重组人干扰素α2b含片及其制备方法 所属技术领域 本发明涉及具有药用抗病毒、调节免疫功能的作用的干扰素，尤其涉及重组人干扰素α2b含片及其制备方法。
背景技术 干扰素有抑制病毒复制，抗细胞增殖和调节免疫应答等多种生物学效应。广泛应用于治疗和预防病毒感染性、免疫功能失调性等疾病。干扰素选自α、β、γ三大类型，最近又发现了ω和Γ两类干扰素。α干扰素可分为许多亚型，分别命名为α1、α2、α3……，其中α2又选自α2a和α2b两种亚型。干扰素α2b的序列结构特征及其重组制备方法，见《欧洲药典》(2000年版)。
从其生产制备方法上来分，干扰素可分为天然干扰素和重组干扰素。天然干扰素是通过培养人的白细胞并利用适当的刺激原(如鸡瘟病毒、仙台病毒)对其进行刺激诱导，使其产生干扰素，再利用生化方法进行纯化而得到。重组干扰素则是通过基因重组的方法，将干扰素基因整合到适当的表达系统中(如大肠杆菌)，在通过发酵或细胞培养的方法使干扰素得到大量表达，然后通过分离纯化而得到。重组人干扰素α2b就是利用此方法，将人的干扰素α2b基因整合到大肠杆菌中，通过发酵，纯化而得到高纯度、高产量的重组人干扰素α2b。重组人干扰素与天然干扰素相比，具有纯度高、产量大、成本低等优点。
现有的α干扰素研究大都采用天然干扰素，如中国专利98105384.x公开了一种复方干扰素含片及其制备方法，但采用的是天然α干扰素与白细胞介素2的混合物。中国专利申请95111433.6公开了一种人白细胞干扰素口含片及其制备方法，但采用的人白细胞干扰素，系由健康人白细胞通过仙台病毒诱导、提纯，并经特殊灭活病毒处理制成。中国专利申请98105383.1公开了一种β干扰素含片及其制备方法，但采用的是β干扰素。中国专利申请95101216.9也隐含公开了一种口服给药的重组人α干扰素组合物，但组分复杂、成本高。这些天然α干扰素含片具有抗病毒、调节免疫功能的作用，如抗流感病毒、抗SARS冠状病毒、乙肝、丙肝病毒、使用的剂量为小剂量，在10000IU以下，以100IU～500IU较多。上述文献公开的技术方案都存在着组分复杂、原料成本高等不足之处。
重组人干扰素α2b目前还有注射剂、滴眼剂、栓剂、凝胶剂、软膏剂等。常用的注射剂具有增加病人痛苦、副作用大、价格昂贵的不足。尚无重组人干扰素含片剂型的研究报道。因此，研究和开发含片剂型，探索单纯重组人干扰素含片的药用功效，充分发挥该剂型用药方便、病人耐受性好、价格低廉等优点，成为人们期盼。本发明人按照SFDA的要求，经过大量地实验研究，终于完成了本发明。
发明内容 本发明的目的在于提供一种安全有效剂量、疗效好、副作用小、便用方便的重组人干扰素α2b含片。
本发明的目的还在于提供重组人干扰素α2b含片制备方法，使得重组人干扰素α2b在制备过程中失活少，并且在进入口腔后能够缓慢释放。
为了达到以上目的，本发明提供了一种重组人干扰素α2b含片，其中包含作为有效成份的重组人干扰素α2b，以及药学上认可的辅料。所述的辅料包括填充剂、甜味剂、粘合剂、稳定剂、崩解剂。填充剂占总重量的百分比为40％～75％；甜味剂占总重量的百分比10％～40％；粘合剂占总重量的百分比6.5％～45％；稳定剂占总重量的百分比0.5％～1％；崩解剂占总重量的百分比0％～12％。
上述小剂量含片的重组人干扰素α2b含量为每片100IU～1000IU，优选400IU～750IU；上述大剂量含片的重组人干扰素α2b含量为每片10000IU～100000IU，优选40000IU～75000IU。
填充剂选自乳糖、果糖中一种或其混合物。甜味剂选自糖粉，能改变含片的味觉性能，增加含片的硬度。粘合剂选自麦芽糖糊精、微粉硅胶、羟丙甲纤维素中一种或其混合物，使含片能更好的压缩成型，延长崩解时限，确保干扰素在口腔粘膜处有充分的作用时间。稳定剂选自甘露醇、海藻糖中一种或其混合物，可提高干扰素分子生物稳定性。崩解剂选自淀粉，淀粉以淀粉浆的形式加入，它是崩解剂。硬脂酸镁为润滑剂。
本发明的制备工艺是，将填充剂、甜味剂、粘合剂按倍比稀释法进行混合，过80目筛；加95％的酒精混合制粒、干燥得混合粉；干扰素原液中加入稳定剂冷冻干燥得干扰素冻干粉；将重组人干扰素冻干粉和上述混合粉按倍比稀释法进行混合，过14目筛；加入少量润滑剂，混合均匀；压制得干扰素含片。
本发明的制备工艺还可以是先将填充剂、甜味剂、粘合剂充分混合，过筛、将淀粉制成淀粉浆加入上述混合辅料中，干扰素和稳定剂加入淀粉浆中一起加入上述混合辅料中，或干扰素加稳定剂配成溶液单独加入上述混合辅料中，然后制成湿颗粒，干燥，压片。
本发明中辅枓也可以使用其它适宜的添加剂如防腐剂和着色剂。
本发明的重组人干扰素α2b含片经一系列实验研究表明安全有效，具有抗病毒，调节免疫功能等功效。可用于治疗和预防严重急性呼吸道综合症、流感、乙肝、丙肝、病毒性心肌炎、多发性硬化症等疾病的作用。
本发明由于辅料组分选择简单、合理，且含片无污染、杂质极少、无潜在因子，因此本发明具有生物利用度高、组分简单、安全有效剂量、疗效好、副作用小、使用方便。人干扰素α2b在制备过程中失活少。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
【具体实施方式】
实施例1 低剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 100IU
乳糖 40％
糖粉 13.2％
麦芽糖糊精 41.8％
羟丙甲纤维素 3.2％
甘露醇 1％
硬脂酸镁 0.8％
b)制备工艺步骤：
(1)将乳糖、糖粉、羟丙甲纤维素、麦芽糖糊精按倍比稀释法进行混合，过80目筛；
(2)加95％的酒精混合制粒、干燥得混合粉；
(3)干扰素原液中加入甘露醇冷冻干燥得干扰素冻干粉；
(4)将重组人干扰素冻干粉和上述混合粉按倍比稀释法进行混合，过14目筛；
(5)加入少量硬脂酸镁，混合均匀；
(6)压片，得干扰素含片。
实施例2 低剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 500IU
乳糖 75％
糖粉 15％
羟丙甲纤维素 4％
麦芽糖糊精 5％
甘露醇 0.5％
硬脂酸镁 0.5％
b)制备工艺步骤：同实施例1。
实施例3 低剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 500IU
乳糖 50％
糖粉 40％
羟丙甲纤维素 4.5％
微粉硅胶 2％
甘露醇 1％
淀粉 2％
硬脂酸镁 0.5％
b)制备工艺步骤：
(1)将乳糖、糖粉、羟丙甲纤维素、微粉硅胶按倍比稀释法进行混合，过80目筛得混合粉。
(2)淀粉制成20％的淀粉浆，加入上述混合粉中。
(3)将重组人干扰素α2b制成一定浓度的溶液，加入甘露醇作稳定剂。
(4)将上述重组人干扰素α2b溶液以喷雾的方式加入上述混合粉末中。或将重组人干扰素α2b溶液加入淀粉浆中，然后将淀粉浆加入上述混合粉中。
(5)充分混合，过14目筛，制成湿颗粒。
(6)30～50℃的温度烘干3～8小时。
(7)干颗粒中再加入少量硬脂酸镁，混合均匀。
(8)压片，得干扰素含片。
实施例4 高剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 50000IU
乳糖 70％
糖粉 10％
羟丙甲纤维素 7％
淀粉 12％
海藻糖 0.5％
硬脂酸镁 0.5％
b)制备工艺步骤：
(1)将乳糖、糖粉、羟丙甲纤维素按倍比稀释法进行混合，过80目筛得混合粉。
(2)淀粉制成20％的淀粉浆，加入上述混合粉中。
(3)将重组人干扰素α2b制成一定浓度的溶液，加入海藻糖作稳定剂。
(4)将重组人干扰素α2b溶液以喷雾的方式加入上述混合粉末中。或将重组人干扰素α2b溶液加入淀粉浆中，然后将淀粉浆加入上述混合粉中。
(5)充分混合，过14目筛，制成湿颗粒。
(6)30～50℃的温度烘干3～8小时。
(7)干颗粒中再加入少量硬脂酸镁，混合均匀。
(8)压片，得干扰素含片。
实施例5 高剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 50000IU
乳糖 56％
糖粉 20％
羟丙甲纤维素 15％
微粉硅胶 5％
淀粉 3％
甘露醇 0.5％
硬脂酸镁 0.5％
b)制备工艺步骤：
同实施例3制备工艺步骤。
实施例6 高剂量重组人干扰素α2b含片(0.25g/片)制备
a)按下述重量百分比称取各组分：
重组人干扰素α2b 100000IU
乳糖 40％
糖粉 32％
麦芽糖糊精 25％
羟丙甲纤维素 2％
海藻糖 0.7％
硬脂酸镁 0.3％
b)制备工艺步骤：
(1)将乳糖、糖粉、羟丙甲纤维素、麦芽糖糊精按倍比稀释法进行混合，过80目筛；
(2)加95％的酒精混合制粒、干燥得混合粉；
(3)干扰素原液中加入海藻糖冷冻干燥得干扰素冻干粉；
(4)将重组人干扰素冻干粉和上述混合粉按倍比稀释法进行混合，过14目筛；
(5)加入少量硬脂酸镁，混合均匀；
(6)压片，得干扰素含片。
试验实施例1 重组人干扰素α2b含片急性毒性试验
实验目的：
观察重组人干扰素α2b含片一次性于口腔粘膜给药后，由于粘膜吸收所产生的毒性反应和死亡情况。
实验材料：
1、药品：重组人干扰素α2b含片，1500000万IU/片，由深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司提供。
2、动物：Wistar大鼠20只雌雄各半，体重250-300g，由吉林省药品检验所动物室提供，合格证编号10-1009。
实验方法：
1、剂量选择：重组人干扰素α2b含片临床每日拟用剂量为15000IU/人，在预试的基础上，选高于临床剂量100倍量。
2、分组、给药及观察：上述大鼠均分为赋形剂组和重组人干扰素α2b含片组。用纱布条将药片包好缝紧，吊系在口腔中，1片/只，1次给药，即刻观察动物状态、毛发、食欲、四肢活动、精神状态、死亡情况及体重变化，连续14日。
实验结果：
1、给药7日之内，赋形剂组及重组人干扰素α2b含片组动物毛发、食欲、四肢活动、精神状态均无异常，无一死亡，体重亦无明显差别，见下表。
表 重组人干扰素α2b含片及赋形剂组急毒试验体重变化(x±s，n＝10) 组别 给药前(g) 给药后7天(g) 给药后14天(g) 赋形剂组 270.2±13.78 290.0±14.96 310.2±14.19 α2b含片组 271.7±14.45 292.0±14.95 311.3±15.93
2、重组人干扰素α2b含片临床拟用量为每日150000IU/人，若人体重按60kg计算，即2500IU/kg；而急毒试验证明，给药量1500000IU/只，未出现毒性反应，若大鼠体重按0.27kg计算，即5600000IU/kg相当于临床剂量的22000倍，所以临床用药非常安全。
试验实施例2 药效学临床测试
实验目的：检测重组人干扰素α2b含片用于健康人群各项免疫学指标的动态变化，评价药效。
实验药品：重组人干扰素α2b含片，500IU/片，由深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司提供。
实验方法：
1、人员选择：年龄18-55岁的经查体确证的健康人。共选20人，其中男11人，女9人。年龄18-30岁13例，年龄30-40岁5例，年龄40-55岁2例。其中干部3人，工人8人，学生4人，护士4人，司机1人。
2、口服方法：每日口含二次，每次一片，每片500IU/片。
3、测定指标：NK细胞数、CD4及IgG(g/L)
4、测定方法：服药前5天中第1、3、5天各采血1次做指标测定；服药后每5天采血1次，共计采血10次，于第7、8、9、10次进行统计数测定。分析方法采用《医学统计学及其软件包》(何清波编，上海科学技术文献出版社2002年版)中介绍的SAS6.12版统计软件。
实验结果：统计取20人的平均值做服药前后对比分析。
表1、2为IgG(g/L)的测定及对比统计分析。
表3、4为CD4的测定及对比统计分析。
表5、6为NK细胞数的测定及对比统计分析。
结论：经过对重组人干扰素α2b含片用于健康人群各项免疫学指标测定和统计学分析，有显著性差异，表示服重组人干扰素α2b含片后提高了机体免疫力。
表1 IgG(g/L)的测定次数服药前12 3 4 5 6 7 8 9 10均数10.211510.631310.7625 10.6750 10.7000 10.7500 10.9563 10.9550 10.9813 11.0563 11.0438
表2 对比统计分析第7次与服药前对比第8次与服药前对比 第9次与服药前对比第10次与服药前对比变量1变量2变量1 变量2 变量1 变量2变量1变量2平均10.2114610.95510.21146 10.98125 10.21146 11.0562510.2114611.04375方差0.2331380.79160.233138 0.673625 0.233138 0.7119580.2331380.758625观测值161616 16 16 161616合并方差0.5123690.453381 0.4725480.495881假设平均差00 00df3030 3030t Stat-2.93805-3.2336 -3.47593-3.34296P(T＜＝t)单0.0031470.001485 0.0007870.001117t 单尾临界1.697261.69726 1.697261.69726P(T＜＝t)双0.0062950.002969 0.0015740.002234t 双尾临界2.042272.04227 2.042272.04227
表3 CD4的测定次数服药前12345678910均数32.26031.78630.44832.19132.77332.89534.59133.70134.60235.38435.634
表4 对比统计分析第7次与服药前对比第8次与服药前对比第9次与服药前对比第10次与服药前对比变量1变量2变量1变量2变量1变量2变量1变量2平均32.2602133.7006332.2602134.6018832.2602135.3843832.2602135.63438方差9.90980225.012179.90980225.071089.90980224.548079.90980226.36631观测值1616161616161616合并方差17.4609817.4904417.2289318.13805假设平均差0000df30303030t Stat-0.97499-1.58369-2012887-2.24087P(T＜＝t)单0.1686820.0618760.0207950.016295t 单尾临界1.697261.697261.697261.69726P(T＜＝t)双0.3373630.1237510.0415890.03259t 双尾临界2.042272.0442272.042272.04227
表5 NK细胞数测定次数服药前12345678910均数15.75116.8516.0717.2917.5618.0819.1219.52521.27421.9168822.72
表6 对比统计分析第7次与服药前对比第8次与服药前对比第9次与服药前对比第10次与服药前对比变量1变量2变量1变量2变量1变量2变量1变量2平均15.7506319.52515.75062521.2737515.7506321.9168815.7506322.72方差37.5826671.8184737.58266471.8074837.5826675.8602137.5826678.87388观测值1616161616161616合并方差54.7005754.69507156.7214458.22827假设平均差0000df30303030t Stat-1.44342-2.112301-2.31575-2.58328P(T＜＝t)单0.0796310.02154720.0137960.007452t 单尾临界1.697261.69726041.697261.69726P(T＜＝t)双0.1592630.04309440.0275910.014905t 双尾临界2.042272.04227042.0442272.04227