淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法 【技术领域】
本发明涉及链霉菌属的新菌种及由它制备农用抗生素的方法。
背景技术
农药是重要的农业生产资料，在保证农作物的高产、稳产中发挥着十分重要的作用。目前，我国每年使用农药制剂高达100多万吨，合原药30多万吨(折纯)，农药品种200多种。面对着巨大的农药需求和大量的投入，我国农药工业不得不走仿制国外已过专利保护期的一些农药品种，这导致了我国农药创制的落后和品种结构的不合理。突出地表现在3个70％现象：杀虫剂占农药的70％，剧毒和高毒农药占杀虫剂的70％，其中有机磷有机氯农药占高毒剧毒农药的70％。
微生物农药通常指用微生物及其代谢产物制造的农药。由于我国幅员辽阔，气候条件、土壤类型、植物种类等多种多样，这就为开发新型微生物农药提供了良好的条件。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种链霉菌属的新菌种，它能够产生一类新的N-糖甙类抗生素。该抗生素对农作物细菌性和真菌性病害具有防治作用。
本发明的另一目的是提供由该新菌种制备该类抗生素的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下方案：
将淡紫灰链霉菌海南变种，通过发酵罐液体深层发酵，发酵液内含有一类糖甙类化合物，这类化合物称为中生素菌。中生菌素对农作物病害，特别是农作物细菌性病害有明显的防治作用。
本发明所述的淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)已于2003年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1026。
CGMCC No.1026是由自然分离的野生链霉菌，经菌种选育后得到。
CGMCC No.1026具有以下微生物特性：
1.形态学特性
该菌种在多种分类培养基上，都能形成发育良好地气生菌丝体及基内菌丝体，菌丝单杈分枝，在气生菌丝体顶端形成卷曲的螺旋形孢子丝1-4圈。常形成10个以上的分生孢子链，孢子圆形或椭圆形(0.6-0.8×1-1.2μm)，孢子表面光滑。
2.培养学特性
该菌种在通常的分类培养基及国际链霉菌规划拟定的培养基(简称ISP培养基)上，形成粉末状气生菌丝体，灰白或微粉的灰色、淡紫灰至暗紫灰，基内菌丝体乳脂色或浅黄色至芥黄色，无可溶性色素。可参见表1。
表1淡紫灰链霉菌海南变种的培养特征培养基 气生菌丝体 基内菌丝体 可溶性色素酵母膏麦芽汁琼脂ISP2 粉末状，淡粉-淡紫灰 无-豆汁黄 无燕麦琼脂ISP3 薄粉状，粉白-淡玫瑰紫 浅黄-象牙黄 无无机盐淀粉ISP4 粉末状，粉白-淡紫灰 浅黄-淡茧黄 无甘油天门冬琼脂ISP5 少，灰白 浅蜜黄 无蛋白胨-铁琼脂ISP6 光秃 褐 褐-黑褐酪氨酸琼脂ISP7 粉末状、白-灰白 浅黄-炒米黄 无高氏合成一号琼脂 粉末状、粉白-淡紫灰 浅黄-象牙黄 无克氏合成一号琼脂 极薄、微灰白 无-淡茧黄 无察氏蔗糖琼脂 光秃 乳白 无Bennett’s琼脂 粉末状、白-微粉 淡褐 无-浅褐Emerson’s琼脂 极薄、微灰白 淡褐 无-浅褐马铃薯块 光秃 淡褐-褐 浅褐-褐
3.生理特性
a.类黑色素的形成：在蛋白胨-酵母膏-铁琼脂(ISP6)上，形成褐色色素，但在酪氨酸琼脂(ISP7)上，无可溶性色素。
b.明胶液化：阳性。
c.牛奶培养：牛奶凝固并胨化。
d.淀粉水解：阳性。
e.硝酸还原：阳性。
f.纤维素分解：不分解。
淡紫灰链霉菌海南变种能很好地利用葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖。其次是果糖、肌醇、菊糖、乳糖、半乳糖。不利用酒石酸钠、甘露醇、棉子糖、醋酸钠、柠檬酸钠。对蔗糖的利用可疑。
中生素菌有6个有效成分，各成分之间依次递增一个β-赖氨酸，其结构见式I。这6个有效成分是一个同系化合物，纸层析结果表明它属于典型的碱性水溶性抗生素类群，混合物的紫外吸收光谱仅显示末端吸收，各组分有类似的红外光谱，在3400，1720，1600，1560，1340和1050cm-1有特征吸收峰，皆为左旋化合物。
式I
其中n为1-6的正整数。
CGMCC No.1026经发酵得到中生菌素水剂的步骤如下：
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，通常条件是温度28～30℃，摇床转速为180～200rpm，培养20～25小时；在种子罐内培养24小时；再转接大罐中发酵60～65小时后，将发酵液进行板框或离心过滤；将滤液调节PH值至4.0-4.5，最后真空浓缩后制得中生菌素水剂成品。
以下发明内容部分是中生菌素的积极效果：
A.中生素菌对一些常见农作物病原菌的抑菌效果见第7页的表2。MIC为最小抑制浓度(Minimal Inhibition Concentration)。中生菌素防治农作物病害的施用方法及效果还可参见第8页的表3。
B.中生素菌对动物的毒性
(1)急性毒性：大白鼠口服，工业品LD50为10000mg/kg，纯品LD50雄性为3 16mg/kg，雌性为237mg/kg。大白鼠经皮，工业品LD50＞10000mg/kg。
(2)皮肤和眼睛的刺激性：大白兔皮肤试验未见红斑形成，无水肿形成。大白兔眼睛用药后1～24h结膜轻度充血水肿，无分泌物，角膜正常，48h恢复正常。
(3)蓄积毒性：按蓄积系数等于死亡半数时总摄样品量除半数致死量，中生菌素蓄积系数为5.8。
(4)致畸性：大鼠妊娠第6天至第15天连续灌胃10天，剂量为0.766～15.32mg/kg，各剂量每次灌0.5mg/100g体重，对胚胎无影响。经卡平方检验，各剂量级吸收胎数和死胎数、胎鼠骨骼畸形与对照组比较无显著差异，胎鼠内脏未见畸形。
(5)微核试验：没有致染色体损伤的作用，没有致生殖细胞畸变的作用。
(6)致突变性：用Ames标准平板掺入法测定，各剂量级均无致突变作用。
C.中生素菌在植物体、土壤中的残留量
(1)样品制备：选择生长健康的莲白菜地，设对照区与30ppm喷药区，喷药后每天取对照土样、对照菜样、喷药土样、喷药菜样，连续取样10天。菜样放组织捣碎皿中捣碎，加水浸泡24h，用纱布滤去菜渣。滤液用滤纸过滤两次，再用布氏漏斗真空抽滤。滤液于50℃水浴蒸发至少量体积，冷冻干燥。土样加水打散，浸泡24h后，用纱布过滤，再用滤纸、布氏漏斗过滤，滤液浓缩冻干。
(2)样品测定：由于中生菌素属于N-糖甙类抗生素，紫外光谱为末端吸收，一般紫外范围无法检测，只有采用柱前将样品与邻苯二甲醛在适当条件下进行衍生化反应，生成具有荧光的产物，再以反相离子对色谱进行分离后，用荧光检测器检出。本方法灵敏度极高，最小检出量为6.9×10-2ppb，重复性好，相对标准偏差cv值为0.2372％，回收率为97.09％。
(3)测定结果：用药后第1天植物体中检出量为0.185μg/ml，第7天检出量为0.001μg/ml，第8天未检出，这说明中生菌素在自然界中残存量极微，而且时间仅有7天，因此，对环境没有污染，对人畜没有毒害。
从以上结果可知，中生菌素是一种使用安全，易于分解的生物农药。
D.中生素菌的农田示范效果：
a.1991-1996年在河南和北京两地用中生菌素(15-30ppm)防治水稻白叶枯病做了系统的试验和示范，包括不用药剂的对比试验，不同发病程度和防治次数试验，秧田施药保护对大田发病期和发病程度的作用，试验示范面积达2万亩。结果表明，中生菌素防水防治水稻白叶枯病的最佳时期是浸种、再加秧田三叶期和移栽前5天喷雾。如遇严重发病年份，与大田发病初期再喷1-2次，能控制了病情的扩展蔓延，防治效果高达86.3-90.1％，优于化学药剂叶枯净和稻禾壮。
b.1992-2000年在河南汝州、郑州、濮阳，山东的沂源、烟台等地的果园中以中生菌素取代退菌特等常用化学杀菌剂，防治苹果轮纹病(烂果病)和叶斑病，采用15-30ppm中生菌素药液与波多液交替使用，生长期共喷3次中生菌素，烂果率一般可控制在0.47-5％，相当或优于常用化学药剂，使用中生菌素防治的果园，果实大、色泽好、果锈少亦是突出特点之一。
c.1992-2000年在郑州、濮阳、沂源等地果园用中生菌素防治苹果叶病，叶斑病病叶率控制在22％左右，病情指数在8％以下，显著优于退菌特、多菌灵等化学药剂。
本发明的优点：中生菌素可以防治农作物病害，特别是防治农作物细菌性病害，应用范围广，且具有高效、低毒、低残留的优点。
【具体实施方式】
实施例1：CGMCC No.1026的选育
将自然分离的淡紫灰链霉菌海南变种野生菌株，通过自然选育得到一株菌落大而饱满的菌株，颜色为淡紫色。以此菌株为出发菌株，其效价近400μg/ml，经溶菌酶酶解获得该菌原生质体，再用紫外诱变15-50秒，取得了较好的诱变效果，得到一株CGMCC No.1026，其效价高达6000～7000μg/ml，是出发菌株的17倍。
实施例2：中生菌素水剂的制备
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，条件是温度28℃，摇床转速为200rpm，培养24小时。然后在种子罐培养24小时，种子罐中采用LM培养基。种子罐转接发酵罐中发酵60小时后，将发酵液进行板框或离心过滤。将滤液调节PH值至4.0，最后真空浓缩(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水剂成品，有效成份含量为10000μg/ml。
培养种子所用的摇瓶培养基为(wt％)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉1.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl 0.3、CaCO3 0.3及通用的微量元素。摇瓶装量为500ml瓶装100ml。
种子罐培养基为(wt％)：葡萄糖1.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl0.4、CaCO3 0.3、氯化钠0.5及通用的微量元素。
发酵培养基为(wt％)：葡萄糖2.5、玉米粉1.0、黄豆饼粉2.0、NH4Cl 0.4、CaCO3 0.3、氯化钠0.5及通用的微量元素。
实施例3
将CGMCC No.1026置于摇瓶中进行种子培养，条件是温度30℃，摇床转速为180rpm，培养20小时。然后在种子罐发酵24小时，种子罐中采用与实施例2相同的LM培养基。种子罐转接发酵罐中发酵65小时后，将发酵液进行板框或离心过滤。将滤液调节PH值至4.5，最后真空浓缩(真空度0.080MPa)后制得中生菌素水剂成品，有效成份含量为9900μg/ml。
表2中生菌素不同组分的抗菌谱(MIC，单位μg/ml)试验菌 n值 发酵液 (水剂) 1 2 3 4 5 6白菜软腐病菌 50 0.09～0.1 1～2 0.78 0.39 0.78 1.56西瓜枯萎病菌 25 1.56 0.78 3～4 0.78 0.39 0.78稻瘟病菌 12.5 3～4 0.39 0.39 0.1～0.2 0.1～0.2 3～4黑曲霉 50 50 0.78 3～4 1～2 3～4 12.5白色假丝酵母 12.5 100 3～4 0.78 0.39 0.39 1～2清酒酵母 25 3～4 0.78 0.1～0.2 3～4 0.04 1～2变形杆菌 50 6～7 3～4 1～2 1～2 3～4 6～7大肠杆菌 100 50 12.5 6～7 6～7 12.5 3～4金黄色葡萄球菌 3～4 1～2 0.1～0.2 0.97 0.09～0.1 0.1～0.2 0.39八叠球菌 6～7 25 0.39 0.97 0.09～0.1 0.1～0.2 0.39枯草杆菌 6～7 0.39 0.09 0.1～0.2 0.04 0.09～0.1 0.1～0.2结核分枝杆菌 6～7 1～2 0.78 0.39 0.78 1～2 0.78草分枝杆菌 3～4 0.1～0.2 0.39 0.9～1 1～2 0.39 12.5小麦赤霉菌 12.5 0.097 0.1～0.2 0.39 0.39 0.39 -油菜黑腐病菌 50 0.97 3～4 1～2 1～2 1～2 -人参锈病菌 6～7 0.097 1～2 0.1～0.2 0.1～0.2 0.1～0.2 -
表3中生菌素防治农作物病害及效果 作物 防治对象施用方法 防治效果(％) 水稻 白叶枯病100μg/ml浸种，15-20μg/ml喷雾2-3次 85-90 大白菜 软腐病50μg/ml浸种，20-30μg/ml喷雾2-3次 70-85 柑桔 溃疡病20-30μg/ml喷雾4-5次 70-85 番茄 青枯病20-30μg/ml灌根2-3次 65-75 黄瓜 细菌性角斑病20-30μg/ml喷雾1-2次 80-90 姜 姜瘟病50μg/ml浸种，20-30μg/ml灌根2-3次 70-80 芦苇 茎枯病20-30μg/ml喷雾2-3次 70-80 青椒 疮痂病20-30μg/ml喷雾2-3次 70-80 苹果树 轮纹病20-30μg/ml喷雾3-4次 70-80 西瓜 枯萎病20-30μg/ml灌根2-3次 60-75