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1、(10)申请公布号 CN 101955975 A(43)申请公布日 2011.01.26CN101955975A*CN101955975A*(21)申请号 200910104328.7(22)申请日 2009.07.14C12N 15/85(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61P 1/16(2006.01)(71)申请人重庆医科大学地址 400016 重庆市渝中区医学院路1号(72)发明人石小枫 刘杞 徐宁 郎清钱克莉 戚敬虎(54) 发明名称组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用(57) 摘要组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬。
2、化治疗应用，本发明属于基因工程技术领域。本发明根据siRNA的设计原理，分别选择TIMP-1和TIMP-2编码区的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，进行BLAST比较，避免与其他基因同源，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pGeneil-1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了TIMP-1和TIMP-2的siRNA表达载体，该载体经脂质体转染肝星状细胞(HSC)，能明显抑制TIMP-1和TIMP-2的表达；上述表达载体，通过肝硬化动物模型验证，能明显地降低肝组织的胶原纤维沉积，可望成为一种新型的抗肝纤维化的基因疗法应用到临床治疗中。(51)Int.Cl.(1。
3、9)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页CN 101955975 A 1/1页21.本发明在构建针对基质金属蛋白酶组织抑制因子1和2(TIMP-1、TIMP-2)siRNA表达载体时，分别设计TIMP-1、TIMP-2siRMA转录模板DNA，根据pGeneil-1载体的要求，每段设计1对各长69nt的寡核苷酸，每条寡核苷酸包括：两端用于形成酶切位点(BamHI和HindIII)的序列、2lnt的TIMP编码区序列(TIMP-1297nt-317nt、TIMP-255lnt-57lnt)、用于形成茎环的9nt序列、反向互补序列、作为终。
4、止信号的6个胸腺嘧啶核苷(T)。与真核表达载体pGeneil-1连接，构建了靶向基质金属蛋白酶组织抑制因子1和2(TIMP-1、TIMP-2)基因序列的siRNA表达载体。2.根据权利要求1所述的TIMP-1、TIMP-2siRNA表达载体构建方法，其特征在于设计的TIMP-1、TIMP-2siRNA序列：TIMP-1siRNA：上游序列：5-GATCCCCTCTGTGGATATGTCCACAATTCAAGACGTTGTGGACATATCCACAGAGGTTTTTTGTCGACA-3下游序列：5-AGCTTGTCGACAAAAAACCTCTGTGGATATGTCCACAACGTCTTGAATT。
5、GTGGACATATCCACAGAGGG-3TIMP-2siRNA：上游序列：5-GATCCGAGATGGCAAGATGCACATTATTCAAGACGTAATGTGCATCTTGCCATCTCTTTTTTGTCGACA-3下游序列：5-AGCTTGTCGACAAAAAAGAGATGGCAAGATGCACATTACGTCTTGAATAATGTGCATCTTGCCATCTCG-33.根据权利要求1所述的TIMP-1、TIMP-2siRNA表达载体构建方法，其特征在于设计的任何一条siRNA序列能形成发夹结构的RNA，即同一条siRNA序列包含了siRNA折叠体的两条互补链，从5端开始先为siRN。
6、A作用链序列(即对应目的基因序列的互补序列)，长度为2lnt，中间以9nt的TTCAAGACG间隔形成茎环发夹结构，最后为siRNA作用链的反向重复序列。4.上述表达载体转染HSC细胞及大鼠，能明显抑制TIMP-1、TIMP-2的表达，降低肝组织的纤维增生，可望成为一种新型的抗肝纤维化的基因疗法应用到临床治疗中。权 利 要 求 书CN 101955975 A 1/4页3组织金属蛋白酶抑制因子 siRNA 表达载体的构建及肝硬化治疗应用技术领域 ：0001 本发明属基因工程技术领域背景技术 ：0002 传统的基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置。
7、换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞(target cells)内，他们或与宿主细胞(host cell)染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前，基因治疗的概念有了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。基因治疗是随着DNA重组技术的成熟而发展起来的，它被认为是医学和药学领域的一次革命，是当今生物医学发展最重要的里程碑之一，同时也必将对传统制药业产生深远。
8、影响和冲击。当前，基因治疗主要针对基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、艾滋病等多种人类重大疾病。总的来说，在基因治疗基础研究和临床试验及产业化各个领域，美国均领先于世界。与美国及欧洲相比，我国基因治疗基础研究和临床试验开展得较早，起点也不低。上海交通大学肿瘤研究所利用TK基因转移治疗脑恶性胶质瘤是当时国内首先进入临床试验的肿瘤基因治疗方案。我国在心血管基因治疗方面也取得了一定进展，VEGF治疗梗塞性心血管病和用人肝细胞生长因子基因治疗病理性瘢痕也取得了重大进展，其中VEGF治疗梗塞性心血管病在北京安贞医院进行了特殊临床试验，这是我国第一个批准进入临床研究的心血管疾病基因治疗方案，也是。
9、继美国之后第二个开展心血管疾病基因治疗临床试验的国家。深圳赛百诺基因技术有限公司从1998年开始进行重组腺病毒p53抗癌注射液的临床试验，至2003年完成了全部临床试验，于2004年1月获得我国SFDA批准的新药生产批文(商品名“今又生” )。随着科技的进步，基因治疗必将向其它严重威胁人民身体健康的难治性疾病方面延伸，如病毒性肝炎肝硬化等。0003 肝纤维化或肝硬化的形成和发展受多种因素影响，主要涉及细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的代谢、产生ECM的细胞及细胞因子的作用。胶原的合成经历细胞内和细胞外两个阶段，依赖于胶原合成酶的参与。研究发现，病理条件下肝星状细胞。
10、具有活化能力，转变为肌成纤维细胞，具有纤维母细胞特性，其胶原分泌量远远大于肝脏细胞和血窦内皮细胞，使其在肝纤维化发病过程中具有极其重要的作用。细胞因子在肝星状细胞活化过程中发挥着重要作用，损伤的肝细胞释放有丝分裂细胞因子，通过KUpffer细胞等释放多种细胞因子引发肝细胞坏死，使肝星状细胞向肌成纤维细胞转化。正常状态下TGF-的表达极少，肝损伤时其表达显著增加，尽管不促进肝星状细胞增殖，但能使单个细胞胶原合威增加60-80，是肝纤维化形成的关键因子。认为抑制TGF-的表达在肝纤维化的防治中具有重要得意义。很多研究都针对如何抑制TGF-的表达这个靶点，说 明 书CN 101955975 A 2/。
11、4页4虽然药物或反义寡核苷酸在动物实验中都对TGF-有良好的抑制作用，但临床应用效果却差强人意，这与人肝纤维化的发生是一连续漫长的过程和多因素参与，而肝纤维化动物模型是较之短暂的过程，同时我们应该想到，抑制或阻断TGF-的产生，单一从这一通路来看，肝星状细胞的活化受到了抑制，但可导致另一些有相同功能的细胞因子，如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-)的增加，而激活胶原的分泌。在实际研究及应用中，不可能干预掉所有因素。因此，避开导致肝纤维化发生的诸多上游因素，选择直接促进胶原降解的下游因素不失为一有效手段。在ECM的降解过程中，基质金属蛋白酶及其抑制因子起着至关重要的作用，胶原蛋白。
12、在细胞内合成后，约有30在细胞内即被溶酶体酶降解；细胞外胶原的降解酶主要为基质金属蛋白酶(Martixmetalloprotenase，MMPs)，它能专一地作用于胶原分子的一定部位，将其降解为两个大小不同的片段而被吸收。组织金属蛋白酶抑制因子(Tissue inhibitors metalloprotenases，TIMPs)是一组抑制MMPs活性的糖蛋白。TIMPs家族MH4个成员组成(TIMP-1、2、3、4)，而肝脏中主要有TIMP-1、T1MP-2存在。MMPs及TIPs在正常状态下处于动态平衡，调节肝内ECM的生成与降解。在病理状态下MMPs/T1MPs的失衡引起ECM质和量的变化。
13、，随着肝纤维化的进展，肝组织TIMP-1、TIMP-2基因表达水平增强，其对MMPs降解ECM有特异性抑制作用，已有研究表明，慢性肝炎患者肝组织内TIMPs水平较正常高2-3倍，肝硬化时其水平为正常的40倍。正是由于TIMPs的增加，ECM不能被MMPs及时降解造成堆积，导致了肝纤维化直至肝硬化的发生。0004 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来兴起的一项新技术，它可高效阻抑靶基因的表达，不仅应用于基因功能的研究，也是一种高效、特异的治疗手段。采用此方法，干扰掉抑制胶原降解的TIMPs(主要是TIMP-1、T1MP-2)，目前国内外有2篇关于T1MP-2 siRN。
14、A的报道，但所设计的序列与我们的不相同，因此，寻找更多及效果更好的干扰序列显然值得研究。这将对肝纤维化或肝硬化的治疗具有重要的意义。发明内容 ：0005 本发明是根据SiRNA的设计原则，针对TIMP-1、TIMP-2的cDNA序列，分别设计目的短链DNA及其对照短链DNA；构建TIMP-1、TIMP-2 siRNA表达载体，具有特异性干扰TIMP-1、TIMP-2的表达。具有特异性、不影响上游细胞因子对细胞的整体调节功能、可利用基因工程技术大量生产、成本低。0006 本发明内容体外和体内两方面的研究。体外研究是构建TIMP-1、TIMP-2的siRNA表达载体，转染培养的肝星状(HSC)细胞。
15、，利用pGenesil质粒的特点检测转染效率，利用PCR技术检测IMP-1、TIMP-2的表达。结果说明，此siRNA表达载体能明显抑制IMP-1、TIMP-2的表达，证明siRNA表达载体的构建是成功的，能进入细胞，并发挥干扰效能。体内研究是分别将上述质粒用水动力法从尾静脉注入Wistar大鼠体内，根据不同时段，处死大鼠，固定肝组织，作肝纤维化分级。附图说明 ：0007 图1是含独特茎环结构的TIMP-1和TIMP-2 siRNA的设计图0008 图2是pGenesil-1-TIMP-1和TIMP-2 siRNA表达载体构建示意图0009 图3是pGenesil-1-TIMP-1和TIMP-。
16、2 siRNA表达载体酶切鉴定图说 明 书CN 101955975 A 3/4页50010 1 pGenesil-1-TIMP1-1 5 pGenesil-1-TIMP20011 2 pGenesil-1-TIMP1 BamHI和HindIII双酶切 6 pGenesil-1-TIMP2 BamHI和HindIII双酶切0012 3 pGenesil-1-TIMP1 PstI酶切 7 pGenesil-1-TIMP2 PstI酶切0013 4 pGenesil-1-TIMP1 SalI酶切 8 pGenesil-1-TIMP2 SalI酶切0014 M DNA marker0015 图4是pG。
17、enesil-1-TIMP-1 siRNA表达载体转染入HSC的效果图0016 图5是pGenesil-1-TIMP-2 siRNA表达载体转染入HSC的效果图0017 图6是pGenesil-1-TIMP-1 siRNA表达载体干扰效果图0018 1、2转染pGenesil-1-TIMP1-1组；3转染pGenesil-1-对照组；4未转染组；M DNA marker0019 图7是pGenesil-1-TIMP-2 siRNA表达载体干扰效果图0020 1、2转染pGenesil-1-TIMP2组；3未转染组；4转染pGenesil-1对照组；M DNA marker0021 图8是pGe。
18、nesil-1-TIMP-1 siRNA表达载体对肝硬化大鼠的作用0022 图9是pGenesil-1-TIMP-2 siRNA表达载体对肝硬化大鼠的作用0023 图10是肝硬化模型大鼠0024 图11是siRNA对照大鼠0025 图12是正常大鼠具体实施方式 ：0026 根据Genbank中大鼠TIMP-1和TIMP-2基因的序列(录入号：NM_021578，NM_021989，AY550026)，遵循siRNA设计原则，分别选择TIMP-1编码区297nt-317nt，TIMP-2编码区551nt-571nt的核苷酸序列，设计相应的siRMA序列，并进行BLAST比较，避免与其他基因同源。。
19、化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pGeneil-1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了两种靶向TIMP-1和TIMP-2基因序列的siRNA表达载体。上述表达载体通过阳离子脂质体介导转染肝星状细胞HSC-T6后，能明显抑制TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达；采用水动力法注射到肝硬化动物模型，能显著降低肝组织的纤维组织增生。具体实施方案如下：0027 1.TIMP-1、TIMP-2 siRNA序列的设计和合成0028 根据siRNA设计原则，选择TIMP-1编码区297nt-317nt，TIMP-2编码区551nt-571nt的核苷酸序列，设计下列相应的。
20、siRNA序列。0029 TIMP-1 siRNA：0030 上游序列：5-GATCCCCTCTGTGGATATGTCCACAATTCAAGACGTTGTGGACATATCCACAGAGGTTTTTTGTCGACA-30031 下游序列：5-AGCTTGTCGACAAAAAACCTCTGTGGATATGTCCACAACGTCTTGAATTGTGGACATATCCACAGAGGG-30032 TIMP-2 siRNA：0033 上游序列：5-GATCCGAGATGGCAAGATGCACATTATTCAAGACGTAATGTGCATCTTGCCATCTCT说 明 书CN 101955975 A 4。
21、/4页6TTTTTGTCGACA-30034 下游序列：5-AGCTTGTCGACAAAAAAGAGATGGCAAGATGCACATTACGTCTTGAATAATGTGCATCTTGCCATCTCG-30035 上述序列用BLAST软件进行同源分析证实后，采用化学合成方法合成单链寡核苷酸。0036 2.DNA片段退火变为双链0037 取等量100mmol/L的DNA合成片段，在退火缓冲液中于95保温5min后，缓慢降至室温，然后用DNA纯化试剂盒进行纯化。0038 3.构建pGenesil-1-TIMP-1和TIMP-2 siRNA表达载体0039 因为含TIMP siRNA的pGeneil-。
22、1载体仅比空质粒多69bp，通过DNA电泳比较分子量大小来筛选重组子显然较为困难。因此，我们根据pGeneil-1的U6 promoter上游带有Sal I酶切位点，在设计每一条siRNA下游序列时，在5端加入Sal I酶切位点，通过简单Sal I单酶切反应就可以快速筛选重组质粒。将纯化的DNA片段分别与Bam I和Hind III双酶切的转录载体pGeneil-1进行连接，转化JM109大肠杆菌，经Kan抗性筛选，用Sal I酶切鉴定，分别筛选出含TIMP-1和TIMP-2目的基因的阳性克隆，并进行DNA序列分析加以确定。0040 4.体外干扰作用：0041 将对数生长期的肝星状细胞HSC-。
23、T6消化，稀释成110 5/ml，接种与6孔培养板，待细胞铺满80左右时转染。采用脂质体转染技术将pGenesil-1-TIMP-1和TIMP-2 siRNA真核表达载体转入肝星状细胞HSC-T6，分别于24h和48h在荧光显微镜下观察转染情况。半定量RT-PCR检测TIMP-1、TIMP-2的mRNA表达，计算机灰度分析，其干扰效率分别为91.3、84.1。0042 5.对肝纤维化大鼠胶原表达的影响：0043 采用高脂高胆固醇饮食及四氯化碳诱导肝实质损伤性肝纤维化大鼠模型。将实验动物随机平均分为5组：正常组，模型组，siRNA低剂量治疗组(25ug/ml)，siRNA高剂量治疗组(50ug/。
24、ml)和siRNA阴性对照组(50ug/ml)，每组8只。除正常对照组以外其他各组均皮下注射40的CCL4和石蜡油的混合液，每周两次，首次剂量为3.3ml/kg，以后每次2.0ml/kg；同时用水动力法从尾静脉注射siRNA表达质粒于高剂量治疗组，一周一次；正常组和模型组注射等体积的无菌生理盐水。除正常组外各组均给予猪油，胆固醇和鼠饲料混合的高脂饮食(三者比例大概为10288)，直到造模结束，共8周。实验结束后所有动物经腹主动脉取血，分离血清备用。并取同一部位肝组织，一部分用福尔马林固定，石蜡包埋切片，观察纤维化程度、免疫组化观察；另一部分置于液氮保存，用于PCR检测TIMP-1、TIMP-2、I、III型胶原的mRNA表达。结果：模型组和siRNA阴性对照组肝小叶正常结构消失，肝细胞呈广泛脂肪变性、坏死，肝细胞浆见多量空泡(为胞浆内沉积的脂肪滴，经乙醇、二甲笨等脂溶性试剂操作后脂肪溶解而形成)，有大量炎症细胞浸润，大量纤维间隔，假小叶形成；而TIMP-1、TIMP-2 siRNA治疗组只见少量肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸润，未见明显纤维间隔形成。说 明 书CN 101955975 A 1/3页7图1图2说 明 书 附 图CN 101955975 A 2/3页8图3图4图5图6图7图8说 明 书 附 图CN 101955975 A 3/3页9图9图10图11图12说 明 书 附 图。