一组抗冠状病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其应用 【技术领域】
本发明涉及一组抗冠状病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其应用。
背景技术
近年的研究结果证实短的双链RNA在多种哺乳动物细胞中具有干扰RNA功能，可以特异抑制特定基因在细胞内的表达。通过该途径也可抑制病毒基因在细胞内的表达，从而用于病毒感染的预防与治疗。
冠状病毒为正链RNA病毒，具有较大的变异性。目前所分离的不同来源的病毒基因组间的相似性小于30％。在流行期间的变异会导致药物治疗和基因治疗失效。
本发明通过同源比较，获得一系列在多种冠状病毒间保守的RNA序列。使用该序列衍生的双链RNA序列可以有效抑制冠状病毒基因的表达。使用质粒转录的该序列也可在细胞内抑制相应基因地表达。因此也可能用于制备抗SARS感染和非典型肺炎的治疗的药物。
【发明内容】
本发明的目的是提供一组抗冠状病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供上述核苷酸序列的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一组抗冠状病毒感染及防治非典型肺炎的RNA序列及其片段，该组RNA序列如下：
(1)ugggauuauccaaaauguga
(2)uguuuuggaauuguaacguugau
(3)uaacucaaaugaaucuuaaguaugc
(4)uauuaucaaaauaauguguu
(5)uuuaacauuugucaagcuguu
(6)uauauuaaauggccuugguauguuuggcu
(7)ggccacgcggaguacgaucgaggguacag
一组由所述的RNA序列及其片段和与之互补的序列杂交形成的双链RNA序列。
一组由所述的RNA序列及其片断在其5’端或3’端加核苷酸修饰的序列。
一组所述的RNA序列及其片段和与之反向互补的序列加上中间非互补连接序列形成的发夹样RNA双链。
一组所述序列对应的DNA序列。
包含所述的RNA序列的表达载体。
包含所述的DNA序列的表达载体。
包裹所述的RNA序列的脂质体。
包裹所述的DNA序列的脂质体。
包裹所述的表达载体的脂质体。
将所述的RNA序列在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的DNA序列在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的表达载体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
将所述的脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物及人体的方法。
所述的RNA序列及其片段用于制备抗冠状病毒感染及非典型肺炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的DNA序列及其片段用于制备抗冠状病毒感染及非典型肺炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的表达载体用于制备抗冠状病毒感染及非典型肺炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的脂质体用于制备抗冠状病毒感染及非典型肺炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
所述的方法用于制备抗冠状病毒感染及非典型肺炎诊断、治疗和预防的药物的应用。
本发明的优点是：通过同源比较，获得一系列与所有已经发表的冠状病毒序列高度同源的RNA序列片段，使用该系列片段衍生的双链RNA序列可以有效地抑制冠状病毒基因的表达；使用质粒转录的该系列RNA也可在细胞内抑制冠状病毒基因的表达；携带该片段对应DNA腺病毒伴随病毒感染细胞后可以转录出对应的双链RNA并抑制冠状病毒基因的表达。
【附图说明】
图1为不同中间冠状病毒的保守性分析图
图2为报告质粒pSPIKE的构建图
图3为双链干扰RNA抑制冠状病毒Spike基因的表达图
图4为双链RNA抑制冠状病毒核衣壳蛋白Flag-Nuc蛋白的表达图
图5为AAV表达的双链RNA可以抑制病毒的增殖图
【具体实施方式】
实施例中采用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。
实施例1不同来源冠状病毒的同源序列：
将SARS全序列输入Blast软件，与GeneBank库中所有已知冠状病毒基因进行同源比较，发现如图1所示的同源区，其同源序列如下。
表1.通过同源比较发现的冠状病毒序列中极度保守的RNA序列 编号 RNA序列 1 ugggauuauccaaaauguga 2 uguuuuggaauuguaacguugau 3 uaacucaaaugaaucuuaaguaugc 4 uauuaucaaaauaauguguu 5 uuuaacauuugucaagcuguu 6 uauauuaaauggccuugguauguuuggcu 7 ggccacgcggaguacgaucgaggguacag
实施例2使用合成RNA双链，降低SARS膜蛋白基因(SPIKE基因)的表达
根据权利要求1中序列6，选取长19核苷酸的RNA片段，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，并在RNA链的3’端用UU修饰，退火后的RNA双链如下：
5’uggccuugguauguuuggcuu 3’
3’uuaccggaaccauacaaaccg 5’
质粒pCMV-Myc(Clontech公司)用EcoRI(10单位)和BglII(10单位)，37℃酶切2小时，回收片断用作载体；合成SARS冠状病毒膜蛋白基因的引物
PS1：cggaattcattttattttcttattatttcttactctcactagtggta；
PS2 cgggatccttatgtgtaatgtaatttgacacc cttca。以SARS cDNA(1ng)为模板，上述引物各100ng，Pfu高保真DNA聚合酶2.5单位，dNTP 0.25mmol/L，MgCl22.5mmol/L，Tris.HCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃ 30秒，46℃ 30秒，72℃ 90秒，使用PekinElmer 9600型PCR仪，共30循环)。PCR产物用QIAGEN纯化试剂盒(QIAgen 28704)，然后用EcoRI和BamHI酶切(条件同前)，和上述载体一起进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌JM109(Promega公司)，获得完全正确的质粒pSPIKE，该质粒转染细胞后可表达带Myc标签的冠状病毒S基因(图2)。
上述质粒2μg与上述合成的RNA2μg(或2μg例3种使用的与Spike基因无关的双链RNA链为对照)一起共转染HEK293细胞(ATCC，转染方法使用InvitrogenLipofectamine 2000，见其说明书)，36小时后裂解细胞，通过抗Myc抗体进行免疫印迹(方法见分子克隆第三版)，比较蛋白的表达产量。
结果如图3所示，与对照比较，冠状病毒Spike基因的表达产量降低了80-90％。由于该蛋白含有病毒进入细胞的识别序列，因此抑制该基因的表达可以阻止病毒的繁殖。
实施例3：使用合成RNA双链抑制衣壳蛋白基因的表达
根据权利要求1中序列7，选取长19核苷酸的RNA片段，并根据互补配对的原则合成其互补链，并在RNA链的3’端用UU修饰，退火后的RNA双链如下：
5’gaguacgaucgaggguacauu 3’
3’uucucaugcuagcucccaugu 5’
质粒pCMV-cMyc(Clontech公司)用EcoRI(10单位)和BglII(10单位)，37℃酶切2小时，回收片断用作载体；合成SARS冠状病毒核衣壳蛋白基因(N基因)的
引物PN1：cggaattccatatgtctgataatggaccccaatcaaa；
PN2：cggaattcggatccttatgcctgagttgaatcagcagaagc。以SARS cDNA(1ng)为模板，上述引物各100ng，按如实施例2所述条件进行PCR扩增并克隆至上述载体，获得正确的质粒pNUC，该质粒染细胞后可表达带Myc标签的核衣壳蛋白。
上述质粒(pNUC)2μg与上述合成的RNA 2μg(或2μg实施例2中使用的与N蛋白无关的双链RNA为对照)一起，如实施例2共转染HEK293细胞，36小时后裂解细胞，通过抗Myc抗体进行免疫印迹(方法见分子克隆第三版)，比较蛋白的表达产量。
结果如图4所示，与对照比较，冠状病毒N基因的表达产量降低了80-90％。由于该蛋白为病毒的外壳蛋白，失去该蛋白的病毒不能扩增，因此可以有效阻止病毒扩增。
实施例4使用合成RNA双链抑制其他冠状病毒基因的表达
按照实施例2所述的方法，使用合成1，3，4，5所对应的RNA双链，和表达RNA依赖的RNA聚合酶的报告质粒一起转染HEK293细胞后，可有效抑制RNA聚合酶基因的表达。其抑制效率见表2。
表2新型双链核糖核酸抑制冠状病毒RNA聚合酶基因表达的效率编号双链RNA 冠状病毒把基因 抑制效率15′gggauuauccaaaaugugauu 3′3′uucccuaauagguuuuacacu 5′ RNA聚合酶 ++++35′ucaaaugaaucuuaaguauguu 3′3′uuaguuuacuuagaauucauac RNA聚合酶 ++++45′auuaucaaaauaauguguuuu 3′3′uuuaauaguuuuauuacacaa 5′ RNA聚合酶 ++55′uuaacauuugucaagcuguuu 3′3′uuaauuguaaacaguucgaca 5′ RNA聚合酶 +++
注：++抑制效率25-50％；+++抑制效率50-75％；++++抑制效率)75％
实施例5.真核载体表达的RNA双链抑制冠状病毒基因的表达
合成实施例1中保守序列6对应的DNA序列及其互补序列(黑斜体)的DNA片断，两端含有BamHI和HindIII的粘末端，中间含有9核苷酸的间隔序列。合成序列如下：退火后形成双链DNA片断。
A：5’gatcccctggccttggtatgtttggcttcaagagagccaaacataccaaggccatttttggaaa；
B：5’agcttttccaaaaatggccttggtatgtttggctctcttgaagccaaacataccaaggccaggg
片断A、B退火后形成双链DNA片断。按文献所述方法(BrummelkampTR et al，Science，296：550.2002)克隆至表达载体pSUPER，获得质粒pSUPER-S。
质粒pSUPER-S与质粒pSPIKE(见实施例2)一起转染HEK293细胞(以质粒pSUPER为阴性对照，转染方法见实施例2)，转染后36小时裂解细胞，用抗Myc抗体进行免疫印迹，如图3所示，结果表明SPIKE蛋白的表达量显著降低。
实施例6.使用腺病毒伴随病毒载体表达得RNAi可以抑制病毒复制。
将例5质粒pSUPER-S用EcoRI+HindIII酶切(酶切条件如前述)，克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS(Stratagen公司)的EcoRI和HindIII位点(连接方法见图2)。构建质粒pAAV-Si，将该质粒(4μg)与辅助质粒pHelper 1μg(Stratagen公司)和质粒pAAV-RC 2μg(Stragagen公司)一起用Lipofectamine法共转染HEK293FT细胞，48小时后取上清制备重组AAV病毒；Vero细胞用DMEM培养基(Invitrogen公司，含10％胎牛血清)培养至50％密度，用上述108重组腺相关病毒感染Vero细胞(以pAAV-MCS为对照)，同时用SARS病毒感染，24小时吸去上清，细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，并转移(BioRad公司半干转移电泳)至硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭后，加10ml 1∶50稀释的恢复期SARS病人血清，孵育1小时后用PBST(pH7.4)洗三次，加抗人IgG-HRP，孵育1小时后用，PBST洗涤如上。如实施例2进行显色。结果冠状病毒SPIKE蛋白有显著着色。在使用表达双链RNA(RNAi)的重组AAV感染后，细胞内SPIKE抗原显著降低(如图5所示)，说明细胞内冠状病毒数量大大降低。
序列表
<110>北京三诺佳邑生物技术有限责任公司
<120>一组抗冠状病毒感染及防治非典型肺炎的核苷酸序列及其应用
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>1
ugggauuauc caaaauguga 20
<210>2
<211>23
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>2
uguuuuggaa uuguaacguu gau 23
<210>3
<211>25
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>3
uaacucaaau gaaucuuaag uaugc 25
<210>4
<211>20
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>4
uauuaucaaa auaauguguu 20
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>5
uuuaacauuu gucaagcugu u 21
<210>6
<211>29
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>6
uauauuaaau ggccuuggua uguuuggcu 29
<210>7
<211>29
<212>RNA
<213>冠状病毒属(coronavirus genera)
<400>7
ggccacgcgg aguacgaucg aggguacag 29