提高细胞催化活性的方法 【技术领域】
本发明涉及将细胞作为催化剂使用，以产生标的物的方法。更为详细的是，把用低级醇处理的细胞作为催化剂使用，以产生标的物的方法。背景技术
多年来，人们一直试图把细胞本身直接作为催化剂用于生物学过程。而要提高细胞的催化活性，就必须降低细胞壁或细胞膜的通透性屏障。许多报告显示，人们在尝试通过降低微生物的通透性屏障，来提高微生物细胞的通透性(Felix等，Ana.Biochem,120:211-234.1982)。
例如，许多已发表的研究结果表明，如用甲苯和乙醇的混合液(Serrano等，Eur.J.Biochem.34:479-482,1973)、溴化十六烷基三甲基铵(Gowda等，Enzyme.Micro.Technol,13:154-157,1991)、乙醚(Seip及Cosimo等，Biotechnol.Bioeng.40:638-642,1992)、醇类(Fenton等，Enzyme Micro.Technol.4:229-232,1982)、毛地黄皂苷(Joshi等，Enzyme Micro.Technol.11:439-444,1989)、Triton X-100(Vlach等，J.Mol.Catal.26:173-185,1984)及六甲撑二胺(Inoue等，Process Biochem.29:271-2751994)来处理酵母，就可以提高膜的通透性。
但是，上述这些有关通透性的研究，都是以确定细胞内酶活性的位点为目地，而不是以工业化利用为目的(Felix等，同前)。
在另一方面，近年来，随着基因重组技术的飞跃发展，已经开发出了优良的基因表达系统。例如，Romanos等在Yeast,8:423-488(1992)中就报告了多种酵母菌的基因表达系。通过这些基因表达系统，可使细胞内产生过量的酶，并蓄积起来，使细胞本身变成了有效的催化剂。
另外，存在于细胞表层、外周胞质或细胞膜中的酶，比如脂肪酶就存在于细胞表层，这些酶就可以直接利用，或通过基因操作使其表达，就能使细胞本身变成有效的催化剂。
不过，要想利用这些蓄积于细胞内的酶，或存在于细胞表层、外周胞质及细胞膜上的酶，就需要降低细胞壁或细胞膜的屏障。但是由于缺乏降低这种通透性屏障的有效方法，就需要一个将细胞破碎的过程。并且，这种方法存在例如为了防止酶失活而需要对温度进行严格控制以及精制等步骤，操作复杂，成本高等缺点。
因此，人们迫切希望开发出一种不经过细胞破碎过程、不需要酶提取及精制、操作简单，成本低廉地提供酶催化剂的技术，也就是通过降低细胞的通透性屏障，把细胞本身直接作为催化剂使用的技术。发明的概要
本发明的目的就是为了解决上述问题。本发明涉及一种通过用低级醇处理得到细胞，该经处理细胞的反应速度比未用低级醇的细胞高50倍或更高。
在优选的实施方案中，上述细胞是用酵母或丝状菌作为上述的处理细胞，并将这些细胞固定在载体上。
在优选的实施方案中，上述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇及异丙醇。
在优选的实施方案中，上述细胞是干燥细胞。
此外，在优选的实施方案中，上述细胞是含有对低级醇具有耐受性的酶的细胞。
在优选的实施方案中，上述酶是乙二醛酶I(Glyoxalase Ⅰ)或脂肪酶。
在优选的实施方案中，上述酶是用重组基因表达的酶。
本发明涉及用低级醇处理得到的细胞组成的催化剂，这种催化剂的反应速度比未用低级醇处理的细胞组成的催化剂的反应速度提高50倍或者更高。
在优选的实施方案中，上述酶是用重组基因表达的酶。
本发明还涉及含有用低级醇处理细胞过程的、细胞的反应速度比未处理时提高50倍或更高的方法。
本发明进一步涉及将细胞与基质反应，生成标的物的方法。这种方法包括将用低级醇处理的、反应速度比未处理细胞的反应速度提高50倍或更高的细胞与对应于酶的基质进行反应的步骤。
在优选的实施方案中，上述细胞是酵母或丝状菌，其中以固定在载体上为佳。
在优选的实施方案中，上述细胞是含有耐低级醇处理的酶的细胞。
在优选的实施方案中，上述酶是乙二醛酶Ⅰ，上述目的产物是S-乳酰谷胱甘肽(S-lactoylglutathione)。
在优选的实施方案中，上述酶是脂肪酶，上述的目的产物是脂肪酸酯。
在优选实施方案中，上述乙二醛酶Ⅰ或脂肪酶是用重组基因表达的。
在优选的实施方案中，上述细胞被固定于载体上，并填充在柱子中。
本发明还涉及含有经低级醇处理所得细胞的传感器，该经处理的细胞的反应速度比未用低级醇处理细胞的反应速度高50倍或更高。
在优选的实施方案中，上述细胞是酵母或丝状菌。
本发明解决了上述各种问题。即，本发明通过用低级醇处理细胞，使细胞的反应速度比未处理时至少提高50倍以上，可望时甚至达到200-600倍。可以认为，这是由于细胞经过低级醇处理后，降低了细胞壁或细胞膜的通透性屏障而带来的结果。在本发明中，经低级醇处理后的游离细胞可以作为催化剂直接使用。被固定的细胞经低级醇处理后也可作为催化剂直接使用。用低级醇处理后的细胞或被固定的细胞可以在干燥后使用。于是，本发明提供了一种用非常简单的方法即可制作、可反复使用的、具有优良催化活性的细胞。
此外，本发明还提供了用低级醇处理的细胞作为催化剂，生产标的物质的方法。附图的简单说明
图1是表示用低级醇处理后的酵母可循环利用的示意图。本发明的优选实施方案
在本发明中使用的细胞包括：大肠杆菌等革兰氏阴性细菌、枯草菌等革兰氏阳性细菌、丝状菌、酵母等真核细胞、动物细胞、植物细胞等。特别是，作为基因重组等的宿主、用于物质生产的大肠菌和酵母，例如酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、念珠菌属的酵母(Candida antractica,Candida rugosa,Candidacylindracea)等优选使用，但又不局限于这些。另外，还可以优选使用根粘菌属(Rhizomucor)、毛霉菌属(Mucor)、曲霉菌属(Aspergillus)、根霉菌属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)的丝状菌。
本发明中用于处理细胞的低级醇优选为碳原子数为1-11的水溶性醇。可以是一价、二价或三价的醇，也可以用甲醇、乙醇等一级醇，异丙醇等二级醇、t-丁醇等三级醇。优选使用的是甲醇、乙醇及异丙醇。这些醇可以单独使用，也可以两种以上联合使用。
处理细胞时所用醇的浓度根据醇的种类不同各异，一般在10％-100％范围内。优选的浓度范围为20-100％，更优选的浓度为40-80％，最优选的浓度为40-60％。另外，醇浓度以v/v％表示。
醇处理时间只要在5分钟以上，没有特别限制。优选的处理时间在10分钟以上。根据醇的种类不同，处理时间可作相应变化。跟酶种类也有关系，用甲醇、乙醇处理既使时间长一些，酶活性几乎不受影响。但用异丙醇长时间处理时，酶活性有若干降低的倾向。
对醇处理的温度没有特别的限制，只要作为目的的酶不会失活的温度即可。因此，对不耐热的酶可用低温处理，而对耐热的酶例如脂肪酶则可用高温处理。对超嗜热的原始菌类可以在100℃以上进行处理。一般的处理温度为4℃-40℃。
在本发明中，对低级醇处理具有耐受性的酶是指用甲醇、乙醇或丙醇处理时不会失活(不会失去活性)。这类酶有乙二醛酶Ⅰ、脂肪酶、磷脂酶等。
在本发明中，可以采用例如测定在单位时间内生成物的生成量或基质的减少量的方法等适当的测定系统来测定反应速度。本发明中所称的反应速度相当于酶学上的初速度。
本发明中，经低级醇处理的细胞的死亡情况虽然也比较多，但是因为细胞内的酶对低级酶处理有耐受性，既使用低级醇处理，酶也不会失活。另外，由于降低了细胞壁或细胞膜的通透性屏障，细胞本身可以作为催化剂反复使用。经过上述处理后，细胞的反应速度至少提高50倍，通常提高100倍以上。在用40-60％的低级醇处理这种优选条件下，细胞活性可提高300-600倍以上。
考虑到要作为催化剂反复利用，细胞最好固定在载体上。最好是将细胞固定在载体上后在进行，必要时也可以经过干燥。进行干燥时要使用不使酶失活的方法，如真空干燥法，冷冻干燥法等。
细胞的固定方法可以采用载体结合法，架桥法及包容法等已知方法。从操作上考虑，以载体结合法最为适合。载体结合法中又包括吸附于离子交换树脂上的化学吸附法或物理吸附法。在本发明中，以使用多孔载体的物理吸附方法最为合适。因为物理吸附方法不需要特别的操作。仅仅将细胞和载体(如前述的多孔物质或泡沫体)混合在一起加以培养，细胞就从载体的开口处进入，并附着于载体上。通过这一操作，细胞就固定在载体上。
本发明中所称的“载体”，其意思是能够使细胞固定的材料，优选的是不溶于水或不溶于特定溶剂的物质。本发明中所使用的载体原料优选的有：例如，聚乙烯醇、聚氨酯泡沫体、聚苯乙烯泡沫体、聚丙烯酰胺、聚乙烯缩甲醛树脂多孔体、硅胶泡沫体、纤维素多孔物等泡沫体或树脂。多孔体或泡沫体开口孔径的大小也根据所固定的细胞的大小有所不同，只要具备细胞能充分进入并且增殖的空间即可。对大肠菌、枯草菌等细菌而言，其孔径约为10μm-500μm；对丝状菌、酵母、真菌及植物细胞而言，其孔径约为50μm-1,000μm；对动物细胞而言其孔径约为30μm-250μm为适合，但不限于此。
此外，对载体的形状没有特殊要求，但考虑到载体的强度，培养效率等因素，以球状体或立方体为好。其尺寸，当形状为球状时，以直径2mm-50mm为宜；立方体状时以2mm-50mm见方为宜。
如上所述，只要把菌体与载体混合在一起，菌体就被固定在载体上，然后直接用低级醇进行处理。
经这样处理后所得到的被固定细胞，可以以游离状态用于反应，也可以把它们填充到柱子里，制成所谓的生物反应器来使用。它们可以连续地或分批地循环使用。
本发明的细胞(催化剂)不仅适用于医药品、食品等使用的蛋白质(酶、抗体等)、氨基酸类的生产，也适用于环境污染物质的除去等用途。此外，还适用于光学活性体的分离等。
本发明中，对有机溶剂具有耐受性的酶还可以用基因重组来表达。将目的基因导入细胞，使目的酶(蛋白质)表达的方法，是本领域公知的技术。所谓目的基因的导入是指将基因导入细胞内，并使其表达，而不论其采用的方法如何。对细菌、酵母、丝状菌、真菌、植物及动物细胞可以用转化、转导、转染、共转染、电穿孔术等方法，通过质粒形式，或插入宿主的基因中，或与宿主基因进行相同的重组等，这些方法意味着对遗传特征进行表达。
用上述方法得到的重组细胞，能在菌体内蓄积多量的目的酶(蛋白质)。因此，本发明方法通过降低细胞壁或细胞膜的通透性屏障，使基质容易通透，从而能够获得使基质与酶的接触机会增多，酶反应更快地进行的效果。
此外，本发明中的细胞或催化剂也可以作为传感器使用。例如，利用细胞内的氧化还原酶，可以测定BOD。作为传感器，它包括氧电极，过氧化氢电极等转导物。根据所使用的酶(催化剂)和要测定的物质来确定用什么样的转导物即可。因为已降低了细胞壁或细胞膜的通透性屏障，本发明的生物传感器具有基质通透性好、感度高、可以反复使用等优点。
用本发明的细胞制备脂肪酶时，可以将细胞用低级醇处理，并将处理后的细胞作为催化剂，用于酯交换反应。即，如本领域人员众所周知的那样，把脂肪酸的甘油酯(如甘油三酯)作为基质，使其在低级醇的存在下与经低级醇处理的细胞进行反应，可以得到脂肪酸酯。而脂肪酸酯可以作为生物能源(biodiesel)使用。(实施例)
以下，用酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为细胞，用乙二醛酶Ⅰ作为对低级醇处理具有耐受性的酶，介绍从丙酮醛(methylglyoxal)制备S-乳酰谷胱甘肽(以下有时略称为S-LG)的过程，以及用丝状菌Rhizopus oryzae作为细胞，用脂肪酶作为反应酶，以制备脂肪酸酯为实施例对本发明进行说明。但是，不言而喻，本发明并不局限于这些实施例。
此外，如下所示，而乙二醛酶Ⅰ在从丙酮醛生成乳酸的反应过程中，催化了从半硫缩醛(hemimercaptal)生成S-LG的反应步骤(反应步骤B)。并且，GSH表示谷胱甘肽。丙酮醛 半硫缩醛 S-乳酰谷胱甘肽(S-LG) 乳酸
A反应步骤为非酶反应；B反应步骤为乙二醛酶Ⅰ；C反应步骤为乙二醛酶Ⅱ。
反应生成物S-LG是具有多方面生理学功能的化合物(Gillespie等，Nature 227:135-136,1995；Kosugi等，Appl.Microbiol.Biotechnol,28:263-267,1988及Thornalley等，Biochem,Biophys.Res.Commum,145:769-774,1979)，为解析和利用其生理学功能，人们希望大量生产这种物质。(酵母的调制例：大量表达乙二醛酶Ⅰ的酵母的调制例)
具有乙二醛酶Ⅰ基因的质粒pE24GL01是由京都大学粮食科学研究所的木村光教授寄赠的。这一质粒pE24GL01是象Inoue和Kimura等在J.Biol.Chem,271:25958-25965,(1996)中记载的那样，将含有乙二醛酶Ⅰ基因(GL01基因)的可读框的2500bp片段重组到多拷贝质粒Yep24(Ura3)中的质粒。将该质粒pE24GL01用醋酸锂法导入到酵母Saccharomyces cerevisiae YPH250(trp-、leu-、lys-、ade-、ura3-52)中。转化株是在分别含有40、60、30、40μg/ml的trp、leu、lys及ade的含SD基本培养基(葡萄糖20g/l,Difco酵母氮基w/o氨基酸6.7g/l)的琼脂培养基中得到的生育株。
将得到的转化株用上述组成的SD液体培养基在30℃培养16小时，然后用后述的细胞提取方法制备细胞提取液，对乙二醛酶Ⅰ的活性进行了测定。这种转化体(重组酵母)与非转化体相比较，菌体内蓄积了大量的乙二醛酶Ⅰ。
此外，测定乙二醛酶Ⅰ活性的方法为：将细胞提取液或处理后的酵母悬浮于含有50mM丙酮醛及50mM谷胱甘肽的100mM磷酸缓冲液(pH6.0)中，30℃振摇一定时间后，在240nm处测定吸光度，把摩尔吸光系数定在3300cm-1M-1，通过测定S-LG的生成量，求出乙二醛酶Ⅰ的活性。把单位时间内，单位湿润酵母重量的S-LG生成量(μmol/min/g-湿润酵母)作为反应速度。(实施例1及比较例1)：(用低级醇及有机溶剂处理酵母)
将以上述方法得到的酵母用SD基本培养基于30℃进行16小时预培养，然后移植到新鲜的SD培养基中，于30℃再次培养，当OD610达到1.0时终止培养。以5000rpm，离心分离5分钟，以回收酵母菌体。回收后的细胞沉淀用0.85％的NaCl溶液洗净后，用于有机溶剂处理。
在湿重0.1g的酵母细胞沉淀中分别加入1.0ml的各种浓度的低级醇，如甲醇、乙醇及异丙醇，以及作为对照的丙酮、醋酸乙酯和乙醚，使酵母悬浮，在4℃或25℃进行所需要时间的有机溶剂处理。处理后，以5,000rpm，离心分离5分钟，回收酵母菌体。回收的细胞沉淀用0.85％的NaCl洗净，作为酶(催化剂)备用。
另外，作为对照，在湿重0.1g的酵母细胞沉淀中加入1ml含有1％TritonX-100或80mM的六亚甲基二胺(HMDA)的350mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，在4℃反应10分钟。处理后，以5000rpm，离心分离5分钟，以回收经处理的酵母菌体。回收后的细胞沉淀用0.85％的NaCl溶液洗净，将其作为酶(催化剂)备用。
另外，作为比较，将经上述方法培养并洗净的重组酵母重新悬浮在pH7.0、100mM的磷酸钾缓冲液中，加入玻璃珠，在涡旋匀浆机上匀浆30秒钟及冰冷1分钟，将该过程重复15次，将细胞破碎。然后在10,000g,4℃下将匀浆液离心分离20分钟，将上清液用作细胞提取液。
另外，根据Inoue等在Appl.Microbiol.Biotechnol.36:569-472(1992)中介绍的方法，用醋酸乙酯制备了细胞提取液。具体过程是：将上述培养、洗净得到的0.1g重组酵母(湿重)再次悬浮于2ml的pH7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，再向其中添加2ml醋酸乙酯，于30℃保温培养10小时后，以5,000rpm,4℃下离心分离5分钟，把分离后的水相作为细胞提取液备用。(用处理的酵母产生S-LG)
将所得到的处理酵母0.1g(湿重)或同量的细胞提取液悬浮于含有50mM甲基乙二醛(methylglyoxal)和50mM谷胱甘肽(GSH)的100mM磷酸缓冲液(pH6.0)中，于30℃振摇，用上述方法测定S-LG的生成量，求出其生成初速度。表1所示为25℃时，用各种浓度的低级醇，在各种时间处理后的结果。表中的ND表示未做试验。表1有机溶剂浓度(％)处理时间(分)S-乳酰谷胱甘肽的生成速度(μmol/分/g-湿重量)甲醇乙醇异丙醇丙酮醋酸乙酯乙醚 0 0 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 20 120 240 ND 18 18 30 280 380 40 10 120 240 280 280 260 400 368 340 550 280 180 60 10 120 240 300 280 280 296 188 160 296 188 128 100 10 120 240 220 120 100 360 360 280 398 420 360 304 ND ND 377 ND ND 337 ND ND(25℃处理)
表1结果显示，经低级醇处理后，细胞的反应性(初速度)惊人地提高了200-550倍(即，细胞的通透性屏障变小，反应容易进行)。低级醇的种类不同，对细胞的处理效果也不同。结果表明，用浓度40％以上的醇处理细胞10分钟时，初速度提高200倍以上。从上述结果可以看出，即使在低级醇当中，异丙醇能够在比甲醇和乙醇更低的浓度降低细胞的通透性屏障。在用各种醇进行处理时，均具有处理时间越短效果越好的倾向。
试验结果还表明，用乙醚、醋酸乙酯、丙酮处理时，也能象低级醇一样提高酵母的反应性。但是，从细胞中漏出蛋白质是其一大问题。
表2表示在4℃条件下，用各种浓度的低级醇在各种时间处理细胞的结果。表2有机溶剂浓度 (％)处理时间(分)S-丙醇酰谷胱甘肽的生成速度(μmol/分/分/g-湿重量)甲醇乙醇异丙醇1％Tri ton X-100 80Mm HMDA细胞提取液醋酸乙酯细胞提取液 0 0 1.1 1.1 1.1 10 15 109 260 20 120 240 ND ND ND ND 10 10 40 10 120 240 180 180 160 400 340 320 640 500 300 60 10 120 340 302 300 387 300 300 100 10 120 390 345 428 326 460 340(4℃处理)
从表2可以看出，4℃处理的效果与25℃时的结果基本相同，但随着醇的浓度升高，以低温处理的效果为好，比25℃的效果要好。
并且，从上表还能看出，用Triton X-100处理及用80mM的六亚甲基二胺(HMDA)处理时，初速度增加10-15倍，而用低级醇处理的效果则要好得多(至少提高200倍以上)。
另外，用以玻璃珠将酵母破碎得到的细胞提取液以及用醋酸乙酯提取的酶分别显示出无处理酵母的109倍、260倍的反应初速度。但是，本发明的低级醇处理酵母的调制比这些酶提取液调制要容易的多，而且反应速度也高。并且，还具有以下实施例2所示的可以重复使用的优点。(实施例2)
再次用实施例1中的在4℃条件下经40％的甲醇、乙醇及丙醇10分钟处理的酵母菌体，测定了S-LG的生成量。结果如图1所示。在图中，a)表示用40％的甲醇、b)表示40％的乙醇、c)表示用40％的丙醇分别处理酵母的结果。0表示第2次使用、▲表示第3次使用、◇表示第4次使用。该结果表示，酶活性尽管有若干程度的下降，但是还可以反复使用。此结果还提示，在经低级醇处理的酵母中还存在有酶，而且在催化反应过程中，酶也很少漏到细胞外。(实施例3)
在装有100ml脂肪酶生产培养基(每升中含多肽胨70g、KH2PO41.0g、NaNO31.0g、MgSO4·7H2O 0.5g及油酸20g)的振荡烧瓶中放入100个6mm见方的聚氨基甲酸酯的泡沫体(BSPs)作为固定用载体，然后植入根霉属(Rhizopus oryzae)IFO 4697菌株，于30℃培养4天。在培养中菌体被固定于BSPs上。培养完毕后，回收固定有菌体的BSPs，然后用80％的醇、在25℃处理10分钟。利用经处理菌体的脂肪酶，并向其中添加按摩尔比1∶1混合的大豆油与甲醇的混合物，然后在30℃每分钟振摇130次使其边浸透边反应两天，进行了脂肪酸酯的合成反应。对所得脂肪酸酯的量，用DB-5毛细管柱子，以甘油三辛酸酯作为内标，用气相色谱层析法定量进行了定量。并且，与用丙酮处理的BSPs菌体做比较，以未经处理的BSPs菌体做对照。结果列于表3。表3处理方式转化率甲醇乙醇异丙醇 9.6 10.0 18.0丙酮未处理 3.8 0.1
结果表明，对于丝状体，用醇处理，特别是用异丙醇处理的效果最好，而未处理的几乎没有活性。产业上的利用可能性
本发明用低级醇处理细胞，其操做简便，而且比未处理的细胞活性提高数百倍，可作为能循环利用的催化剂来使用。换言之，细胞只经过低级醇处理，就可使细胞中的对有机溶液剂具有耐受性的酶的反应速度比未用低级醇处理的细胞的反应速度提高600倍。可以期待的是，通过降低细胞膜、细胞壁等的通透性屏障，保持在细胞内、细胞表层以及细胞质中的酶活性能够得到飞跃的提高。