具有增加的琥珀酸产量的突变大肠杆菌菌株 本发明的合同来源
根据美国能源部与代表Argonne国家实验室的芝加哥大学之间的合同号W-31-109-ENG-38，美国政府具有本发明的权利。
本发明的背景
1、本发明的领域：
本发明涉及生产琥珀酸，苹果酸或延胡索酸的方法，更具体地说，本发明涉及大量产生琥珀酸，苹果酸和延胡索酸的细菌。
2、本发明的背景：
羧酸可作为许多化学药品的潜在前体。例如，琥珀酸可用作诸如1，4-丁二醇(BDO)，四氢呋喃和γ-丁酰内酯的塑料前体的原料。来自琥珀酸的新产物不断开发出来，其中最引人注目的是由琥珀酸与BDO交联形成的聚酯。一般来说，琥珀酸酯具有作为新的“绿色”溶剂的潜力，它能代替更有害的溶剂并可用作每年总产值超过十亿美元的数百万磅化学药品地前体。与琥珀酸一起，其它的4碳二羧酸，如苹果酸和延胡索酸也具有原料潜力。
从可更新的原料生产这类羧酸(例如，通过发酵方法)是代替从不可更新资源产生该羧酸的更耗能方法的一种途径。琥珀酸是产丙酸细菌无氧发酵的一种中间体，但该过程产生低产量和浓度的琥珀酸。
厌氧瘤胃细菌，如Bacteroides ruminicola和Bacteroidesamylophilus也产生琥珀酸。然而，瘤胃细菌在发酵过程中在特征上不稳定。
很早就已知道大肠杆菌发酵产生混合酸，如在Stokes，J.L.1949，“以大肠杆菌悬液发酵葡萄糖”，细菌学杂志，57：147-158中所述。然而，对于每摩尔发酵的葡萄糖，只生产1.2摩尔甲酸，0.1-0.2摩尔乳酸和0.3-0.4摩尔琥珀酸。因此，经发酵生产羧酸的努力导致相当大量的生长底物如葡萄糖不能转变成所需产物。
在Glassner等的美国专利5143834中所列的发酵过程中使用的诸如A.succiniciproducens的一些细菌自然产生中等产量的琥珀酸。然而，该宿主生物将至少1摩尔碳水化合物转化成1.33摩尔琥珀酸和0.67摩尔乙酸。乙酸副产物的产生说明昂贵的葡萄糖的1/3未转变成琥珀酸。而且，已显示A.succiniciproducens宿主菌株渗压耐受性不高，不能耐受高浓度的盐，且还受中等浓度产物的抑制。最后，A.succiniciproducens存在操作困难，因为作为专性厌氧生物，使用该生物的程序必须在无氧条件下进行。另外，接种物的培养基制品需要加入色氨酸且还需要混合4种不同的溶液，其中之一含腐蚀性和有毒的H2S。
在本领域需要一种经济地生产大量羧酸，如琥珀酸，苹果酸和延胡索酸的发酵方法。该方法应使用低花费的营养成份和底物且提供高发酵率。为了实现该方法，需要一种渗压耐受性，特征清楚的兼性细菌宿主以达到2∶1摩尔比的产物与生长底物比产生所需产物。
本发明的概述
本发明的一个目的是提供克服现有技术中许多缺陷的生产4-碳二羧酸的方法。
本发明的另一目的是提供一种兼性微生物菌株，它产生每升100克的苹果酸浓度。本发明的一个特征是将不能将丙酮酸代谢为苹果酸的细菌与苹果酸酶基因结合。本发明的一个优势是专一性生产苹果酸，或生产苹果酸及琥珀酸。
本发明的另一个目的是提供一种兼性微生物菌株，它以大约2∶1的琥珀酸与碳水化合物食品源之比产生琥珀酸。本发明的一个特征是在选择培养技术后出现菌株。本发明的一个优势是经济地产生生产琥珀酸的突变株而不需对亲本株进行耗时的遗传操作。
简单地说，本发明提供了一种分离生产琥珀酸的细菌的方法，包含分离缺乏降解丙酮酸之能力的兼性微生物；以有氧方法增加该微生物的生物量；将生物量置于无氧环境的葡萄糖富集培养基中使降解丙酮酸的突变体能生长并分离该突变体。
本发明还提供了一种突变体，其特征在于它产生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作为发酵产物，它来自缺乏丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶的基因的亲本且属于大肠杆菌类细菌。
附图的简要描述
通过参照附图说明的本发明实施方案的下面的详细描述可更好地理解本发明的上述和其它目的及优点，其中：
图1是描绘根据本发明，琥珀酸与乙酸产量的比率增加的图；
图2是描绘根据本发明用苹果酸酶基因转化NZN111后琥珀酸产量增加的图。
本发明的详细描述
一般来说，本发明人发现了确定能经济地以发酵方法生产大量琥珀酸，延胡索酸和苹果酸的细菌的方法。
大肠杆菌突变的详细描述：
在一个实施方案中，开发了琥珀酸产量增加的大肠杆菌的一个新突变菌株。本发明人命名该菌株为AFP111，表明该菌株由美国能源部选择原料计划的努力而产生。
如上所述，正常情况下，在无氧条件下野生型大肠杆菌产生发酵产物的混合物，其中琥珀酸是微量成份。然而，在无氧条件下生长AFP111时，主要代谢产物是琥珀酸。AFP111含有单一的自发染色体突变，它产生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物，其中琥珀酸是主要产物。用AFP111可产生每份葡萄糖重量99％的琥珀酸重量的最大产率。使用AFP111明显降低了以发酵方法生产琥珀酸的成本。
厌氧发酵是从诸如葡萄糖的燃料获得能量的最古老的途径。在厌氧细胞中，这是唯一的产生能量过程。在大多数兼性细胞中，这是葡萄糖代谢中的专性第一阶段，接着是经三羧酸循环对发酵产物的有氧氧化。
最广泛使用的发酵类型是以产生的丙酮酸作为次末级产物的糖酵解。丙酮酸的贮存取决于在该生物中存在哪一种基因。在乳酸脱氢酶存在的条件下，当丙酮酸经NADH和H+还原成乳酸时糖酸解终止。在存在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶时，形成乙醇。在存在丙酮酸甲酸裂解酶时，发酵以产生乙酸，乙醇和甲酸，或氢加二氧化碳终止。
如果在细菌基因组中出现的一个或许多突变消除了该微生物中负责丙酮酸降解的基因，那么丙酮酸会积累。在无氧生长的大肠杆菌中，这些基因是丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(ldh)。研究者可从Dr.David Clark，Southern Illinois Universitv，Carbondale IL63901大量获得的大肠杆菌菌株NZN111在两基因中均含有突变，其中由于大肠杆菌染色体DNA序列的改变，pfl和ldh均已失活。因此，NZN111不能经发酵生长。
获得突变的详细描述：
令人惊奇且预料不到的是，本发明人发现了NZN111的其它改变，这些改变在选择培养期间自发地出现或经质粒转化出现，最终导致出现产生琥珀酸作为主要产物的AFP111。
当在系列培养技术中使用选择环境时出现导致AFP111型特征的NZN111的自发染色体突变。在第一步，在富集培养基，如LuriaBertaini(LB)肉汤(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，和1％NaCl，pH7.5)中以有氧发酵增加NZN111生物量。需要每毫升109至1010个细胞的产量。尽管可改变培养基，但在37℃，标准压力下5-7小时的生长期期间可产生上述浓度。
作为第二步，将积累的生物量置于富含葡萄糖的无氧条件中以利于只有那些能降解丙酮酸的细胞(突变体)生长。具体地说，将细胞涂布于1.5％琼脂，该琼脂板含大约每升1-30克(g/l)的葡萄糖，优选10g/l葡萄糖，及30微克(μg)卡那霉素。卡那霉素抗性基因插入NZN111的乳酸脱氢酶基因中。在37℃下在控制的无氧环境中生长培养物24小时。产生好结果的一种无氧环境是二氧化碳和氢气的混合物，它通过使用以GASPAKTM购自Becton-Dickinson，Cockeysville，Maryland的大气控制装置提供。
培养期间产生了许多个AFP111菌落(大约每107个细胞中有2个)，其中大约一半能在液体培养基中生长以产生所需的产物混合物。
在质粒转化的例子中，当用含突变的苹果酸脱氢酶基因mdh的质粒pMDH13转化NZN111时，恢复丙酮酸降解产生乳酸。系列培养该转化子[NZN111(pMDH13)]产生含自发染色体突变的AFP111。AFP111产生琥珀酸，乙酸和乙醇的混合物作为发酵产物，与生长培养基中所用的葡萄糖重量相比，产生的琥珀酸高达99％。pMDH13的形成和转化方案相似于W.E.Boernke等(1995年9月10日)Archives ofBiochemistry and Biophysics 322，No.1.pp.43-52所公开的方案，本文引用以供参考。
AFP111生长的详细描述
AFP111易于处理且其随后的生长使该菌株比现有技术的A.succinici-producens更易于研究。例如，由于该生物的兼性有氧特征，本发明的生长方法不需严格使用无氧培养技术。该方法不需诸如葡萄糖和色氨酸的昂贵生长培养基来生产大量生物量。而且，该生物具有渗压耐受性，能产生高于每升发酵液50g有机酸盐的浓度而对其代谢无任何抑制。最后，AFP111细菌也在A.succiniciproducens不能同化的木糖和其它戊糖上生长。
为了对本文所述的菌株进行实验评价，在无葡萄糖的生长培养基(Luria Broth)中有氧培养细胞至细胞密度达到0.5和10OD600之间。
一旦达到AFP111的这一合适的生物量，将细胞注射或转移入密封的发酵反应室中以容纳于其中。培养基是用葡萄糖或一些其它的合适的碳水化合物混合而成，如木糖，半乳糖或阿拉伯糖，浓度范围为大约10到30g/l。改变现在容纳的混合物的气氛，从而实现无氧条件。实现该气氛改变的一个方法是通过一个通气站进行，其中将环境气体交换成二氧化碳。
在将混合物导入发酵反应室之前，给反应室提供适当量的缓冲培养基，如MgCO3或CaMg(CO3)2，以维持近中性pH。为达到合适的缓冲能力，一般使用大约4至8重量百分数的缓冲培养基。当以固体提供缓冲培养基以赋予发酵液随时间释放的缓冲能力时获得特别好的效果。
上述程序导致高产率的琥珀酸。例如，获得6∶1比率的琥珀酸与乙酸的重量比，具有99％的产率。当在氢气H2浓度为大约25％至100％之间存在下进行发酵时能进一步增加琥珀酸与乙酸的比率。这些结果表明，不象现有技术的微生物，本发明的突变体AFP111使用外源性氢作为还原剂。例如，当存在Luria培养基，葡萄糖，缓冲剂，氢气与二氧化碳(CO2从缓冲剂中释放)的混合物时，获得的琥珀酸与乙酸比率达到9，如图1所示。这一结果反应了本方法的另一个优势，强调了葡萄糖降解为所需产物，而无不希望的产生乙酸的副反应。
下面表1显示了原始亲本LCB320(也从Southern IllinoisUniversity获得)，NZN111和AFP111的羧酸产物分布。
当使用100％的二氧化碳气体时，琥珀酸产量增加，琥珀酸浓度达到每升约45克，生产力达到大约每小时每升1.6克，琥珀酸克数相对于葡萄糖克数的百分产率达到99％，琥珀酸与乙酸重量比达到大约6。
表1：AFP111和亲本的产物产率，以相对于起始葡萄糖的摩尔产量(摩尔百分数)表示
产物 原始亲本 中间亲本 突变体
LCB320 NZN111 AFP111
琥珀酸 12 2 109
乳酸 24 0 0
丙酮酸 1 17 0
甲酸 26 0 0
乙酸 51 6 49
乙醇 80 15 47
总产量 193％ 41％ 206％
理论上的摩尔产率值可以是200％，因为1分子的葡萄糖可产生2分子的全部产物。
当在NZN111中产生大肠杆菌NAD-依赖性苹果酸酶(经过添加并诱导基因maeA)时，也产生琥珀酸。在这种情况下，使用诱导型质粒pMEE2-1以在转化体NZN111(pMEE2-1)中表达苹果酸酶基因。
从大肠杆菌MC1061分离的基因组DNA用作经PCR克隆苹果酸酶的模板。用限制性核酸内切酶HindIII和PstI消化大肠杆菌MC1061，所得的消化物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行大小分离。使用上文所述PhotoGene核酸检测系统(Cat8192SA)经Southera印迹分析测定含苹果酸酶基因的基因组DNA片段的大。
制备生物素标记的探针的详细描述：
引物以公开的该基因的部分DNA序列为基础；
有义：CGAAGAACAAGCGGAACGAGCAT；
反义：GGCAGCAGGTTCGGCATCTTGTC。
这些引物以1微摩尔(μM)与大约20纳克(ng)基因组DNA在标准的100微升(μl)PCR反应液中混合，产生预期0.8千碱基(kb)的苹果酸酶基因的内部片段。使用Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，California)纯化PCR产物并使用BioNick标记系统(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)进行生物素标记。生物素标记的PCR产物在用HindIII和第二种核酸内切酸裂解的基因组大肠杆菌DNA的Southern印迹分析中用作探针。苹果酸酶基因测定为位于HindIII和PstI消化的DNA的含2.0-2.5kb片段的区域。
起始苹果酸酶基因克隆详述：
用HindIII和PstI消化1微克的大肠杆菌DNA并在预制的1％TAE琼脂糖凝胶上进行大小分离。分离2.0-2.5kb区域的大肠杆菌DNA片段并使用Qiaex凝胶提取试剂盒纯化。纯化的DNA片段连接进已用PstI和HindIII裂解并用虾碱性磷酸酶处理的pUC19的多接头区。连接物然后用作PCR反应的模板以扩增完整的苹果酸酶基因。1微升的连接混合物用作模板，其中含1uM靶向苹果酸酶基因的有义引物GATGCCCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGT，及0.25μM靶向连接的pUC19DNA的反义引物TTTTCCCAGTCACGACGTTG。扩增参数为94℃变性，55℃杂交1分钟，72℃延伸3分钟，共35个循环。在1％TAE-琼脂糖凝胶上分析PCR产物，使用Qiaex凝胶提取试剂盒分离并纯化1.8kb的片段。用BcI和BgI消化部分PCR产物以证实该产物确实含有苹果酸酶基因。用PstI和NcoI消化剩余的PCR产物，凝胶分离，再纯化，然后连接进用NcoI和PstI裂解的表达载体pTRC99a(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)的多接头区。以标准方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株NZN111，以使用Xmn的限制性片段分析筛选所得的菌落(4个实验菌落和2个对照菌落)(预期0.7kb，1.4kb和3.9kb片段)。含克隆的苹果酸酶基因的质粒命名为pMEE3。
苹果酸酶的另一N端详述
100ml NZN(pMEE3)培养物以过夜培养的方式生长，使用Qiagen质粒试剂盒分离该质粒，分离的质粒用作PCR反应的模板。设计新引物以产生在苹果酸酶第一次克隆中所用的引物下游81个碱基对的另一N端。20纳克质粒用作模板，其中含有1μM有义引物AGGATCCATGGAACCAAAAACAAAAAAC和反义引物CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。扩增参数与上面所述相同。以BclI和BglII的限制性图谱再次证实部分PCR产物，证实了该产物含苹果酸酶基因。用PstI和NcoI消化剩余的PCR物质，凝胶分离，再纯化并连接进已用NcoI和PstI裂解的表达载体pTc99aa(Pharmacia，Inc.Piscataway，N.J.)的多接头区。以标准方法用连接混合物转化大肠杆菌株JM109并以限制性片段分析筛选所得菌落(3个实验克隆和1个对照克隆)的所需插入片段。含该苹果酸酶基因这一版本的质粒命名为pMEE2。
启动子诱导物条件最佳化的详述；
用1.5ml pMEE2的过夜培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素的30毫升LB培养基。生长2小时后，将30ml培养物分成3-10ml等份试样。用0，100μM和10μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导酶活性。在0，1，2，3和4小时从每个培养物中取出2ml样品。根据标准方法分离蛋白质并按上面所述测定活性。相对于时间的酶产量在下面表2中描述：表2：在LB培养基中以IPTG诱导的苹果酸酶产量时间(小时) 无IPTG 100μM IPTG 10μM IPTG
μg/分钟/mg蛋白质0 3.09 - -1 4.83 26.5 5.842 4.26 38.2 10.063 8.46 75.3 32.74 9.92 88.2 38.95
在图2中描述了pMEE2表达的生理学效应。在2ml含氨苄青霉素的LB培养基中有氧生长双份NZN111(pMEE2)培养物和作为对照的NZN111(pTRC99a)。每种培养物的一份用10μMIPTG诱导。3小时后，OD600从0.6增加到4.8。将1毫升该培养物注射进装有10ml含20g/1葡萄糖，1g/L乙酸和0.5g固体MgCO3的LB培养基的密封的58ml瓶中。气氛由1∶1∶2比率的空气∶氢气∶二氧化碳组成并高出环境压力1个大气压。立即取样并在37℃，100rpm摇动培养期间间隔从培养基取样。下面表3提供了用pMEE2及原始载体(pTRC99a)转化NZN111时的产物产率的比较。
表3
NZN111(pMEE2)与NZN111(pTRC99a)中苹果酸酶表达的效果
产物 载体 maeA
g/L
琥珀酸 0.3 6.5
乳酸 0.4 0.4
乙酸 0 0
乙醇 0 0.2
表3中所示的结果是大约19至42小时的培养期间的结果。
乳芽孢杆菌属突变体详述：
本发明还确定了经发酵更高产地生产苹果酸的方法。苹果酸是琥珀酸的前体，原则上是比琥珀酸更好的终产物，其生产少一步还原步骤。苹果酸产量的理论化学计算法是1摩尔葡萄糖和2摩尔二氧化碳转变成2摩尔的苹果酸。因此可生产苹果酸而不浪费葡萄糖。也可形成延胡索酸，它是苹果酸的脱水产物，且是还原途径中琥珀酸的前体。也可同时形成苹果酸和延胡索酸而不产生副产物，但苹果酸的更高的可溶性使其在大规模生产方法中是优选的。
用负责苹果酸酶生产的基因(如maeA)转化合适的细菌可产生过量的苹果酸。一般来说，理想的细菌应缺乏乳酸脱氢酶活性以及其它代谢丙酮酸的酶，从而导致积累丙酮酸。用maA转化细菌可直接产生苹果酸。为了维持高水平的苹果酸生产，细菌必须不能将苹果酸转变回乳酸或转变成延胡索酸或琥珀酸。一些乳芽孢杆菌属菌株缺乏负责该转变的丙乳酸酶，延胡索酸酶和延胡索酸还原酶，所以这类菌株是在发酵方法中生产苹果酸的特别合适的候选物。由于其极高的渗透压耐受性特征，进一步增强了乳杆菌属的合适性。Lactobacillusgasseri是用于该操作的接近条件的宿主，因为已显示它在葡萄糖发酵期不能代谢苹果酸且在遗传上可被较好地鉴定。干酪乳芽孢杆菌也具有相当大的潜力，因为它比L.gasseri表现出更高的渗压耐受性。
一般来说，在缺乏功能性乳酸脱氢酶基因的乳芽孢杆菌属宿主中诱导在诸如pTRK327的合适的乳芽孢杆菌属表达载体中的苹果酸酶基因(如maeA)可形成苹果酸。经过将苹果酸酶插入宿主的乳酸脱氢酶基因中可实现这一点。
尽管参考列举的实施方案的详细描述已描述了本发明，这些详细描述并不打算限制在所附权利要求中限定的本发明的范围。