肽的制造方法.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102124021 A(43)申请公布日 2011.07.13CN102124021A*CN102124021A*(21)申请号 200880130757.5(22)申请日 2008.06.17C07K 7/08(2006.01)C07K 1/06(2006.01)(71)申请人索尔维公司地址比利时布鲁塞尔(72)发明人罗兰卡伦斯 洛朗让尼乔治斯布隆迪尔(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人顾晋伟 韩宏星(54) 发明名称肽的制造方法(57) 摘要本发明涉及用于在溶液相中制造Omiganan肽的一种方法。本发明还涉及在用于制造Omigana

2、n的方法中新颖的中间产物并且涉及用于制造这些中间产物的方法。(85)PCT申请进入国家阶段日2011.02.15(86)PCT申请的申请数据PCT/EP2008/057637 2008.06.17(87)PCT申请的公布数据WO2009/152850 EN 2009.12.23(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 3 页 说明书 15 页序列表 5 页 附图 1 页CN 102124030 A 1/3页21.一种用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ

3、ID NO 1)的Omiganan肽或其衍生物的方法，该方法包括在溶液中将第一肽与第二肽偶联的至少一个步骤，该第一肽具有活化的羧基以及至少两个氨基酸单元、或选自以下的氨基酸：具有活化羧基的Ile、Leu、Arg以及Trp、Pro；该第二肽具有游离氨基以及至少两个氨基酸单元，其中该第一肽与第二肽不同，并且它们包含选自以下的氨基酸：Ile、Leu、Arg、Trp、Pro以及Lys，其顺序如Omiganan中序列Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(SEQ ID NO 1)所指定的。2.根据权利要求1所述的方法，包括将Arg-Trp-Pro-

4、Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其衍生物与Ile-Leu偶联的步骤，其中Ile的氨基受到氨基保护基团的保护。3.根据权利要求1或2所述的方法，包括将Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3)或其衍生物与Arg-Trp-Pro偶联的步骤，其中Arg的氨基受到保护基团的保护。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，包括将Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4)或其衍生物与Trp-Trp-Pro偶联的步骤，其中该N端Trp的氨基受到保护基团的保护。5.根据权利要求2至4中

5、任一项所述的方法，其中该保护基团选自叔丁氧羰基(Boc)基团以及苄氧基羰基(Z)基团。6.根据权利要求5所述的方法，其中Arg或Trp的氨基受到苄氧基羰基(Z)基团的保护。7.根据权利要求5所述的方法，其中Lys中的侧链氨基和/或Ile中的N端氨基受到叔丁氧羰基(Boc)的保护。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括形成含Arg的肽的四苯基硼酸盐。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述含Arg的肽的四苯基硼酸盐是通过使偶联步骤反应介质与四苯基硼酸盐阴离子的来源相接触而形成的，该反应介质包含由权利要求1至7中任一项所述的偶联步骤所获得的含Arg的肽。10.根据权利要求9所述的方法，其中

6、所述四苯基硼酸盐阴离子的来源包括四苯基硼酸钠。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸盐不经分离而经历至少一个另外的合成步骤。12.根据权利要求11所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸盐至少经历脱保护步骤然后是偶联步骤。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该第二肽具有选自以下的式：NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)、NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6)、N

7、H2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于该Ly

8、s侧链氨基的任选的保护基团，并且R是用于Lys的羧基的羧基保护基团，优选是酰胺基。14.根据权利要求13所述的方法，其中该第二肽包含0.1wt至1wt的其(D)权 利 要 求 书CN 102124021 ACN 102124030 A 2/3页3Arg-Arg-Lys(X)-R类似物。15.根据权利要求14所述的方法，其中该第二肽包含0.2wt至0.9wt的(D)Arg-Arg-Lys(X)-R类似物。16.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中该第二肽是NH2-Arg-Lys(X)-R，其中X是用于该Lys侧链氨基的任选的保护基团，并且R是用于Lys的羧基的羧基保护基团，优选是酰胺基团

9、，并且该第一肽选自：Y-Trp-Arg、Y-Pro-Trp-Arg、Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)、Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)、Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO14)、Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15)、Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16)、Y-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Ile-Leu-Arg-T

10、rp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 18)，其中Y是氨基保护基团，优选Z基团。17.根据权利要求16所述的方法，其中该偶联是在芳基环化的氧代三嗪活化剂、优选HOOBt的存在下进行的。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中该偶联在-10到+10的温度下进行。19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中该偶联在卤化溶剂与非卤化溶剂的混合物、优选氯化溶剂与酰胺型溶剂的混合物中进行。20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中使Z-Trp-Arg-OH与HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2偶联，该活化剂是HOOBt，该溶剂是DMA与亚

11、甲基氯的混合物，并且该偶联在第一个时间段中在-55的温度下进行3到5小时，并且在第二时间段中在+55的温度下进行6到10小时。21.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中该第二肽是通过权利要求16至20中任一项所述的方法获得的。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，该方法依照图1的方案。23.一种用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的脱保护方法，该方法包括在基本上无水的条件下使式Y 1-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro

12、-Trp-Arg-Arg-Lys(Y2)-NH2(SEQ ID NO 1)的前体肽与酸进行反应，其中Y1与Y2指相同或不同的氨基保护基团或H，并且Y1或Y2中的至少一个是对酸敏感的氨基保护基团。24.根据权利要求23所述的方法，其中Y1和Y2是Boc。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中该酸选自：HCl、HF、三氟乙酸、以及三氟甲磺酸。26.根据权利要求25所述的方法，其中该酸是HCl，并且其中针对每摩尔的肽优选使用6到32摩尔、更优选12到24摩尔的HCl。27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中该反应在有机溶剂中、优选在脂肪醇中、更优选在异丙醇中进行。28.根据权利要求

13、23至27中任一项所述的方法，其中基本上无水的条件是通过在含有10mg/kg到1.5wt、优选50mg/kg到1wt的水的液体反应介质中进行该反应而实现的。29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中该反应是在碳阳离子清除剂、特别是叔丁基阳离子清除剂的存在下进行的。权 利 要 求 书CN 102124021 ACN 102124030 A 3/3页430.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中该反应是在0到80、优选30到45的温度下进行的。31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中该Omiganan肽是以其五盐酸盐的形式被回收的。32.根据权利要求23至31中任一项

14、所述的方法，其中该前体肽是由权利要求1至22中任一项所述的方法获得的。33.一种用于纯化Omiganan肽的方法，其包括使不纯的Omiganan肽经历反向液相色谱法，其中流动相包含水以及有机溶剂。34.根据权利要求33所述的方法，其中该流动相包含乙腈。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中该流动相包含乙酸盐缓冲剂。36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，还包括反离子交换步骤。37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，还包括浓缩和冷冻干燥步骤。38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中该omiganan肽是由权利要求1至32中任一项所述的方法获得的。39.Trp-T

15、rp-Pro-OH。40.Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)。41.Arg-Trp-Pro-OH。42.Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4)。43.Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 6)。44.根据权利要求40至43中任一项所述的化合物，其中该N端氨基受到保护基团、优选Z基团的保护。45.根据权利要求40以及42至44中任一项所述的化合物，其中Lys的侧链氨基受到保护基团、优选Boc基团的保护。46.根据权利要求40至44中任一项所述的化合

16、物的四苯基硼酸盐。47.包括在图1中的含Arg的肽中的任何一种的四苯基硼酸盐。权 利 要 求 书CN 102124021 ACN 102124030 A 1/15页5肽的制造方法0001 本发明涉及用于制造Omiganan肽及其中间产物的方法，并且此外涉及在用于制造Omiganan的方法中的新颖的中间产物。0002 Omiganan是对于肽H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)的常见国际命名(CID)，它主要是以其五盐酸化物(5HCl)盐的形式被使用。Omiganan是一种阳离子的抗微生物的肽。最近的

17、研究还显示了它可以在炎症应答中起作用。Omiganan在体外分析中证明了对抗多种微生物的一种快速杀菌活性，这些微生物移殖于皮肤中而且可以在炎症病变的致病中起作用。此外，Omiganan五氯化物目前是在II-III期用于治疗严重的痤疮，并且在III期临床试验中用于预防中心静脉导管相关的血流感染。0003 Omiganan可以经由一种线性肽合成而生产，其中对应的氨基酸被顺序地添加到一个增长的肽链中。至于所希望的Omiganan肽的产率和纯度，这些方法是不令人满意的。0004 本发明现在使之可得到一种用于该Omiganan肽的改进的合成。0005 美国专利号5,262,567披露了使用一种化合物(包

18、括一个胍基团以及一种未取代的四苯基硼酸盐离子)作为该肽合成中的中间产物。作为一个实例，描述了由精氨酸与四苯基硼酸盐(TPB)形成的化合物的合成以及它在合成该肽Boc-Leu-Arg-OH中的用途。0006 WO 99/65506A披露了包含阳离子肽的药用组合物，这些阳离子肽包括阳离子肽MBI 11B20CN，它包含Omiganan的氨基酸序列。0007 因此本发明的目标是提供用于生产该Omiganan肽的方法，该方法以高产率和高纯度给出Omiganan。根据本发明的方法出人意料地允许以有限的步骤(特别是纯化步骤)生产所述肽，因此大大减小了制造成本。0008 因此本发明在第一方面涉及用于制造具有

19、序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)Omiganan肽或其一种衍生物的一种方法，该方法包括在溶液中将一种第一肽与一种第二肽进行偶联的至少一个步骤，该第一肽具有一个活化的羧基以及至少两个氨基酸单元、或一种选自下组的氨基酸，该组的组成为：具有一个活化羧基的Ile、Leu、Arg、以及Trp、Pro；该第二肽具有一个游离的氨基以及至少两个氨基酸单元，其中该第一与第二肽是不同的并且包含选自下组的多个氨基酸，该组的组成为：Ile、Leu、Arg、Trp、Pro、以及Lys，处于由Omiganan中的序列I

20、le-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(SEQ ID NO 1)所说明的顺序中。0009 为了本发明的目的，术语“肽”是指一种聚合物，其中这些单体是通过酰胺键共价地附接在一起的氨基酸。肽是两个或经常是更多个氨基酸单体长。另外，所有的肽序列由左边或右边取向是处于氨基端到羧基端的常规方向的那些化学式代表。0010 为了本发明的目的，术语“氨基酸”旨在表示任何包括至少一个NR1R2基团(优选NH2基团)、以及至少一个羧基的化合物。本发明的这些氨基酸可以是天然存在的或是合成的。这些天然氨基酸除甘氨酸之外，包含一种手性碳原子。除非另外确切指明，优选的

21、是包含具有L构型的天然氨基酸的这些化合物。贯穿本申请将氨基酸残基缩写为如下：异亮氨酸是Ile；亮氨酸是Leu；精氨酸是Arg；色氨酸是Trp；脯氨酸是Pro并且赖氨酸是Lys。说 明 书CN 102124021 ACN 102124030 A 2/15页60011 为了本发明的目的，术语肽的“C-端”是由一个游离羧基(-COOH)封端的一种氨基酸序列的末端。另一方面，术语肽的“N-端”是指由一种具有游离氨基(-NH2)的氨基酸封端的一种氨基酸序列的末端。0012 为了本发明的目的，术语“偶联”是指在一种氨基酸的羧基或一种第一肽的C-端与另一种氨基酸的氨基或一种第二肽的N-端之间的反应。换言之，

22、在偶联的过程中，两个肽中间产物片段、或一个肽中间产物片段以及一种反应性氨基酸被偶联，一般是在一种适当的溶剂中、并且通常是在促进该偶联反应的效率以及质量的另外试剂的存在下。这些肽中间产物片段被反应性地安排，因而一个片段的N-端变为偶联至另一个片段的C-端，或反之亦然。0013 如在此使用的，术语“肽衍生物”包括一种类似物，其中一个或多个氨基酸残基已经被对应的D异构体或被一个非天然的氨基酸残基、或其一种化学衍生物所取代。一种肽的化学衍生物包括但不限于：含有多个另外的化学部分的一种衍生物，假如该衍生物保持该肽的抑制活性，则这些另外的化学部分通常不是该肽的一部分。这类衍生物的实例是：(a)该氨基端的或

23、另一个游离氨基的N-酰基衍生物，其中该酰基基团可以是一种烷酰基基团比如乙酰基、己酰基、辛酰基；一种芳酰基，如苯甲酰基、或生物素基；(b)该羧基端的或另一个游离羧基或多个羟基的酯类；以及(c)该羧基端的或另一个游离羧基的酰胺，通过与氨或与一种适当的胺反应而产生。Omiganan的衍生物及其中间产物还是(例如)该Omiganan序列的受保护的片段和肽、Omiganan与无机的或有机酸的盐类(优选无机酸、并且最优选盐酸)的盐及其中间产物。可能使用的与有机酸的盐的实例是与乙酸、柠檬酸、草酸、三氟乙酸、四苯基硼酸以及酒石酸的盐类。0014 在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括将Arg-Trp-Pro

24、-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一种衍生物与Ile-Leu进行偶联的步骤，其中Ile的氨基受一个氨基保护基团所保护。0015 此外优选的是本发明的方法包括将Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3)或其一种衍生物与Arg-Trp-Pro进行偶联的步骤，其中Arg的氨基受到一个保护基团保护。0016 该方法优选地包括将Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 4)或其一种衍生物与Trp-Trp-Pro进行偶联的步骤，其中Trp N端的氨基受到一个保护基团保护。0017 此

25、外，本发明根据一个第二方面是针对一种用于制造H-Arg-Lys(Boc)-NH2的方法，该方法包括以下步骤：0018 (a)将Z-Arg-OH.Cl与H-Lys(Boc)-NH2进行偶联；并且0019 (b)将步骤(a)中所获得的Z-Arg-Lys(Boc)-NH2氢解，优选是在一种Pd催化剂的存在下。0020 术语“Lys(Boc)”旨在表示氨基侧链受到一个Boc基团保护的一种赖氨酸。0021 在第三方面，本发明是针对新颖的中间产物Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 2)。0022 在第四个方面，本发明是针

26、该新颖的中间产物Z-Arg-Trp-Pro-OH。0023 在第五个方面，本发明是针对一种用于制造Z-Arg-Trp-Pro-OH的方法，该方法包括使H-Trp-Pro-OH与Z-Arg-OH.HCl进行偶联的步骤。说 明 书CN 102124021 ACN 102124030 A 3/15页70024 在第六个方面，本发明是针对新颖的中间产物Z-Trp-Trp-Pro-OH。0025 在第七个方面，本发明是针对一种用于制造Z-Trp-Trp-Pro-OH的方法，该方法包括使H-Trp-Pro-OH与Z-Trp-Osu进行偶联的步骤。0026 在第八个方面，本发明是针对一种用于制造中间产物Bo

27、c-Ile-Leu-OH的方法，该方法包括使Boc-Ile-NCA与H-Leu-OH进行偶联的步骤。0027 在第九个方面，本发明是针对新颖的中间产物Z-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 4)。0028 在第十个方面，本发明是针对新颖的中间产物Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 3)。0029 在本发明的方法中，保护基团一般用于在所涉及的氨基酸或肽中间产物中的一个或多个氨基。保护基团的用途没有具体进行限制。0030 以说明的方式，在本发明的这些化合物中可以采用以下保护基团：0031 酰基型保护基团

28、，特别是甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、4-甲苯磺酰基、苯磺酰基以及2-硝基苯基次磺酸基；0032 芳香族的尿烷型保护基团，例如尤其是取代的或未取代的苄氧基羰基、对-溴代苄氧基羰基、对-甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、2-(4-联苯基)丙基(2)氧基羰基、2-(3，5-二甲基氧苯基)、丙基(2)氧基羰基、以及三苯基膦酰基乙基氧基羰基；0033 脂肪族的尿烷型保护基团，特别是叔丁氧羰基、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、烯丙氧羰基、9-芴甲氧羰基、2-甲基磺酰基乙氧羰基以及2，2，3-三氯乙基氧基羰基；0034 环烷基尿烷型保护基团，例如尤其是环戊氧羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基

29、、叔戊氧基羰基以及异冰片基氧基羰基；0035 硫尿烷型保护基团，特别是苯基硫代羰基、0036 烷基型保护基团，例如尤其是三苯基甲基(三苯甲基)以及苄基；0037 三烷基硅烷基团，如三烷基硅烷。上述的保护基团特别适合作为氨基保护基团。0038 在本发明的一种或多种方法中，优选的是在与一个保护基团进行偶联的步骤过程中一种氨基酸基团中的至少一个氨基受到保护，该保护基团选自一种芳香族的尿烷型保护基团以及脂肪族的尿烷型保护基团。更优选地，所述保护基团是选自一种叔丁氧羰基(Boc)基团与一种苄氧基羰基(Z)基团。0039 在本发明的一种或多种方法的一个优选实施方案中，该苄氧基羰基(Z)基团被用作一个氨基酸

30、单元中一个端氨基的保护基团，其中该氨基酸单元是Arg或Trp。0040 在本发明的一种或多种方法的另一个优选实施方案中，该叔丁氧羰基(Boc)基团被用作Lys中的侧链氨基的和/或Ile中的N-端氨基的保护基团。0041 特别适合用于保护该羧基的其他保护基团包括烷氧基，特别是甲酯、乙酯、叔丁酯以及苄基酯。在一个优选实施方案中，Lys的羧基是作为酰胺、特别是作为CONH2基团被保护的。0042 在本发明的一种或多种方法中，该第一肽具有一个活化的羧基以及一般至少两个氨基酸单元。在本发明的方法中可以使用不同的活化基团，它们减少了副反应和/或增大了反应效率，优先选自：碳二亚胺类、羰基二咪唑类、酰卤类、磷

31、鎓盐类、以及脲鎓或胍鎓盐说 明 书CN 102124021 ACN 102124030 A 4/15页8类。例如，磷鎓和脲鎓盐类在一种叔碱(例如二异丙基乙胺(DIPEA)以及三乙胺(TEA)的存在下可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类(例如BOP、PyBOP、HBTU、以及TBTU全部产生了HOBt酯)。帮助防止外消旋作用的其他试剂包括碳二亚胺类(例如N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)或水溶性碳二亚胺(WSCDI)与一种添加的辅助亲核体(例如1-羟基-苯并三唑(HOBt)、3，4二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)

32、、1-羟基-氮杂苯并三唑(HOAt)、或HOSu)或其衍生物。可以使用的另一种试剂是TBTU。例如用N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)、新戊酰氯(PivCl)、异丁基氯甲酸酯(IBCF)、HBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基铵脲鎓六氟磷酸盐)、以及EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉)获得了好的结果。0043 根据本发明优选的活化基团是DCC、EDC以及HBTU。0044 当使用这类羧酸活化剂时，该偶联反应经常是在一

33、种碱作为额外试剂的存在下进行的。在本发明的另一个具体的方面，该偶联反应因此是在一种碱的存在下进行的。该碱是优先选自叔胺类以及杂芳香族胺类，如N-甲基吗啉(NMM)、吡啶、三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)或它们的混合物。更优选地，它是选自N-甲基吗啉以及二异丙基乙胺。0045 除这些活化基团之外，有时候有利地使用添加剂。优选的添加剂是N-羟基丁二酰亚胺(Suc-OH)、N-羟基苯并三唑(HOBt)、或3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3苯并三嗪(HOOBt)以及它们的衍生物。通常这些添加剂是基于待活化的羧基的量值按1到2当量的量值使用。0046 在本发明的另一个具体的方面，如

34、以上说明的肽的偶联是在至少一种极性有机溶剂的存在下进行的。在一个具体的优选实施方案中，该极性有机溶剂允许对所形成的肽键的外消旋作用、该肽和/或肽片段的溶解度、以及偶联反应速率进行特别有效的控制。该极性有机溶剂优先选自：N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(AcOEt)、异丙基乙酸酯、二氯甲烷(DCM)、亚甲基氯、吡啶、氯仿、乙腈、二甲氧基乙烷、二噁烷、四氢呋喃(THF)或它们的混合物。更优选地，它是选自N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)、以及N，N二甲基甲酰胺(DM

35、F)或它们的混合物。最优选地，该极性有机溶剂是N，N-二甲基乙酰胺(DMA)。一种优选的混合物包含20到80(体积)的DMA以及80到20(体积)的二氯甲烷(CH2Cl2)、更优选50到70(体积)的DMA以及50到30(体积)的二氯甲烷(CH2Cl2)。0047 如在此使用的术语“偶联”或“偶联步骤”具体是指将不同的肽或氨基酸进行偶联的步骤。0048 在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括使Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一种衍生物与受保护的Ile-Leu或其一种衍生物进行偶联的步骤。在这个步骤中，优选将H

36、OOBt用作一种添加剂。此外，这个偶联步骤优选是在DMA/二氯甲烷(CH2Cl2)的一种混合物中进行，该混合物优选包含50到75(体积)的DMA以及25到50(体积)的二氯甲烷(CH2Cl2)。此外该偶联步骤优选在EDC的存在下进行。说 明 书CN 102124021 ACN 102124030 A 5/15页90049 在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，该第二肽具有选自以下的化学式：NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)，NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-

37、Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6)，NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO7)，NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)，NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)，NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)，NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)

38、-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于该Lys-侧链氨基的一个保护基团、优选是一种Boc基团，并且R是用于Lys的羧基的一个羧基保护基团、优选是一种酰胺基团。0050 事实上本发明允许贯穿该合成对于在该Ominagan肽的10位置包含Arg的D-对映异构体的多种产物的存进行控制并且将其最小化。0051 在这个实施方案中，该第二肽总体上包括从0.1wt到1wt、有利地从0.2wt-0.9wt、并且经常从0.2wt到0.7wt的一种肽，该肽选自：NH2-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4)、NH2-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(

39、SEQ ID NO 5)、NH2-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6)、NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、N

40、H2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)、以及NH2-(D)Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X和R是如上所说明的。本发明还涉及所述第二肽。0052 在一个进一步优选的实施方案中，该第二肽是NH2-Arg-Lys(X)-R，其中X是用于该Lys-侧链氨基的一个任选的保护基团、优选是一种Boc基团，并且R是用于Lys的羧基的一个羧基保护基团，优选是一个酰胺基团，并且该第一肽是选自下组：Y-Trp-Arg、Y

41、-Pro-Trp-Arg、Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)、Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)、Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 14)、Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15)、Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16)、Y-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-T

42、rp-Arg(SEQ ID NO 18)，并且Y是用于该N-端氨基的一个氨基保护基团、特别是如上所说明的、优选是一个Z基团。0053 在这个具体的实施方案中，该偶联有利地在一种芳基环化的氧代-三嗪活化剂、优选HOOBt的存在下进行。0054 在这个实施方案中，该偶联总体上是在从-10到+10的温度下进行的。0055 在这个实施方案中，该偶联经常是在一种卤化的与非卤化的溶剂的一个混合物中、优选一种氯化的溶剂与一种酰胺型溶剂的一个混合物进行的。适当的氯化的溶剂包括：例如氯仿、1，2-二氯乙烷以及优选地二氯甲烷。适当的酰胺型溶剂包括：例如N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺以及优选地N，N-二甲基

43、乙酰胺。亚甲基氯与N，N-二甲基乙酰胺的一种混合物已经给出了良好的结果。0056 特别有利的是使Z-Trp-Arg-OH与HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2偶联。0057 在本实施方案的最优选的方面，使Z-Trp-Arg-OH与HCl.H-Arg-Lys(Boc)-NH2偶说 明 书CN 102124021 ACN 102124030 A 6/15页10联，该活化剂是HOOBt，该溶剂是DMA与亚甲基氯的一种混合物，并且该偶联在第一时间段中在-55的温度下进行了3到5小时、并且在第二时间段中在+55的温度下进行了6到10小时。0058 根据本发明特别优选的方法是依照图1的方案。在该方

44、案中X与Y可以是相同的或不同的。它们优选地是不同的。当X是一种叔丁氧羰基(Boc)基团并且Y是一种苄氧基羰基(Z)基团时，获得了良好的结果。0059 本发明还涉及用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的一种脱保护方法，该方法包括在基本上无水的条件下使具有化学式Y1-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Y2)-NH2(SEQ ID NO 1)的一种前体肽与一种酸进行反应，其中Y1与Y2指代相同或不同的氨基保护

45、基团或H，并且Y1或Y2的至少一个是一种对酸敏感的氨基保护基团。0060 保护基团Y1和Y2可以是例如包括在以上概括说明中的氨基保护基团。优选的是Y1与Y2二者都是氨基保护基团。更优选地，Y1与Y2二者都是Boc。0061 在根据本发明的脱保护方法中，该酸经常是选自：HCl、HF、HBr、HI、三氟乙酸、以及三氟甲磺酸。更优选地，该酸是HCl。特别是在此情况下，对每摩尔肽使优选用6到32摩尔、更优选12到24摩尔的酸。0062 根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在一种有机溶剂中进行，优选是在一种脂肪族的醇、特别是一种仲醇中，更优选是在异丙醇中。0063 在根据本发明的脱保护方法中，基本上无水

46、的条件是例如通过在包含从10mg/kg到1.5wt、优选从50mg/kg到1wt的水的一种液体反应介质中进行该反应而实现的。更优选地，该反应介质的含水量是从100mg/kg到0.5wt。0064 尤其在Y1与Y2中的至少一个是Boc时，该反应有利地在对于碳阳离子、特别是该叔丁基阳离子的一种清除剂(例如苯甲硫醚、以及优选地4-(甲硫基)苯酚)的存在下进行。0065 根据本发明的脱保护方法的反应总体上是在从0到80、优选从25到45的温度下进行的。0066 在根据本发明的脱保护方法中，该Omiganan肽有利地是以其五盐酸化物盐的形式被回收。0067 在根据本发明的脱保护方法中，该前体肽优选地是通

47、过根据本发明的方法获得的。0068 在该脱保护方法的一个特别优选的实施方案中，使Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO 1)脱保护从而产生5HCl.H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)是在HCl与一种仲醇的一个混合物中、优选在用于叔丁基碳阳离子的一种清除剂(例如4-(甲硫基)苯酚)的存在下进行的。0069 最优选地是使用HCl与异丙醇的一种混合物。以这种方式所获得的脱保护的产物可以按一种特别经济有效的方式进行纯化，并且比其他可能的脱保护方法(除其他之外包括用乙酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、HF、以及HBr进行分裂)更有效。本申请人已经发现，例如与用三氟乙酸(TFA)(对于富含色氨酸的肽像Omiganan而言是更多副产物的来源)进行的一说 明 书CN 102124021 A