Omiganan 五氯化物目前是在 II-III 期用于治疗严重的痤疮， 并且在 III 期临床试验中用于预防中心静脉导管相关的血 流感染。
     Omiganan 可以经由一种线性肽合成而生产， 其中对应的氨基酸被顺序地添加到一 个增长的肽链中。至于所希望的 Omiganan 肽的产率和纯度， 这些方法是不令人满意的。
     本发明现在使之可得到一种用于该 Omiganan 肽的改进的合成。
     美国专利号 5,262,567 披露了使用一种化合物 ( 包括一个胍基团以及一种未取代 的四苯基硼酸盐离子 ) 作为该肽合成中的中间产物。作为一个实例， 描述了由精氨酸与四 苯基硼酸盐 (TPB) 形成的化合物的合成以及它在合成该肽 Boc-Leu-Arg-OH 中的用途。
     WO 99/65506A 披露了包含阳离子肽的药用组合物， 这些阳离子肽包括阳离子肽 MBI 11B20CN， 它包含 Omiganan 的氨基酸序列。
     因此本发明的目标是提供用于生产该 Omiganan 肽的方法， 该方法以高产率和高 纯度给出 Omiganan。根据本发明的方法出人意料地允许以有限的步骤 ( 特别是纯化步骤 ) 生产所述肽， 因此大大减小了制造成本。
     因此本发明在第一方面涉及用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)Omiganan 肽或其一种衍生物的一种方法， 该方法 包括在溶液中将一种第一肽与一种第二肽进行偶联的至少一个步骤， 该第一肽具有一个活 化的羧基以及至少两个氨基酸单元、 或一种选自下组的氨基酸， 该组的组成为 ： 具有一个活 化羧基的 Ile、 Leu、 Arg、 以及 Trp、 Pro ； 该第二肽具有一个游离的氨基以及至少两个氨基酸 单元， 其中该第一与第二肽是不同的并且包含选自下组的多个氨基酸， 该组的组成为 ： Ile、 Leu、 Arg、 Trp、 Pro、 以及 Lys， 处于由 Omiganan 中的序列 Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-P ro-Trp-Arg-Arg-Lys(SEQ ID NO 1) 所说明的顺序中。
     为了本发明的目的， 术语 “肽” 是指一种聚合物， 其中这些单体是通过酰胺键共价 地附接在一起的氨基酸。肽是两个或经常是更多个氨基酸单体长。另外， 所有的肽序列由 左边或右边取向是处于氨基端到羧基端的常规方向的那些化学式代表。
     为了本发明的目的， 术语 “氨基酸” 旨在表示任何包括至少一个 NR1R2 基团 ( 优选 NH2 基团 )、 以及至少一个羧基的化合物。本发明的这些氨基酸可以是天然存在的或是合成 的。这些天然氨基酸除甘氨酸之外， 包含一种手性碳原子。除非另外确切指明， 优选的是包 含具有 L 构型的天然氨基酸的这些化合物。贯穿本申请将氨基酸残基缩写为如下 ： 异亮氨 酸是 Ile ； 亮氨酸是 Leu ； 精氨酸是 Arg ； 色氨酸是 Trp ； 脯氨酸是 Pro 并且赖氨酸是 Lys。
     为了本发明的目的， 术语肽的 “C- 端” 是由一个游离羧基 (-COOH) 封端的一种氨基 酸序列的末端。另一方面， 术语肽的 “N- 端” 是指由一种具有游离氨基 (-NH2) 的氨基酸封 端的一种氨基酸序列的末端。
     为了本发明的目的， 术语 “偶联” 是指在一种氨基酸的羧基或一种第一肽的 C- 端 与另一种氨基酸的氨基或一种第二肽的 N- 端之间的反应。换言之， 在偶联的过程中， 两个 肽中间产物片段、 或一个肽中间产物片段以及一种反应性氨基酸被偶联， 一般是在一种适 当的溶剂中、 并且通常是在促进该偶联反应的效率以及质量的另外试剂的存在下。这些肽 中间产物片段被反应性地安排， 因而一个片段的 N- 端变为偶联至另一个片段的 C- 端， 或反 之亦然。
     如在此使用的， 术语 “肽衍生物” 包括一种类似物， 其中一个或多个氨基酸残基已 经被对应的 D 异构体或被一个非天然的氨基酸残基、 或其一种化学衍生物所取代。一种肽 的化学衍生物包括但不限于 ： 含有多个另外的化学部分的一种衍生物， 假如该衍生物保持 该肽的抑制活性， 则这些另外的化学部分通常不是该肽的一部分。这类衍生物的实例是 ： (a) 该氨基端的或另一个游离氨基的 N- 酰基衍生物， 其中该酰基基团可以是一种烷酰基 基团比如乙酰基、 己酰基、 辛酰基 ； 一种芳酰基， 如苯甲酰基、 或生物素基 ； (b) 该羧基端的 或另一个游离羧基或多个羟基的酯类 ； 以及 (c) 该羧基端的或另一个游离羧基的酰胺， 通 过与氨或与一种适当的胺反应而产生。Omiganan 的衍生物及其中间产物还是 ( 例如 ) 该 Omiganan 序列的受保护的片段和肽、 Omiganan 与无机的或有机酸的盐类 ( 优选无机酸、 并 且最优选盐酸 ) 的盐及其中间产物。可能使用的与有机酸的盐的实例是与乙酸、 柠檬酸、 草 酸、 三氟乙酸、 四苯基硼酸以及酒石酸的盐类。 在一个优选的实施方案中， 本发明的方法包括将 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与 Ile-Leu 进行偶联的步骤， 其中 Ile 的 氨基受一个氨基保护基团所保护。
     此外优选的是本发明的方法包括将 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3) 或其一种衍生物与 Arg-Trp-Pro 进行偶联的步骤， 其中 Arg 的氨基受到一个保护基团 保护。
     该方法优选地包括将 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4) 或其一种衍生物与 Trp-Trp-Pro 进行偶联的步骤， 其中 Trp N 端的氨基受到一个保护基团保护。
     此外， 本发明根据一个第二方面是针对一种用于制造 H-Arg-Lys(Boc)-NH2 的方 法， 该方法包括以下步骤 ：
     (a) 将 Z-Arg-OH.Cl 与 H-Lys(Boc)-NH2 进行偶联 ； 并且
     (b) 将步骤 (a) 中所获得的 Z-Arg-Lys(Boc)-NH2 氢解， 优选是在一种 Pd 催化剂的 存在下。
     术语 “Lys(Boc)” 旨在表示氨基侧链受到一个 Boc 基团保护的一种赖氨酸。
     在第三方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2)。
     在第四个方面， 本发明是针该新颖的中间产物 Z-Arg-Trp-Pro-OH。
     在第五个方面， 本发明是针对一种用于制造 Z-Arg-Trp-Pro-OH 的方法， 该方法包 括使 H-Trp-Pro-OH 与 Z-Arg-OH.HCl 进行偶联的步骤。
     在第六个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Trp-Pro-OH。
     在第七个方面， 本发明是针对一种用于制造 Z-Trp-Trp-Pro-OH 的方法， 该方法包 括使 H-Trp-Pro-OH 与 Z-Trp-Osu 进行偶联的步骤。
     在第八个方面， 本发明是针对一种用于制造中间产物 Boc-Ile-Leu-OH 的方法， 该 方法包括使 Boc-Ile-NCA 与 H-Leu-OH 进行偶联的步骤。
     在第九个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4)。
     在第十个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys( Boc)-NH2(SEQ ID NO 3)。
     在本发明的方法中， 保护基团一般用于在所涉及的氨基酸或肽中间产物中的一个 或多个氨基。保护基团的用途没有具体进行限制。
     以说明的方式， 在本发明的这些化合物中可以采用以下保护基团 ：
     酰基型保护基团， 特别是甲酰基、 三氟乙酰基、 邻苯二甲酰基、 4- 甲苯磺酰基、 苯磺 酰基以及 2- 硝基苯基次磺酸基 ；
     芳香族的尿烷型保护基团， 例如尤其是取代的或未取代的苄氧基羰基、 对 - 溴代 苄氧基羰基、 对 - 甲氧基苄氧基羰基、 二苯甲基氧基羰基、 2-(4- 联苯基 ) 丙基 (2) 氧基羰 基、 2-(3， 5- 二甲基氧苯基 )、 丙基 (2) 氧基羰基、 以及三苯基膦酰基乙基氧基羰基 ； 脂肪族的尿烷型保护基团， 特别是叔丁氧羰基、 二异丙基甲氧羰基、 异丙氧羰基、 乙氧羰基、 烯丙氧羰基、 9- 芴甲氧羰基、 2- 甲基磺酰基乙氧羰基以及 2， 2， 3- 三氯乙基氧基 羰基 ；
     环烷基尿烷型保护基团， 例如尤其是环戊氧羰基、 金刚烷氧基羰基、 环己氧基羰 基、 叔戊氧基羰基以及异冰片基氧基羰基 ；
     硫尿烷型保护基团， 特别是苯基硫代羰基、
     烷基型保护基团， 例如尤其是三苯基甲基 ( 三苯甲基 ) 以及苄基 ；
     三烷基硅烷基团， 如三烷基硅烷。上述的保护基团特别适合作为氨基保护基团。
     在本发明的一种或多种方法中， 优选的是在与一个保护基团进行偶联的步骤过程 中一种氨基酸基团中的至少一个氨基受到保护， 该保护基团选自一种芳香族的尿烷型保护 基团以及脂肪族的尿烷型保护基团。 更优选地， 所述保护基团是选自一种叔丁氧羰基 (Boc) 基团与一种苄氧基羰基 (Z) 基团。
     在本发明的一种或多种方法的一个优选实施方案中， 该苄氧基羰基 (Z) 基团被用 作一个氨基酸单元中一个端氨基的保护基团， 其中该氨基酸单元是 Arg 或 Trp。
     在本发明的一种或多种方法的另一个优选实施方案中， 该叔丁氧羰基 (Boc) 基团 被用作 Lys 中的侧链氨基的和 / 或 Ile 中的 N- 端氨基的保护基团。
     特别适合用于保护该羧基的其他保护基团包括烷氧基， 特别是甲酯、 乙酯、 叔丁酯 以及苄基酯。在一个优选实施方案中， Lys 的羧基是作为酰胺、 特别是作为 CONH2 基团被保 护的。
     在本发明的一种或多种方法中， 该第一肽具有一个活化的羧基以及一般至少两个 氨基酸单元。在本发明的方法中可以使用不同的活化基团， 它们减少了副反应和 / 或增大 了反应效率， 优先选自 ： 碳二亚胺类、 羰基二咪唑类、 酰卤类、 磷鎓盐类、 以及脲鎓或胍鎓盐
     类。例如， 磷鎓和脲鎓盐类在一种叔碱 ( 例如二异丙基乙胺 (DIPEA) 以及三乙胺 (TEA)) 的 存在下可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类 ( 例如 BOP、 PyBOP、 HBTU、 以及 TBTU 全部 产生了 HOBt 酯 )。帮助防止外消旋作用的其他试剂包括碳二亚胺类 ( 例如 N， N- 二环己 基碳二亚胺 (DCC)、 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳二亚胺 (EDC) 或水溶性碳二亚 胺 (WSCDI)) 与一种添加的辅助亲核体 ( 例如 1- 羟基 - 苯并三唑 (HOBt)、 3， 4 二氢 -3- 羟 基 -4- 氧代 -1， 2， 3- 苯并三嗪 (HOOBT)、 1- 羟基 - 氮杂苯并三唑 (HOAt)、 或 HOSu) 或其衍 生物。可以使用的另一种试剂是 TBTU。例如用 N， N- 二环己基碳二亚胺 (DCC)、 N-(3- 二 甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳二亚胺 (EDC)、 新戊酰氯 (PivCl)、 异丁基氯甲酸酯 (IBCF)、 HBTU(O-( 苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 )、 HATU(O-(7- 氮杂苯并 三唑 -1- 基 )-N， N， N’ ， N’ - 四甲基铵脲鎓六氟磷酸盐 )、 以及 EEDQ(2- 乙氧基 -1- 乙氧碳 酰基 -1， 2- 二氢喹啉 ) 获得了好的结果。
     根据本发明优选的活化基团是 DCC、 EDC 以及 HBTU。
     当使用这类羧酸活化剂时， 该偶联反应经常是在一种碱作为额外试剂的存在下进 行的。在本发明的另一个具体的方面， 该偶联反应因此是在一种碱的存在下进行的。该碱 是优先选自叔胺类以及杂芳香族胺类， 如 N- 甲基吗啉 (NMM)、 吡啶、 三乙胺 (TEA)、 二异丙基 乙胺 (DIPEA) 或它们的混合物。更优选地， 它是选自 N- 甲基吗啉以及二异丙基乙胺。 除这些活化基团之外， 有时候有利地使用添加剂。优选的添加剂是 N- 羟基丁二酰 亚胺 (Suc-OH)、 N- 羟基苯并三唑 (HOBt)、 或 3， 4- 二氢 -3- 羟基 -4- 氧代 -1， 2， 3 苯并三嗪 (HOOBt) 以及它们的衍生物。通常这些添加剂是基于待活化的羧基的量值按 1 到 2 当量的 量值使用。
     在本发明的另一个具体的方面， 如以上说明的肽的偶联是在至少一种极性有机溶 剂的存在下进行的。在一个具体的优选实施方案中， 该极性有机溶剂允许对所形成的肽键 的外消旋作用、 该肽和 / 或肽片段的溶解度、 以及偶联反应速率进行特别有效的控制。该 极性有机溶剂优先选自 ： N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)、 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 N- 甲基吡 咯烷酮 (NMP)、 二甲亚砜 (DMSO)、 乙酸乙酯 (AcOEt)、 异丙基乙酸酯、 二氯甲烷 (DCM)、 亚甲 基氯、 吡啶、 氯仿、 乙腈、 二甲氧基乙烷、 二噁烷、 四氢呋喃 (THF) 或它们的混合物。更优选 地， 它是选自 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 二氯甲烷 (DCM)、 以及 N， N 二甲基甲酰胺 (DMF) 或它们的混合物。最优选地， 该极性有机溶剂是 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)。一种优选的混合物包含 20％到 80％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 80％到 20％ ( 体积 ) 的 二氯甲烷 (CH2Cl2)、 更优选 50％到 70％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 50％到 30％ ( 体积 ) 的二氯 甲烷 (CH2Cl2)。
     如在此使用的术语 “偶联” 或 “偶联步骤” 具体是指将不同的肽或氨基酸进行偶联 的步骤。
     在一个优选的实施方案中， 本发明的方法包括使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与受保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物进行 偶联的步骤。在这个步骤中， 优选将 HOOBt 用作一种添加剂。此外， 这个偶联步骤优选是在 DMA/ 二氯甲烷 (CH2Cl2) 的一种混合物中进行， 该混合物优选包含 50％到 75％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 25％到 50％ ( 体积 ) 的二氯甲烷 (CH2Cl2)。此外该偶联步骤优选在 EDC 的存在下 进行。
     在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中， 该第二肽具有选自以下的化 学式 ： NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、 NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)， NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6)， NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Ar g-Lys(X)-R(SEQ ID NO7)， NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)， N H2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)， NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-T rp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)， NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)， 其中 X 是用于该 Lys- 侧链氨基的一个保护基团、 优选 是一种 Boc 基团， 并且 R 是用于 Lys 的羧基的一个羧基保护基团、 优选是一种酰胺基团。
     事实上本发明允许贯穿该合成对于在该 Ominagan 肽的 10 位置包含 Arg 的 D- 对 映异构体的多种产物的存进行控制并且将其最小化。
     在 这 个 实 施 方 案 中， 该 第 二 肽 总 体 上 包 括 从 0.1wt ％ 到 1wt ％、 有利地从 0.2wt ％ -0.9wt ％、 并 且 经 常 从 0.2wt ％ 到 0.7wt ％ 的 一 种 肽， 该肽选自 ： NH2-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、 NH2-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)、 NH2-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6) 、 NH 2-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、 NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、 NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、 NH2-ArgTrp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、 NH2-Leu-Arg-Trp-ProTrp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)、 以及 NH2-(D)Leu-Arg-Trp-ProTrp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)， 其中 X 和 R 是如上所说明的。本发 明还涉及所述第二肽。
     在一个进一步优选的实施方案中， 该第二肽是 NH2-Arg-Lys(X)-R， 其中 X 是用 于该 Lys- 侧链氨基的一个任选的保护基团、 优选是一种 Boc 基团， 并且 R 是用于 Lys 的 羧基的一个羧基保护基团， 优选是一个酰胺基团， 并且该第一肽是选自下组 ： Y-Trp-Arg、 Y-Pro-Trp-Arg、 Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)、 Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)、 Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 14)、 Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15)、 Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16)、 Y-Leu-Arg-Trp-Pro-T rp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、 Y-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SE Q ID NO 18)， 并且 Y 是用于该 N- 端氨基的一个氨基保护基团、 特别是如上所说明的、 优选 是一个 Z 基团。
     在这个具体的实施方案中， 该偶联有利地在一种芳基环化的氧代 - 三嗪活化剂、 优选 HOOBt 的存在下进行。
     在这个实施方案中， 该偶联总体上是在从 -10℃到 +10℃的温度下进行的。
     在这个实施方案中， 该偶联经常是在一种卤化的与非卤化的溶剂的一个混合物 中、 优选一种氯化的溶剂与一种酰胺型溶剂的一个混合物进行的。 适当的氯化的溶剂包括 ： 例如氯仿、 1， 2- 二氯乙烷以及优选地二氯甲烷。适当的酰胺型溶剂包括 ： 例如 N- 甲基吡咯 烷酮、 N， N- 二甲基甲酰胺以及优选地 N， N- 二甲基乙酰胺。亚甲基氯与 N， N- 二甲基乙酰胺 的一种混合物已经给出了良好的结果。
     特别有利的是使 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 偶联。
     在本实施方案的最优选的方面， 使 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 偶联， 该活化剂是 HOOBt， 该溶剂是 DMA 与亚甲基氯的一种混合物， 并且该偶联在第一时间段 中在 -5℃ ±5℃的温度下进行了 3 到 5 小时、 并且在第二时间段中在 +5℃ ±5℃的温度下 进行了 6 到 10 小时。
     根据本发明特别优选的方法是依照图 1 的方案。在该方案中 X 与 Y 可以是相同的 或不同的。它们优选地是不同的。当 X 是一种叔丁氧羰基 (Boc) 基团并且 Y 是一种苄氧基 羰基 (Z) 基团时， 获得了良好的结果。
     本发明还涉及用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg -Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的 Omiganan 肽的一种脱保护方法， 该方法包括在基本上无水 的条件下使具有化学式 Y1-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Y2)-NH 其中 Y1 与 Y2 指代相同或不同的氨基保 2(SEQ ID NO 1) 的一种前体肽与一种酸进行反应， 护基团或 H， 并且 Y1 或 Y2 的至少一个是一种对酸敏感的氨基保护基团。
     保护基团 Y1 和 Y2 可以是例如包括在以上概括说明中的氨基保护基团。优选的是 Y1 与 Y2 二者都是氨基保护基团。更优选地， Y1 与 Y2 二者都是 Boc。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该酸经常是选自 ： HCl、 HF、 HBr、 HI、 三氟乙酸、 以及 三氟甲磺酸。更优选地， 该酸是 HCl。特别是在此情况下， 对每摩尔肽使优选用 6 到 32 摩 尔、 更优选 12 到 24 摩尔的酸。 根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在一种有机溶剂中进行， 优选是在一种 脂肪族的醇、 特别是一种仲醇中， 更优选是在异丙醇中。
     在根据本发明的脱保护方法中， 基本上无水的条件是例如通过在包含从 10mg/kg 到 1.5wt％、 优选从 50mg/kg 到 1wt％的水的一种液体反应介质中进行该反应而实现的。更 优选地， 该反应介质的含水量是从 100mg/kg 到 0.5wt％。
     尤其在 Y1 与 Y2 中的至少一个是 Boc 时， 该反应有利地在对于碳阳离子、 特别是该 叔丁基阳离子的一种清除剂 ( 例如苯甲硫醚、 以及优选地 4-( 甲硫基 ) 苯酚 ) 的存在下进 行。
     根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在从 0℃到 80℃、 优选从 25℃到 45℃的 温度下进行的。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该 Omiganan 肽有利地是以其五盐酸化物盐的形 式被回收。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该前体肽优选地是通过根据本发明的方法获得 的。
     在该脱保护方法的一个特别优选的实施方案中， 使 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Tr p-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 1) 脱保护从而产生 5HCl.H-Ile-Leu-A rg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 是在 HCl 与一种仲醇的一 个混合物中、 优选在用于叔丁基碳阳离子的一种清除剂 ( 例如 4-( 甲硫基 ) 苯酚 ) 的存在 下进行的。
     最优选地是使用 HCl 与异丙醇的一种混合物。以这种方式所获得的脱保护的产物 可以按一种特别经济有效的方式进行纯化， 并且比其他可能的脱保护方法 ( 除其他之外包 括用乙酸、 三氟乙酸、 甲烷磺酸、 HF、 以及 HBr 进行分裂 ) 更有效。 本申请人已经发现， 例如与 用三氟乙酸 (TFA)( 对于富含色氨酸的肽像 Omiganan 而言是更多副产物的来源 ) 进行的一
     个程序相比， 一种 HCl/ 异丙醇混合物优选在一种用于叔丁基碳阳离子的清除剂的存在下 给出了更好的结果。 而且， 在此具体情况下， 脱保护优选是在一种如上所说明的基本上不含 水的反应介质中进行。而且， 在此具体情况下， 所述脱保护反应有利地是在从 20℃到 80℃、 优选从 25℃到 45℃、 并且更优选从 30℃到 40℃的温度下进行。
     在本发明的多个实施方案中， 在一种催化剂的存在下进行一种氢解作用。 优选地， 使用一种可以结合不同载体 ( 例如碳、 SiO2、 Si-Al 化合物等等 ) 采用的 Pd 催化剂。
     在一个具体实施方案中， 根据本发明的方法包括形成一种含 Arg 的肽的四苯基硼 酸盐。典型地， 所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐是通过使一种偶联步骤反应介质与四苯基 硼酸盐阴离子的一种来源相接触而形成的， 该介质包含经常通过根据本发明的方法的一个 偶联步骤所获得的一种含 Arg 的肽。四苯基硼酸盐类适合作为四苯基硼酸盐阴离子的来 源。
     因此， 优选的是在一种四苯基硼酸盐 (TPB) 的存在下进行至少一个步骤， 该盐优 选地是在至少一个偶联步骤完成以后加入。
     在该四苯基硼酸盐 (TPB) 的盐中的阳离子可以是有机的或无机的。有机离子的实 例是四乙基铵、 二异丙基乙基铵、 N- 乙基哌啶鎓、 N- 甲基吗啉鎓、 N- 乙基吗啉鎓。适当的无 + + 机离子是例如钠 (Na ) 或锂 (Li )。最优选地， 使用一种能够形成水溶液的四苯基硼酸盐。 优选的是 LiTPB 与 NaTPB。最优选使用的四苯基硼酸盐是 NaTPB。
     该 TPB 阴离子可以在其苯环上被取代或者它可以无任何取代而被使用。优选地， 该 TPB 阴离子没有被取代。适当的取代的 TPB 阴离子的实例包括 ： 例如四 (3， 5- 双三氟甲 苯基 ) 硼酸盐。
     所采用的四苯基硼酸盐的量值可以在宽的界限中变化。优选地， 在该含 Arg 的肽 中对每个 Arg 单元采用从 1 到 10 当量、 优选 1 到 1.5 当量的四苯基硼酸盐。
     该四苯基硼酸盐在本发明的方法中优选是在完成至少一个偶联步骤之后的处理 (work-up) 过程中、 在一种溶剂或多种溶剂的混合物的存在下采用。适当的溶剂尤其是甲 醇、 甲氧乙醇、 二氯甲烷、 正丁醇、 异丁醇、 仲丁醇、 以及叔丁醇。 使用甲氧乙醇获得了良好的 结果。
     在这个实施方案中， 可以有利地使所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐不经分离而经 受至少一个另外的合成步骤。经常地， 使所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐经受至少一个脱 保护步骤接着经受一个偶联步骤。
     在一个最优选的实施方案中， 本发明是针对一种用于制造 Omiganan 肽的方法， 该 方法包括以下步骤 (a) 至 (d) ：
     (a) 使 Arg-Lys-NH2 或其一种衍生物、 特别是使 Arg-Lys(Boc)-NH2 与 N- 保护的 Trp-Arg-OH 或其一种衍生物、 特别是与 Z-Trp-Arg-OH 进行偶联。
     (b) 使 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4) 或 其 一 种 衍 生 物、特 别 是 使 Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4) 与 N- 保护的 Trp-Trp-Pro 或其一种衍生物、 特 别是与 Z-Trp-Trp-Pro-OH 进行偶联。
     (c) 使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3) 或其一种衍生物、 特别 是使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 3) 与 N- 保护的 Arg-Trp-Pro 或 其一种衍生物、 特别是与 Z-Arg-Trp-Pro-OH 进行偶联。(d) 使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种 衍生物、 特别是使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2) 与 N- 保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物、 特别是与 Boc-Ile-Leu-OH 进行偶联。
     图 1 的方案展示了该包括步骤 (a)、 (b)、 (c)、 以及 (d) 的方法的最优选的实施方 案。
     在根据本发明的这些方法中所采用的这些操作条件总体上对于本发明不是关键 的。因此， 进行该方法的压力总体上是为了将该反应介质维持在一种液态， 有利的是在 0.1 与 10 巴之间。在大气压下已经获得了良好的结果。进行该方法的该温度通常是在 -50℃ 与 100℃之间、 并且可以依赖于一个具体步骤中的这些反应物以及旨在最终制备的化合物 的性质而改变。优选地， 该温度是大于或等于 -45℃， 更优选地它是大于或等于 -25℃。另 一方面， 该温度优选是低于或等于 60℃， 更优选地它是大于或等于 50℃。
     在特殊的偶联步骤中， 可以应用优选的更受限制的温度范围。例如在将 Arg-T rp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与受保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物进行偶联的步骤中， 优选的将该偶联反应在一个第一时间段中在 0℃ ±5℃的温度范围内进行优选大约 3 到 5 小时、 并且在一个第二时间段中在 20℃ ±5℃ 的温度范围内优选进行大约 6 到 10 小时。 在本发明的方法的一个优选实施方案中， 使用了中间产物 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Bo c)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4)。优选地， 通过将 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 进 行偶联而获得 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4)。优选地， 该偶联步骤是 在 HOOBt 的存在下进行的。
     在这个偶联步骤中， 优选将温度在一个第一时间段中在 -5℃ ±5℃的范围内维持 大约 2 到 5 小时、 并且在一个第二时间段中在 5℃ ±5℃的温度范围内维持大约 6 到 10 小 时。
     将 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 进行偶联之后优选跟随一个步骤 ( 还将被称作处理步骤 )， 该步骤包括向该偶联步骤的反应介质中加入一种 NaTPB 盐， 优选 是在水溶液中， 更优选是在 Na2CO3 的存在下。
     在本发明的一个或多个偶联步骤中， 一种肽优选地是按 0.8 到 1.2 摩尔的肽 / 每 摩尔其他肽、 更优选 0.9 到 1.1、 并且最优选 0.95 到 1.05 摩尔的肽 / 每摩尔其他肽的量值 使用。
     例如， 具有一个活化的羧基以及一般至少两个氨基酸单元的第一肽优选地是与具 有一个游离氨基以及至少两个氨基酸单元的第二肽进行偶联， 使用 0.8 到 1.2、 更优选 0.9 到 1.1 摩尔第一肽 / 每摩尔第二肽的一个量值。
     本发明的该第一方面的方法具有众多的优点 ：
     - 它是一种具有较少反应步骤的非常收敛的路径。在使用四苯基硼酸盐 (TPB) 盐 类的多个实施方案中， 在用 TPB 盐类进行选择性提取之后有可能使那些盐沉淀或者不经分 离而继续进行合成。这提供了合成过程中的增大的灵活性。没有必要用在侧链上受保护的 Arg 进行操作。
     - 在色氨酸单元的吲哚环上进行合成的过程中不需要保护。已知色氨酸对强酸性 介质是非常敏感的 ( 这些吲哚核的烷化、 有色副产物的形成 )。 考虑到事实上这种保护是昂
     贵的并且之后是难以消除的， 这是一个重要的优点。因此， 在一种具体的优选实施方案中， 在此前所披露的这些方法以及片段中， 至少一个色氨基酸单元并且优选全部色氨基酸单元 是未被保护的。
     - 本发明的方法还允许减少 Arg 10 以及 Leu 2 上的外消旋作用的量， 这允许了更 容易的最终纯化。
     - 最后， 本发明的方法允许相当平稳的条件用于最终的脱保护， 特别是 ( 若适当 时 )Boc 基团的消除。
     - 本发明的方法此外还允许 ( 特别是在使用具有一种 C- 端 Pro 的第一肽的某些优 选实施方案中 ) 进一步减小外消旋作用的风险， 从而允许了一种更加容易的最终纯化。
     具 体 地 说， 本 发 明 的 该 第 一 方 面 的 方 法 允 许 获 得 Omiganan 而 伴 随 有 显 著 减 小 的 量 的 这 三 种 主 要 副 产 物， 即 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)、 H-Ile-(D)Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg -Lys-NH2(SEQ ID NO 1)( 是通过在偶联步骤过程中对该外消旋作用的更好控制 ) 以及 H-I le-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-OH(SEQ ID NO 1)( 是通过避免在一 种强酸性水介质中工作 )。
     一个将根据本发明的方法所生产的 Omiganan 在一个另外的纯化步骤、 特别是一 个单一纯化步骤中进行纯化。
     本发明还涉及用于纯化该 Omiganan 肽的一种方法， 该方法包括使一种不纯的 Omiganan 肽经受一种液相色谱法、 特别是 HPLC 色谱法， 其中流动性包括水以及一种有机溶 剂。在 HPLC 色谱法技术之中， 反相以及离子交换相色谱法是优选的。使用反相获得了优异 的结果。可以使用不同的反相柱， 特别是基于 C4、 C8、 C18 硅石的反相柱。
     在这个方法中， 该流动相优选地包括乙腈。 在这个方法中， 该流动相有利地包括一 种缓冲剂。使用一种乙酸盐缓冲剂获得了良好的结果。包括乙腈与一种乙酸盐缓冲剂、 pH 5 的一种体系作为流动相是特别优选的。
     根据本发明的纯化方法经常进一步包括一个反离子交换步骤。例如， 可以将纯化 过的肽进行洗涤， 优选是在一种色谱柱上用一种氯化物盐水溶液 ( 特别是 NaCl 水溶液 ) 与 一种有机溶剂 ( 特别是乙腈 ) 的一个混合物。若适当时， 在离子交换之后可以用乙腈与水 的一种混合物将该纯化过的肽从该柱中洗脱， 由此可以获得纯化的 omiganan 的一种浓缩 溶液。
     根据本发明的纯化方法还可以包括一个结晶步骤。
     根据本发明的纯化方法因此可以进一步包括一个浓缩步骤以及任选地一个冷冻 干燥步骤。
     实例
     以下实例说明了本发明的方法， 但不应被解释为对本发明进行限制。若没有另外 指明， 则该化合物的纯度是大于按重量计 98％并且指出的比率是指体积比。
     1.Z-Arg-Lys(Boc)NH2.TPB 的合成
     将 1.02 当量的 Z-Arg-OH.HCl(Mw ＝ 344.8) 在室温下加入 DMA 与 CH2Cl2(6/4) 的 一种混合物中。此后， 加入 1.03 当量的 HOBt(N- 羟基苯并三唑， Mw ＝ 135.12) 以及 1.00 当量的 H-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 245.3 ； 纯度 ： 99％ )。在将该溶液冷却到 0±5℃之后， 加入1.03 当量的 EDC.HCl(Mw191.7)。
     在 0±5℃下继续搅拌另外 30 分钟， 然后在室温下搅拌至少 2 小时。在通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 将用一种 CH2Cl2/ 异 -BuOH(6/4) 混合物稀释该反应混合物并且用 0.5 当量的 HCl 溶液进行萃取。用 CH2Cl2/ 异 -BuOH(6/4) 的一种混合物第二次萃取该酸 性水相。首先用含有 1.05 当量的四苯基硼酸钠 (TPBNa)(Mw ＝ 342g) 的一种 Na2CO3 的 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤组合的有机相， 然后用一种 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液洗涤 4 次。
     在已经将该有机相在真空中浓缩以后， 将甲氧乙醇以若干个部分加入该浓缩物中 以除去痕量的异丁醇接着将它进一步蒸发。 然后将该浓缩物最后用甲氧乙醇稀释并且将其 缓慢地加入一种冷的 (0 到 5℃ )5％ ( 重量 )NaCl 水溶液之中。该肽沉淀出并且将其在低 温下保持至少 30 分钟然后过滤。
     用冷 (0±5℃ ) 脱矿质水将该固体洗涤 3 次。其后， 使该固体再溶解于 MeOH 中并 且进行搅拌直到获得一种轻微混浊的溶液为止。 将该溶液部分地浓缩并然后将该甲醇溶液 缓慢地加入到一种冷却的水性 NaCl 5％ ( 重量 ) 溶液中。在将该沉淀物在被过滤掉之前 在低温下保存至少 30 分钟。最后用冷的脱矿质水 (0±5℃ ) 将该固体洗涤 3 次并且在真 空 (45℃ ) 下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。基于对含量进行的 NMR 测量， 产率是 89％。
     2.HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 的合成
     使 1.00 当量的 TPB.Z-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 535.6 ； 纯度＝ 62.0％ ) 的一种甲 醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000 ； 3.00 当 量 )。在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的 有机相在真空中部分浓缩。将浓缩的溶液用水稀释。
     加入 Pd 催化剂 (Mw ＝ 106.4 ； 2％重量 ) 并且然后将该悬浮液在 35℃ ±5℃下氢 化至少 5 小时。将该催化剂过滤掉、 用一种甲醇 / 水混合物洗涤两次。将该滤液在真空中 蒸发， 该残余物悬浮在 DMA 中并且使之在真空中部分蒸发以清除痕量的水。在检验水的含 量以后， 用 HCl(0.1N) 滴定最终溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于滴定 ) ： 90％。
     3.Z-Trp-Arg-OH 的合成
     将 2.00 当量的水和 1 当量的 Arg(Mw ＝ 174.2) 与 DMF 混合并且在室温下进行搅 拌直到获得一种溶液为止。将 1.03 当量的 Z-Trp-OSu(Mw ＝ 435.45 ； 纯度＝ 98％ ) 溶解在 DMF 中并且倾倒在该精氨酸溶液中。然后在室温下继续搅拌至少 5 小时。在通过 HPLC 检验 该反应的终止以后， 通过缓慢地加入冷的乙腈 (0±5℃ ) 而使该反应混合物沉淀并且在过 滤之前在此温度下保持至少 30 分钟。用 CH3CN/IPE( 异丙醚 )(1/1) 的一种混合物将该沉 淀物洗涤 3 次然后用 IPE 洗涤 2 次。然后在真空中在 45℃下将该固体干燥。最终获得一种 白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ： 86％。
     4.Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4) 的合成
     将 1.00 当量 Z-Trp-Arg-OH(Mw ＝ 494.5 ； 纯度＝ 85.0％ ) 以及 1.10 当量 HOOBt(Mw ＝ 163.13) 加入 1.15 当量 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 437.5 ； 纯度＝ 20.0％ ) 的 DMA 溶液中， 该溶液之前已经用 CH2Cl2 稀释了。将该溶液冷却到 -5℃ ±5℃后， 缓慢倒入 1.00当量 HCl/ 二噁烷 4N 并然后加入 1.10 当量 EDC(Mw ＝ 191.7)。将该反应混合物在 -5±5℃ 下搅拌至少 3 小时并然后在 5℃ ±5℃下搅拌至少 8 小时。在通过 HPLC 检验该反应的完成 以后， 用一种 CH2Cl2/ 仲丁醇混合物 (6/4) 将该反应混合物稀释， 首先用含有 HCl(0.5 当量 ) 的 NaCl 的 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤该反应混合物、 然后用 1900ml 的含有 2.2 当量 NaTPB(Mw ＝ 342) 的一种 5％ ( 重量 )Na2CO3 水溶液洗涤， 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗 涤 5 次。在该有机层浓缩以后， 将残余物溶解在甲醇中然后在真空中浓缩以便清除大部分 的剩余 CH2Cl2。通过 NMR 滴定最终溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于滴定含量 ) ： 83％。
     5.2HCl.H-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4) 的合成
     使 1.00 当量 2TPB.Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 878.11) 的甲醇溶液若干 次穿过一个柱， 该柱含有 6.00 当量的一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000)。 在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的有机相在真空 中部分地浓缩。用水将该浓缩溶液稀释并且加入 Pd 催化剂。然后在 35℃ ±5℃下将该悬 浮液氢化至少 3 小时。将该催化剂过滤掉并且用甲醇洗涤两次。将该滤液在真空中蒸发， 该残余物溶解在 DMA 中并且将其进一步浓缩以消除剩余的水。在检验水的含量以后， 将沉 淀物溶解在 DMA 中并且在真空中部分地蒸发以便适配该溶液的重量。用 0.1NHCl 滴定最终 溶液并且不经任何纯化而进一步使用。 产率 ( 基于该滴定 ) ： 95％。
     6.Z-Trp-Trp-Pro-OH 的合成
     将 DMA、 1.05 当量的 DIPEA(Mw ＝ 129.2) 以及 1.05 当量的 H-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 301.3 ； 纯度＝ 91.0 ％ ) 在室温下混合至少 30 分钟直到形成一种溶液为止。然后用乙酸 乙酯稀释该反应混合物并且将其冷却到 5℃ ±5℃。一旦达到这个温度， 就加入 1.00 当量 的 Z-Trp-Osu(Mw ＝ 435.45 ； 纯度＝ 98.0 ％ )， 并且在将该溶液留置来再次升温到室温之 前继续搅拌至少 30 分钟。在通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 加入 0.2 当量的 DMAPA(N， N’ - 二甲基氨基丙胺， Mw ＝ 102.2g/mol)。将该反应混合物用乙酸乙酯稀释并且用含有 2 当量 KHSO4 的 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液进行洗涤。进一步地首先用一种 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤该有机相并且最后用水。将该有机相在真空中部分地浓缩， 该残余物被悬 浮在乙酸乙酯中并将其进一步浓缩以便消除剩余的水。 将浓缩的肽溶液以多个小部分加入 MTBE/ 石油醚 (45-55)(1/1) 的一种冷的 (0±5℃ ) 混合物中， 并且将沉淀物在过滤之前在 0±5℃保持至少 30 分钟。 过滤后， 然后将其用石油醚 (45-55) 洗涤并且在真空中在 45℃下 进行干燥。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 82％。
     7.Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 3) 的合成
     将 1.00 当 量 的 Z-Trp-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 621.7 ； 纯 度 ＝ 94.0 ％ ) 加 入 之 前 用 CH2Cl2 稀释过的 1.05 当量 2HCl.HTrp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 816.9 ； 纯度＝ 15.0％ ) 的 DMA 溶液之中。然后， 加入 1.20 当量 N， N’ - 二异丙基乙胺 (DIPEA)(Mw ＝ 129.2) 以 及 1.05 当量的 2-(1H- 苯并三唑 -1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲六氟磷酸酯 )(HBTU)(Mw ＝ 379.24)。 将该反应混合物在室温下搅拌至少 1 小时。 在通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/2) 将该反应混合物稀释、 首先用 NaCl 与 HCl(1.5 当量 ) 的
     一种 5％ ( 重量 ) 水溶液进行洗涤、 然后用 Na2CO3 与 2.2 当量 NaTPB(Mw ＝ 342g/ 摩尔 ) 的 一种 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤、 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤三次。在该有 机层浓缩以后， 将残留的油在甲氧乙醇中溶解若干次、 然后在真空中浓缩以便消除大部分 的剩余异丁醇。在 GC 控制之后， 将该浓缩物通过缓慢倒入冷的 (0±5℃ )5％ ( 重量 )NaCl 水溶液而使它沉淀。在搅拌至少 1 小时以后， 将该悬浮液过滤并且用冷水洗涤两次。将该 沉淀物在真空中在 45℃下进行干燥。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 98％。
     8.2HCl.H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 3) 的合成
     使 1.00 当 量 2TPB.Z-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1347.5 ； 纯 度＝ 64.0 ％ ) 的一种甲醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958( 或 Amberjet Cl 1000 ； 6.00 当量 )。 在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤、 洗 涤三次。使这些组合的有机相在真空中部分地浓缩、 并然后用水稀释。最后， 加入 2％ ( 重 量 ) 的 Pd 催化剂， 并且将该悬浮液在 40℃下氢化至少 3 小时。将该催化剂过滤掉、 用甲醇 / 水的一种混合物洗涤三次。 将组合的滤液在真空中蒸发、 残余物悬浮在 DMA 中并且将其进 一步浓缩以消除剩余的水。在检验水的含量以后， 用 HCl(0.1N)、 AgNO3(0.1N)、 或 NMR 滴定 该溶液并且不经任何纯化而进一步使用。 产率 ( 基于滴定 ) ＝ 82％。
     9.Z-Arg-Trp-Pro-OH 的合成
     将 DMA、 1.00 当 量 的 DIPEA 以 及 1.00 当 量 的 H-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 301.3 ； 纯 度＝ 94.0 ％ ) 在室温下混合至少 30 分钟直到获得一种溶液为止， 然后将该溶液冷却到 10±5° (1 号溶液 )。将 1.00 当量的 Z-Arg-OH.HCl(Mw ＝ 344.8) 在室温下加入 DMA 中直 到获得一种澄清溶液为止 (2 号溶液 )。在将 2 号溶液冷却到 -15℃ ±5℃期间， 加入 1.05 当量吡啶 (Mw ＝ 79.1 ； 纯度＝ 99.0％ ) 以及 1.00 当量的 DIPEA。一旦达到这个温度， 就将 1.00 当量的新戊酰氯 (PivCl)(Mw ＝ 120.58) 倒入该反应混合物 (2 号溶液 ) 中， 将其进一 步活化大约 5 分钟。最后， 将 1 号溶液加入活化的 2 号溶液中， 并且将该反应混合物进一步 搅拌至少 1 小时同时停止冷却， 并且允许该反应混合物升温至室温。
     在已经通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 将该肽溶液在真空中进行浓缩。用乙腈 和水稀释残余物并且用 2N K2CO3 将 pH 调节到 8.0±0.2。然后将该溶液在真空中部分地浓 缩并且将残余物冷却到 5℃ ±5℃以进行沉淀。在过滤之前维持搅拌至少 30 分钟、 并且然 后用水洗涤沉淀物。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ： 90％。
     10.Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.3TPB(SEQ ID NO 2) 的合成
     将 1.00 当量的 Z-Arg-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 591.65 ； 纯度＝ 96.0 ％ )、 1.00 当量的 HCl/ 二噁烷 (4N) 以及 1.05 当量 HOBt(Mw ＝ 135.12 ； 纯度＝ 98.0％ ) 加入 1.00 当量 2HCl. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1213.4 ； 纯度＝ 85.0％ ) 在用 CH2Cl2 稀 释过的 DMA 中的溶液中。 在已经将该溶液冷却到 10℃ ±5℃以后， 加入 1.02 当量 EDC(Mw ＝ 191.7)。将该反应混合物在 10℃ ±5℃搅拌 30 分钟、 并且然后在室温下搅拌至少 4 小时。 在通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/3) 将该反应混合物
     稀释、 首先用具有 HCl(0.5 当量 ) 的一种 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液进行洗涤、 然后用含有 3 当量 NaTPB(Mw ＝ 342) 的一种 5％ ( 重量 )Na2CO3 水溶液洗涤、 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤两次。 在该有机层浓缩以后， 将残余的油在甲氧乙醇中溶解若干次、 然后在 真空中进行浓缩以便消除大部分的异丁醇。在 GC 控制之后， 将该浓缩物通过缓慢地倒入冷 的 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中而使它沉淀。在搅拌至少 1 小时以后， 将该悬浮液过滤并且用 冷水洗涤两次。在将该沉淀物 40℃ ±5℃下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 87％。
     11.3HCl.H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2) 的合成
     使 1.00 当 量 3TPB.Z-Arg-Trp-Pro-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1787.1 ； 纯度＝ 57.0％ ) 的一种甲醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过 的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000， 9.00 当量 )。在已经通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过 滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的有机相在真空中部分地浓缩。然后用水将该浓缩的 溶液稀释并且加入 Pd 催化剂。然后将该悬浮液在 35℃ ±5℃下氢化至少 6 小时。将该催 化剂过滤掉、 用一种甲醇 / 水混合物洗涤三次。将该组合的滤液在真空中蒸发， 残余物悬浮 在 DMA 中并且将其进一步浓缩以消除剩余的水。在检验该水的含量以后， 用 HCl(0.1N) 或 NMR 滴定该溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于 NMR 含量测量 ) ： 93％。
     12.Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     根据两个路径进行 Boc-Ile-Leu-OH 二肽的合成 ：
     - 经由 Boc-Ile-OH 的活化的酯 OSu( 路径 A)
     - 通过使用 Boc-Ile-OH 的 UNCA( 尿烷 N- 保护的羧酸酐 )( 路径 B)
     路径 A ： Boc-Ile-OSu 的合成 ( 对比 )
     在 搅 拌 下， 将 1.00 当 量 的 Boc-Ile-OH.1/2H2O(Mw ＝ 240.3) 以 及 1.05 当 量 的 Suc-OH(Mw ＝ 115) 加入乙酸乙酯中。将该溶液冷却到 0±5℃并且然后将稀释在乙酸乙酯 中的 1.10 当量 DCC(Mw ＝ 206.3) 倒入该溶液中。将该悬浮液在 0℃下搅拌至少 30 分钟、 并且在室温下搅拌至少 5 小时。在已经通过加入 2.42g 乙酸 (0.20 当量 ) 使该反应混合物 猝灭以后， 将 DCU 过滤并且用乙酸乙酯洗涤两次。用以下物质洗涤这些有机层 ： 含 0.5 当量 KHSO4 的 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液 ； 含 0.5 当量 Na2CO3 的 5％ ( 重 量 )NaCl 水溶液、 并且最后是 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液。将该溶剂在真空下进行浓缩。在乙 酸乙酯中吸收该浓缩溶液两次、 并且进一步在真空中蒸发以便消除剩余的水。用环己烷或 庚烷稀释该浓缩的有机层。将该沉淀的悬浮液在室温下搅拌至少 30 分钟、 过滤并最终在真 空下 (45℃ ) 干燥。干燥过的沉淀物产出了 89％ ( 基于 NMR 含量 ) 的 Boc-Ile-Osu， 为白色 固体。
     路径 A ： Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     将 1.01 当量的 H-Leu-OH(Mw ＝ 131.2) 在大约 50℃下首先用 2.10 当量 TMA(Mw ＝ 145.12) 甲硅烷基化直到获得一种澄清溶液为止。将该溶液冷却到室温， 并且用乙酸异丙 酯进行稀释。然后将 1.00 当量的 Boc-Ile-OSu 固体 (Mw ＝ 328.26 ； 100.0％ ) 加入甲硅烷 基化的 H-Leu-OH 溶液中。将该反应混合物在室温下进一步搅拌至少 8 小时。在通过 HPLC证实该反应的完成以后， 通过加入 DMAPA 和水使该溶液猝灭、 用以下物质进行洗涤 ： 500ml 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中的 KHSO4(1.00 当量 ) ； 500ml 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 以及水。 在将该乙酸异丙酯在真空中蒸发以后， 通过用乙酸异丙酯进行共沸蒸馏而去除过量的水。 在浓缩过程中该肽沉淀出。然后将该浓缩的悬浮液稀释在环己烷中。将沉淀物在室温下搅 拌至少 10 分钟、 过滤并最终在真空中在 45℃下进行干燥。干燥过的沉淀物产出了 ( 基于 NMR 含量 )80％的 Boc-Ile-Leu-OH， 为白色固体。
     路径 B ： Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     将 1.00 当量的 Boc-Ile-NCA(Mw ＝ 257.3) 加入 1.10 当量 H-Leu-OH(Mw ＝ 131.2) 在 DMSO 中的悬浮液中。然后将该悬浮液在 60℃ ±5℃下加热至少 2 小时。在通过 HPLC 检 验转化率以后， 用乙酸异丙酯稀释该反应混合物、 用以下物质进行洗涤 ： 在 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中的 KHSO4(Mw ＝ 136 ； 1.00 当量 )、 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 以及水。 在将乙酸异丙酯 在真空中蒸发以后， 通过用乙酸异丙酯进行共沸蒸馏而消除过量的水。在浓缩过程中该肽 沉淀出。然后将该浓缩的悬浮液在环己烷中稀释。将该沉淀物在室温下搅拌至少 10 分钟、 过滤并最终在真空中在 45℃下进行干燥。 干燥的沉淀物产出了 89％的 Boc-Ile-Leu-OH， 为 白色固体 ( 基于 NMR 含量 )。
     13.3HCl.Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2( SEQ ID NO 1) 的合成
     将 1.05 当 量 的 Boc-Ile-Leu-OH(Mw ＝ 344.4) 以 及 1.10 当 量 的 HOOBt(Mw ＝ 163.13) 加入 1.00 当量 3HCl.H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(M w ＝ 1652.9 ； 纯度＝ 89.0％ ) 在 DMA 与 CH2Cl2 中的一种冷的 (0±5℃ ) 溶液中。 然后将 1.20 当量的 EDC(N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N- 乙基碳二亚胺 ； Mw ＝ 191.7 ； 纯度＝ 100.0％ ) 加 入该反应混合物， 将它在 0±5℃下进一步搅拌大约 4 小时、 然后在室温下搅拌至少 8 小时。 在已经通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/2) 将该反应混 合物稀释、 并且用一种 5％ ( 重量 )NaCl 的水溶液 +HCl(0.3 当量 ) 进行洗涤。在该有机层 浓缩以后， 将残余的油通过缓慢地倒入冷的 (0±5℃ ) 乙腈中而使它沉淀。 在 0±5℃下搅拌 至少 30 分钟以后， 将该悬浮液过滤并且用冷的 MTBE 洗涤两次。将该沉淀物在 40℃ ±5℃ 下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 88％。
     14.5HCl.H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的合成
     将 1.00 当量的 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc) -NH2(SEQ ID NO 1)(Mw ＝ 1980 ； 纯度＝ 89.0％ ) 缓慢地加入相对于该肽含有 24 当量 HCl 以及 6 当量 4-( 甲硫基 ) 苯酚 (Mw ＝ 124.2) 的异丙醇中。在完成加入以后， 用异丙醇稀释 该反应混合物。将该反应混合物在 35℃ ±5℃下搅拌至少 2 小时。在通过 HPLC 检验该反 应的完成以后， 将该反应混合物缓慢倒入冷的异丙醚中。将该沉淀物在 0±5℃下搅拌至少 15 分钟、 然后过滤、 用异丙醚洗涤三次、 并且最后在真空下干燥从而获得 5HCl.H-Ile-LeuArg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)。
     15.5HCl.H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的纯化将实例 14 中所获得的产物溶解在一种乙酸盐缓冲剂中并且在 0.5μm 膜上过滤。 使用以下参数通过 HPLC 将生成的溶液进行纯化 ：
     -柱： 2.0*25cm(ID*L)
     - 固定相 ： C18 硅石 ； 10μm-100A
     - 流动相 ： A ＝乙酸盐缓冲剂， pH 5.0(0.15M)
     B ＝乙腈
     - 流速 ： 19mL/min
     - 波长 ： 254nm
     - 梯度 (min ； ％ B) ： (0 ； 10)(5 ； 10)(6 ； 18)(36 ； 33)(36.1 ； 60)(43 ； 60)(43.1 ； 10) (52 ； 10)
     所获得的 Omiganan 肽 (SEQ ID NO 1) 具有超过 98％的纯度。
     将所生成的高纯度部分用水稀释并且使用以下流动相将同一个柱用来将乙酸根 离子转化为 Cl- 离子 ：
     - 水 / 乙腈 95/5v/v， 用于该柱的平衡
     -0.5M NaCl/MeCN 95/5v/v， 用于离子交换
     - 水 /MeCN 60/40v/v， 用于洗脱
     Omiganan 是 对 于 肽 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-N H2(SEQ ID NO 1) 的常见国际命名 (CID)， 它主要是以其五盐酸化物 (5HCl) 盐的形式被使 用。Omiganan 是一种阳离子的抗微生物的肽。最近的研究还显示了它可以在炎症应答中 起作用。Omiganan 在体外分析中证明了对抗多种微生物的一种快速杀菌活性， 这些微生物 移殖于皮肤中而且可以在炎症病变的致病中起作用。此外， Omiganan 五氯化物目前是在 II-III 期用于治疗严重的痤疮， 并且在 III 期临床试验中用于预防中心静脉导管相关的血 流感染。
     Omiganan 可以经由一种线性肽合成而生产， 其中对应的氨基酸被顺序地添加到一 个增长的肽链中。至于所希望的 Omiganan 肽的产率和纯度， 这些方法是不令人满意的。
     本发明现在使之可得到一种用于该 Omiganan 肽的改进的合成。
     美国专利号 5,262,567 披露了使用一种化合物 ( 包括一个胍基团以及一种未取代 的四苯基硼酸盐离子 ) 作为该肽合成中的中间产物。作为一个实例， 描述了由精氨酸与四 苯基硼酸盐 (TPB) 形成的化合物的合成以及它在合成该肽 Boc-Leu-Arg-OH 中的用途。
     WO 99/65506A 披露了包含阳离子肽的药用组合物， 这些阳离子肽包括阳离子肽 MBI 11B20CN， 它包含 Omiganan 的氨基酸序列。
     因此本发明的目标是提供用于生产该 Omiganan 肽的方法， 该方法以高产率和高 纯度给出 Omiganan。根据本发明的方法出人意料地允许以有限的步骤 ( 特别是纯化步骤 ) 生产所述肽， 因此大大减小了制造成本。
     因此本发明在第一方面涉及用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)Omiganan 肽或其一种衍生物的一种方法， 该方法 包括在溶液中将一种第一肽与一种第二肽进行偶联的至少一个步骤， 该第一肽具有一个活 化的羧基以及至少两个氨基酸单元、 或一种选自下组的氨基酸， 该组的组成为 ： 具有一个活 化羧基的 Ile、 Leu、 Arg、 以及 Trp、 Pro ； 该第二肽具有一个游离的氨基以及至少两个氨基酸 单元， 其中该第一与第二肽是不同的并且包含选自下组的多个氨基酸， 该组的组成为 ： Ile、 Leu、 Arg、 Trp、 Pro、 以及 Lys， 处于由 Omiganan 中的序列 Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-P ro-Trp-Arg-Arg-Lys(SEQ ID NO 1) 所说明的顺序中。
     为了本发明的目的， 术语 “肽” 是指一种聚合物， 其中这些单体是通过酰胺键共价 地附接在一起的氨基酸。肽是两个或经常是更多个氨基酸单体长。另外， 所有的肽序列由 左边或右边取向是处于氨基端到羧基端的常规方向的那些化学式代表。
     为了本发明的目的， 术语 “氨基酸” 旨在表示任何包括至少一个 NR1R2 基团 ( 优选 NH2 基团 )、 以及至少一个羧基的化合物。本发明的这些氨基酸可以是天然存在的或是合成 的。这些天然氨基酸除甘氨酸之外， 包含一种手性碳原子。除非另外确切指明， 优选的是包 含具有 L 构型的天然氨基酸的这些化合物。贯穿本申请将氨基酸残基缩写为如下 ： 异亮氨 酸是 Ile ； 亮氨酸是 Leu ； 精氨酸是 Arg ； 色氨酸是 Trp ； 脯氨酸是 Pro 并且赖氨酸是 Lys。
     为了本发明的目的， 术语肽的 “C- 端” 是由一个游离羧基 (-COOH) 封端的一种氨基 酸序列的末端。另一方面， 术语肽的 “N- 端” 是指由一种具有游离氨基 (-NH2) 的氨基酸封 端的一种氨基酸序列的末端。
     为了本发明的目的， 术语 “偶联” 是指在一种氨基酸的羧基或一种第一肽的 C- 端 与另一种氨基酸的氨基或一种第二肽的 N- 端之间的反应。换言之， 在偶联的过程中， 两个 肽中间产物片段、 或一个肽中间产物片段以及一种反应性氨基酸被偶联， 一般是在一种适 当的溶剂中、 并且通常是在促进该偶联反应的效率以及质量的另外试剂的存在下。这些肽 中间产物片段被反应性地安排， 因而一个片段的 N- 端变为偶联至另一个片段的 C- 端， 或反 之亦然。
     如在此使用的， 术语 “肽衍生物” 包括一种类似物， 其中一个或多个氨基酸残基已 经被对应的 D 异构体或被一个非天然的氨基酸残基、 或其一种化学衍生物所取代。一种肽 的化学衍生物包括但不限于 ： 含有多个另外的化学部分的一种衍生物， 假如该衍生物保持 该肽的抑制活性， 则这些另外的化学部分通常不是该肽的一部分。这类衍生物的实例是 ： (a) 该氨基端的或另一个游离氨基的 N- 酰基衍生物， 其中该酰基基团可以是一种烷酰基 基团比如乙酰基、 己酰基、 辛酰基 ； 一种芳酰基， 如苯甲酰基、 或生物素基 ； (b) 该羧基端的 或另一个游离羧基或多个羟基的酯类 ； 以及 (c) 该羧基端的或另一个游离羧基的酰胺， 通 过与氨或与一种适当的胺反应而产生。Omiganan 的衍生物及其中间产物还是 ( 例如 ) 该 Omiganan 序列的受保护的片段和肽、 Omiganan 与无机的或有机酸的盐类 ( 优选无机酸、 并 且最优选盐酸 ) 的盐及其中间产物。可能使用的与有机酸的盐的实例是与乙酸、 柠檬酸、 草 酸、 三氟乙酸、 四苯基硼酸以及酒石酸的盐类。 在一个优选的实施方案中， 本发明的方法包括将 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与 Ile-Leu 进行偶联的步骤， 其中 Ile 的 氨基受一个氨基保护基团所保护。
     此外优选的是本发明的方法包括将 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3) 或其一种衍生物与 Arg-Trp-Pro 进行偶联的步骤， 其中 Arg 的氨基受到一个保护基团 保护。
     该方法优选地包括将 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4) 或其一种衍生物与 Trp-Trp-Pro 进行偶联的步骤， 其中 Trp N 端的氨基受到一个保护基团保护。
     此外， 本发明根据一个第二方面是针对一种用于制造 H-Arg-Lys(Boc)-NH2 的方 法， 该方法包括以下步骤 ：
     (a) 将 Z-Arg-OH.Cl 与 H-Lys(Boc)-NH2 进行偶联 ； 并且
     (b) 将步骤 (a) 中所获得的 Z-Arg-Lys(Boc)-NH2 氢解， 优选是在一种 Pd 催化剂的 存在下。
     术语 “Lys(Boc)” 旨在表示氨基侧链受到一个 Boc 基团保护的一种赖氨酸。
     在第三方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2)。
     在第四个方面， 本发明是针该新颖的中间产物 Z-Arg-Trp-Pro-OH。
     在第五个方面， 本发明是针对一种用于制造 Z-Arg-Trp-Pro-OH 的方法， 该方法包 括使 H-Trp-Pro-OH 与 Z-Arg-OH.HCl 进行偶联的步骤。
     在第六个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Trp-Pro-OH。
     在第七个方面， 本发明是针对一种用于制造 Z-Trp-Trp-Pro-OH 的方法， 该方法包 括使 H-Trp-Pro-OH 与 Z-Trp-Osu 进行偶联的步骤。
     在第八个方面， 本发明是针对一种用于制造中间产物 Boc-Ile-Leu-OH 的方法， 该 方法包括使 Boc-Ile-NCA 与 H-Leu-OH 进行偶联的步骤。
     在第九个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4)。
     在第十个方面， 本发明是针对新颖的中间产物 Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys( Boc)-NH2(SEQ ID NO 3)。
     在本发明的方法中， 保护基团一般用于在所涉及的氨基酸或肽中间产物中的一个 或多个氨基。保护基团的用途没有具体进行限制。
     以说明的方式， 在本发明的这些化合物中可以采用以下保护基团 ：
     酰基型保护基团， 特别是甲酰基、 三氟乙酰基、 邻苯二甲酰基、 4- 甲苯磺酰基、 苯磺 酰基以及 2- 硝基苯基次磺酸基 ；
     芳香族的尿烷型保护基团， 例如尤其是取代的或未取代的苄氧基羰基、 对 - 溴代 苄氧基羰基、 对 - 甲氧基苄氧基羰基、 二苯甲基氧基羰基、 2-(4- 联苯基 ) 丙基 (2) 氧基羰 基、 2-(3， 5- 二甲基氧苯基 )、 丙基 (2) 氧基羰基、 以及三苯基膦酰基乙基氧基羰基 ； 脂肪族的尿烷型保护基团， 特别是叔丁氧羰基、 二异丙基甲氧羰基、 异丙氧羰基、 乙氧羰基、 烯丙氧羰基、 9- 芴甲氧羰基、 2- 甲基磺酰基乙氧羰基以及 2， 2， 3- 三氯乙基氧基 羰基 ；
     环烷基尿烷型保护基团， 例如尤其是环戊氧羰基、 金刚烷氧基羰基、 环己氧基羰 基、 叔戊氧基羰基以及异冰片基氧基羰基 ；
     硫尿烷型保护基团， 特别是苯基硫代羰基、
     烷基型保护基团， 例如尤其是三苯基甲基 ( 三苯甲基 ) 以及苄基 ；
     三烷基硅烷基团， 如三烷基硅烷。上述的保护基团特别适合作为氨基保护基团。
     在本发明的一种或多种方法中， 优选的是在与一个保护基团进行偶联的步骤过程 中一种氨基酸基团中的至少一个氨基受到保护， 该保护基团选自一种芳香族的尿烷型保护 基团以及脂肪族的尿烷型保护基团。 更优选地， 所述保护基团是选自一种叔丁氧羰基 (Boc) 基团与一种苄氧基羰基 (Z) 基团。
     在本发明的一种或多种方法的一个优选实施方案中， 该苄氧基羰基 (Z) 基团被用 作一个氨基酸单元中一个端氨基的保护基团， 其中该氨基酸单元是 Arg 或 Trp。
     在本发明的一种或多种方法的另一个优选实施方案中， 该叔丁氧羰基 (Boc) 基团 被用作 Lys 中的侧链氨基的和 / 或 Ile 中的 N- 端氨基的保护基团。
     特别适合用于保护该羧基的其他保护基团包括烷氧基， 特别是甲酯、 乙酯、 叔丁酯 以及苄基酯。在一个优选实施方案中， Lys 的羧基是作为酰胺、 特别是作为 CONH2 基团被保 护的。
     在本发明的一种或多种方法中， 该第一肽具有一个活化的羧基以及一般至少两个 氨基酸单元。在本发明的方法中可以使用不同的活化基团， 它们减少了副反应和 / 或增大 了反应效率， 优先选自 ： 碳二亚胺类、 羰基二咪唑类、 酰卤类、 磷鎓盐类、 以及脲鎓或胍鎓盐
     类。例如， 磷鎓和脲鎓盐类在一种叔碱 ( 例如二异丙基乙胺 (DIPEA) 以及三乙胺 (TEA)) 的 存在下可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类 ( 例如 BOP、 PyBOP、 HBTU、 以及 TBTU 全部 产生了 HOBt 酯 )。帮助防止外消旋作用的其他试剂包括碳二亚胺类 ( 例如 N， N- 二环己 基碳二亚胺 (DCC)、 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳二亚胺 (EDC) 或水溶性碳二亚 胺 (WSCDI)) 与一种添加的辅助亲核体 ( 例如 1- 羟基 - 苯并三唑 (HOBt)、 3， 4 二氢 -3- 羟 基 -4- 氧代 -1， 2， 3- 苯并三嗪 (HOOBT)、 1- 羟基 - 氮杂苯并三唑 (HOAt)、 或 HOSu) 或其衍 生物。可以使用的另一种试剂是 TBTU。例如用 N， N- 二环己基碳二亚胺 (DCC)、 N-(3- 二 甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳二亚胺 (EDC)、 新戊酰氯 (PivCl)、 异丁基氯甲酸酯 (IBCF)、 HBTU(O-( 苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 )、 HATU(O-(7- 氮杂苯并 三唑 -1- 基 )-N， N， N’ ， N’ - 四甲基铵脲鎓六氟磷酸盐 )、 以及 EEDQ(2- 乙氧基 -1- 乙氧碳 酰基 -1， 2- 二氢喹啉 ) 获得了好的结果。
     根据本发明优选的活化基团是 DCC、 EDC 以及 HBTU。
     当使用这类羧酸活化剂时， 该偶联反应经常是在一种碱作为额外试剂的存在下进 行的。在本发明的另一个具体的方面， 该偶联反应因此是在一种碱的存在下进行的。该碱 是优先选自叔胺类以及杂芳香族胺类， 如 N- 甲基吗啉 (NMM)、 吡啶、 三乙胺 (TEA)、 二异丙基 乙胺 (DIPEA) 或它们的混合物。更优选地， 它是选自 N- 甲基吗啉以及二异丙基乙胺。 除这些活化基团之外， 有时候有利地使用添加剂。优选的添加剂是 N- 羟基丁二酰 亚胺 (Suc-OH)、 N- 羟基苯并三唑 (HOBt)、 或 3， 4- 二氢 -3- 羟基 -4- 氧代 -1， 2， 3 苯并三嗪 (HOOBt) 以及它们的衍生物。通常这些添加剂是基于待活化的羧基的量值按 1 到 2 当量的 量值使用。
     在本发明的另一个具体的方面， 如以上说明的肽的偶联是在至少一种极性有机溶 剂的存在下进行的。在一个具体的优选实施方案中， 该极性有机溶剂允许对所形成的肽键 的外消旋作用、 该肽和 / 或肽片段的溶解度、 以及偶联反应速率进行特别有效的控制。该 极性有机溶剂优先选自 ： N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)、 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 N- 甲基吡 咯烷酮 (NMP)、 二甲亚砜 (DMSO)、 乙酸乙酯 (AcOEt)、 异丙基乙酸酯、 二氯甲烷 (DCM)、 亚甲 基氯、 吡啶、 氯仿、 乙腈、 二甲氧基乙烷、 二噁烷、 四氢呋喃 (THF) 或它们的混合物。更优选 地， 它是选自 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 二氯甲烷 (DCM)、 以及 N， N 二甲基甲酰胺 (DMF) 或它们的混合物。最优选地， 该极性有机溶剂是 N， N- 二甲基乙酰胺 (DMA)。一种优选的混合物包含 20％到 80％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 80％到 20％ ( 体积 ) 的 二氯甲烷 (CH2Cl2)、 更优选 50％到 70％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 50％到 30％ ( 体积 ) 的二氯 甲烷 (CH2Cl2)。
     如在此使用的术语 “偶联” 或 “偶联步骤” 具体是指将不同的肽或氨基酸进行偶联 的步骤。
     在一个优选的实施方案中， 本发明的方法包括使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与受保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物进行 偶联的步骤。在这个步骤中， 优选将 HOOBt 用作一种添加剂。此外， 这个偶联步骤优选是在 DMA/ 二氯甲烷 (CH2Cl2) 的一种混合物中进行， 该混合物优选包含 50％到 75％ ( 体积 ) 的 DMA 以及 25％到 50％ ( 体积 ) 的二氯甲烷 (CH2Cl2)。此外该偶联步骤优选在 EDC 的存在下 进行。
     在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中， 该第二肽具有选自以下的化 学式 ： NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、 NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)， NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6)， NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Ar g-Lys(X)-R(SEQ ID NO7)， NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)， N H2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)， NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-T rp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)， NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)， 其中 X 是用于该 Lys- 侧链氨基的一个保护基团、 优选 是一种 Boc 基团， 并且 R 是用于 Lys 的羧基的一个羧基保护基团、 优选是一种酰胺基团。
     事实上本发明允许贯穿该合成对于在该 Ominagan 肽的 10 位置包含 Arg 的 D- 对 映异构体的多种产物的存进行控制并且将其最小化。
     在 这 个 实 施 方 案 中， 该 第 二 肽 总 体 上 包 括 从 0.1wt ％ 到 1wt ％、 有利地从 0.2wt ％ -0.9wt ％、 并 且 经 常 从 0.2wt ％ 到 0.7wt ％ 的 一 种 肽， 该肽选自 ： NH2-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、 NH2-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)、 NH2-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6) 、 NH 2-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、 NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、 NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、 NH2-ArgTrp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、 NH2-Leu-Arg-Trp-ProTrp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)、 以及 NH2-(D)Leu-Arg-Trp-ProTrp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)， 其中 X 和 R 是如上所说明的。本发 明还涉及所述第二肽。
     在一个进一步优选的实施方案中， 该第二肽是 NH2-Arg-Lys(X)-R， 其中 X 是用 于该 Lys- 侧链氨基的一个任选的保护基团、 优选是一种 Boc 基团， 并且 R 是用于 Lys 的 羧基的一个羧基保护基团， 优选是一个酰胺基团， 并且该第一肽是选自下组 ： Y-Trp-Arg、 Y-Pro-Trp-Arg、 Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)、 Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)、 Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 14)、 Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15)、 Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16)、 Y-Leu-Arg-Trp-Pro-T rp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、 Y-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SE Q ID NO 18)， 并且 Y 是用于该 N- 端氨基的一个氨基保护基团、 特别是如上所说明的、 优选 是一个 Z 基团。
     在这个具体的实施方案中， 该偶联有利地在一种芳基环化的氧代 - 三嗪活化剂、 优选 HOOBt 的存在下进行。
     在这个实施方案中， 该偶联总体上是在从 -10℃到 +10℃的温度下进行的。
     在这个实施方案中， 该偶联经常是在一种卤化的与非卤化的溶剂的一个混合物 中、 优选一种氯化的溶剂与一种酰胺型溶剂的一个混合物进行的。 适当的氯化的溶剂包括 ： 例如氯仿、 1， 2- 二氯乙烷以及优选地二氯甲烷。适当的酰胺型溶剂包括 ： 例如 N- 甲基吡咯 烷酮、 N， N- 二甲基甲酰胺以及优选地 N， N- 二甲基乙酰胺。亚甲基氯与 N， N- 二甲基乙酰胺 的一种混合物已经给出了良好的结果。
     特别有利的是使 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 偶联。
     在本实施方案的最优选的方面， 使 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 偶联， 该活化剂是 HOOBt， 该溶剂是 DMA 与亚甲基氯的一种混合物， 并且该偶联在第一时间段 中在 -5℃ ±5℃的温度下进行了 3 到 5 小时、 并且在第二时间段中在 +5℃ ±5℃的温度下 进行了 6 到 10 小时。
     根据本发明特别优选的方法是依照图 1 的方案。在该方案中 X 与 Y 可以是相同的 或不同的。它们优选地是不同的。当 X 是一种叔丁氧羰基 (Boc) 基团并且 Y 是一种苄氧基 羰基 (Z) 基团时， 获得了良好的结果。
     本发明还涉及用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg -Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的 Omiganan 肽的一种脱保护方法， 该方法包括在基本上无水 的条件下使具有化学式 Y1-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Y2)-NH 其中 Y1 与 Y2 指代相同或不同的氨基保 2(SEQ ID NO 1) 的一种前体肽与一种酸进行反应， 护基团或 H， 并且 Y1 或 Y2 的至少一个是一种对酸敏感的氨基保护基团。
     保护基团 Y1 和 Y2 可以是例如包括在以上概括说明中的氨基保护基团。优选的是 Y1 与 Y2 二者都是氨基保护基团。更优选地， Y1 与 Y2 二者都是 Boc。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该酸经常是选自 ： HCl、 HF、 HBr、 HI、 三氟乙酸、 以及 三氟甲磺酸。更优选地， 该酸是 HCl。特别是在此情况下， 对每摩尔肽使优选用 6 到 32 摩 尔、 更优选 12 到 24 摩尔的酸。 根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在一种有机溶剂中进行， 优选是在一种 脂肪族的醇、 特别是一种仲醇中， 更优选是在异丙醇中。
     在根据本发明的脱保护方法中， 基本上无水的条件是例如通过在包含从 10mg/kg 到 1.5wt％、 优选从 50mg/kg 到 1wt％的水的一种液体反应介质中进行该反应而实现的。更 优选地， 该反应介质的含水量是从 100mg/kg 到 0.5wt％。
     尤其在 Y1 与 Y2 中的至少一个是 Boc 时， 该反应有利地在对于碳阳离子、 特别是该 叔丁基阳离子的一种清除剂 ( 例如苯甲硫醚、 以及优选地 4-( 甲硫基 ) 苯酚 ) 的存在下进 行。
     根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在从 0℃到 80℃、 优选从 25℃到 45℃的 温度下进行的。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该 Omiganan 肽有利地是以其五盐酸化物盐的形 式被回收。
     在根据本发明的脱保护方法中， 该前体肽优选地是通过根据本发明的方法获得 的。
     在该脱保护方法的一个特别优选的实施方案中， 使 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Tr p-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 1) 脱保护从而产生 5HCl.H-Ile-Leu-A rg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 是在 HCl 与一种仲醇的一 个混合物中、 优选在用于叔丁基碳阳离子的一种清除剂 ( 例如 4-( 甲硫基 ) 苯酚 ) 的存在 下进行的。
     最优选地是使用 HCl 与异丙醇的一种混合物。以这种方式所获得的脱保护的产物 可以按一种特别经济有效的方式进行纯化， 并且比其他可能的脱保护方法 ( 除其他之外包 括用乙酸、 三氟乙酸、 甲烷磺酸、 HF、 以及 HBr 进行分裂 ) 更有效。 本申请人已经发现， 例如与 用三氟乙酸 (TFA)( 对于富含色氨酸的肽像 Omiganan 而言是更多副产物的来源 ) 进行的一
     个程序相比， 一种 HCl/ 异丙醇混合物优选在一种用于叔丁基碳阳离子的清除剂的存在下 给出了更好的结果。 而且， 在此具体情况下， 脱保护优选是在一种如上所说明的基本上不含 水的反应介质中进行。而且， 在此具体情况下， 所述脱保护反应有利地是在从 20℃到 80℃、 优选从 25℃到 45℃、 并且更优选从 30℃到 40℃的温度下进行。
     在本发明的多个实施方案中， 在一种催化剂的存在下进行一种氢解作用。 优选地， 使用一种可以结合不同载体 ( 例如碳、 SiO2、 Si-Al 化合物等等 ) 采用的 Pd 催化剂。
     在一个具体实施方案中， 根据本发明的方法包括形成一种含 Arg 的肽的四苯基硼 酸盐。典型地， 所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐是通过使一种偶联步骤反应介质与四苯基 硼酸盐阴离子的一种来源相接触而形成的， 该介质包含经常通过根据本发明的方法的一个 偶联步骤所获得的一种含 Arg 的肽。四苯基硼酸盐类适合作为四苯基硼酸盐阴离子的来 源。
     因此， 优选的是在一种四苯基硼酸盐 (TPB) 的存在下进行至少一个步骤， 该盐优 选地是在至少一个偶联步骤完成以后加入。
     在该四苯基硼酸盐 (TPB) 的盐中的阳离子可以是有机的或无机的。有机离子的实 例是四乙基铵、 二异丙基乙基铵、 N- 乙基哌啶鎓、 N- 甲基吗啉鎓、 N- 乙基吗啉鎓。适当的无 + + 机离子是例如钠 (Na ) 或锂 (Li )。最优选地， 使用一种能够形成水溶液的四苯基硼酸盐。 优选的是 LiTPB 与 NaTPB。最优选使用的四苯基硼酸盐是 NaTPB。
     该 TPB 阴离子可以在其苯环上被取代或者它可以无任何取代而被使用。优选地， 该 TPB 阴离子没有被取代。适当的取代的 TPB 阴离子的实例包括 ： 例如四 (3， 5- 双三氟甲 苯基 ) 硼酸盐。
     所采用的四苯基硼酸盐的量值可以在宽的界限中变化。优选地， 在该含 Arg 的肽 中对每个 Arg 单元采用从 1 到 10 当量、 优选 1 到 1.5 当量的四苯基硼酸盐。
     该四苯基硼酸盐在本发明的方法中优选是在完成至少一个偶联步骤之后的处理 (work-up) 过程中、 在一种溶剂或多种溶剂的混合物的存在下采用。适当的溶剂尤其是甲 醇、 甲氧乙醇、 二氯甲烷、 正丁醇、 异丁醇、 仲丁醇、 以及叔丁醇。 使用甲氧乙醇获得了良好的 结果。
     在这个实施方案中， 可以有利地使所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐不经分离而经 受至少一个另外的合成步骤。经常地， 使所述含 Arg 的肽的四苯基硼酸盐经受至少一个脱 保护步骤接着经受一个偶联步骤。
     在一个最优选的实施方案中， 本发明是针对一种用于制造 Omiganan 肽的方法， 该 方法包括以下步骤 (a) 至 (d) ：
     (a) 使 Arg-Lys-NH2 或其一种衍生物、 特别是使 Arg-Lys(Boc)-NH2 与 N- 保护的 Trp-Arg-OH 或其一种衍生物、 特别是与 Z-Trp-Arg-OH 进行偶联。
     (b) 使 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4) 或 其 一 种 衍 生 物、特 别 是 使 Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4) 与 N- 保护的 Trp-Trp-Pro 或其一种衍生物、 特 别是与 Z-Trp-Trp-Pro-OH 进行偶联。
     (c) 使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3) 或其一种衍生物、 特别 是使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 3) 与 N- 保护的 Arg-Trp-Pro 或 其一种衍生物、 特别是与 Z-Arg-Trp-Pro-OH 进行偶联。(d) 使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种 衍生物、 特别是使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2) 与 N- 保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物、 特别是与 Boc-Ile-Leu-OH 进行偶联。
     图 1 的方案展示了该包括步骤 (a)、 (b)、 (c)、 以及 (d) 的方法的最优选的实施方 案。
     在根据本发明的这些方法中所采用的这些操作条件总体上对于本发明不是关键 的。因此， 进行该方法的压力总体上是为了将该反应介质维持在一种液态， 有利的是在 0.1 与 10 巴之间。在大气压下已经获得了良好的结果。进行该方法的该温度通常是在 -50℃ 与 100℃之间、 并且可以依赖于一个具体步骤中的这些反应物以及旨在最终制备的化合物 的性质而改变。优选地， 该温度是大于或等于 -45℃， 更优选地它是大于或等于 -25℃。另 一方面， 该温度优选是低于或等于 60℃， 更优选地它是大于或等于 50℃。
     在特殊的偶联步骤中， 可以应用优选的更受限制的温度范围。例如在将 Arg-T rp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2) 或其一种衍生物与受保护的 Ile-Leu 或其一种衍生物进行偶联的步骤中， 优选的将该偶联反应在一个第一时间段中在 0℃ ±5℃的温度范围内进行优选大约 3 到 5 小时、 并且在一个第二时间段中在 20℃ ±5℃ 的温度范围内优选进行大约 6 到 10 小时。 在本发明的方法的一个优选实施方案中， 使用了中间产物 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Bo c)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4)。优选地， 通过将 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 进 行偶联而获得 Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4)。优选地， 该偶联步骤是 在 HOOBt 的存在下进行的。
     在这个偶联步骤中， 优选将温度在一个第一时间段中在 -5℃ ±5℃的范围内维持 大约 2 到 5 小时、 并且在一个第二时间段中在 5℃ ±5℃的温度范围内维持大约 6 到 10 小 时。
     将 Z-Trp-Arg-OH 与 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 进行偶联之后优选跟随一个步骤 ( 还将被称作处理步骤 )， 该步骤包括向该偶联步骤的反应介质中加入一种 NaTPB 盐， 优选 是在水溶液中， 更优选是在 Na2CO3 的存在下。
     在本发明的一个或多个偶联步骤中， 一种肽优选地是按 0.8 到 1.2 摩尔的肽 / 每 摩尔其他肽、 更优选 0.9 到 1.1、 并且最优选 0.95 到 1.05 摩尔的肽 / 每摩尔其他肽的量值 使用。
     例如， 具有一个活化的羧基以及一般至少两个氨基酸单元的第一肽优选地是与具 有一个游离氨基以及至少两个氨基酸单元的第二肽进行偶联， 使用 0.8 到 1.2、 更优选 0.9 到 1.1 摩尔第一肽 / 每摩尔第二肽的一个量值。
     本发明的该第一方面的方法具有众多的优点 ：
     - 它是一种具有较少反应步骤的非常收敛的路径。在使用四苯基硼酸盐 (TPB) 盐 类的多个实施方案中， 在用 TPB 盐类进行选择性提取之后有可能使那些盐沉淀或者不经分 离而继续进行合成。这提供了合成过程中的增大的灵活性。没有必要用在侧链上受保护的 Arg 进行操作。
     - 在色氨酸单元的吲哚环上进行合成的过程中不需要保护。已知色氨酸对强酸性 介质是非常敏感的 ( 这些吲哚核的烷化、 有色副产物的形成 )。 考虑到事实上这种保护是昂
     贵的并且之后是难以消除的， 这是一个重要的优点。因此， 在一种具体的优选实施方案中， 在此前所披露的这些方法以及片段中， 至少一个色氨基酸单元并且优选全部色氨基酸单元 是未被保护的。
     - 本发明的方法还允许减少 Arg 10 以及 Leu 2 上的外消旋作用的量， 这允许了更 容易的最终纯化。
     - 最后， 本发明的方法允许相当平稳的条件用于最终的脱保护， 特别是 ( 若适当 时 )Boc 基团的消除。
     - 本发明的方法此外还允许 ( 特别是在使用具有一种 C- 端 Pro 的第一肽的某些优 选实施方案中 ) 进一步减小外消旋作用的风险， 从而允许了一种更加容易的最终纯化。
     具 体 地 说， 本 发 明 的 该 第 一 方 面 的 方 法 允 许 获 得 Omiganan 而 伴 随 有 显 著 减 小 的 量 的 这 三 种 主 要 副 产 物， 即 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)、 H-Ile-(D)Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg -Lys-NH2(SEQ ID NO 1)( 是通过在偶联步骤过程中对该外消旋作用的更好控制 ) 以及 H-I le-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-OH(SEQ ID NO 1)( 是通过避免在一 种强酸性水介质中工作 )。
     一个将根据本发明的方法所生产的 Omiganan 在一个另外的纯化步骤、 特别是一 个单一纯化步骤中进行纯化。
     本发明还涉及用于纯化该 Omiganan 肽的一种方法， 该方法包括使一种不纯的 Omiganan 肽经受一种液相色谱法、 特别是 HPLC 色谱法， 其中流动性包括水以及一种有机溶 剂。在 HPLC 色谱法技术之中， 反相以及离子交换相色谱法是优选的。使用反相获得了优异 的结果。可以使用不同的反相柱， 特别是基于 C4、 C8、 C18 硅石的反相柱。
     在这个方法中， 该流动相优选地包括乙腈。 在这个方法中， 该流动相有利地包括一 种缓冲剂。使用一种乙酸盐缓冲剂获得了良好的结果。包括乙腈与一种乙酸盐缓冲剂、 pH 5 的一种体系作为流动相是特别优选的。
     根据本发明的纯化方法经常进一步包括一个反离子交换步骤。例如， 可以将纯化 过的肽进行洗涤， 优选是在一种色谱柱上用一种氯化物盐水溶液 ( 特别是 NaCl 水溶液 ) 与 一种有机溶剂 ( 特别是乙腈 ) 的一个混合物。若适当时， 在离子交换之后可以用乙腈与水 的一种混合物将该纯化过的肽从该柱中洗脱， 由此可以获得纯化的 omiganan 的一种浓缩 溶液。
     根据本发明的纯化方法还可以包括一个结晶步骤。
     根据本发明的纯化方法因此可以进一步包括一个浓缩步骤以及任选地一个冷冻 干燥步骤。
     实例
     以下实例说明了本发明的方法， 但不应被解释为对本发明进行限制。若没有另外 指明， 则该化合物的纯度是大于按重量计 98％并且指出的比率是指体积比。
     1.Z-Arg-Lys(Boc)NH2.TPB 的合成
     将 1.02 当量的 Z-Arg-OH.HCl(Mw ＝ 344.8) 在室温下加入 DMA 与 CH2Cl2(6/4) 的 一种混合物中。此后， 加入 1.03 当量的 HOBt(N- 羟基苯并三唑， Mw ＝ 135.12) 以及 1.00 当量的 H-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 245.3 ； 纯度 ： 99％ )。在将该溶液冷却到 0±5℃之后， 加入1.03 当量的 EDC.HCl(Mw191.7)。
     在 0±5℃下继续搅拌另外 30 分钟， 然后在室温下搅拌至少 2 小时。在通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 将用一种 CH2Cl2/ 异 -BuOH(6/4) 混合物稀释该反应混合物并且用 0.5 当量的 HCl 溶液进行萃取。用 CH2Cl2/ 异 -BuOH(6/4) 的一种混合物第二次萃取该酸 性水相。首先用含有 1.05 当量的四苯基硼酸钠 (TPBNa)(Mw ＝ 342g) 的一种 Na2CO3 的 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤组合的有机相， 然后用一种 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液洗涤 4 次。
     在已经将该有机相在真空中浓缩以后， 将甲氧乙醇以若干个部分加入该浓缩物中 以除去痕量的异丁醇接着将它进一步蒸发。 然后将该浓缩物最后用甲氧乙醇稀释并且将其 缓慢地加入一种冷的 (0 到 5℃ )5％ ( 重量 )NaCl 水溶液之中。该肽沉淀出并且将其在低 温下保持至少 30 分钟然后过滤。
     用冷 (0±5℃ ) 脱矿质水将该固体洗涤 3 次。其后， 使该固体再溶解于 MeOH 中并 且进行搅拌直到获得一种轻微混浊的溶液为止。 将该溶液部分地浓缩并然后将该甲醇溶液 缓慢地加入到一种冷却的水性 NaCl 5％ ( 重量 ) 溶液中。在将该沉淀物在被过滤掉之前 在低温下保存至少 30 分钟。最后用冷的脱矿质水 (0±5℃ ) 将该固体洗涤 3 次并且在真 空 (45℃ ) 下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。基于对含量进行的 NMR 测量， 产率是 89％。
     2.HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2 的合成
     使 1.00 当量的 TPB.Z-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 535.6 ； 纯度＝ 62.0％ ) 的一种甲 醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000 ； 3.00 当 量 )。在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的 有机相在真空中部分浓缩。将浓缩的溶液用水稀释。
     加入 Pd 催化剂 (Mw ＝ 106.4 ； 2％重量 ) 并且然后将该悬浮液在 35℃ ±5℃下氢 化至少 5 小时。将该催化剂过滤掉、 用一种甲醇 / 水混合物洗涤两次。将该滤液在真空中 蒸发， 该残余物悬浮在 DMA 中并且使之在真空中部分蒸发以清除痕量的水。在检验水的含 量以后， 用 HCl(0.1N) 滴定最终溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于滴定 ) ： 90％。
     3.Z-Trp-Arg-OH 的合成
     将 2.00 当量的水和 1 当量的 Arg(Mw ＝ 174.2) 与 DMF 混合并且在室温下进行搅 拌直到获得一种溶液为止。将 1.03 当量的 Z-Trp-OSu(Mw ＝ 435.45 ； 纯度＝ 98％ ) 溶解在 DMF 中并且倾倒在该精氨酸溶液中。然后在室温下继续搅拌至少 5 小时。在通过 HPLC 检验 该反应的终止以后， 通过缓慢地加入冷的乙腈 (0±5℃ ) 而使该反应混合物沉淀并且在过 滤之前在此温度下保持至少 30 分钟。用 CH3CN/IPE( 异丙醚 )(1/1) 的一种混合物将该沉 淀物洗涤 3 次然后用 IPE 洗涤 2 次。然后在真空中在 45℃下将该固体干燥。最终获得一种 白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ： 86％。
     4.Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 4) 的合成
     将 1.00 当量 Z-Trp-Arg-OH(Mw ＝ 494.5 ； 纯度＝ 85.0％ ) 以及 1.10 当量 HOOBt(Mw ＝ 163.13) 加入 1.15 当量 HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 437.5 ； 纯度＝ 20.0％ ) 的 DMA 溶液中， 该溶液之前已经用 CH2Cl2 稀释了。将该溶液冷却到 -5℃ ±5℃后， 缓慢倒入 1.00当量 HCl/ 二噁烷 4N 并然后加入 1.10 当量 EDC(Mw ＝ 191.7)。将该反应混合物在 -5±5℃ 下搅拌至少 3 小时并然后在 5℃ ±5℃下搅拌至少 8 小时。在通过 HPLC 检验该反应的完成 以后， 用一种 CH2Cl2/ 仲丁醇混合物 (6/4) 将该反应混合物稀释， 首先用含有 HCl(0.5 当量 ) 的 NaCl 的 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤该反应混合物、 然后用 1900ml 的含有 2.2 当量 NaTPB(Mw ＝ 342) 的一种 5％ ( 重量 )Na2CO3 水溶液洗涤， 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗 涤 5 次。在该有机层浓缩以后， 将残余物溶解在甲醇中然后在真空中浓缩以便清除大部分 的剩余 CH2Cl2。通过 NMR 滴定最终溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于滴定含量 ) ： 83％。
     5.2HCl.H-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4) 的合成
     使 1.00 当量 2TPB.Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 878.11) 的甲醇溶液若干 次穿过一个柱， 该柱含有 6.00 当量的一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000)。 在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的有机相在真空 中部分地浓缩。用水将该浓缩溶液稀释并且加入 Pd 催化剂。然后在 35℃ ±5℃下将该悬 浮液氢化至少 3 小时。将该催化剂过滤掉并且用甲醇洗涤两次。将该滤液在真空中蒸发， 该残余物溶解在 DMA 中并且将其进一步浓缩以消除剩余的水。在检验水的含量以后， 将沉 淀物溶解在 DMA 中并且在真空中部分地蒸发以便适配该溶液的重量。用 0.1NHCl 滴定最终 溶液并且不经任何纯化而进一步使用。 产率 ( 基于该滴定 ) ： 95％。
     6.Z-Trp-Trp-Pro-OH 的合成
     将 DMA、 1.05 当量的 DIPEA(Mw ＝ 129.2) 以及 1.05 当量的 H-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 301.3 ； 纯度＝ 91.0 ％ ) 在室温下混合至少 30 分钟直到形成一种溶液为止。然后用乙酸 乙酯稀释该反应混合物并且将其冷却到 5℃ ±5℃。一旦达到这个温度， 就加入 1.00 当量 的 Z-Trp-Osu(Mw ＝ 435.45 ； 纯度＝ 98.0 ％ )， 并且在将该溶液留置来再次升温到室温之 前继续搅拌至少 30 分钟。在通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 加入 0.2 当量的 DMAPA(N， N’ - 二甲基氨基丙胺， Mw ＝ 102.2g/mol)。将该反应混合物用乙酸乙酯稀释并且用含有 2 当量 KHSO4 的 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液进行洗涤。进一步地首先用一种 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤该有机相并且最后用水。将该有机相在真空中部分地浓缩， 该残余物被悬 浮在乙酸乙酯中并将其进一步浓缩以便消除剩余的水。 将浓缩的肽溶液以多个小部分加入 MTBE/ 石油醚 (45-55)(1/1) 的一种冷的 (0±5℃ ) 混合物中， 并且将沉淀物在过滤之前在 0±5℃保持至少 30 分钟。 过滤后， 然后将其用石油醚 (45-55) 洗涤并且在真空中在 45℃下 进行干燥。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 82％。
     7.Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.2TPB(SEQ ID NO 3) 的合成
     将 1.00 当 量 的 Z-Trp-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 621.7 ； 纯 度 ＝ 94.0 ％ ) 加 入 之 前 用 CH2Cl2 稀释过的 1.05 当量 2HCl.HTrp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 816.9 ； 纯度＝ 15.0％ ) 的 DMA 溶液之中。然后， 加入 1.20 当量 N， N’ - 二异丙基乙胺 (DIPEA)(Mw ＝ 129.2) 以 及 1.05 当量的 2-(1H- 苯并三唑 -1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲六氟磷酸酯 )(HBTU)(Mw ＝ 379.24)。 将该反应混合物在室温下搅拌至少 1 小时。 在通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/2) 将该反应混合物稀释、 首先用 NaCl 与 HCl(1.5 当量 ) 的
     一种 5％ ( 重量 ) 水溶液进行洗涤、 然后用 Na2CO3 与 2.2 当量 NaTPB(Mw ＝ 342g/ 摩尔 ) 的 一种 5％ ( 重量 ) 水溶液洗涤、 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤三次。在该有 机层浓缩以后， 将残留的油在甲氧乙醇中溶解若干次、 然后在真空中浓缩以便消除大部分 的剩余异丁醇。在 GC 控制之后， 将该浓缩物通过缓慢倒入冷的 (0±5℃ )5％ ( 重量 )NaCl 水溶液而使它沉淀。在搅拌至少 1 小时以后， 将该悬浮液过滤并且用冷水洗涤两次。将该 沉淀物在真空中在 45℃下进行干燥。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 98％。
     8.2HCl.H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 3) 的合成
     使 1.00 当 量 2TPB.Z-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1347.5 ； 纯 度＝ 64.0 ％ ) 的一种甲醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过的树脂 IRA 958( 或 Amberjet Cl 1000 ； 6.00 当量 )。 在通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过滤、 洗 涤三次。使这些组合的有机相在真空中部分地浓缩、 并然后用水稀释。最后， 加入 2％ ( 重 量 ) 的 Pd 催化剂， 并且将该悬浮液在 40℃下氢化至少 3 小时。将该催化剂过滤掉、 用甲醇 / 水的一种混合物洗涤三次。 将组合的滤液在真空中蒸发、 残余物悬浮在 DMA 中并且将其进 一步浓缩以消除剩余的水。在检验水的含量以后， 用 HCl(0.1N)、 AgNO3(0.1N)、 或 NMR 滴定 该溶液并且不经任何纯化而进一步使用。 产率 ( 基于滴定 ) ＝ 82％。
     9.Z-Arg-Trp-Pro-OH 的合成
     将 DMA、 1.00 当 量 的 DIPEA 以 及 1.00 当 量 的 H-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 301.3 ； 纯 度＝ 94.0 ％ ) 在室温下混合至少 30 分钟直到获得一种溶液为止， 然后将该溶液冷却到 10±5° (1 号溶液 )。将 1.00 当量的 Z-Arg-OH.HCl(Mw ＝ 344.8) 在室温下加入 DMA 中直 到获得一种澄清溶液为止 (2 号溶液 )。在将 2 号溶液冷却到 -15℃ ±5℃期间， 加入 1.05 当量吡啶 (Mw ＝ 79.1 ； 纯度＝ 99.0％ ) 以及 1.00 当量的 DIPEA。一旦达到这个温度， 就将 1.00 当量的新戊酰氯 (PivCl)(Mw ＝ 120.58) 倒入该反应混合物 (2 号溶液 ) 中， 将其进一 步活化大约 5 分钟。最后， 将 1 号溶液加入活化的 2 号溶液中， 并且将该反应混合物进一步 搅拌至少 1 小时同时停止冷却， 并且允许该反应混合物升温至室温。
     在已经通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 将该肽溶液在真空中进行浓缩。用乙腈 和水稀释残余物并且用 2N K2CO3 将 pH 调节到 8.0±0.2。然后将该溶液在真空中部分地浓 缩并且将残余物冷却到 5℃ ±5℃以进行沉淀。在过滤之前维持搅拌至少 30 分钟、 并且然 后用水洗涤沉淀物。最终获得一种白色固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ： 90％。
     10.Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2.3TPB(SEQ ID NO 2) 的合成
     将 1.00 当量的 Z-Arg-Trp-Pro-OH(Mw ＝ 591.65 ； 纯度＝ 96.0 ％ )、 1.00 当量的 HCl/ 二噁烷 (4N) 以及 1.05 当量 HOBt(Mw ＝ 135.12 ； 纯度＝ 98.0％ ) 加入 1.00 当量 2HCl. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1213.4 ； 纯度＝ 85.0％ ) 在用 CH2Cl2 稀 释过的 DMA 中的溶液中。 在已经将该溶液冷却到 10℃ ±5℃以后， 加入 1.02 当量 EDC(Mw ＝ 191.7)。将该反应混合物在 10℃ ±5℃搅拌 30 分钟、 并且然后在室温下搅拌至少 4 小时。 在通过 HPLC 证实该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/3) 将该反应混合物
     稀释、 首先用具有 HCl(0.5 当量 ) 的一种 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液进行洗涤、 然后用含有 3 当量 NaTPB(Mw ＝ 342) 的一种 5％ ( 重量 )Na2CO3 水溶液洗涤、 并且最终用 5％ ( 重量 ) 的 NaCl 水溶液洗涤两次。 在该有机层浓缩以后， 将残余的油在甲氧乙醇中溶解若干次、 然后在 真空中进行浓缩以便消除大部分的异丁醇。在 GC 控制之后， 将该浓缩物通过缓慢地倒入冷 的 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中而使它沉淀。在搅拌至少 1 小时以后， 将该悬浮液过滤并且用 冷水洗涤两次。在将该沉淀物 40℃ ±5℃下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 87％。
     11.3HCl.H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2) 的合成
     使 1.00 当 量 3TPB.Z-Arg-Trp-Pro-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(Mw ＝ 1787.1 ； 纯度＝ 57.0％ ) 的一种甲醇溶液若干次穿过一个柱， 该柱含有一种甲醇洗涤过 的树脂 IRA 958(Mw ＝ 1000， 9.00 当量 )。在已经通过 HPLC 检验这种交换以后， 将该树脂过 滤并且用甲醇洗涤三次。使这些组合的有机相在真空中部分地浓缩。然后用水将该浓缩的 溶液稀释并且加入 Pd 催化剂。然后将该悬浮液在 35℃ ±5℃下氢化至少 6 小时。将该催 化剂过滤掉、 用一种甲醇 / 水混合物洗涤三次。将该组合的滤液在真空中蒸发， 残余物悬浮 在 DMA 中并且将其进一步浓缩以消除剩余的水。在检验该水的含量以后， 用 HCl(0.1N) 或 NMR 滴定该溶液并且不经任何纯化而进一步使用。
     产率 ( 基于 NMR 含量测量 ) ： 93％。
     12.Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     根据两个路径进行 Boc-Ile-Leu-OH 二肽的合成 ：
     - 经由 Boc-Ile-OH 的活化的酯 OSu( 路径 A)
     - 通过使用 Boc-Ile-OH 的 UNCA( 尿烷 N- 保护的羧酸酐 )( 路径 B)
     路径 A ： Boc-Ile-OSu 的合成 ( 对比 )
     在 搅 拌 下， 将 1.00 当 量 的 Boc-Ile-OH.1/2H2O(Mw ＝ 240.3) 以 及 1.05 当 量 的 Suc-OH(Mw ＝ 115) 加入乙酸乙酯中。将该溶液冷却到 0±5℃并且然后将稀释在乙酸乙酯 中的 1.10 当量 DCC(Mw ＝ 206.3) 倒入该溶液中。将该悬浮液在 0℃下搅拌至少 30 分钟、 并且在室温下搅拌至少 5 小时。在已经通过加入 2.42g 乙酸 (0.20 当量 ) 使该反应混合物 猝灭以后， 将 DCU 过滤并且用乙酸乙酯洗涤两次。用以下物质洗涤这些有机层 ： 含 0.5 当量 KHSO4 的 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液 ； 含 0.5 当量 Na2CO3 的 5％ ( 重 量 )NaCl 水溶液、 并且最后是 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液。将该溶剂在真空下进行浓缩。在乙 酸乙酯中吸收该浓缩溶液两次、 并且进一步在真空中蒸发以便消除剩余的水。用环己烷或 庚烷稀释该浓缩的有机层。将该沉淀的悬浮液在室温下搅拌至少 30 分钟、 过滤并最终在真 空下 (45℃ ) 干燥。干燥过的沉淀物产出了 89％ ( 基于 NMR 含量 ) 的 Boc-Ile-Osu， 为白色 固体。
     路径 A ： Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     将 1.01 当量的 H-Leu-OH(Mw ＝ 131.2) 在大约 50℃下首先用 2.10 当量 TMA(Mw ＝ 145.12) 甲硅烷基化直到获得一种澄清溶液为止。将该溶液冷却到室温， 并且用乙酸异丙 酯进行稀释。然后将 1.00 当量的 Boc-Ile-OSu 固体 (Mw ＝ 328.26 ； 100.0％ ) 加入甲硅烷 基化的 H-Leu-OH 溶液中。将该反应混合物在室温下进一步搅拌至少 8 小时。在通过 HPLC证实该反应的完成以后， 通过加入 DMAPA 和水使该溶液猝灭、 用以下物质进行洗涤 ： 500ml 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中的 KHSO4(1.00 当量 ) ； 500ml 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 以及水。 在将该乙酸异丙酯在真空中蒸发以后， 通过用乙酸异丙酯进行共沸蒸馏而去除过量的水。 在浓缩过程中该肽沉淀出。然后将该浓缩的悬浮液稀释在环己烷中。将沉淀物在室温下搅 拌至少 10 分钟、 过滤并最终在真空中在 45℃下进行干燥。干燥过的沉淀物产出了 ( 基于 NMR 含量 )80％的 Boc-Ile-Leu-OH， 为白色固体。
     路径 B ： Boc-Ile-Leu-OH 的合成
     将 1.00 当量的 Boc-Ile-NCA(Mw ＝ 257.3) 加入 1.10 当量 H-Leu-OH(Mw ＝ 131.2) 在 DMSO 中的悬浮液中。然后将该悬浮液在 60℃ ±5℃下加热至少 2 小时。在通过 HPLC 检 验转化率以后， 用乙酸异丙酯稀释该反应混合物、 用以下物质进行洗涤 ： 在 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液中的 KHSO4(Mw ＝ 136 ； 1.00 当量 )、 5％ ( 重量 )NaCl 水溶液、 以及水。 在将乙酸异丙酯 在真空中蒸发以后， 通过用乙酸异丙酯进行共沸蒸馏而消除过量的水。在浓缩过程中该肽 沉淀出。然后将该浓缩的悬浮液在环己烷中稀释。将该沉淀物在室温下搅拌至少 10 分钟、 过滤并最终在真空中在 45℃下进行干燥。 干燥的沉淀物产出了 89％的 Boc-Ile-Leu-OH， 为 白色固体 ( 基于 NMR 含量 )。
     13.3HCl.Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2( SEQ ID NO 1) 的合成
     将 1.05 当 量 的 Boc-Ile-Leu-OH(Mw ＝ 344.4) 以 及 1.10 当 量 的 HOOBt(Mw ＝ 163.13) 加入 1.00 当量 3HCl.H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(M w ＝ 1652.9 ； 纯度＝ 89.0％ ) 在 DMA 与 CH2Cl2 中的一种冷的 (0±5℃ ) 溶液中。 然后将 1.20 当量的 EDC(N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N- 乙基碳二亚胺 ； Mw ＝ 191.7 ； 纯度＝ 100.0％ ) 加 入该反应混合物， 将它在 0±5℃下进一步搅拌大约 4 小时、 然后在室温下搅拌至少 8 小时。 在已经通过 HPLC 检验该反应的完成以后， 用一种 CH2Cl2/ 异丁醇混合物 (8/2) 将该反应混 合物稀释、 并且用一种 5％ ( 重量 )NaCl 的水溶液 +HCl(0.3 当量 ) 进行洗涤。在该有机层 浓缩以后， 将残余的油通过缓慢地倒入冷的 (0±5℃ ) 乙腈中而使它沉淀。 在 0±5℃下搅拌 至少 30 分钟以后， 将该悬浮液过滤并且用冷的 MTBE 洗涤两次。将该沉淀物在 40℃ ±5℃ 下进行干燥。最终获得一种灰白色的固体。
     产率 ( 基于 NMR 含量 ) ＝ 88％。
     14.5HCl.H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的合成
     将 1.00 当量的 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc) -NH2(SEQ ID NO 1)(Mw ＝ 1980 ； 纯度＝ 89.0％ ) 缓慢地加入相对于该肽含有 24 当量 HCl 以及 6 当量 4-( 甲硫基 ) 苯酚 (Mw ＝ 124.2) 的异丙醇中。在完成加入以后， 用异丙醇稀释 该反应混合物。将该反应混合物在 35℃ ±5℃下搅拌至少 2 小时。在通过 HPLC 检验该反 应的完成以后， 将该反应混合物缓慢倒入冷的异丙醚中。将该沉淀物在 0±5℃下搅拌至少 15 分钟、 然后过滤、 用异丙醚洗涤三次、 并且最后在真空下干燥从而获得 5HCl.H-Ile-LeuArg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)。
     15.5HCl.H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1) 的纯化将实例 14 中所获得的产物溶解在一种乙酸盐缓冲剂中并且在 0.5μm 膜上过滤。 使用以下参数通过 HPLC 将生成的溶液进行纯化 ：
     -柱： 2.0*25cm(ID*L)
     - 固定相 ： C18 硅石 ； 10μm-100A
     - 流动相 ： A ＝乙酸盐缓冲剂， pH 5.0(0.15M)
     B ＝乙腈
     - 流速 ： 19mL/min
     - 波长 ： 254nm
     - 梯度 (min ； ％ B) ： (0 ； 10)(5 ； 10)(6 ； 18)(36 ； 33)(36.1 ； 60)(43 ； 60)(43.1 ； 10) (52 ； 10)
     所获得的 Omiganan 肽 (SEQ ID NO 1) 具有超过 98％的纯度。
     将所生成的高纯度部分用水稀释并且使用以下流动相将同一个柱用来将乙酸根 离子转化为 Cl- 离子 ：
     - 水 / 乙腈 95/5v/v， 用于该柱的平衡
     -0.5M NaCl/MeCN 95/5v/v， 用于离子交换
     - 水 /MeCN 60/40v/v， 用于洗脱
     然后将生成的产物进行浓缩并且冷冻干燥。19102124021 A CN 102124030
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