正蚓科双胸蚓属蚯蚓纤溶酶基因核苷酸序列及其克隆方法 本发明涉及一种正蚓科双胸蚓属蚯蚓纤溶酶基因核苷酸序列及其克隆方法。
蚯蚓体内富含纤溶酶，它是一种具有溶血栓活性的蛋白水解酶，具有可观的医用前景。目前国内外均很注重对蚯蚓纤溶酶的研究。
本发明的目的是提供一种正蚓科双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)纤溶酶基因的核苷酸序列及其克隆方法。
为实现上述目的，本发明 以正蚓科双胸蚓属蚯蚓mRNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经反转录、PCR方法得到纤溶酶基因。基因测序结果为cDNA由888核苷酸组成，自5′端至3′端为
GTGAT AGGGG CACTA ACGCTAGCCCAGGAGAGTGCCCATGGCAACTGTC
TCAGCAACGCCAAAGCGGTTCTTGGTCGCACAGCTGCGGAGCATCGCTTC
TGAGCTCAACTTCCGCTCTCAGCGCATCGCACTGCGTCGATGGAGTGCTA
CCCAACAACA TTCGAGTCATCGCTGGTCTTTGGCAACAGTCGGACACAAG
CGGCACTCAGACCGCTAACGTCGATAGCTACACCATGCATGAGAACTATG
GTGCTGGTACTGCTTCGTACTCCAATGACATTGCCATTCTGCACCTCGCA
ACGTCCATCAGCCTCGGAGGAAACATCCAGGCAGCTGTCCTTCCCGCCAA
CAACAACAACGACTACGCCGGAACCACATGCGTCATCTCCGGATGGGGTC
GCACAGATGGAACGAACAATCTGCCGGACATCCTTCAGAAGTCGTCAATT
CCGGTCATAACGACCGCCCAGTGCACCGCCGCCATGGTTGGAGTCGGTGG
AGCCAACATCTGGGATAATCACATCTGCGTCCAGGATCCTGCTGGCAACA
CCGGAGCCTGCAATGGCGATAGCGGTGGCCCACTGAACTGCCCAGACGGC
GGAACTCGAGTGGTTGGTGTTACTTCGTGGGTTGTATCCAGTGGCCTTGG
TACATGTCTTCCGGACTACCCTTCCGTCTACACCCGAGTCAGCGCCTACT
TGGGTTGGATCGGAGACAACTCTCGTTAGGAGAGTCACACTGATAAAGAA
AGCTCCAGAAAGACAAGCAGTCAACATCTCGAAAACAGAAGTTCTACGGA
ATAACAAGTGGCATTCCAATAATTATTGTCACCATAATAACGATTTAATGCA
AGCGTAAAAGCTGGTTCTCATTAAATCCGTTCATAG
克隆正蚓科双胸蚓属蚯蚓纤溶酶基因的方法包括：蚯蚓纤溶酶的分离纯化，蚯蚓纤溶酶的蛋白质N-末端氨基酸序列测定、扩增引物合成，蚯蚓总RNA提取，mRNA的反转录，目的基因的PCR扩增、目的基因片段的回收，目的基因片段克隆入载体，质粒DNA的快速小量制备。所述的蚯蚓纤溶酶的基因克隆扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5′GTN ATH GEN CNA AAYGC3′其中N＝A、C、G、T；H＝A、C、T；Y＝C、Y。
本发明优点是提供一种正蚓科双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)纤溶酶基因核苷酸序列及其克隆方法，该基因由888核苷酸组成，其中1-726位核苷酸是基因成熟肽序列，727-729位是终止密码子TAG。该基因表达的蛋白质具有巨大的医用前景。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
图1为正蚓科双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)纤溶酶基因核苷酸序列
图2为图1的888核苷酸编码的全部氨基酸序列
蚯蚓纤溶酶的基因克隆程序如下：
1、蚯蚓纤溶酶的分离纯化检测：人工饲养的正蚓科双胸蚓属蚯蚓常规清洁处理，低温匀浆，离心去杂质；超滤除菌去除热源；亲合层析、高压液相纯化，收取蛋白质并纯化，纯化的蛋白质经变性聚丙烯酰胺电泳，银染，蛋白质分子量为30Kda，检测结果显示0.1ng蚯蚓纤溶酶有较强的纤溶活性，大约相当于0.02u尿激酶的纤溶活性。
2、蚯蚓纤溶酶蛋白质N-末端氨基酸序列测定：蚯蚓纤溶酶冻干品溶于19兆纯水(纯水仪：美国Millipor公司Milli-Q plus纯水仪)样品直接加样测定。使用的食品为美国Applied Biosystem 494A/473A蛋白质N-末端序列测定仪。测定工作参数：Initial Yield：2.47pmols Repetitive Yield：94.6％ouc.序列测定结果：蚯蚓纤溶酶蛋白质N-末端20个氨基酸序列如下：
VIGG TNAS PGEF PWQL SQQR
3、蚯蚓纤溶酶基因克隆扩增引物：根据蚯蚓纤溶酶N-末端氨基酸序列设计合成简并寡核苷酸扩增引物，引物长度为20个核苷酸，引物名称为P30(VIG)，组成如下：
P30(VIG)：5′GTN ATH GGN GGN CAN AAY GC3′
其中N＝A、C、G、T；H＝A、C、T；Y＝C、T。
4、蚯蚓(Lumbricus bimastus)总RNA提取：取鲜活蚯蚓放入湿地滤纸堆中过夜，以清洁其腹腔内容物。将蚯蚓放入10％乙醇中麻醉15分钟，等其僵直后，剪去头尾部，称重，加入适量总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)和酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清、沉淀用75％乙醇洗一次，晾干、管底沉淀物即为蚯蚓总RNA。
5、蚯蚓mRNA的提取(mRNA的纯化)：采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。
(1)取蚯蚓总RNA溶于水中，放入65℃水浴10分钟，加入适当的Oligo(dT)探针和20×SSC，混匀，放置室温冷却，称为A液。
(2)冷却期间配置
a、0.5×SSC(1.2ml)用30ul 20×SSC和1.17ml DEPC水配置成。
b、0.1×SSC(1.4ml)用7ul 20×SSC和1.393ml DEPC水配置成。
(3)磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。
(4)mRNA杂交物的洗涤和收获：将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml水重新悬浮至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的蚯蚓纤溶酶mRNA。
6、mRNA的反转录：取蚯蚓溶栓酶mRNA3.0ul，Oligo dTl.0ul(10mM)，72℃水浴2分钟，冰浴2分钟，加入2.0ul 5×first-strandbuffer，1.0ulDTT(20MM)，1.0uldNTP(mix10mM)，1.0ul mMLV(200u/ul)，去离子水1.0ul，总体积为10ul，42℃反应1小时。
7、目的基因的PCR扩增：试管中分别加入80ul水，10倍反应缓冲液10ul，上游P30(VIG)引物2ul(25pmol)，下游引物oLigo dT 2ul(10mM)，反转录产物2ul，煮沸3分钟，冰浴1分钟，加入dNTP(10mM)2ul，Taq酶2ul，混匀离心后加石蜡油50ul，进行PCR扩增。扩增条件为：94℃、40秒，60C、60秒，72℃90秒，35个循环。
8、目的基因片段的回收：上述PCR产物采用低熔点琼脂糖法回收，步骤如下：当欲回收的DNA片段与模板DNA泳动分开后，在此片段前方挖一大小适宜的小槽，加满熔化的低熔点琼脂糖，待其充分凝固，将凝胶置电泳槽中继续电泳，直到紫外线下见欲分离的片段完全进入低熔点琼脂糖后，挖出含DNA的凝胶置于1.5ml离心管中，加入适当体积的TE缓冲液65℃水浴10分钟，加入等体积酚，混匀再置65℃水浴5分钟，12Krpm离心5分钟，上层水相再用酚/氯仿抽提一次，上清加1/10体积3MNaAc和2.5倍体积无水乙醇、液氮气相10分钟后，15Krpm离心10分钟，70％乙醇洗两次，干燥后溶于适当体积的TE中。
9、目的基因片段克隆入PGEM-T载体：将目的基因片段与PGEM-T载体按适当比例(5-10∶1)加入10×T4DNA连接酶缓冲液1ul T4DNA连接酶1ul及适量的去离子水中，总体积为10ul，4℃连接过夜。
感受态细胞的制备：挑取单个JM109菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液呈“云雾状”或OD值为0.6时，4℃5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1MCaCl2悬浮，再5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内6小时备用。
连接产物的转化：取上述连接产物5ul加入100ul感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入无氨苄青霉素的LB培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200ul菌液加入40ul20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(x-gal))及4ul 0.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混匀后涂含氨苄青霉素LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定。
10、质粒DNA的快速小量制备：挑取单菌落接种于4ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。菌液加入1.5ml离心管中，5000rpm离心8分钟，弃上清、沉淀悬浮于15ul悬浮液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA，PH8.0)，加200ul裂解液(0.2NNaoH，1％SDS)，置冰浴5分钟后，加150ul中和液(3.0MKAc，PH4.8)，冰浴10分钟，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清加等体积酚/氯仿抽提一次，上清加2倍体积无水乙醇，置液氮气相10分钟后，12000rpm离心10分钟，沉淀物用70％乙醇洗1次，真空抽干后加入20ulTE(10mMTris，HCl，1mMNa2EDTA，PH8.0和1ulRNaseA(10mg/ml)，37℃培养1小时，-20℃冻存备用。
11、蚯蚓纤溶酶基因cDNA序列测定：提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems 373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子。
SP6启动子序列(24mer)：CAT ACG ATT TAG GTG ACACTA TAG。
T7启动子序列(23mer)：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGAGA。
12、核苷酸序列测定结果：蚯蚓纤溶酶cDNA序列为888核苷酸组成，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、乌嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：A-227、C-253、G-219；T189(见附图1)，编码296个氨基酸(见附图2)。基因成熟肽序列为第1-726位核苷酸，编码242个氨基酸，其余核苷序列为3′末端非编码区。该蛋白质cDNA成熟肽终止密码子位于基因第727-729位，终止密码为TAG。根据蚯蚓溶纤酶cDNA序列推测的该蛋白质等电点(PI)为4.15，蛋白质为酸性。
正蚓科双胸蚓属蚯蚓(Lumbricns bimastus)纤溶酶基因核苷酸的序列表为：
序列长度：888pb
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链状
序列种类：cDNA
来源：正蚓科双胸蚓属蚯蚓(Lumbricus bimastus)
序列特征：1-726位核苷酸是基因成熟肽序列，终止密码子位于基因第727-729位，为TAG。