一种预防人艾滋病毒和其它病原体性传播的新型杀微生物剂 技术领域：
本发明涉及预防艾滋传播的制药领域，具体地，涉及硝酸镧和来源于青阳参的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物配制而成的复方制剂。
背景技术：
性传播疾病(sexually transmitted disease，STD)已经成为我国和全球的生殖健康和卫生防疫的难题。仅以美国为例，在前十位常见疾病中，STD就有五种。每年的新病例有1200万，仅1994年的预防开支达到170亿美元左右，由此可见它的危害。在其他国家，特别是发展中国家(包括中国)，STD引起的危害和损失也是很大的。据我国权威部门公布的材料，我国性病的年增长率超过30％，艾滋病和艾滋病毒感染者的增长率，1999年比1998年分别增长105％和250％。
在20多种性传播疾病当中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球已死亡艾滋病人3000万人，仅2002年就死亡310万人，有4200万人感染上了艾滋病毒，2002年就有500万新感染者，每天有约一万五千人新感染上艾滋病毒，其中妇女约占总数的44％。由同性或异性性传播引起的感染者占80-90％。虽然已有高效联合疗法(鸡尾酒疗法)可以减少发病率和死亡率，但还不能治愈。所需要的医疗费用更是绝大部分发展中国家的患者无法承受的开支。根据消灭天花和脊髓灰质炎的经验，即使将来研制出高效艾滋病疫苗，其他防治方法也还需要继续使用至少五十年。已有研究表明，其它的性传播疾病会增加艾滋病毒感染地机会，所以针对杀其它STD病原体的杀微生物剂的使用，除了直接减少这些疾病的发生之外，还会间接地阻止艾滋病毒的性传播。因此，目前的主攻方向是研制出高效、价廉和安全的针对艾滋病毒的杀微生物剂。由此可见，研制出实用的杀微生物剂是社会十分迫切需要的。
鉴于杀微生物剂在减少性传播所引起的HIV感染以及其它性传播病原体引起的疾病的发生方面可能会发挥重要作用，联合国艾滋病总署，美国国立卫生研究院，疾病控制中心，美国避孕研究与发展计划(CONRAD)以及许多非政府组织，多种私人基金会都特别强调杀微生物剂的研究，某些大的制药公司也逐步更多地投入资金和参与这类研究。由洛氏基金会资助，1999年3月29-4月2日在意大利召开的避孕研究与发展的公立和私立机构合作会议上，有好几个报告专门阐述了杀微生物剂的重要性和最新研究进展。2000年1月13-14日，美国国立卫生研究院的变态反应与传染病研究所召开了关于局部使用的杀微生物剂临床前评价的学术讨论会。2000年3月13日-16日在美国首都华盛顿附近的Alexandria，2002年5月在比利时分别召开了题为Microbicides 2000和2002的大型国际性学术讨论会，每次参加人数达600多，来自全世界好几十个国家的代表出席了会议。联合国艾滋病总署的主任PeterPiot专程出席并做了报告。我国的艾滋病毒感染的态势十分严峻。采取有效措施，减少像我国这样一个具有世界最多人口的发展中国家的HIV感染的传播，是十分紧迫的任务。如前所述，我们不能坐等有效的HIV疫苗来阻止和消灭HIV-1的传播。即使已有这种疫苗，艾滋病的流行也仍然至少会持续50年左右。脊髓灰质炎和天花的实例就已经证明这一点。因此，我们不能等到像目前有些发展中国家那样，HIV感染已经成灾，已经成为国家的严重社会和经济问题之后再来头痛医头，脚痛医脚。我们必须积极研究新的能够减少或阻止HIV-1传播的药物或制剂，使之造福于社会和我们整个民族的未来。
目前还没有一种杀微生物剂上市，正在研究之中的杀微生物剂至少有60种以上，按照作用机理可分为五类：(1)直接杀死或灭活病毒和细菌的制剂；(2)抑制病毒进入粘膜细胞的制剂；(3)抑制病毒与细胞融合的制剂；(4)抑制HIV与细胞融合之后的病毒活性或复制；(5)作为赋形剂的聚合物。其中有30来种是既具有抗微生物的活性，又有避孕或杀精子的活性，有的主要起避孕或杀精子作用，有16种只具有抗微生物的活性，4种具有机械屏障作用。在这些杀微生物剂当中，有3种进入临床III期试验，4种进入II期试验，16种进入了I期临床试验。在临床前研究阶段的有33种，其中已做过动物试验的有28种，其余5种只有体外试验资料。特别值得指出的是，最新研究资料证明，以表面活性剂和去污剂组成的杀微生物剂(如壬丙醇等)会增加艾滋病毒性传播的机会。学术界已经公认这类制剂应该禁止使用。在我国，至今还未见类似的研究。
本发明所说的新型杀微生物剂是一个复方制剂，主要组成成分是化合物硝酸镧和来源于青阳参的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物，硝酸镧分子量小，来源丰富，对人艾滋病毒及其它某些性传播病原体引起的疾病有很好的抑制作用，治疗指数达到700～900，而β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物是来源于一种特产植物青阳参，分子量为2万左右的多糖，我们的研究结果表明，它对人艾滋病毒的抑制活性(治疗指数TI值)大于1000，它能与HIV-1 GP120的V3区结合，从而阻止病毒与宿主细胞结合。本发明使用复方可以通过多靶点作用，增强药物抗病原体的的综合力量和互补作用，达到增强药效的目的。
发明内容：
本发明的一个目的是提供一种预防艾滋病毒性传播的新型杀微生物剂。
本发明的另一个目的是提供一种预防艾滋病毒性传播的新型杀微生物剂在阻止艾滋病毒性传播中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种预防艾滋病传播的新型杀微生物剂在阻止HSV性传播中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种预防艾滋病传播的新型杀微生物剂阻止白色念珠菌性传播中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种预防艾滋病传播的新型杀微生物剂阻止性传播疾病病原体通过生殖道传播中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了下面的方案：
一种预防艾滋病传播的新型杀微生物剂，是用硝酸镧和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物作为原料，以重量比为0.1∶1～1000∶1配制而成。
为了更好的了解本发明的实质性内容，下面用实验来说明本发明在阻止性传播疾病病原体通过生殖道传播的有益效果。
1、新型杀微生物剂体外抗HIV-1病毒活性检测的实验方法
先进行病毒感染性的滴定，在96孔板上，将病毒做倍比稀释，设置梯度，并且每个梯度设置多个孔形成一组，同时设置对照组。每孔加入适当的细胞(2×104/孔)，使每孔的终体积为200μl。37℃，5％CO2培养。第三天补加新鲜完全培养基100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中病毒诱导的细胞致病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞体的形成来确定；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID50(50％ Tissue culture infectious dose)。用MTT方法测定细胞存活和增殖。取适量的细胞与不同浓度的样品溶液混合，放置37℃，5％CO2培养箱中培养三天或者五天，测定细胞毒性IC50(50％ inhibition concentration)。然后在96孔平底培养板上，将待测样品用培养基进行倍比稀释，设置适当的稀释度，每孔100μl，设多个重复孔，同时设置正常细胞对照。对于病毒感染的细胞。每孔加适当的细胞，然后每孔加入适量的病毒上清，每孔的终体积为200μl，置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察样品对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下，计数病毒诱导细胞形成的合胞体数。通过计算得到新型杀微生物剂的治疗指数。
(3)通过计算得出新型杀微生物剂的细胞毒性IC50(对50％的宿主细胞产生毒性的样品的浓度)；EC50为具有50％合胞体形成抑制率的样品浓度。治疗指数TI值(therapeutic index)为IC50/EC50的比值。
2、MTT法测定新型杀微生物剂体外对白色念珠菌的抑制作用
取待试的新型杀微生物剂体10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培养基，充分混合后，使浓度为10mg/ml，过滤除菌，置4℃保存；首先将待试药新型杀微生物剂体稀释至合适的浓度(96孔培养板)同时设置阴性对照和空白对照。每系列孔(除空白和生长对照系列外)取100μl给下一孔，最终留100μl，余下的弃去。用头孢菌素作阳性对照，浓度稀释同待测新型杀微生物剂体的稀释；用沙保氏培养基把白色念珠菌悬液浓度从4.5×106cfu/ml调到4.5×105cfu/ml，将稀释好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；接种菌液后，培养板于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，观察生长情况。待阴性对照孔生长良好后，把板1000rpm离心10min。吸出150μl培养基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃温箱4小时，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；培养板37℃放置12小时后，用酶标仪于波长595nm，参考波长655nm下，测定OD值。通过计算得到样品新型杀微生物剂体对白色念珠菌的抑制活性。
抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100
3、PRA法测定新型杀微生物剂体外对HSV病毒的抑制作用
将Vero细胞悬液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；待细胞单层铺满24孔板后，每孔加200μl病毒上清或培养基，轻摇，使病毒稀释液和细胞单层充分接触，37℃，5％CO2孵育1小时；用RPMI1640对药物作两倍稀释，设置阿昔洛韦做阳性对照；弃培养基，加入PBS洗板；加入未凝固的琼脂糖覆盖培养基(A、B混和液)，每孔1ml。加入稀释好的待测药液，每孔0.5ml，其中第6孔(病毒生长孔)和第12孔(细胞生长孔)不加；置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。然后用2％甲醛固定细胞10min；加入700μl龙胆紫染液，染色20min；用自来水轻轻洗涤3次，倒置凉干，在倒置显微镜下计数空斑。通过计算得到样品新型杀微生物剂体对HSV病毒的抑制活性。
4、MTT法检测新型杀微生物剂体外对Vero细胞的毒性作用
在96孔平底培养板上，将待测化合物用培养基2倍稀释。作7个稀释度，每孔100μl，设两个重复孔。同时设置不含化合物的细胞对照组和空白组及阿昔洛韦阳性对照；离心(1000rpm，10min)，用完全培养基重悬后每孔加入100μl(4×105/well)悬液；置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。然后将96孔细胞培养板低速离心，取150μl培养上清，加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育过夜；用酶标仪测定各孔的OD值。通过计算得到样品新型杀微生物剂在体外对细胞的存活率的影响，了解其毒性作用。
名词解释：
TCID50：(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培养细胞出现CPE的病毒上清稀释度；
IC50：对50％的宿主细胞产生毒性的样品的浓度；
EC50：具有50％合胞体形成抑制率的样品的浓度；
治疗指数(therapeutic index，TI值)为IC50/EC50的比值，治疗指数达到100以上的化合物则视为有抗病毒活性。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物的制备方法
根据已公开专利98118102.3方法制备，取青阳参(Cynanchum otophyllum)植物的根500克，粉碎成粉末后用热水(94℃)浸提2-3次，合并浸提液，冷却静置4小时，离心沉淀(4000次/分)，倾泻出上层液，沉淀物除去弃之。上层液用其2-3倍体积的甲醇加入，摇动搅拌即有白色絮状的多糖沉淀，放置过夜，上层液澄清，下层沉淀紧密。用吸液管吸去上层液，下层沉淀离心分离，弃去上层液，下层沉淀物转移至抽滤漏斗抽氧过滤，滤出的沉淀先用丙酮洗涤，后用乙醚洗涤及压滤，沉淀物在真空干燥器内(器内有五氧化二磷吸温剂)抽气真空干燥6小时，就得白色多糖10克。
实施例2：新型杀微生物剂体外抗HIV作用检测的实验
在96孔培养板上，将HIV-1(H9/HIV-1IIIB，由英国MRC惠赠，按常规方法复苏，培养，收集，分装和冻存)贮存液作5倍稀释，共8梯度，每个梯度设6孔，同时设置对照组。每孔加入C8166细胞(为T淋巴细胞系，由英国Medical ResearchCouncil(MRC)，AIDS Reagent Project惠赠)50μl(2×104/孔)，每孔终体积为200μl。37℃，5％CO2培养。第三天补加新鲜完全培养基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中病毒诱导的细胞致病变效应(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞体的形成来确定；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID50(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培养细胞出现CPE的病毒上清稀释度。再将96孔细胞培养板低速离心后，小心吸去150μl上清，然后每孔加5mg/ml MTT溶液(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)；SDS(Sodium Dodecyl sulfate)；DMF(N，N’-Dimethyl formamine)20μl，37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4小时，每孔加100μl 20％SDS-50％DMF，37℃孵育过夜，用Bio-Rad 3550 ELISA仪(测定波长为595nm；参考波长为655nm)检测。取4×105/ml C8166细胞悬液100μl与不同浓度的样品溶液混合，置37℃，5％CO2培养箱中培养三天或五天，然后测定其细胞毒性IC50(50％ inhibitionconcentration)。在96孔平底培养板上，将待测样品用培养基进行5倍稀释，共八个稀释度，每孔100μl，设2个重复孔，同时设置正常细胞对照。对于HIV感染的细胞。每孔加4×105/ml的C8166细胞80μl，然后每孔加入20μl HIV-1上清，每孔的终体积为200μl，置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察样品对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下，计数HIV-1诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50(50％ effective concentration)为抑制合胞体形成达50％时的样品的浓度。得到以下的结果：
合胞体形成法测新型杀微生物剂的抗HIV-1IIIB作用和MTT法测对C8166细胞的毒性作用 Samples EC50(μg/ml) IC50(μg/ml) TI 1 1.62 3807.25 2350.15 2 1.85 4032.41 2179.68
实施例3：新型杀微生物剂对HSV-1的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用
一、PRA法测定新型杀微生物剂对HSV-1的抑制作用
1、将Vero细胞悬液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
2、待细胞长成致密单层，铺满24孔板板底后，快速融解HSV-1，然后每孔加200μl病毒上清或培养基，轻晃板，使病毒稀释液和细胞单层充分接触，37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时；
3、另一块板中用RPMI1640对药物作两倍稀释，用阿昔洛韦做阳性对照；
4、小心吸出培养基(注意不要碰壁)，每孔加入1mlPBS轻轻洗板一次；
5、加入未凝的覆盖培养基(A、B混和液)，每孔1ml。及时加入稀释好的待测药液，每孔0.5ml，6孔(病毒生长孔)和12孔(细胞生长孔)不加；
A：RPMI1640+2％FCS 12ml 37℃水浴保温
B：1％琼脂糖(现配) 13ml 60℃水浴保温
6、置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。第三天移出培养基，并每孔加入1ml2％甲醛固定细胞，10min；
7、加入700μl龙胆紫染液，染色20min；
8、移出染液，用自来水轻轻洗涤3次，倒置凉干，在倒置显微镜下计数空斑。
根据下例公式计算化合物对HSV-1的抑制率：
二、MTT法检测新型杀微生物剂对Vero细胞的毒性作用
1、在96孔平底培养板上，将待测新型杀微生物剂用培养基进行2倍稀释。共7个稀释度，每孔100μl，设两个重复孔。同时设置不含新型杀微生物剂的细胞对照组和空白组及阿昔洛韦阳性对照；
2、离心Vero细胞(1000rpm，10min)，用完全培养基重悬后每孔加入100μl(4×105/well)悬液；
3、置37℃，5％CO2培养箱中培养三天。第三天将96孔细胞培养板低速离心后，吸取150μl培养上清，再加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时左右，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育过夜；
4、用酶标仪测定各孔的OD值，根据下面公式计算出细胞存活率：
得到以下的试验结果：
表1 新型杀微生物剂对HSV-1的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用 新型杀微生物 剂样品编号 IC50 (mM) EC50 (mM) TI值 1 183.5212 0.8632 212.61 2 192.0243 0.7967 241.02 3 186.9582 0.9093 205.61
实施例4：MTT法测定新型杀微生物剂对白色念珠菌的抑制作用
1、取待新型杀微生物剂10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培养基，充分混合后，使浓度为10mg/ml，过滤除菌，置4℃保存；
2、待试新型杀微生物剂使用前稀释至合适的浓度(96孔培养板)注：第8孔加不含药的沙保氏培养基100μl，作阴性对照；
3、第9孔加200μl生理盐水，作空白对照，设三孔重复。每系列孔(除空白和生长对照系列外)取100μl给下一孔，最终留100μl，余下的弃去。
4、用头孢菌素作阳性对照，浓度稀释同待测药物稀释；
5、用沙保氏培养基把菌悬液浓度从4.5×106cfu/ml调到4.5×105cfu/ml，将稀释好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；
6、接种菌液后，培养板于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，观察生长情况。待阴性对照孔生长良好后，把板1000rpm离心10min。吸出150μl培养基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃温箱4小时，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；
7、培养板37℃放置12小时后，用酶标仪于波长595nm，参考波长655nm下，测定OD值。根据下面公式计算出化合物对白色念珠菌的抑制作用；
8、抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100
9、MIC90＝抑制率高于90％的浓度-(抑制率高于90％的浓度-抑制率低于90％的浓度)×(高于90％的抑制率-90)/(高于90％的抑制率-低于90％的抑制率)得到以下结果：
MTT法测定新型杀微生物剂对白色念珠菌的抑制作用 药物 (化合物) MIC90(μM) 1 2 3 头孢菌素 14.5166 8.6748 12.8763 新型杀微生物剂 1.7361 1.3973 1.5382