治疗幽门螺杆菌感染的方法 本发明涉及治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染的方法，用于这类方法的药物制剂，能维持幽门螺杆菌球形培养物存活的方法，以及使球形转变为螺旋形的方法。
幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，它与慢性活性胃炎和消化性溃疡病密切相关(Marshall等，Medical Journal of Australia，142：439-444(1985)；Buck，G.E.，Journal of Clinical Microbiology，3：1-12(1990))。在体外培养时，幽门螺杆菌以两种不同的形态存在，即可培养的螺旋形和不能培养的球形(Marshall等，Microbios letters，25：83-88(1984)；Kung，J.S.L.，和HO，B.，Workshop on Gastroduodenal Pathology andCampylobacter pylori(abstract P9)，编辑F.Megraud和H.Lamouliatte，Bordeaux，France(1988))。该细菌的螺旋形在与空气接触约2小时后不能存活。在不利条件下，螺旋形分化成球形(Vijayakumari和Ho，ActaGastro-enterologica Belgica，56：101(1993))。
迄今为止，只有一个成功地在体外将球形转变为螺旋形的报道，业已证实该实验不能重复(Mai等人，Gastroduodenal Pathology andCam pylobacter pylori，PP28-33，编者F.Megraud和H.Lamouliatte，Elsevier Science Publishers(1989))。虽然体外形成球形可通过抗生素或脱除营养物而实现(Nilius等人，Zbl.Bakt.280：259-272(1993))，但下列因素妨碍了对该球形的研究：缺乏有关该形式的信息，它在幽门螺杆菌生命周期中的作用，以及缺乏任何获取该形式的培养物的方法。迄今一直认为幽门螺杆菌的球形实际上是“死的”、非存活的形式，它在该细菌生命周期中的作用尚不清楚。
现已发现该球形是有活性的且能被诱导转变为螺旋形。一种可能的方法是施用脲酶而实现该转变。WO 95/22987公开了应用基于脲酶的疫苗治疗幽门螺杆菌感染。但未公开基于脲酶使球形转变为螺旋形的通用“化学”非免疫方法。由于该细菌的螺旋形可用抗生素处理，这些结果说明有可能更有效地治疗幽门螺杆菌感染，所以再发生幽门螺杆菌介导的胃病的几率将大为减小。
因此，本发明的第一方面提供了治疗哺乳动物幽门螺杆菌感染地方法，它包括给哺乳动物施用一种能诱使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的转变剂。
该转变剂优选不是呈疫苗的形式，即不是施用它来激发任何免疫反应的。
一般说来，施用该转变剂将构成涉及施用一种或多种抗生素的治疗方案的一部分。所以，在本发明该方面的一个实施方案中，本方法进一步包括给哺乳动物施用有效量的至少一种抗生素的步骤。
在施用该转变剂之后施用一种或多种抗生素较为合适。这样，可在施用抗生素之前使球形转变为螺旋形。
当然，已知抗生素能诱使螺旋形逆变为球形。因此，通常的情况是，需要施用数次转变剂/抗生素循环以保证有效地根除幽门螺杆菌。于是，本发明的第二个方面提供了治疗哺乳动物幽门螺杆菌感染的方法，该方法包括至少两次治疗循环，每次治疗循环包括：
(i)给哺乳动物施用一种能诱使幽门螺杆菌从球形转变成螺旋形的转变剂；
(ii)给哺乳动物施用有效量的至少一种抗生素。
每次治疗循环之后，余留的幽门螺杆菌数量将越来越少。治疗终点可应用可商购的幽门螺杆菌诊断检验来测定。
在本发明这些方面优选的实施方案中，施用的转变剂是足以使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的一定量脲酶。在本发明的上下文中，脲酶包括所有形式的脲酶，可以是细菌的(例如幽门螺杆菌或奇异变形菌(Protieus mirabitis)脲酶)或是非细菌的(例如刀豆脲酶)，以及脲酶的一种或多种单独的亚单位，或者就是得自这类亚单位的肽。在一个实施方案中，只施用脲酶的C亚单位和D亚单位。
如果施用的转变剂是脲酶，则本方法还可包括给哺乳动物施用尿素。尿素可以一起施用或者单独施用。
给定了幽门螺杆菌有机体生命周期的性质，就可见防止螺旋形向球形转变的方法也能有效地提高正常幽门螺杆菌治疗方案的效果。因此，本发明的第三个方面提供了治疗哺乳动物幽门螺杆菌感染的方法，该方法包括给哺乳动物施用一种能防止幽门螺杆菌从螺旋形转变为球形的阻止剂。
在本发明该方面的一个实施方案中，该阻止剂也是脲酶，任选与尿素一起施用。
治疗幽门螺杆菌感染的另一个可能的方法是通过使该有机体在螺旋形和球形之间转变而“耗尽”该有机体。于是，本发明的第四个方面提供了治疗哺乳动物幽门螺杆菌感染的方法，该方法包括一次或多次治疗循环，每次治疗循环包括：
(i)给哺乳动物施用一种能诱使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的转变剂；和
(ii)给哺乳动物施用一种能诱使幽门螺杆菌从螺旋形转变为球形的转变剂。
在本发明该方面的一个实施方案中，能诱使向螺旋形转变的转变剂是脲酶，而能诱使向球形转变的转变剂是“抗脲酶”，例如脲酶的抑制剂或特异性抗体。
本发明的第五个方面提供了治疗哺乳动物幽门螺杆菌感染的方法，该方法包括给哺乳动物施用能改变胃中pH的试剂。在该实施方案中，降低pH可使存在的螺旋形幽门螺杆菌提高脲酶产量。脲酶含量的增高能使存在的任何球形转变为螺旋形，于是使抗生素处理更为有效。因此，本方法通常还包括给哺乳动物施用至少一种抗生素的步骤。改变pH的方法可包括服用可食用的酸或碱。
在本文所述的本发明的所有方法中，哺乳动物优选是人。
本发明的方法一般应用呈药物制剂形式的转变剂。因此，本发明的第六个方面提供了一种药物制剂，它包括一种能诱使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的转变剂以及一种或多种药物上可接受的载体和/或赋形剂。该药物制剂也优选不是呈疫苗的形式。
在本发明该方面的一个实施方案中，该转变剂是脲酶，而且该药物制剂也任选包括尿素。
本发明的药物制剂可呈含有预定量转变剂的单位剂量形式，例如每个剂量中含脲酶(和任选含尿素)。这样的一个单位包含例如足够的脲酶以便在37℃下30min内转变3mg尿素，这取决于病人的年龄、体重和病况。
本发明的药物制剂应适于口服，并且可呈不同的单位形式，例如胶囊或片剂；粉剂或粒剂；在水成液或非水液体中的溶液或悬浮液；可食用的泡沫体；或水包油型液体乳液或油包水型液体乳液，或任何惯常的或非惯常的药物形式。
如果脲酶和尿素一起施用，则适当的施用形式应防止这两种组分混合。
本发明的第七个方面提供了一种能使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的转变剂在制备用于治疗幽门螺杆菌感染的药剂中的应用。在该方面的一个实施方案中，该转变剂也是脲酶，且该药剂也任选包括尿素。该药剂也优选不是疫苗。
本文所述结果还可应用于体外。因此，本发明的其它方面提供了：
(a)将培养物中幽门螺杆菌从球形转变成螺旋形的方法，它包括向球形培养物中添加能诱使幽门螺杆菌从球形转变为螺旋形的转变剂；和
(b)将培养物中幽门螺杆菌从螺旋形转变成球形的方法，它包括向螺旋形培养物中添加能诱使幽门螺杆菌从螺旋形转变为球形的转变剂。
至于(a)，转变剂可呈生长有螺旋形但已从中除去了螺旋形的培养基的形式。螺旋形在培养基中优选至少生长了3天。另外，该转变剂是脲酶，任选和尿素一起。
至于(b)，优选的转变剂是“抗脲酶”，例如脲酶抑制剂或脲酶的特异性抗体。
因此，体外转变方法为生产球形和螺旋形两种待生产的抗原来源创造了条件。它们将特别适用于生产特异性抗原，该抗原用于该细菌的两种形式的诊断检验中。
本发明的各方面的优选特征在于，各方面相互之间已作必要的修正。
现在将参照下述实施例阐述本发明，不能认为下述实施例以任何方式限定本发明。
实施例1
a)细菌菌株和球形幽门螺杆菌的制备
应用从患有非溃疡性消化不良病人分离的局部幽门螺杆菌菌株V2，不过也可同样应用其它野生型株。最初在巧克力血液琼脂(CBA)上生长该菌株以检查纯度。然后将该平板培养物用作种菌接种含有30mlBHIH(添加有10％马血清和0.4％酵母提取物的脑心浸渍物)的250mlSchott平底圆瓶，在37℃下培养72h。该培养物反过来又作为恒化器或分批培养物的种菌。
如Ho和Vijayakumari(Microbios，76：59-66(1993))所述那样装配含有540ml BHIH的1.5L发酵罐。用培养3天的2×30ml幽门螺杆菌培养物接种该培养基，给定1∶10(种菌：培养基)的比率。每天供应两次二氧化碳，并将搅拌机调节至35rpm。以一定时间间隔取样，检查脲酶活性，pH，生存力，和显微镜检查形态变化。
在这些条件下保持该培养物达3个月，其间继续每天监控这些细胞。当观察到均匀/同步培养物时，在10,000g下离心40min收获细胞并洗涤一次。然后采用改进的甘氨酸法(Ho，B.，和Jiang，B.，EuropeanJournal of Gastroenterology and Hepatology，7：121-124(1995))将沉淀物用来制备球形抗原。
也可应用1L Schott圆底瓶或具有密封橡皮塞、带侧臂的1L锥形瓶，瓶中盛有270ml BHIH。钻一个直径为7mm的孔以便能安装一次性的过滤装置，该过滤装置包括直径为50mm的0.22μm滤器(例如Gelman)。每个270ml BHIH用30ml培养3天的幽门螺杆菌培养物接种。通过该0.22μm滤器每天供给两次二氧化碳。
在37℃的振荡培养箱(New Brunswick)中在90rpm下培养该培养物达9周，接着在10,000g下离心40min来收获细胞。
将所得球形菌在-80℃的甘油-BHIH中贮存2年。需要时，在10,000xg下离心30min收集球形菌，并用PBS(pH7.2)洗涤一次。
诱导培养液(IB)的制备
将培养3天的幽门螺杆菌螺旋形菌接种入上述1.5L发酵罐或1LSchott旋塞瓶或1L锥形瓶中的BHIH。3天后，在10,000xg下离心10min收集上清液。用0.2μm膜滤器将废培养基过滤两次。后面称该滤液为诱导培养液(IB)。将两个滤器转到CBA板上并在37℃潮湿的二氧化碳培养箱中培养1周。
将球形菌诱导成螺旋形
将球形幽门螺杆菌接种入30ml上清液(IB)并在37℃下5％的二氧化碳培养箱中培养至最终浓度为每ml 108个球形菌。将相似量的球形菌接种入30ml新鲜的BHIH作为对照。随后，随时间(24hr)往球形培养物中加入新鲜的BHIH。
透射电子显微术
在24、48、72和96小时的时间间隔，通过离心作用收获各培养物的等分样并在PBS中洗涤两次。将细胞重悬于PBS中并用负染色法处理，用于透射电子显微术。
也可将细胞固定于2％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH7.0)中达2-3小时或者在4℃下放置一夜，然后用0.1M二甲胂酸盐缓冲液洗涤两遍。将细胞重悬于蒸馏水中，再用上述负染色法处理。
将数滴细胞悬浮液放在涂覆碳的400目铜网上达1分钟。吸干多余的液体，将铜网风干使之固定。再用1滴1％的磷钨酸把铜网染色1分钟，然后吸干过剩的染液。风干后，将铜网用Philips CM120透射电子显微镜检查。
用抗生素处理
在BHIH中进一步用5μg/ml阿莫西林处理球形菌以保证任何存在的螺旋形被诱导成球形，或者被杀死。处理之后，将球形菌悬浮液洗涤2次，重悬于初始体积的BHIH中。将1ml悬浮液等分样接种入新鲜的BHIH并接着培养。
将尿素加入IB和BHIH
以5mM的浓度往IB或BHIH中的球形菌内加入尿素。以一定的时间间隔取样供显微镜检查，并在CBA上和BHIH中传代培养。
结果
在单独的BHIH或CBA的传代培养中未生长球形制剂。类似地，用于过滤幽门螺杆菌培养物的第二滤器在单独的CBA上或BHIH内都不表现出任何生长。3天或以上的IB对于脲酶在30min内的试验呈阳性。
在相差显微术中显现出稠密的球形菌。复染法要过30min才生效。在IB中诱导24h后，球形菌变得松散，并开始挤出新生螺旋细胞。可看到一些新生的螺旋形连在“母体”球形壳上。诱导48h时，这种“出生”过程变得更为明显。在BHIH诱导下，新螺旋形菌变成成熟的细胞并能活动。在2×BHIH中，螺旋形菌活动性更强。将尿素加入IB和BHIH时，生长作用更为明显，螺旋形早在24h时就出现了。
从再生的球形菌产生的螺旋形菌完全能存活和具有机能。发现它们能轻易地同KATO III细胞连接。该过程类似于正常螺旋形对KATO III细胞的病原性侵袭。
讨论
这些结果表明，可以将幽门螺杆菌由球形诱导转变为螺旋形。IB中的某因子(“诱导物”)也就必定影响该转变过程。此外，发现未加尿素时螺旋形菌只是部分地转变/生长。
“诱导物”引发较厚的球形多糖层内新生长出螺旋形。所以，营养物/诱导物显然可通过该覆盖层。以前得到的资料表明，在球形内脲酶亚单位C和D缺乏或存在量较低。上述资料表明IB中存在脲酶。因此，可总结得知脲酶的亚单位C和D其实就是“诱导物”。
引入新鲜的BHIH培养基提供了必要的营养物以保证充分转变(否则IB会缺失或者甚至耗尽)。提供尿素的生理含量证实尿素在该有机体的代谢过程中起关键性作用。
将这些发现外推到活体内的情形中，认为该生物体在胃上移生后，在粪便中分泌的螺旋形菌转变为球形以保证来自体内存活。当再引入口腔时，它们在龈下蚀斑微需氧条件下保留在那里。存在产生脲酶的其它细菌或者确有其它来源时，就能诱导转变为螺旋形菌。一旦这样转变时，细菌就移生在口中，并从口腔沿消化道向下迁移而移生在胃中。
因此，通过惯常的抗生素消灭螺旋形菌显然还不够。只要使存在的球形菌转变为螺旋形菌就可使胃病复发。所以关键是要根除螺旋形菌和球形菌二者以防止这种复发。为此，就必须使存在的任何球形菌转变为螺旋形，这样抗生素处理就可根除所有的幽门螺杆菌感染。
诱导转变为螺旋形可以这样来实现，即添加脲酶、任选和作为另外成分的尿素一起添加。