细胞骨架样基因的编码蛋白特异性抗体 本发明属于人类基因组技术领域。
本发明所述细胞骨架样基因(JWA)是发明人在美国加州大学戴维斯(UCDavis)访问研究期间(1996.3～1998.3)用DD-PCR，噬菌体筛选法，RACE-PCR等方法从人气管支气管上皮细胞构建的cDNA文库中克隆的与细胞骨架有关的全新基因。该基因全长cDNA序列为2107bp，其开放读框序列为564bp，共编码188个氨基酸。进一步研究显示JWA基因开放读框序列中含有三个膜转运区，每个区含有23个氨基酸，在三个膜转运区的两端有蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点。Northern杂交分析显示该基因有两个大小不同的mRNA转录物，经反向转录，3′-RACE-PCR,Southern杂交分析和Rnase Protection Assay等研究已确定两个转录物的确切终止位置。用携带JWA基因开放读框序列的表达载体(PCMV-2-Flag-JWA)转染S-6和HBE细胞后的免疫荧光染色结果显示JWA基因编码的蛋白酷似细胞骨架微管。该蛋白明显地受去聚合剂colchicine和nocodazole的影响但不受冷处理的影响。另外，该基因在几种肿瘤细胞中的表达明显地受去甲基化药物5-azacytidin的影响。
由于JWA基因序列在GenBank数据库中尚无同源性基因，故发明人对于JWA基因的结构和功能研究结果全部是开创性的。美国国家生物技术情报中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)已于最近正式接受JWA基因作为GenBank的新成员。该基因编号为“BankIt 200994,Accession Number:AF070523＂。GAATTCGGCACGAGCCGAGACAGAGCCGCTGTCAACTCTCCAACTCAGCTCAGCTGATCGGTTGCCGCCGCCGCCGCCGCCAGATTCTGGAGGCGAAGAACGCAAAGCTGAGAACATGGACGTTAATATCGCCCCACTCCGCGCCTGGGACGATTTCTTCCCGGGTTCCGATCGCTTTGCCCGGCCGGACTTCAGGGACATTTCCAAATGGAACAACCGCGTAGTGAGCAACCTGCTCTATTACCAGACCAACTACCTGGTGGTGGCTGCCATGATGATTTCCATTGTGGGGTTTCTGAGTCCCTTCAACATGATCCTGGGAGGAATCGTGGTGGTGCTGGTGTTCACAGGGTTTGTGTGGGCAGCCCACAATAAAGACGTCCTTCGCCGGATGAAGAAGCGCTACCCCACGACGTTCGTTATGGTGGTCATGTTGGCGAGCTATTTCCTTATCTCCATGTTTGGAGGAGTCATGGTCTTTGTGTTTGGCATTACTTTTCCTTTGCTGTTGATGTTTATCCATGCATCGTTGAGACTTCGGAACCTCAAGAACAAACTGGAGAATAAAATGGAAGGAATAGGTTTGAAGAGGACACCGATGGGCATTGTCCTGGATGCCCTAGAACAGCAGGAAGAAGGCATCAACAGACTCACTGACTATATCAGCAAAGTGAAGGAATAAACATAACTTACCTGAGCTAGGGTTGCAGCAGAAATTGAGTTGCAGCTTGCCCTTGTCCAGACCTATGTTCTGCTTGCGTTTTTGAAACAGGAGGTGCACGTACCACCCAATTATCTATGGCAGCATGCATGTATAGGCCGAACTATTATCAGCTCTGATGTTTCAGAGAGAAGACCTCAGAAACCGAAAGAAAACCACCACCCTCCTATTGTGTCTGAAGTTTCACGTGTGTTTATGAAATCTAATGGGAAATGGATCACACGATTTCTTTAAGGGAATTAAAAAAAATAAAAGAATTACGGCTTTTACAGCAACAATACGATTATCTTATAGGAAAAAAAAAAATCATTGTAAAGTATCAAGACAATACGAGTAAATGAAAAGGCTGTTAAAGTAGATGACATCATGTGTTAGCCTGTTCCTAAATCCCTAGAATTGTAATGTGTGGGATATAAATTAGTTTTTATTATTCTCTTAAAAATCAAAGATGATCTCTATCACTTTGCCACCTGTTTGATGTGCAGTGGAAACTGGTTAAGCCAGTTGTTCATACTTCCTTTACAAATATAAAGATAGCTGTTTAGGATATTTTGTTACATTTTTGTAAATTTTTGAAATGCTAGTAATGTGTTTTCACCAGCAAGTATTTGTTGCAAACTTAATGTCATTTTCCTTAAGATGGTTACAGCTATGTAACCTGTATTATTCTGGACGGACTTATTAAAATACAAACAGACAAAAAATAAAACAAAACTTGAGTTCTATTTACCTTGCACATTTTTTGTTGTTACAGTGAAAAAAATGGTCCAAGAAAATGTTTGCCATTTTTGCATTGTTTCGTTTTTAACTGGAACATTTAGAAAGAAGGAAATGAATGTGCATTTTATTAATTCCTTAGGGGCACAAGGAGGACAATAATAGCTGATCTTTTGAAATTTGAAAAACGTCTTTAGATGACCAAGCAAAAAGACTTTAAAAAATGGTAATGAAAATGGAATGCAGCTACTGCAGCTAATAAAAAATTTTAGATAGCAATTGTTACAACCATATGCCTTTATAGCTAGACATTAGAATTATGATAGCATGAGTTTATACATTCTATTATTTTTCCTCCCTTTCTCATGTTTTTATAAATAGGTAATAAAAAATGTTTTGCCTGCCAATTGAATGATTTCGTAGCTGAAGTAGAAACATTTAGGTTTCTGTAGCATTAAATTGTGAAGACAACTGGAGTGGTACTTACTGAAGAAACTCTCTGTATGTCCTAGAATAAGAAGCAATGATGTGCTGCTTCTGATTTTTCTTGCATTTTAAATTCTCAGCCAACCTACAGCCATGATCTTTAGCACAGTGATATCACCATGACTTCACAGACATGGTCTAGAATCTGTACCCTTACCCACATATGAAGAATAAAATTGATTAAAGGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG
JWA基因cDNA序列MDVNIAPLRAWDDFFPGSDRFARPDFRDISKWNNRVVSNLLYYQTNYLVV 50AAMMISIV(1)GFLSPFNMILGGIVVVLVFTGFVWAAHN(2)KDVLRRMKKRYPTT 100FVMVVMLASYFLISMFGGVMVFVFGITFPL(3)LLMFIHASLRLRNLKNKLEN 150KMEGIGLKRTPMGIVLDALEQQEEGINRLTDYISKVKE 188
JWA基因开放读框氨基酸序列序列中(1),(2),(3)为三个膜转运区，SDR和SLR为PKC磷酸化位点
本发明的目的是：鉴于JWA基因是本发明人发现的全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所做的科学研究工作。本发明人用NorthernBlot,Western Blot，基因转染和荧光免疫组织化学染色等方法研究证实，JWA基因表达一种新的细胞骨架蛋白。该基因广泛存在于所研究的多种组织和细胞，其mRNA的表达受诱导分化剂维甲酸(Retinoid acids)，氧化剂过氧化氢(H2O2)，去甲基化药物(5-Azacytidin)等的明显影响：该基因编码蛋白的表达明显地受去聚合剂秋水仙素(Colchicine)和Nocodazole的影响以及热休克处理等的影响。JWA基因地进化保守，表达活跃的特征提示该基因具有十分活跃的生物学功能。尤其是其作为一种新的细胞骨架蛋白，对细胞的增殖和分化都有非常重要的作用。进一步研究JWA基因编码蛋白在细胞内的确切定位，有助于对该基因生物学功能的了解。而基因编码蛋白特异性抗体则是研究基因结构和功能的不可缺少的重要工具。JWA基因编码蛋白多克隆和单克隆特异性抗体，可用作免疫组织化学染色，ELISA，免疫电镜，免疫沉淀等多种根据免疫学原理设计的检测方法。可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究，在各种生物样本(如血液，尿液等)中的含量变化研究以及蛋白质-蛋白质相互作用研究等。
本发明的技术方案是：JWA基因全部开放读框氨基酸序列(共188个氨基酸，见本申请所列)，特别是含有亲水氨基酸区的C末端15个氨基酸，N末端30个氨基酸，第80～100个氨基酸和第135～155个氨基酸序列。选择上述序列中的部分序列合成多肽，与KLH载体蛋白结合后，用完全和不完全佐剂混合，免疫新西兰兔(200ug/兔/次，每周激发注射一次)，制备多克隆抗体(anti-JWA IgG)；免疫Balb C鼠(100ug/鼠/次，每月激发注射一次)，分离脾脏B淋巴细胞并和骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，进一步用亚克隆方法，ELISA法和抗体分型方法筛选分泌IgG抗体的单克隆，制备单克隆抗体(anti-JWA IgG)。
本发明实施例：1．细胞骨架样基因编码蛋白特异性多克隆抗体取合成的JWA基因编码氨基酸C末端15个氨基酸多肽(序列为：DALEQQEEGINRLTD，分子量：1731)10mg，与载体蛋白KLH(Keyhole LimpetHymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，于三个月后取血分离血清。以免疫前动物血清作为对照做ELISA测定各免疫兔血清中抗体滴度。筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗原的特异性。根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍增数为1∶200～500。细胞骨架样基因编码蛋白特异性多克隆抗体用于westem blot试验：(1)．用1640培养液(含10％胎牛血清)培养CHL/SMMC7723细胞于60mm培养皿中至100％覆盖率(通常5～7天)，然后用/不用1～3mM的H2O2/10(-6)M的维甲酸/5～10ng/ml的5-Azacytin/10ng/ml的colchicine处理细胞3～24小时；(2)．用PBS洗细胞3次，吸去PBS，用100ul 2倍的SDS溶解和收集细胞，加入5％的β巯基乙醇，95℃加热10分钟，加入溴酚蓝后用14.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白(70V 30min)，然后将蛋白转移到尼龙膜上。(3)．用含5％脱脂奶粉和1/500正常羊血清的PBST先封闭尼龙膜(置摇床上30min)。然后加入1∶200的一抗(兔抗JWA IgG)，室温1小时。(4)．用PBST洗涤五次，每次五分钟。然后加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶1000)，室温1小时。(5)．用PBST洗涤五次，每次五分钟。加入ABC试剂，室温30分钟。(6)．用PBST洗涤五次，每次五分钟。用DAB显色。比较不同组细胞JWA基因编码蛋白在不同处理条件下的变化。从而分析影响JWA蛋白表达因素。2．细胞骨架样基因编码蛋白特异性单克隆抗体取合成的JWA基因编码氨基酸C末端15个氨基酸多肽(序列为：DALEQQEEGINRLTD，分子量：1731)10mg，与载体蛋白KLH(Keyhole LimpetHymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹部皮下注射)，每月激发注射一次，连续免疫四个月后取血分离血清，取脾脏分离B淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞。经多次亚克隆和用抗原(合成多肽)及IgG筛选获得分泌抗JWA合成多肽IgG的杂交瘤细胞株。用ELISA确定抗体的滴度。
细胞骨架样基因编码蛋白特异性单克隆抗体用于培养细胞的荧光免疫组织化学染色试验：(1)．用1640培养液(含10％胎牛血清)培养CHL/SMMC7723细胞于35mm培养皿中至100％覆盖率(通常5～7天)，然后用/不用1～3mm的H2O2/10(-6)M的维甲酸/5～10ng/ml的5-Azacytin/10ng/ml的colchicine处理细胞3～24小时；用甲醇固定细胞10min。(2)用PBS洗涤细胞2～3次，加入1∶500的正常羊血清封闭30min。再用PBS洗涤细胞2～3次后加入1∶1000的鼠抗JWA基因编码蛋白单克隆抗体，37℃温育1小时。(3)．用PBS洗涤细胞5次，加入1∶200的荧光素标记的羊抗鼠IgG 37℃温育1小时。(4)用PBS洗涤细胞5次，制片后用荧光显微镜观察JWA基因蛋白在细胞内的分布特征。