木本植物铁结合蛋白基因及其快速克隆方法 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种木本植物铁结合蛋白基因及其快速克隆方法。
铁结合蛋白是一切动植物用于发育的储存铁的唯一共同来源。据统计世界范围内约30％的人口存在缺铁，以妇女、儿童最严重。铁的缺乏不仅会阻碍大脑认识能力的发育，而且铁结合蛋白基因的表达还与人类的多种疾病，如贫血、各种神经混乱、衰老及视力下降、肝硬化、腹膜分离、纤维肉瘤等密切相关。分子生物学研究已证明在离体条件下铁结合蛋白能抑制一些白血病细胞系的生长，在医治鼠的饮食性铁缺乏中植物铁结合蛋白非常有效。因此，有人认为通过生物技术途径提高作物种子中铁结合蛋白的表达和种子铁的其它可溶性成分将是解决全球性饮食中铁缺乏问题的一条可持续的有效途径。
90年代以来，国外先后报道了大豆、豌豆、豇豆、菜豆、苜蓿、玉米、油菜、拟南芥、马铃薯、兰花等高等植物铁结合蛋白基因的分离和克隆，而国内迄今未见任何有关报道。特别是木本植物铁结合蛋白基因的研究国内外至今仍然是空白。已报道的植物铁结合蛋白基因的分离技术，其方法是通过mRNA途径合成cDNA，然后再利用cDNA做探针筛选目的基因文库(cDNA和基因组文库)，或用RT-PCR方法和mRNA差异显示的方法获得目的基因。这些方法虽然成功地克隆了以上报道的各种植物的铁结合蛋白基因，但所获得的克隆片段绝大多数只是基因地部分序列，并非基因完整的表达序列。通过mRNA途径分离和克隆植物基因虽然目前仍然是基因克隆的主要技术，但整个技术途径步骤繁多、程序复杂、与mRNA有关的操作步骤难度较大、耗时和需要较多的经费。如果能找到一种简单、快速、有效的铁结合蛋白基因的分离和克隆方法将是十分有用的。
本发明的目的在于提供一种木本植物的铁结合蛋白基因，同时提供一种简单、快速、有效的铁结合蛋白基因完整表达序列的分离和克隆方法。
本发明通过以下步骤实现：
(1)引物设计：用常规方法设计序列如下的引物：
引物Ⅰ:5′端：5′＞TTT CGC CCA TAT GGC TCT TGC TCC ATC＜3′
引物Ⅱ:3′端：5′＞GCA GGA TCC TAA TCA AGA AGT CTT TGA TC＜3′
(2)PCR扩增：用2.0μl(10ng/μl)木本植物基因组DNA、17.75μl水、2.5μl 10×缓冲液、1.5μl Mgcl2(25mM)、0.25μldNTPs(5mM)、0.5μl引物Ⅰ、0.5μl引物Ⅱ、0.2μl Taq酶作为扩增体系进行如下PCR扩增：
PCR 94℃5分钟→[94℃1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟]X35循环→72℃8分钟→5℃，得到木本植物铁结合蛋白基因。
(3)克隆、测序和序列的同源性分析：用《分子克隆——实验指南》(二版，金冬雁等译)上的方法进行克隆，对片段进行商业测序，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/网站上进行序列的同源性比较。
上述步骤(2)基因组DNA可用小金海棠或者桑树的基因组DNA
上述方法得到的铁结合蛋白基因的核苷酸序列及推定的氨基酸序列如下：
ATG-GCT-CTT-GCT-CCA-TCC-AAA-GTT-TCC-ACC-TTT-TCT
M A L A P S K V S T F SGGT-TTT-TCT-CCC-AAA-CCC-AGT-GTT-GGG-GGT-GCT-CAG-AAA-AAC-CCA-ACT-TGC-TCT-GTT-TCT G F S P K P S V G G A Q K N P T C S V SCTG-AGC-TTT-TTG-AAT-GAG-AAA-CTT-GGA-AGC-AGA-AAC-CTT-AGG-GTT-TGT-GCC-TCA-ACG-GTG L S F L N E K L G S R N L R V C A S T VCCT-CTC-ACT-GGG-GTG-ATT-TTT-GAA-CCG-TTT-GAG-GAG-GTT-AAG-AAG-AGC-GAG-CTT-GCT-GTT P L T G V I F E P F E E V K K S E L A VCCA-ACT-GCT-CCC-CAA-GTC-TCG-TTG-GCT-CGT-CAG-AAC-TAC-GCT-GAT-GAG-TGT-GAA-TCT-GCG P T A P Q V S L A R Q N Y A D E C E S AATT-AAC-GAG-CAG-ATA-AAT-GTG-GAA-TAC-AAT-GCT-TCC-TAC-GTG-TAC-CAC-TCC-TTG-TTT-GCA I N E Q I N V E Y N A S Y V Y H S L F ATAC-TTT-GAC-AGG-GAC-AAC-GTG-GCT-CTC-AAG-GGA-TTT-GCC-AAG-TTC-TTC-AAG-GAA-TCT-AGT Y F D R D N V A L K G F A K F F K E S SGAG-GAA-GAA-AGA-GAG-CAC-GCT-GAA-AAG-CTC-ATG-AAA-TAT-CAG-AAT-ACT-CGC-GGT-GGA-AGG E E E R E H A E K L M K Y Q N T R G G RGTT-GTT-CTT-CAC-GCC-ATC-AAG-AAT-GTC-CCC-TCA-GAA-TTT-GAG-CAT-GTG-GAA-AAG-GGG-GAT V V L H R I K N V P S E F E H V E K G DGCA-TTG-TAT-GCA-ATG-GAA-TTA-GCT-TTG-TCT-TTG-GAG-AAG-TTA-GTG-AAT-GAG-AAA-CTT-CTG A L Y A M E L A L S L E K L V N E K L LAAT-GTG-CAC-AGT-GTG-GCA-GAT-CGC-AAC-AAT-GAC-CCT-CAA-ATG-GCC-GAC-TTC-ATT-GAA-AGC N V H S V A D R N N D P Q M A D F I E SGAG-TTT-TTG-TCT-GAA-CAG-GTT-GAA-TCA-ATT-AAG-AAA-ATT-TCA-GAG-TAT-GTG-GCT-CAG-TTG E F L S E Q V E S I K K I S E Y V A Q LAGA-AGG-GTT-GGA-AAG-GGT-CAC-GGT-GTT-TGG-CAC-TTT-GAT-CAA-AGA-CTT-CTT-GAT-TAG R R V G K G H G V W H F D Q R L L D
本发明的优点是：通过本发明所获得的基因可用于构建植物表达载体转化以收获种子为目的的各种作物，提高铁结合蛋白在作物种子中的表达，解决人和动物食物中缺铁的问题。同时也可利用该基因构建原核表达载体转化大肠杆菌，利用微生物的高效、稳定表达来直接生产人类食品和医药中需要的植物铁结合蛋白。另外，在科学研究方面还可利用该基因做探针开展植物的各种抗环境逆境的研究。同时，该方法利用优良苹果种质资源小金海棠或桑树，通过基因组DNA途径，用简单的PCR扩增方法，操作步骤少、程序简单、各步骤难度小、只需要很少的经费和时间就可获得铁结合蛋白基因的完整表达序列。本发明获得的铁结合蛋白基因的序列，起始和终止密码子完整，并具有基因完整的编码序列。
实施例1：
用常规方法设计引物Ⅰ:5′端：5′＞TTT CGC CCA TAT GGC TCT TGC TCC ATC＜3′和引物Ⅱ:3′端：5′＞GCA GGA TCC TAA TCA AGA AGT CTT TGA TC＜3′，然后用2.0μl(10ng/μl)桑树基因组DNA、17.75μl水、2.5μl10×缓冲液、1.5μl Mgcl2(25mM)、0.25μl dNTPs(5mM)、0.5μl引物Ⅰ、0.5μl引物Ⅱ、0.2μl Taq酶作为扩增体系进行如下PCR扩增：PCR 94℃ 5分钟→[94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟]X35循环→72℃ 8分钟→5℃，得到桑树铁结合蛋白基因。最后用《分子克隆——实验指南》(二版，金冬雁等译)上的方法进行克隆，对片段进行商业测序，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/网站上进行序列的同源性比较。
实施例2：
用常规方法设计引物Ⅰ:5′端：5′＞TTT CGC CCA TAT GGC TCT TGC TCC ATC＜3′和引物Ⅱ:3′端：5′＞GCA GGA TCC TAA TCA AGA AGT CTT TGA TC＜3′，然后用2.0μl(10ng/μl)小金海棠基因组DNA、17.75μl水、2.5μl10×缓冲液、1.5μl Mgcl2(25mM)、0.25μl dNTPs(5mM)、0.5μl引物Ⅰ、0.5μl引物Ⅱ、0.2μl Taq酶作为扩增体系进行如下PCR扩增：PCR 94℃ 5分钟→[94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟]X35-循环→72℃8分钟→5℃，得到苹果铁结合蛋白基因。最后用《分子克隆——实验指南》(二版，金冬雁等译)上的方法进行克隆，对片段进行商业测序，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/olast/网站上进行序列的同源性比较。