抗除草剂植物 本发明涉及重组DNA技术，尤其涉及当与未转基因的同样的植物相比较时显示出对除草剂具有基本的抗性或基本的耐受性的转基因植物的生产。本发明还涉及用于该转基因植物的生产或由该转基因植物产生的核苷酸序列(和其表达产物)。
在经受除草剂时，对除草剂具有基本“耐受性”的植物提供了一个当与同样经受除草剂地非耐受性的相同的植物相比较时右移的剂量/响应曲线。这样的剂量/响应曲线具有标示着“剂量”的x轴和标示着“致死百分率”、“除草效应”等等的y轴。为了产生指定的除草效应，耐受性植物通常需要至少两倍于非耐受性的相同植物的除草剂。当经受为了杀死种植了用于商业目的农作物的农田中的杂草而通常为农业界采用的浓度和使用率的除草剂时，对除草剂具有基本抗性的植物显示出很少的(如果有的话)坏死、裂解、萎黄病或别的病害。
特别优选的是，植物对于将5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(在下文中为“EPSPS”)作为它们的作用位点的除草剂(在下文中为“草甘膦”)具有基本的抗性或基本的耐受性，除草剂中N-膦酰基甲基甘氨酸(和其多种盐)是优秀的例子。
除草剂可以根据通常的有关除草剂施用的技术在种子发芽前或后施用于含有已经变得对除草剂具有抗性的农作物的农田中。本发明特别提供了用于这样的耐受或抗除草剂的植物的生产中的核苷酸序列。
根据本发明可以提供一种抗草甘膦的EPSPS酶，其中和野生型EPSPS相比较，该蛋白质序列经过下述的修饰：第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSL，其中该酶不含有序列K(A/V)AKRAVVVGCGGKFPVE，其特征在于该酶是稳定的，并拥有下列序列基元(i)至(viii)中的至少一种，下列序列基元中的X为任意氨基酸，Z、Z1和Z2为除了指定的那些氨基酸之外的任意氨基酸：
(i)ALLMZAPLA，其中Z不是S或T；
(ii)EIEIZDKL，其中Z不是V；
(iii)FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V；
(iv)AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R；
(v)GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不是E；
(vi)ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T；
(vii)TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L；
(viii)(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R。
一个优选的该酶的实施方案包含基元(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)中的至少两种。于特定的本发明的酶的实施方案之中，基元(i)中Z为A；基元(ii)中Z为I；基元(iii)中Z为A；基元(iv)中Z为K、T或A；基元(v)中Z1为R或A或者次优选地为D或E，Z2优选地为V或A或者次优选地为T；序列基元(vi)中Z1为E或A，Z2为P、I或V；基元(vii)中Z为R或K；以及基元(viii)中Z为T或S或者次优选地为Q。特别优选的该酶的实施方案含有一种或多种选自下列的序列：
(i)(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)；
(ii)(I/V)VVGC GG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；
(iii)(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)；
(iv)(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)；
(v)(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E；
(vi)(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；
(vii)(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G)。
本发明也包含了含有编码本发明的酶的区域的分离多核苷酸，尤其这样的多核苷酸含有例如SEQ ID No.4或5中描述的序列，或者含有通过将位于SEQ ID No.4或5序列中的内含子与植物基因组文库中含有的多核苷酸杂交所得的序列。本发明也包括含有编码叶绿体转运肽和位于该肽3端的双子叶植物的(dicotyledenous)抗草甘膦的5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)的区域的分离多核苷酸，该区域位于植物可操作启动子的表达控制之下，但以该启动子相对于该区域不是异源的和叶绿体转运肽相对于该合成酶不是异源的为条件。
“异源的”表示来自不同的来源，相应地“非异源的”表示出自相同的来源——但是在基因水平上而不在有机体或组织水平上。例如CaMV 35S启动子相对于矮牵牛花EPSPS编码序列明显地是异源的，因为启动子来源于病毒而它所控制表达的序列来源于植物。可是根据本发明，术语“异源的”有着更狭窄的含义。例如，当其涉及本发明时，“异源的”表示矮牵牛花EPSPS编码序列相对于如也来源于矮牵牛花的启动子(不是控制EPSPS基因表达的启动子)是“异源的”。在这一意义上来说，来源于矮牵牛花EPSPS基因并用于控制同样来源于矮牵牛花的EPSPS编码序列表达的矮牵牛花启动子相对于该编码序列是“非异源的”。可是，“非异源的”并不意味着启动子和编码序列必须一定从同一种和同样的(原始的或祖先)多核苷酸中获得。同样地，关于转运肽也一样。例如，来源于向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶叶绿体转运肽相对于同样来源于向日葵(同样的植物、组织或细胞)的EPSPS基因编码序列是“异源的”。来源于向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶转运肽编码序列相对于也来源于向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶编码序列是“非异源的”，即使两者序列的来源为可能存在于不同的细胞、组织或向日葵植株中的不同的多核苷酸。
该多核苷酸最特别优选的形式包含了在转录本的5至3方向上含有下列组分的构建体：或者(1)：
(i)至少一个转录增强子，其为增强区域，位于从中获得增强子的序列的转录起始点的上游，而且增强子本身在内源性地含有它的序列中或当它作为构建体的一部分而异源地存在时不能发挥启动子的作用；
(ii)来自大豆EPSPS基因的启动子；
(iii)编码大豆EPSPS叶绿体转运肽的大豆基因组序列；
(iv)编码大豆EPSPS的基因组序列；
(v)转录终止子；
其中大豆EPSPS编码序列和野生型序列相比较经过下述的修饰：第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSLTAAV；或者(2)：
(i)至少一个转录增强子，其为增强区域，位于从中获得增强子的序列的转录起始点的上游，而且增强子本身在内源性地含有它的序列中或当它作为构建体的一部分而异源地存在时不能发挥启动子的作用；
(ii)来自欧洲油菜(Brasicca napus)EPSPS基因的启动子；
(iii)编码欧洲油菜EPSPS叶绿体转运肽的欧洲油菜基因组序列；
(iv)编码欧洲油菜EPSPS的基因组序列；
(v)转录终止子；
其中欧洲油菜EPSPS编码序列和野生型序列相比较经过下述的修饰：第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSLTAAV。
本发明的多核苷酸，特别是在刚刚前述的段落中揭示的两个，可能进一步含有编码叶绿体转运肽/磷酸烯醇丙酮酸合成酶(CTP/PPS)或叶绿体转运肽/丙酮酸正磷酸二激酶(CTP/PPDK)的序列，该序列位于植物可操作启动子的表达控制之下。特别优选的是，PPDK蛋白质序列通过其自身的转运肽在植物内被导向叶绿体，相应地刚刚前述的句子中的多核苷酸编码这样的非异源组合物。PPDK编码序列可以来源于单子叶植物或双子叶植物，如此编码的蛋白质可选地为非冷不稳定的。“非冷不稳定的”表示当在与Usami等人(1995)Plant Mol.Biol.，27，969-980的条件相似的实验条件下于0摄氏度孵育5分钟，该酶保留至少50％的活性。这样的“冷稳定的”酶至少要比从F.bidentis中分离的类似的酶稳定两倍。PPS或PPDK酶造成了作为草甘膦作用位点并含有EPSPS酶的叶绿体中提高的PEP水平。
多核苷酸的增强区域优选地构成这样一个序列，其3末端位于从中获得增强子的序列的最近转录起始点上游至少40个核苷酸处。在多核苷酸的进一步实施方案中，增强区域构成这样一个区域，其3末端位于所述的最近起始点上游至少60个核苷酸处；在多核苷酸的更进一步实施方案中，所述的增强区域构成这样一个序列，其3末端位于从中获得增强子的序列的TATA共有序列第一个核苷酸上游至少10个核苷酸处。
根据本发明的多核苷酸可能含有两个或更多个转录增强子，它们在特定的多核苷酸实施方案中可能是串联存在的。
在本发明的多核苷酸中，增强子或第一个增强子(如果有多于一个增强子存在)的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子上游约100到约1000核苷酸之间，或者在该区域含有内含子或别的非翻译序列的情况下，位于5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约100至大约1000个核苷酸之间。在更优选的多核苷酸实施方案中，增强子或第一个增强子的3末端位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中第一个核苷酸的上游大约150至大约1000个核苷酸之间；在更进一步优选的实施方案中，增强子或第一个增强子的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子上游约300到约950核苷酸之间，或者位于5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约300至大约950个核苷酸之间。在更加优选的实施方案中，增强子或第一个增强子的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约770至大约790个核苷酸之间。
在另一个本发明的多核苷酸中，增强子或第一个增强子的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约300至大约380个核苷酸之间；在优选的该另一个多核苷酸的实施方案中，增强子或第一个增强子的3末端位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约320至大约350个核苷酸之间。
在根据本发明的多核苷酸中，来自EPSPS基因的启动子的上游区域可能含有至少一个来源于位于启动子转录起始点上游的序列的增强子，其中所述启动子选自肌动蛋白、rolDFd、S-腺苷高半胱氨酸酶、组蛋白、微管蛋白、多聚遍在蛋白质与质体蓝素基因和CaMV35S与FMV35S基因的启动子。
相应地，本发明的多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于肌动蛋白基因转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于rolDfd基因转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于组蛋白基因转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于微管蛋白基因转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于CaMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有来源于CaMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子，和第二个含有来源于FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强子。
无论各种增强子以什么样的同一性和并置出现在多核苷酸中，构成EPSPS叶绿体转运肽翻译起始点的密码子5端的核苷酸可能为优选的Kozack。这一点意味着什么对于熟练的技术人员来说是相当熟悉的，而且将会从下面的实施例中变得更加明晰。
特别优选的本发明的多核苷酸实施方案包含编码来源于相对高度表达的基因(如葡聚糖酶、查耳酮合成酶与核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶基因)的非翻译5前导序列的序列，所述序列位于编码EPSPS叶绿体转运肽的序列上游。
本发明的多核苷酸也可能含有位于编码EPSPS叶绿体转运肽的基因组序列5端的非翻译区中的病毒来源的翻译增强子。本领域中熟练的技术人员知道这样适合的翻译增强子(例如来源于TMV的Omega与Omega主要(prime)序列和来源于烟草蚀刻病毒的Omega与Omega主要序列的同一性)，以及怎样将这样的翻译增强子引入到多核苷酸中以造成所期望的增长的蛋白质表达结果。
根据本发明的多核苷酸可能进一步包含编码某些蛋白质的区域，这些蛋白质能够赋予含有它的植物材料至少一种下列农艺上所想要的特性：对于昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、干旱(dessication)和除草剂的抗性。尽管这样的多核苷酸期望除草剂抗性赋予基因而不是EPSPS，如草甘膦氧化还原酶(GOX)，但是除草剂可能不为草甘膦，在此情形下抗性赋予基因可以选自编码下列蛋白质的基因：膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合成酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氢蝶酸合成酶、多胺转运蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、从真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中可获得的tfdA基因的产物和已知的上述蛋白质的经过诱变或其他修饰的变体。在多核苷酸提供多重除草剂抗性的情形下，这样的除草剂可以选自二硝基苯胺除草剂、三唑并-嘧啶、尿嘧啶、苯脲、三酮、异噁唑、N-乙酰苯胺、噁二唑、triazinone、sulfonanilide、酰胺、酰基苯胺、isoxaflutole、氟咯草酮、哒草伏和triazolinone类型的除草剂，以及种子发芽后除草剂选自草甘膦与其盐、草铵膦、黄草灵、灭草松、双丙氨酰膦、除草定、稀禾定或其他环己二酮、麦草畏、蔓草磷、胺草唑、苯氧基丙酸、喹禾灵或其他芳氧基-苯氧基丙酸、毒莠定、伏草隆(fluormetron)、莠去津或其他三嗪、嗪草酮、氯嘧黄隆、绿黄隆、flumetsulam、氯吡啶磺隆、嘧黄隆(sulfometron)、灭草喹、咪草烟、异噁酰草胺、咪草啶酸(imazamox)、磺草唑胺、嘧疏苯甲酸钠(pyrithrobac)、砜嘧磺隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟黄胺草醚、乙羧氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、磺草酮、百草枯、敌草快、溴苯腈和噁唑禾草灵。
根据本发明的多核苷酸的特殊实施方案提供了对于草甘膦和原卟啉原氧化酶(PPGO)抑制剂尤其是butafenicil两者的抗性，为此相应的抗性蛋白质为PPGO或其抗性变体。特别优选的编码这样的除草剂抗性赋予组合的构建体包含本发明EPSPS编码序列和编码PPDK或PPS以及抗PPGO抑制剂的PPGO酶的编码序列，这些序列(如果需要)可通过其自身的转运肽而被导向叶绿体，并且如果蛋白质编码序列是植物来源而非细菌来源，这些序列可位于非异源启动子的表达控制之下。
在多核苷酸含有编码杀昆虫蛋白的序列的情形下，这些蛋白质可能选自来源于Bt的结晶毒素，包括分泌型Bt毒素、蛋白酶抑制剂、凝集素、致病杆菌(Xenhorabdus)/光杆状菌(Photorhabdus)毒素。真菌抗性赋予基因可选自编码已知的AFPs、防卫素、几丁质酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特别优选的杀昆虫蛋白为cryIAc、cryIAb、cry3A、Vip1A、Vip1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪花莲凝集素。在多核苷酸含有细菌抗性赋予基因的情形下，这些基因可选自编码杀菌肽和techyplesin及其类似物的基因。病毒抗性赋予基因可选自编码病毒外壳蛋白、运动蛋白、病毒复制酶和已知提供病毒抗性的反义与核酶序列的基因；然而，逆境、盐和干旱抗性赋予基因可选自编码谷胱甘肽-S-转移酶与过氧化物酶的基因、构成已知的CBF1调节序列的序列和已知造成海藻糖积累的基因。
根据本发明的多核苷酸可以经过下述修饰来提高其含有的蛋白质编码序列的表达：可以除去mRNA不稳定基元和/或偶然拼接区域，或者使用作物偏爱密码子，以使植物中经如此修饰的多核苷酸的表达产生相似的蛋白质，该相似的蛋白质与在内源性地含有非修饰多核苷酸的这样区域的有机体中通过非修饰多核苷酸蛋白质编码区域的表达而获得的蛋白质具有基本上相似的活性/功能。经修饰的多核苷酸和该植物中内源性地含有并编码基本上相同的蛋白质的多核苷酸之间的同一性程度可以达到某一程度，以防止经修饰的和内源的序列之间的共抑制。在这种情形下，这些序列之间的同一性优选地应该小于大约70％。
本发明此外还包括含有本发明的多核苷酸的生物或转化载体。因此，“载体”尤其表示下列中的一种：质粒、病毒、粘粒或者经转化或转染以致含有该多核苷酸的细菌。
本发明此外还包括用所述的多核苷酸或载体转化的植物材料，以及已经或将用含有编码某些蛋白质的区域的多核苷酸进一步转化的此类经转化的植物材料，所述蛋白质能够赋予含有它的植物材料具有至少一种下列农艺上所想要的特性：对于昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、干旱和除草剂的抗性。
本发明此外还包括由从用本发明的多核苷酸转化的材料中再生出来的植物和产生于用含有编码能够造成叶绿体中磷酸烯醇丙酮酸水平提高的蛋白质(如磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PPS)或丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK))的序列的多核苷酸转化的材料再生的植物杂交产生的形态上正常并可育的完整植物。这样的蛋白质通过合适的转运肽而被导向叶绿体——在PPDK酶的情形下优选地通过自身的肽。
本发明此外还包括包含本发明的多核苷酸的形态上正常并可育的完整植株，该植株由从用本发明的多核苷酸或载体转化的材料中再生出来的植物和用含有编码CTP/PPS或CTP/PPDK的区域和/或编码能够赋予含有它的植物材料具有至少一种下列农艺上所想要的特性(对于昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、干旱和除草剂的抗性)的蛋白质的区域的多核苷酸转化的植物杂交产生。本发明也包括结果形成的植物的子代，它们的种子和植物体部分。
本发明的植物可以选自农作物、水果和蔬菜，例如canola、向日葵、烟草、糖甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、饲料甜菜、西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、甘蓝、洋葱、大豆(soya spp)、甘蔗、豌豆、蚕豆(field bean)、白杨、葡萄、柑橘、苜蓿、黑麦、燕麦、草坪与饲料用草、亚麻与油料种子油菜和未特别提及的产坚果植物，它们的子代、种子和植物体部分。
特别优选的这样的植物包括大豆、canola、芸苔、棉花、糖甜菜、向日葵、豌豆、马铃薯和饲料甜菜。
本发明此外还包括选择性地控制农田中杂草的方法，该农田里含有杂草和本发明的植物或其具有除草剂抗性的子代，该方法包含将草甘膦类型的除草剂以能够控制杂草而又基本上不影响植物的足够的数量向田中施用。根据这个方法，一种或多种除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂和抗病毒剂可以在草甘膦除草剂施用之前或之后向农田(其中含有植物)中施用。
本发明此外还提供生产对于草甘膦除草剂具有基本的耐受性或基本的抗性的植物的方法，其包括下列步骤：
(i)用本发明的多核苷酸或载体转化植物；
(ii)选择经如此转化的材料；和
(iii)将经如此选择的材料再生成形态上正常并可育的完整植物。
转化可以包括用任何已知的方法将多核苷酸引入材料中，特别是采用下列方法：(i)用包裹有多核苷酸的微粒对材料进行弹果(biolistic)轰击；(ii)用覆盖着含有多核苷酸的溶液的金刚砂纤维对材料进行穿刺；或者(iii)将多核苷酸或载体引入土壤杆菌(Agrobacterium)中，并将经如此转化的土壤杆菌和植物材料进行共培养，从而植物材料得到转化，随后进行再生。对于特定的植物种类可能需要常规修正的植物转化、选择和再生技术对于熟练的技术人员来说是熟知的。经如此转化的植物材料可以通过其对草甘膦的抗性来选择。
本发明此外还提供本发明的多核苷酸或载体在对于草甘膦具有基本的耐受性或基本的抗性的植物组织和/或形态上正常并可育的完整植物的生产中的用途。
本发明此外还包括选择经过转化从而可以表达目的基因的生物材料的方法，其中经转化的材料含有本发明的多核苷酸或载体，以及其中选择程序包含使经转化的材料受到草甘膦或其盐的处理，然后选择存活的材料。该材料可以是植物来源的，尤其可以来源于选自大豆、糖甜菜、棉花和芸苔的双子叶植物。
本发明此外还包括再生出含有外源DNA的可育的转化植物的方法，包括下列步骤：
(a)产生来自该植物的再生组织用于转化；
(b)用该外源DNA转化该再生组织，其中该外源DNA含有选择性DNA序列，该序列在再生组织中作为选择装置发挥作用；
(c)步骤(b)之后大约1天至60天之间，将从步骤(b)中得来的该再生组织置于能够使该组织中产生出苗的培养基之中，其中该培养基可能进一步含有用于选择含有该选择性DNA序列的再生组织的化合物，从而可以进行经转化的再生组织的鉴定或选择；
(d)在至少一棵苗从步骤(c)的经选择的组织中形成之后，将该苗转移到能够从该苗中产生出根的第二个培养基之中从而形成植物幼苗，其中第二个培养基可选地含有该化合物；和
(e)培育该植物幼苗成为可育的转基因植物，其中外源DNA以孟德尔方式遗传至子代植物中，
其特征在于外源DNA为根据本发明的多核苷酸，或外源DNA所包含的选择性DNA序列含有根据本发明的多核苷酸，以及该化合物为草甘膦或其盐。植物可以为上面所指出的双子叶植物——更优选地选自大豆、canola、芸苔、棉花、糖甜菜、向日葵、豌豆、马铃薯和饲料甜菜，该再生组织可以由胚胎发生愈伤组织、体细胞胚、未成熟胚等等组成。
本发明也包括含有用于检测本发明的酶或者多核苷酸或其编码的酶的手段(means)的诊断试剂盒，因此该试剂盒适合于鉴定含有这些的组织或样品。多核苷酸可以通过技术人员所熟知的PCR扩增来检测，所用引物可以容易地得自本申请中揭示的酶编码序列。酶本身可以通过例如在诊断上辨别这些酶所含有的抗原区域的抗体的使用来检测。
经过下列的描述并结合相关的附图与序列表，本发明将会进一步变得明晰。
序列：
SEQ ID No.1描述了欧洲油菜的基因组DNA
2 Bn EPSPS5 (PCR引物)
3 Bn EPSPS3 (PCR引物)
4 BnF1 (PCR引物)
5 BnF2 (PCR引物)
6 BnF3 (PCR引物)
7 BnF4 (PCR引物)
8 BnF5 (PCR引物)
9 BnF6 (PCR引物)
10 BnF7 (PCR引物)
11 BnF8 (PCR引物)
12 BnF9 (PCR引物)
13 BnF10 (PCR引物)
14 BnF11 (PCR引物)
15 BnF12 (PCR引物)
16 BnXho (PCR引物)
17 BnMUTBot (PCR引物)
18 BnMUTTop (PCR引物)
19 BnNde (PCR引物)
20 BnRBSEP (PCR引物)
21 Brasr 12 (PCR引物)
22 Brasr 11 (PCR引物)
23 Bnapus开始rev
24 基因组步查1
25 基因组步查2
26 CaMV343 (PCR引物)
27 CaMV46C (PCR引物)
28 BnGUSXMa (PCR引物)
29 FMV增强子
30 CaMV35S增强子
31 大豆基因组EPSPS序列克隆1/14
32 大豆基因组EPSPS序列克隆1/12
33 EPSPS 10反向(PCR引物)
34 EPSPS 4正向 (PCR引物)
35 含有双突变的SEQ ID No.31
36 含有双突变的SEQ ID No.32
37 FMV35S90增强子
38 FMV35S46增强子
39 Gm Term Bam(PCR引物)
40 Gm Term Eco(PCR引物)
41 BnMUT2PST (PCR引物)
42 BnMUTKPN (PCR引物)
43 GmRubPac (PCR引物)
44 GmRubbot (PCR引物)
45 GmRubtop (PCR引物)
46 GmRubKpn (PCR引物)
47 ZMPPDK1 (PCR引物)
48 ZMPPDK2 (PCR引物)
49 ECPPS1 (PCR引物)
50 ECPPS2 (PCR引物)
51-65 存在于稳定的本发明EPSPS蛋白质中的基元
实施例
用于克隆、表达和鉴别本发明的稳定的抗草甘膦EPSP合成酶的方法将于此处得到描述。
本发明的稳定的抗草甘膦EPSPS是以经过在合适的缓冲液中于37℃孵育至少4个小时之后仍保持稳定(保留大于大约80％的催化活性)为特征的。下面将通过例子说明，酶稳定性实验可以用基本上纯化的、部分纯化的或粗制的酶提取物制剂(例如后者可作为经遗传工程学方法改变而表达抗草甘膦EPSPS的转基因植物提取物而容易地获得，或相似地可作为经遗传工程学方法改变而表达编码抗草甘膦EPSPS的转基因的微生物提取物而容易地获得)合适地来进行。理想地，测试抗草甘膦酶的稳定性应以两种方式进行：以纯化的形式；然后将纯化的蛋白质添加回粗制的植物提取物中从而在更逼真的类植物体内条件下来测试它们。在这样的提取物中，源自抗草甘膦EPSPS的酶活性能够容易地通过在一定范围的草甘膦浓度下测试活性而从易受影响的内源性EPSPS背景中区别出来。在草甘膦的区别浓度(例如0.1mM草甘膦，存在有0.1mM PEP)下，几乎所有测到的活性均来自抗性酶。
实施例1鉴定稳定的抗草甘膦EPSP合成酶的方法
为了测试抗草甘膦EPSPS的稳定性，该酶的测试溶液(按照下面的描述于pH～7.0-7.5的缓冲液中和以纯化或部分纯化的形式制备)于37℃加热4-5个小时。然后将经加热的酶的抗草甘膦活性和a)同样地制备但保持于冰温下的样品以及b)新鲜制备的同样样品的活性相比较。
本发明的稳定的抗草甘膦酶通过下列事实来表征，于37℃经过5小时的孵育，当按照下面的描述进行检测时，它们相对于合适的对照丧失很少的(如果有的话)其原始的抗草甘膦催化活性(小于20％，优选地小于15％，更优选地小于10％)。优选地使用基本上纯的酶进行稳定性实验，尽管当使用粗制的制剂或将纯蛋白质添加到粗制的提取物中时通常也可以获得非常相似的结果。适合用于酶提取物的检测和制备的方法在下面得到进一步的详细说明。抗草甘膦EPSPS的稳定性可以适当地通过各种别的基本上同等的方法(例如将酶于稍微高些的温度加热更短的时间，或者于更低的温度加热更长的时间，如于25℃保持3天)来评测。
实施例2检测EPSPS活性和测定动力学常数的方法
一般根据Padgette等人1987(Archives of Biochemistry andBiophysics，258(2)564-573)的放射化学方法用K+作为阳离子平衡离子的主要种类来进行检测。25℃、pH7.0、含有50mM Hepes(KOH)且总体积为50μl的试样包含适当稀释于pH7.0并含有10％甘油与5mM DTT的Hepes中的纯化的酶或植物提取物(见下)，14C PEP作为变化的底物(用于动力学测定)或者固定在100或250μM，按照说明莽草酸-3-磷酸(K+盐)为0.75或2mM。可选地，对于粗制的植物提取物的检测，试样还包含5mM KF和/或0.1mM钼酸铵。通过14C磷酸烯醇丙酮酸(环己铵+盐)的添加开始进行检测，并于2-10分钟(优选的为2分钟)后通过含1份乙酸和9份乙醇的50μl溶液的添加终止检测。在检测终止之后，取20μl溶液上样到synchropak AX100(25cm×4.6cm)柱上，然后采用0.28M磷酸钾、pH6.5且流速为0.5ml/min的流动相的等度洗脱进行色谱分析并超过35分钟。在这些条件之下，对于PEP和EPSP的保持时间根据个别的柱分别为～19和25分钟。CP 525TR闪烁计数器连接于AX100柱的末端。其装配有0.5ml流动吸收池，闪烁剂(Ultima FloAP)的流速设定为1ml/min。将PEP和EPSP相关的峰面积进行积分，从而确定出标记的PEP向EPSP转化的百分率。表观Km和Vmax值通过使用来自ErithacusSoftware Ltd.的Grafit 3.09b经简单加权用最小二乘拟合成双曲线(least squares fit to a hyperbola with simple weighting)来确定。Km值一般使用8-9种在Km/2至10Km间变化的可变底物的浓度和三重点来确定。除了特别指出的地方之外，数据点只包括在底物向EPSP的转化率小于30％的分析之中。
莽草酸-3-Pi(S3P)按照下述方法制备，向pH8.5且含有0.05M莽草酸、0.0665M ATP(Na盐)、10mM KF、5mM DTT和0.05MMgCl2 6H2O的7ml 0.3M TAPS中加入75μl 77单位(μmol min-1)ml-1的莽草酸激酶溶液。在室温下24小时后，通过95℃的短暂加热来终止反应。将反应溶液于pH9的0.01M Tris HCl中作50倍稀释，然后通过用0-0.34M LiCl2梯度在Dowex 1X8-400上的阴离子交换进行色谱分析。将S3P部分合并、冻干，然后再溶解于7ml蒸馏水中。然后加入28ml 0.1M Ba(CH3COOH)2和189ml无水乙醇。将该溶液于4℃搅拌过夜。收集结果所得的S3P三钡沉淀，并在30ml 67％乙醇中洗涤。然后将经洗涤的沉淀溶解于～30ml蒸馏水中。通过加入K2SO4就可与所要求的一样产生出S3P的K+盐。对于添加硫酸盐的最小过量应非常小心。除去BaSO4沉淀，再将含有所需的S3P盐的上清液冻干。将每一种盐称重并用质子NMR分析。如此制备的S3P制剂根据质子NMR具有大于90％的纯度，根据其重量和31P NMR的积分只含有很少的残余的硫酸钾。
实施例3适用于EPSPS检测的植物材料提取物的制备
用液氮冷却的研钵和研杵将愈伤组织或植物幼苗材料(0.5-1.0g)研磨成细的冷冻粉末。该粉末溶解于等体积的合适的经冷却的提取缓冲液(例如pH7.5且含有1mM EDTA、3mM DTT、1.7mM’pefabloc’(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、1.5mM亮抑蛋白酶肽、1.5mM胃蛋白酶抑制剂A、10％v/v甘油和1％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone)的50mM Hepes/KOH缓冲液)中，再次悬浮，混和并于经冷却的离心机中离心以沉降下碎片。上清液沿着冷却的Sephadex G25的PD10柱经过交换而进入pH7.5且含有1mM EDTA、3mM DTT和10％v/v甘油的25mM Hepes/KOH缓冲液中。蛋白质通过用牛血清白蛋白标准化的Bradford方法来评估。提取物的一部分冷冻于液氮中；一部分立即进行检测。
实施例4检测在粗制的植物材料中EPSPS的活性和区别草甘膦抗性在总活性中的比例的方法
植物提取物的EPSPS检测按照上面描述的方法用0.1mM 14C-PEP和0.75mM莽草酸-3-Pi在不存在或存在0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸的条件下进行。在这些检测条件下，根据评估，本发明的EPSPS的有抗性的形式只有小于8.5％被抑制，而敏感的w/t形式基本上完全被抑制(大于98％)。因此，存在草甘膦(A)的条件下所观测到的活性水平代表了来源于转基因表达的抗性酶的水平的～92％，而易受影响的w/t EPSPS的水平等于不存在草甘膦的条件下所观测到的EPSPS活性的总水平减去Ax的值～1.08。因为本发明的突变型酶的Vmax据评测仅为例如w/t酶的Vmax的大约三分之一(而且因为对于w/t与突变型的PEP的Km值据评测为大约20μM或更少)，所以突变型酶多肽的表达水平相对于内源性的w/t EPSPS的表达水平的比率比以它们的观测到的相对活性的比率为基础计算的比率高约三倍。EPSPS多肽表达(突变型+w/t)的总水平也是用蛋白质印迹法来评测的。
实施例5编码成熟的欧洲油菜EPSPS的w/t cDNA在大肠杆菌(E.coli)中的克隆和表达
用来自BRL的Superscript RT按照厂商所提供的建议通过RT-PCR从温室培育的欧洲油菜植物中分离得到的RNA之中扩增欧洲油菜EPSPS cDNA。PCR使用来自Stratagene的Pfu turbo聚合酶按照厂商所提供的方法来进行。基于已知的核苷酸序列(EMBL目录号X51475)的合适设计的寡核苷酸引物用于扩增反应和逆转录阶段。使用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒将PCR产物克隆进pCRBlunt II中。插入片段序列用测序法进行确认，并证实该预期的可读框相当于预期的成熟的叶绿体的欧洲油菜EPSPS蛋白质的可读框，但有一点不同的是存在一个起始Met。经克隆和证实的EPSPS序列用本领域所熟知的合适的限制酶切除，然后将经纯化的片段克隆到经同样消化的pET24a(Novagen)之中。将重组克隆引入到Stratagene提供的经密码子优化的大肠杆菌RP菌株——BL 21(DE3)之中。在向发酵罐培养基(补充了100μg/ml卡那霉素的LB)中加入1mM IPTG后，EPSPS蛋白质在该菌株中得到了表达。以下述方法确定了准确预知质量的重组蛋白质：(i)以考马斯将细胞提取物的SDS凝胶染色，并与经考马斯染色的转化了空的pET24a载体的相同的大肠杆菌细胞提取物的凝胶放在一起比较和(ii)通过使用前面纯化的植物EPSPS蛋白质的多克隆抗体进行蛋白质印迹法分析。
实施例6抗草甘膦的突变体欧洲油菜EPSPS在大肠杆菌中的克隆和表达
pCRBlunt中的欧洲油菜EPSPS cDNA用作模板以进行两个PCR，所使用的引物对被设计为可引入特殊的改变以使结果所得的反应产物编码经修饰的EPSPS蛋白质，其中第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSLTAAV。在本领域中，欧洲油菜EPSPS基因的序列是已知的，以及设计用作影响该诱变的引物的方法是熟知的。
由此产生的PCR产物经凝胶纯化，并使用Invitrogens Zero BluntTOPO试剂盒克隆进pCRBlunt II中。确认插入片段的DNA序列和其预测的可读框相当于预测的成熟的叶绿体的欧洲油菜EPSPS蛋白质(有一点不同的是，存在一个起始Met)的可读框，以及编码了所期望的改变(于EPSPS序列内在特定位点上T向I和P向S的特定突变)。经如此克隆和证实的欧洲油菜EPSPS序列用合适的限制酶切除，然后将经纯化的片段克隆到经同样消化的pET24a(Novagen)之中。将重组克隆引入到Stratagene提供的经密码子优化的大肠杆菌RP菌株——BL 21(DE3)之中。在向发酵罐培养基(补充了100μg/ml卡那霉素的LB)中加入1mM IPTG后，EPSPS蛋白质在该菌株中得到了表达。以下述方法确定了准确预知质量的重组蛋白质：(i)以考马斯将细胞提取物的SDS凝胶染色，并与经考马斯染色的转化了空的pET24a载体的相同的大肠杆菌细胞提取物的凝胶放在一起比较和(ii)通过使用先前纯化的植物EPSPS蛋白质的多克隆抗体进行蛋白质印迹法分析。这种欧洲油菜EPSPS突变形式按照这里的描述进行纯化和鉴别。
实施例7突变体欧洲油菜EPSPS的纯化和鉴别
成熟的突变体欧洲油菜EPSPS蛋白质按下所述于～4℃进行纯化。将25g湿重的细胞在pH7.5且含有5mM DTT、2mM EDTA和20％v/v甘油的50ml 0.1M Hepes/KOH缓冲液中进行洗涤。经过低速离心之后，将细胞沉淀重悬于50ml同样的但还含有2mM’Pefabloc’(丝氨酸蛋白酶抑制剂)的缓冲液中。使用玻璃匀浆器将细胞均匀地悬浮，然后使用Constant Systems(Budbrooke Rd，Warwick，U.K.)Basic Z细胞破裂仪于10000磅/平方英寸破裂细胞。粗制的提取物于～30,000g离心1小时，并丢弃沉淀。加入鱼精蛋白硫酸盐(鲑精蛋白)至0.2％的最终浓度，混和并让溶液静置30分钟。通过于～30,000g离心30分钟除去沉淀出来的物质。加入Aristar级别的硫酸铵至40％饱和度的最终浓度，接着搅拌30分钟，然后于～27,000g离心30分钟。沉淀物重悬于～10ml与用于细胞破裂同样的缓冲液中，再加入硫酸铵使溶液达到～70％的饱和度，将溶液搅拌30分钟并再次离心以产生出沉淀物，将该沉淀物重悬于～15ml的S200缓冲液中(含有1mM DTT、1mMEDTA和20％v/v甘油的10mM Hepes/KOH(pH 7.8))。将该溶液过滤(0.45微米)、上样和经过含有用S200缓冲液平衡的Superdex 200的K26/60柱进行色谱分析。将基于EPSPS酶活性而检测出的含有EPSPS的部分合并，并上样到含有20ml用S200缓冲液平衡的HPQ-Sepharose的xk16柱上。该柱用S200缓冲液洗涤，然后EPSPS在来自同样缓冲液中0.0M至0.2M KCl的线性梯度中洗脱出来。EPSPS在对应于等于或低于大约0.1M的盐浓度的一个单峰中洗脱出来。将基于EPSPS酶活性而检测出的含有EPSPS的部分合并，并上样到用Superdex 75缓冲液(含有2mM DTT、1mM EDTA和10％v/v甘油的25mM Hepes/KOH(pH 7.5))平衡的Superdex 75的HiLoad xk26/60柱上。将基于酶活性而鉴定出的含有EPSPS的部分合并，并上样到1ml用同样的Superdex 75缓冲液平衡的MonoQ柱上。该柱用起始缓冲液洗涤，EPSPS在来自0.0-0.2M KCl的15ml线性梯度的整个过程中以一个单峰洗脱出来。在纯化中的这个阶段可获得接近(＞90％)纯的EPSPS。可选择地，EPSPS可通过交换进入含有1.0M(Aristar)硫酸铵的Superdex 75缓冲液中并上样到10ml于同样的缓冲液中平衡的苯基琼脂糖的柱上来进行进一步的纯化。EPSPS在来自1.0-0.0M硫酸铵的下降的硫酸铵线性梯度的过程的早期以一个单峰洗脱出来。
通过这些方法或相似的方法获得的、并按上面的描述在2mM莽草酸-3-Pi存在条件下进行检测的经过纯化的欧洲油菜EPSPS的突变形式具有～5μmol/min/mg的表观Vmax和～25μM的对于PEP的Km。在40μM PEP时，对于草甘膦钾盐的IC50为～0.6mM。突变体EPSPS对于草甘膦钾的估计的Ki值为～0.45mM。
实施例8编码欧洲油菜EPSPS的基因组DNA的克隆
编码EPSPS的欧洲油菜基因组DNA片段(SEQ ID No.1)在本领域中是已知的(Gasser和Klee，1990)。PCR引物BnEPSPS5(SEQ IDNo.2)和BnEPSPS3(SEQ ID No.3)用于将EPSPS基因从分离自含油种子用芸苔(Brassica napus var.Westar)的基因组DNA中扩增出来。
Pfu聚合酶用于在下列条件下进行PCR：
94℃5分钟
94℃1分钟
55℃30秒
72℃12分钟
将结果所得的3.8Kb产物克隆进pCR4Blunt-Topo，并用下列的引物测序：M13正向、M13反向(Invitrogen)、BnF1(SEQ ID No.4)、BnF2(SEQ ID No.5)、BnF3(SEQ ID No.6)、BnF4(SEQ ID No.7)、BnF5(SEQ ID No.8)、BnF6(SEQ ID No.9)、BnF7(SEQ ID No.10)、BnF8(SEQ ID No.11)、BnF9(SEQ ID No.12)、BnF10(SEQ ID No.13)、BnF11(SEQ ID No.14)、BnF12(SEQ ID No.15)。
实施例9将突变引入编码BnEPSPS的基因组DNA中
将所期望的Thr-Ile和Pro-Ser突变用含有密码子改变以引入所期望的氨基酸改变的寡核苷酸引物通过PCR引入到欧洲油菜EPSPS基因中。引物BnXho(SEQ ID No.16)和BnMUTBot(SEQ ID No.17)用于扩增来自含油种子用芸苔基因组DNA的EPSPS的所需区域。同样地，引物BnMutTop(SEQ ID No.18)和BnNde(SEQ ID No.19)用于扩增来自含油种子用芸苔基因组DNA的附加区域。将1μl的每一种PCR产物混和，然后让重叠的互补序列退火。产物然后通过用引物BnXho和BnNde的PCR连接。结果所得的PCR产物经过克隆并测序以检查包含了双突变。将BnEPSPS克隆中的Xho1/Nde1片段切除并用含有双突变的经克隆的Xho1/Nde1片段替换。
实施例10用于植物中突变体欧洲油菜EPSPS的表达、并在编码突变体欧洲油菜EPSPS的基因的上游具有核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列的构建体
烟草核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列通过PCR引入到构建体中。引物BnRBSEP(SEQ ID No.20)和Brasr12(SEQ ID No.21)用于从作为模板的50ng野生型欧洲油菜基因组DNA中用Pfu-Turbo聚合酶扩增出产物。将结果所得的PCR产物克隆进pCR4 blunt TOPO中，克隆通过经定向的限制性消化例如可以用Not1(来自载体)和Xho1将其切除来进行鉴定。然后核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列以Not1/Xho1引入经突变的BnEPSPS克隆之中。
实施例11过基因组步查对欧洲油菜EPSPS启动子(用于植物中EPSPS的表达)的鉴定
任何植物基因的上游或下游序列的增加的长度可以使用由Clontech提供和指导的基因组步查试剂盒来获得。根据基因组步查试剂盒所带的方案中描述的方法使用欧洲油菜基因组DNA和SEQ IDNo.22和23(Bras r11和Bnapus开始rev)中所描述的引物来获得欧洲油菜EPSPS基因的上游序列。
Bras r11(SEQ ID No.22)引物和基因组步查试剂盒中所提供的AP1引物一起使用，而Bnapus开始rev引物和基因组步查试剂盒所提供的AP2引物一起使用。产物使用来自Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒并根据厂商指导克隆进pCR-TOPO中。PCR用M13正向和反向引物来进行，并使用来自Pharmacia的Ready to Go Beads来确定哪些克隆含有正确大小的插入片段。许多这些克隆用于制造DNA制备物，然后这些DNA用于确定插入片段的核苷酸序列。
第二套引物(分别为SEQ ID No.24和25)用于显示如下的进一步的步查：
与AP1引物一起的基因组步查1(SEQ ID No.24)
与AP2引物一起的基因组步查2(SEQ ID No.25)
除了Clontech的方案所推荐的那些之外还可进行另外的基因组消化。这些消化包括Alu I、Hae III、Hinc II和Rsa I。然后这些经消化的DNA进行与按照基因组步查试剂盒所带方案的描述进行的别的消化同样的处理。这样做是为了增加获得正确的长PCR产物的机会。PCR产物使用来自Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒并根据制造指导再次克隆进pCR-TOPO中，然后对于获得自每一个克隆产物并含有正确大小的插入片段的随机克隆进行序列测定。测定插入片段的序列。获得欧洲油菜EPSPS翻译起始位点上游大约1kb长的序列，该序列邻近于所发表的序列。
实施例12用于植物中突变体欧洲油菜EPSPS的表达的构建体
35S增强子用引物CaMV343和CaMV46C(分别为SEQ ID No.26和27)通过PCR从载体pMJB1(图1)中扩增出来。
将PCR产物克隆进载体pCR4Blunt-TOPO中并测序。按照先前的实施例中的描述所获得的所期望的启动子用含有Sph1位点的5引物和BnGUSXma(SEQ ID No.28)从含油种子用芸苔基因组DNA中扩增出来。
PCR产物直接用Sph1和Xma1进行消化，并以Sph1/Xma1(用Sph1部分消化)连接到含有35S增强子的pCR4Blunt-TOPO载体之中。然后将与BnEPSPS启动子融合的CaMV35S增强子用Not1(来自载体)和Xma1从pCR4Blunt中切除，并克隆进含有烟草核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列和突变的欧洲油菜EPSPS基因的pCR4Blunt载体中。FMV增强子(SEQ ID No.29)或CaMV35S增强子(SEQ ID No.30)经化学方法合成，并亚克隆进载体pCR4 BluntTOPO中。以Not1/Sac1将FMV增强子从pCR4-Blunt中切除，并以Not1/Sac1连接到CaMV35S增强子/欧洲油菜启动子/核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列/欧洲油菜EPSPS中。最终的构建体显示在图2中。整个表达盒可以用EcoR 1切除，并连接到用于植物转化的合适载体中。
实施例13植物的转化和再生
表达盒用EcoR 1从pFCBnEPSPS载体中切除，并在唯一的EcoR1限制性位点连接到例如二元载体pBin19中。该含有所需的表达盒的二元载体采用Holsters等人(1978)所提供的冻融转化法转化到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA 4404中。烟草的转化和整个植物的再生用枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun)并根据Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)的方案来进行。转化结果物在含有卡那霉素的MS-培养基上进行选择。可选择地，pFCBnEPSPS或者别的能够通过来自大豆的抗草甘膦EPSPS基因的表达在植物中呈递草甘膦抗性的构建体也可以不采用经描述用于大豆的土壤杆菌介导的技术而直接引入植物中。
将构建体采用弹果型方法(例如Santarem ER，Finer，J.J(1999)“使用维持于半固体培养基上的增生性胚胎发生组织的大豆的转化”(Transformation of soyabean(Glycine max(L.)Merrill)usingproliferative embryogenic tissue maintained on a semi-solidmedium)，In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 35，451-455；USP-5,503,998，USP 5830728)或者通过土壤杆菌的感染(例如USP-5,024,944，USP 5,959,179)转化入可再生的胚胎发生的大豆组织中。可再生的胚胎发生的大豆组织获取自例如未成熟胚的子叶或别的合适组织。
增生性胚胎发生组织例如可以维持于半固体培养基上。这样的组织例如可通过下面的途径获得。长3-4mm的未成熟的合子胚分离自例如花形成2-3星期后的大豆的豆荚。可以通过“递光”对豆荚中具有正确长度和成熟度的胚胎的存在进行检查。然后将豆荚消毒。移出未成熟胚并从每个中除去轴。然后将未成熟胚置于pH7.0且含有维生素B5、3％蔗糖和40mg/l 2，4-D的“D40-低盐”半固体(0.2％脱乙酰吉兰糖胶)MS盐培养基之上3-4星期。为了胚的增殖，然后将材料转移到pH5.7且含有维生素B5、3％蔗糖、20mg/l 2，4-D和0.2％脱乙酰吉兰糖胶的“D20”MS盐培养基上。选出带有亮绿色的球形的增生性胚的材料，并于每2-3星期进行传代培养。
选出20-25块/板的组织(于轰击前经传代培养4-5天)，并排列于含有D20培养基的皿的中央，以用于轰击。组织通过在无菌的罩下暴露15分钟来干燥15分钟。将包裹有DNA构建体的金微粒(例如用上面的参考文献中所描述的方法包裹)用大量商业上可获得的枪中的任何一种两次轰击入D20培养基上的组织中。作为进一步的实施例，使用PDS1000微粒枪。微粒可以采用与Klein等人(1987)，Nature，327，70-73所描述的方法相似的方式进行制备和用DNA包裹。可选择地，例如在微离心管中将60mg金或钨微粒(～1.0μm)于HPLC-等级乙醇中反复进行洗涤，然后于无菌水中反复进行洗涤。将微粒重悬于1ml无菌水中，然后在微离心管中分配成50μl等分试样。金微粒储存于4℃，钨微粒储存于-20℃。将3mg DNA加入每一个(解冻的)微粒的等分试样中，并将管子以最高速度涡旋振荡。在维持近持续的涡旋振荡的同时，加入50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺。在经过10分钟进一步的涡旋振荡之后，样品在Eppendorf微离心机中离心5秒，排除掉上清液，然后将微粒在HPLC-等级乙醇的连续添加中进行洗涤。将微粒完全重悬于60μl乙醇中，然后以10μl等分试样分配至PDS1000微粒枪中使用的每一个大载体表面上。PDS1000微粒枪的部件通过浸泡于70％乙醇中和风干进行表面消毒。将按照上面的描述准备的、带有排列成2.5cm圆盘的组织的目标平板置于离阻挡屏6cm处。然后将经适当挑选的裂口盘用于轰击。
轰击后一个星期，将所有的组织块转移到缓冲至pH5.7并含有在0.05至5mM之间合适的选择性浓度的草甘膦的D20培养基上。再过3-4星期之后，将所有的组织转移到含有在该浓度范围内增加了浓度的草甘膦的新鲜D20培养基上。再经过3-4星期之后，挑选出活的组织并于每3-4星期在含有草甘膦的类似的D20培养基中进行传代培养。可选择地，在一些除了草甘膦外的别的选择标记也存在的情况下，那么选择可以按适当的方式进行(例如使用增加浓度的潮霉素)。生长的部分就这样维持着，并在有足够的组织时可以用PCR进行分析以确认它们对于所期望的DNA是转基因的。
为了使胚发育和成熟，将组织块置于包含MS盐的M6培养基上，该MS盐pH5.7并且含有维生素B5、6％麦芽糖和0.2％脱乙酰吉兰糖胶。6-9个团块于23℃置于高的皿中。3-4星期之后，胚伸长了，可以将其分离并转移以进行另一轮M6培养基上的培育。4-6星期之后，胚成为奶油色并可准备进行干燥。将9个这样的奶油色胚置于干燥的培养皿中，然后用Parafilm封口并放到架子上2-3天。胚应该是有些软的，而不是“松脆而易碎的”。
经干燥的胚可以通过置于OMS(无生长调节因子的MS培养基)上进行发芽。在通常发生于一星期内的发芽之后，将植物转移到更大的盒子中，一旦形成足够的根和苗就可从那时起转移到土壤中。为了防止真菌污染，用蒸馏水从根部洗去OMS是适宜的。可将植物保持和生长于高湿和最初24小时光照的条件下。可让植物在24小时光照条件下生长至大约2英尺高，然后通过转换成16小时光照的状况来促进植物开花和形成豆荚。收集种子，后代用通常的植物育种方法经培养、杂交和回交以便将转基因移入所期望的植物背景中。植物可采用通常的分子生物学方法包括PCR分析、Southern、Western、ELISA和酶测定技术进行常规分析以确定转基因的存在和表达。
实施例14获得编码稳定的抗草甘膦EPSPS的基因的方法
在本发明的一个实施方案中，例如以此处所述的方法构建了适合于在大肠杆菌中表达的抗草甘膦EPSPS基因，在其编码序列中，第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含下列保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSL。
本发明的稳定的抗草甘膦EPSP合成酶和编码它们的基因然后可通过下述方法获得：经随机或部分随机诱变(例如用化学和UV诱变)过程，经使用非校读DNA聚合酶(例如在如XL1 red菌株中)或者经使用许多“直接进化”方法(例如由Kuchner和Amold(1997)在TIBTECH，15，523-530中所综述的或由Stemmer(1994)在PNAS，91，10747-10751中所描述的)中的任何一种来产生大量的变异体，再选择出表达稳定的且保持草甘膦抗性的EPSPS的基因。选择的合适方法包括，例如突变基因(如来自弱的组成型启动子)在生长于提高了的温度(如37-42℃)下的大肠杆菌Aro A菌株中的表达，和选择出那些最能够在基本培养基(可选地还含有草甘膦)中生长的转化体。可选择地，在培养基含有选择性浓度的草甘膦的条件下，可以使用非aro A宿主菌株(优选地如rec A)。熟练的技术人员会认识到许多诱变和选择的方法可以应用于本发明范围之内。
实施例15稳定的抗草甘膦EPSPS和编码它们的基因
稳定的欧洲油菜EPSPS双突变形式为本发明的一个实施例。熟练的技术人员会认识到在别的实施例中本发明的这样的EPSPS和编码它们的基因可以用与上面所描述的相同或相似的方法进行克隆、分离和鉴别。
在本发明的EPSPS和EPSPS基因序列中，编码序列在第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，在第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含下列保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSL。
本发明的EPSPS蛋白质序列的进一步特征在于它们不包含具有序列K(A/V)AKRAVVVGC GGKFPVE的区域。
本发明的EPSPS蛋白质序列的进一步特征在于它们包含至少一种以(i)至(viii)列于下的氨基酸序列基元：
(i)ALLMZAPLA，其中Z不是S或T；
(ii)EIEIZDKL，其中Z不是V；
(iii)FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V；
(iv)AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R；
(v)GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不是E；
(vi)ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T；
(vii)TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L；
(viii)(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R。
其中X为任意氨基酸以及Z、Z1和Z2为除了指定的那些氨基酸之外的任意氨基酸。
对于本发明的EPSPS基因和蛋白质，更优选的为蛋白质序列包含序列基元(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)中的至少一种，优选地包含这些中的至少两种。
此外，氨基酸序列基元(i)中Z优选地为A；序列基元(ii)中Z优选地为I；序列基元(iii)中Z优选地为A；序列基元(iv)中Z优选地为K、T或A；序列基元(v)中Z1优选地为R或A以及次优选地为D或E，Z2优选地为V或A以及次优选地为T；序列基元(vi)中Z1优选地为E或A，Z2优选地为P、I或V；序列基元(vii)中Z优选地为R或K；序列基元(viii)中Z优选地为T或S以及次优选地为Q。
此外，一些本发明的EPSPS蛋白质序列的特征在于它们包含至少一种下列的序列：
(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)或
(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E或
(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)或
(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)或
(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E或
(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E或
(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G)。
此外，本发明的EPSPS序列优选地来源于双子叶植物。
实施例16来源于大豆的稳定的抗草甘膦EPSPS
本发明优选的实施例为这样的EPSPS蛋白质序列和编码它们的DNA序列，其来自大豆(见例如EPSPS基因SEQ ID No.33和34)并根据实施例15经过任选的修饰从而产生稳定的抗草甘膦EPSP合成酶。
特别优选的实施例为来源于大豆并具以下特征的EPSP合成酶基因：
(a)编码序列在第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，在第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含下列保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSL；
和
(b)DNA编码序列可以依照实施例15进行进一步的修饰，以致编码的蛋白质含有氨基酸序列基元(ii)、(iii)、(v)和(viii)中的至少一种，优选的为两种或更多种。
实施例17编码EPSPS的大豆部分长cDNA的克隆
大豆RNA用TrizolTM试剂按由Gibco BRL所描述的方法进行分离，cDNA第一链使用简并引物EPSPS 10反向(SEQ ID No.35)并按照厂商提供的方案用Superscript II(Gibco BRL)来合成。在PCR中，使用经逆转录的大豆cDNA第一链产物作为模板，引物为EPSPS4正向(SEQ ID No.34)与EPSPS 10反向(SEQ ID No.33)，并根据厂商提供的方案使用由AmershamPharmaciaTM提供的ready to goPCR beads。
使用下列PCR条件：
1.94℃ 3分钟 1个循环
2.94℃ 45秒
50℃ 30秒
72℃ 1分钟 25个循环
3.72℃ 10分钟 1个循环
将获得的大约1kb的产物根据厂商的建议用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆进pCR2.1中。菌落经随意地挑选出来，并通过用QIAprep Mini-Prep试剂盒(Qiagen)的质粒制备进行选择以用于进一步的操作，随后用EcoR I消化以显示出这些克隆中插入片段的大小。含有所期望的1kb插入片段的克隆继续下面的操作。选择出的克隆的多核苷酸序列用ABI 377自动测序仪测定。数据库搜索用Blast算法(Altschul等人，1990)进行，结果表明经测序的克隆的大多数含有与已知的植物EPSPS序列有高同源性的部分长cDNA。
实施例18编码大豆EPSPS的基因组多核苷酸序列的分离
从Stratagene购买了于Lambda Fix II中构建的大豆基因组文库，根据厂商方案涂布出1,000,000个克隆。Hybond N+滤膜用于从文库平板中转印，这些根据AmershamPharmacia和“Molecular Cloning-alaboratory manual”(Sambrook等人，1989)所提供的方案来进行。DNA向膜上的UV交联用UV Stratalinker(Stratagene)来完成。大豆EPSPS cDNA探针通过用EcoR I消化含有大豆EPSPS部分长cDNA序列的克隆和用琼脂糖凝胶电泳纯化1kb产物来制备。探针使用Ready-To-GoTM DNA标记试剂盒(AmershamPharmacia)用32PdCTP来标记。滤膜在Rapid-Hyb缓冲液(Amersham Pharmacia)中进行预杂交和杂交。用0.1×SSPE和0.5％SDS于65℃进行洗涤。然后将滤膜包于Saran wrap内，并按照“Molecular Cloning-alaboratory manual”(Sambrook等人，1989)中的描述在含有增感屏的盒子内使胶片曝光。
挑出杂交噬菌斑到SM缓冲液中，以低一些的密度再次涂板，并经过2轮进一步的纯化进行再筛选。用本领域所熟知的方法(Sambrook等人，1989)从噬斑纯化噬菌体原液中收回噬菌体DNA。收回的噬菌体DNA用Not1消化，然后将基因组DNA亚克隆进pBluescript中。结果所得的载体转化入TOP 10大肠杆菌中。结果所得的克隆按照厂商提供的方案用Genome Priming System(NEB)进行测序。简要地，选择出足够批次的96 GPS结果物，用QiagenTM Biorobot制备DNA。DNA用NEB提供的GPS-S和GPS-N引物并用ABI 377自动测序仪进行测序。序列数据用Seqman(DNASTAR Inc)分析。借助于Blast算法，编码EPSPS的基因通过与已知EPSPS基因的同源性来鉴定。在SEQ ID No.37和SEQ ID No.38中给出了含有显示出与已知EPSPS高度同源性的序列的两个重叠群的序列，将它们分别称为GmEPSPS1/14和GmEPSPS12。在图3和图4中给出了这些基因的图解说明。
本领域的熟练技术人员会知道大豆中可能存在别的EPSPS基因，可以使用与该实施例所描述的相似的一整套方法将这些基因分离出来并进行核苷酸序列的测定。
实施例19含有大豆EPSPS基因的植物转化载体的产生
FMV35S90(SEQ ID No.37)和FMV35S46(SEQ ID No.38)这两个增强子组合通过化学方法合成，并用Hind III/Pac 1亚克隆进载体pTCV1001(图5)。大豆EPSPS终止子和编码序列的一个小区域是以克隆GmEPSPS1/14为模板用引物GmTermBam(SEQ ID No.39)和GmTermEco(SEQ ID No.40)通过PCR而获得的。将PCR产物克隆进pCR4-Blunt-TOPO，并进行测序，然后用Pst 1和EcoR 1切除，再连接入含有FMV/CaMV35S增强子的pTCV1001载体中。最后，将GmEPSPS1/14中含有大豆EPSPS基因的大部分的Pac1：BamH1DNA片段切除，并克隆进含有增强子和终止子的pTCV1001载体中。
实施例20 EPSPS基因中突变的引入
将需要增加对草甘膦抗性的所期望的Thr至Ile和Pro至Ser的突变用下面的方式插入到构建体中。含有引起所期望的氨基酸突变的核苷酸改变的引物BnMUT2PST(SEQ ID No.41)和引物BnMUTKPN(SEQ ID No.42)一起在以GmEPSPS1/14为模板使用pfu-TURBO聚合酶(Stratagene)的PCR中使用。将现在含有所期望的突变的PCR产物克隆进pCR4-Blunt-TOPO中并测序。然后以Kpn 1和Pst 1将其切除，并用于替换含有WT序列的pTCV1 001中的构建体内的相应片段。最终的载体称为pTCVGMEPSPS(图6)。
实施例21 5 UTL的引入
附加的5 UTL，例如那些来自核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)小亚基或烟草葡聚糖酶的，可以通过PCR插入构建体中。另外，围绕AUG翻译起始密码子的序列经优化为共有序列Kozak序列ACCAUGG。关于SSU核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列，引物GmRubPac(SEQ ID No.43)和GmRubbot(SEQ ID No.44)用于将大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶5 UTL引入到大豆EPSPS基因的5 UTL中。然后，GmRubTop(SEQ ID No.45)和GmRubKpn(SEQID No.46)用于将大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶5 UTL引入大豆EPSPS基因的第一个外显子中。然后用引物GmRubPac和GmRubKpn通过PCR将这两个PCR产物连接起来，再将结果所得的产物克隆进pCR4Blunt-TOPO中并测序。一旦PCR产物的真实性得到确认，以Pac 1：Kpn 1将其从PCR4载体中切除，并将其用于替换载体pTCVGMEPSPS中的Pac 1/Kpn 1限制片段。
这些实施例描述了包含两个融合于在编码序列中含有特定的突变从而能够在植物中产生抗草甘膦EPSPS酶的大豆EPSPS基因的增强子的DNA序列的构建。本领域的熟练技术人员会知道增强子可以引入到启动子和转录起始位点上游各种不同距离的位置，从而增强植物细胞中双突变EPSPS大豆基因转录的速率和/或数量。该距离可能只好对于每个个别的基因根据经验来确定。这包括制造许多增强子融合在离双突变EPSPS大豆基因转录起始点不同距离位置上的构建体，和将这些构建体引入植物材料并检测这些材料对于选择性浓度的草甘膦的抗性。本领域的熟练技术人员还会知道增强子的选择并不局限于CaMV35S和FMV增强子，还可能包括来自植物中高度表达的任何基因的增强子，特别包括来自肌动蛋白基因、遍在蛋白质基因和甘露氨酸、胭脂氨酸与章鱼氨酸合成酶基因以及源自鸭跖草黄斑驳病毒与别的植物中表达的植物病毒的基因例如马铃薯病毒Y与X外壳蛋白基因的增强子。5 UTL的选择可以不局限于大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基，来自别的基因的前导序列也可以使用。
实施例22植物的转化和再生
表达盒用Xma 1从pTCVGMEPSPS载体中切除，并在唯一的Xma1限制性位点连接到二元载体pBin19中。该含有所期望的表达盒的二元载体采用Holsters等人(1978)所提供的冻融转化法转化到根癌土壤杆菌菌株LBA 4404中。烟草的转化和整个植物的再生用枯斑三生烟并根据Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)的方案来进行。转化的结果物在含有卡那霉素的MS培养基上进行选择。
可选择地，PTCGMEPSPS或别的能够通过来自大豆的抗草甘膦EPSPS基因的表达在植物中呈递草甘膦抗性的构建体可以不采用在包括下列的许多参考文献以及实施例13中所描述用于大豆的土壤杆菌介导的技术而直接引入植物中：Physiol.Plant.(1990)，79(1)，210-12；USP-5,968,830；WO-0042207和USP-5,959,179。
实施例23转基因植物的分析
转化体的PCR分析
从转化系中获取叶片样品，并根据已知的方法提取出DNA。设计出针对转基因中特定区域的寡核苷酸引物以便能够在待测植物材料中进行其检测。
RNA分析
植物中编码转基因的mRNA的存在用RNA印迹杂交法进行检测。总RNA用Tri-试剂按照厂商(SigmaTM)提供的方案从叶片组织中提取。印迹用现有的程序制备，并用放射性标记的大豆EPSPS cDNA进行探查。
蛋白质分析
转基因植物中重组蛋白质的存在按照蛋白质印迹法程序用经标准方案制备的抗重组大豆EPSPS的抗体来确定。
酶检测
植物中抗性EPSPS的活性通过使用14C放射性标记的底物并用HPLC检测产物来检测。
除草剂耐受性的测试
在组织培养后，将转基因植物转移到含有John Innes盆栽堆肥No.3的5英寸的花盆中。让植物在温室中适应环境(大约2星期)，然后将配制的草甘膦用轨道喷雾器(track spayer)以各种不同的浓度施用于空气中的组织。用于鉴定那些对草甘膦具有抗性的转基因植物的视觉评估在施药后21天进行。
实施例24质体定位的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)或磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PPS)的构建体的引入
编码来自玉米的PPDK(EMBL目录号J03901)并含有其自体转运肽序列的cDNA用引物ZMPPDK1(SEQ ID No.47)和ZMPPDK2(SEQ ID No.48)通过RT-PCR从玉米组织中扩增出来。将RT-PCR产物克隆进载体pCR2.1 TOPO中，并测序以检查其真实性。将玉米PPDK基因作为Nco 1/Kpn 1片段从pCR2.1载体中切除，并连接入经同样消化的pMJB1(图1)中。然后在进一步的植物转化之前将植物表达盒亚克隆进pTCVGMEPSPS盒(图6)中。别的PPDK基因例如编码来自Flaveria brownii(EMBL目录号AAQ94645)或水稻的冷稳定PPDK的基因可以用相似的策略进行遗传工程改变。同样地，大肠杆菌中编码PPS(EMBL目录号X59381)的基因用寡核苷酸ECPPS1(SEQ ID No.49)和ECPPS2(SEQ ID No.50)通过PCR进行扩增。将PCR产物克隆进含有植物可操作启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)、叶绿体转运信号序列(例如来自核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基的序列)和终止子(例如NOS)的植物表达盒之中。
【序列表】
编码EPSPS的欧洲油菜基因组DNA (SEQ ID No.1)
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BnEPSPS5(SEQ ID No.2)
gcatgcagatcttaaaggctcttttccagtc
BnEP SPS3(SEQ ID No.3)
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BnF1(SEQ ID No.4)
gcgcaatctagcagaatctg
BnF2(SEQ ID No.5)
tccttcttgccgctctatct
BnF3(SEQ ID No.6)
gcgttgaagaagctggggct
BnF4(SEQ ID No.7)
acctataggagatttggttg
BnF5(SEQ ID No.8)
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BnF6(SEQ ID No.9)
gttccatatgttgaaatgac
BnF7(SEQ ID No.10)
tccactctgaatcatcaaat
BnF8(SEQ ID No.11)
gtaagaatctaagctcattc
BnF9(SEQ ID No.12)
tcatggttgcttaaactcta
BnF10(SEQ ID No.13)
cagcttgtgctgatgttcca
BnF11(SEQ ID No.14)
cgatcatctttgaaaatgtg
BnF12(SEQ ID No.15)
ctctctgttttgattccata
BnXho(SEQ ID No.16)
cgcatcagcctcgagcttcttcgtg
BnMUTBot(SEQ ID No.17)
ggtgagtgaacgcatggctattcctgcat
BnMutTop(SEQ ID No.18)
atgcaggaatagccatgcgttcactcacc
BnNde(SEQ ID No.19)
catttcaacatatggaacagatatc
BnRBSEP(SEQ ID No.20)
cccgggatattggaagttaaaggaaaagagagaaagagaaatctttctgtctaagtgtaattaaccatggcgcaatctagcagaatctg
c
Brasr12(SEQ ID No.21)
ggacgtggaaacagaagctg
Brasr11(SEQ ID No.22)
tctcaaaccgaaagatgcag
Bnapus开始rev(SEQ ID No.23)
ggttgaagcacaatctctgaagcttccatgg
基因组步查1 (SEQ ID No.24)
gatcttgggtcattttaatgggccttctaac
带有AP1引物
基因组步查2 (SEQ ID No.25)
aaataaacccattaaccactaatgaaaaagggat
带有AP2引物
CaMV343(SEQ ID No.26)
gcggagctcgagacttttcaacaaaggg
CaMV46C(SEQ ID No.27)
atcccgggaagcatgcgaaggatagtgggattgtg
BnGUSXma(SEQ ID No.28)
cgcccgggattgaatttbaaagc
FMV增强子(SEQ ID No.29)
tctagagcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagcatctttgcctttatt
gcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgta
tgacgaacgcagtgacgaccacaaaagagctc
CaMV35S增强子(SEQ ID No.30)
tgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaag
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cccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacg
taagggatgacgcacaatcccactatccttc gcaagacccttc
编码EPSPS的大豆基因组DNA (SEQ ID No.31)
aaaaaataccttttagtaaaataagagcgtragatcaatcagacgttttctctttgggacttctcattcttaattgaattgacaataactaaagt
gaaactaaggctaaaatcaactcgcctagtcaagctcgtccacaaaaataggtttttgaaagtttaccatgtcagtttcttactaagtaaaa
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EPSPS 10反向 (SEQ ID No.33)
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EPSPS 4正向 (SEQ ID No.34)
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含有双突变的SEQ ID No.31 (SEQ ID No.35)
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tttgctgctcagattctcctttggactatctaccatatcatttagcaaacctgttcactgctcagattctcatttattctttgtttcctctatttttca
gtggcaagttggagagttaaagagactgagaggatgatagcaatctgcacagaactcagaaaggtgagtgtcttgctaattcctttatg
gtttcgatattactggactttttacatctcactgacctactctgtcttggtatttcagctaggagcaacagttgaagaaggtcctgattactgt
gtgattactccacctgagaaattgaatgtcacagctatagacacatatgatgaccacagaatggccatggcattctctcttgctgcttgtg
gggatgttccagtaaccatcaaggatcctggttgcaccaggaagacatttccygactactttgaagtccttgagaggttmacaaagca
ctaagcattttgtacattgagtaggaagagagagagagataaatactcacaaaacagtgagtatatgcatggcttgcttttgtttcttaaca
ttcccttgtaagaacttgagataatttgtattgttggaaagagctattgattctgttgtatcaaagtaatttaatttccagtacagacttggctct
attcctcatatgtggtggtgtacattgcatctttgcatttgatcccatttctattgggataggaccatacctttttttgtttattattcaagtcaaac
ttagcagataatatgtggtgaccagaaaatagtctagctagcaaatagacctgtgattgcatgtttgaattcaggacttcaggacatttaat
taatgagtgacaatgttaaaaagctcgccaacaggagttgacacatctgattgagtcttctattaacactaactgtaacttgagtttgattat
cagattcctcctgttggtaggtaatatgtaaatttcactatatatttaccgaggttggtggtcttacttgactttgaagaggtgagtgtaattta
aacttttatatcaaaaaaagattgctaaaagcttgagtggcatgcaacaaatagcaatgaaagaatgactatggccttgggaaccaaatg
gccacgtaccacttttccaccaacttgagagccctggtcctggatgatgcccctttttttttttcatttctttgacaataaagaaagttcttattc
ttggcaattgcaagtcgtttgtggaagtcacatgaaattcaccataggcttcattgttcaaatcctttagtcactaactaaaggctggaccta
tgcaagaattttggctactcttataaatgctgtgcggcaaagactacggaaaaatataaattattgcatatctagaggtgaggttcattgct
cccatccatttttccaagaactaaaatatatataaattattaatatgatattacattgaaaaataatatttttcttttaaatatgtgatcataagttta
attttaagtctattcatacgaaaaaaatatttattagaaaagattaatttattaaatggatctcaatattttaagaaattaacttttagctctcaac
caacagatgatttgagttaaaaaaatgtatatataaactattgcatatctgctgatttttgtttgtaacaccaataagtgggcattttactaaat
ccatgtgacaatgtactgaatgttttagaatacagtctggtttgataataaaacgtgcataaagtccagcttatgttaactcttaattcatgga
aaatgatgatatgcgaattgaaagaaagaaaaccataatgtaagtgcagttttctctctcttttttaatattattcaatatcagattgcacatg
ggaaggggtattggctcatgtgggatattagtttttgtcccttacctaaaaagagagaaaagagaaaaataacaatttaaaaagagtacca
ccgctaccacctttttcgcttttaaatttttgttctgttttcactactctttcatgcgttgtttgttggcttctgatagtgacgaatatgatataatga
ttttatgttgggaaaaaagtgccatgtaaattctagagattgaaattttagcatcaaattatttattttatcaccttttaaaatttgttgcatgtga
aagaatttgaagctctccaacaaggaaataacacttcaatccttagagtcatcctctagatcccaaaagaatgtgatgtttatacacattag
tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagggtttatattatattaatgagtgatgtacgaggac
ggtggtgacactatatggccaaaacaagtgtaatataattatttttttttctcaagtattactctatccttgaatattattagtcttaaatcttcaa
gcaccttgtgaacgaagcaatcttgtcc
FMVS35S90增强子 (SEQ ID No.37)
aagcttcccgggccggccgcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagc
atctttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccac
tcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaactcgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattcca
ttgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccat
cgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacca
cgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcttaattaa
FMV35S46增强子 (SEQ ID No38)
aagcttcccgggccggccgcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagc
atctttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccac
tcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaactcgagaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaagaatatca
aagatacagtctcagaagaccagagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagct
atctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaagatggcttctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaaga
tgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaa
gcaagtggattgatgttaattaa
GmTerm Bam(SEQ ID No.39)
ctgcagggatcctggttgcaccaggaag
GmTermEco(SEQ ID No.40)
gaattcccgggtatggtgaatttcatgtg
BnMUT2PST(SEQ ID No.41)
gacttctcgggtaccatcacattgc
BnMUTkpn(SEQ ID No.42)
cacctgcagcaaccacagctgctgtcaaagaacgcattgcaataccagcatttcc
GmRubPac(SEQ ID No.43)
aatttaattaattcataaatatgttac
GmRubbot(SEQ ID No.44)
ggtcttctccttcttagttctcaactacttgttcttctgctgccagatttcaattttccttaaagttgtgaac
GmRubtop(SEQ ID No.45)
atctggcagcagaagaacaagtagttgagaactaagaaggagaagaccatggcccaagtgagcagagtgcac
GmRubKpn(SEQ ID No.46)
ggcaatgtgatggatcccgagaag
ZMPPDK1(SEQ ID No.47)
gcgccatggcggcatcggtttccaggg
ZMPPDK2(SEQ ID No.48)
gcgggtacctcagacaagcacctgagctgcagc
ECPPS1(SEQ ID No.49)
gcggcatgcccaacaatggctcgtc
ECPS2(SEQ ID No.50)
gcggatccttatttcttcagttcagcca
EPSPS基元(SEQ ID No.51)
ALLMZAPLA，其中Z不是S或T
EPSPS基元(SEQ ID No.52)
EIEIZDKL，其中Z不是V
EPSPS基元(SEQ ID No.53)
FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V
EPSPS基元(SEQ ID No.54)
AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R
EPSPS基元(SEQ ID No.55)
GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不是E
EPSPS基元(SEQ ID No.56)
ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T
EPSPS基元(SEQ ID No.57)
TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L
EPSPS基元(SEQ ID No.58)
(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R
EPSPS基元(SEQ ID No.59)
(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)
EPSPS基元(SEQ ID No.60)
(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E
EPSPS基元(SEQ ID No.61)
(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)
EPSPS基元(SEQ DI No.62)
(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)
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(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E
EPSPS基元(SEQ ID No.64)
(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；
EPSPS基元(SEQ ID No.65)
(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G).
序列表
<110>Syngenta Limited
<120>抗除草剂植物
<130>PPD50594/WO
<140>PCT/GB01/04131
<141>2001-09-14
<150>GB0023911.1
<151>2000-09-29
<150>GB0027693.1
<151>2000-11-13
<150>GB0023910.3
<151>2000-09-29
<160>70
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3836
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<400>1
gcatgcagat cttaaaggct cttttccagt ctcacctacc aaaactataa gaaaatccac 60
ttgctgtctg aaatagccga cgtggataaa gtacttaaga cgtggcacat tattattgac 120
tactagaaaa aaaactcata caccatcgta ggagttgggg ttggtgaaga atttgatggg 180
tgcctctccc ccccccactc accaaactca tgttctttgt aaagccgtca ctacaacaac 240
aaaggagacg acagttctat agaaaagctt tcaaattcaa tcaatggcgc aatctagcag 300
aatctgccat ggcgtgcaga acccatgtgt tatcatctcc aatctctcca aatccaacca 360
aaacaaatca cctttctccg tctccttgaa gacgcatcag cctcgagctt cttcgtgggg 420
attgaagaag agtggaacga tgctaaacgg ttctgtaatt cgcccggtta aggtaacagc 480
ttctgtttcc acgtccgaga aagcttcaga gattgtgctt caaccaatca gagaaatctc 540
gggtctcatt aagctacccg gatccaaatc tctctccaat cggatcctcc ttcttgccgc 600
tctatctgag gtacatatac ttgcttagtg ttaggccttt gctgtgagat tttgggaact 660
atagacaatt tagtaagaat ttatatataa tttttttaaa aaaaatcaga agcctatata 720
tatttaaatt tttccaaaat ttttggaggt tataggctta tgttacacca ttctagtctg 780
catctttcgg tttgagactg aagaatttta ttttttaaaa aattattata gggaactact 840
gtagtggaca acttgttgaa cagtgatgac atcaactaca tgcttgatgc gttgaagaag 900
ctggggctta acgtggaacg tgacagtgta aacaaccgtg cggttgttga aggatgcggt 960
ggaatattcc cagcttcctt agattccaag agtgatattg agttgtacct tgggaatgca 1020
ggaacagcca tgcgtccact caccgctgca gttacagctg caggtggcaa cgcgaggtaa 1080
ggttaacgag ttttttgtta ttgtcaagaa attgatcttg tgtttgatgc ttttagtttg 1140
gtttgttttc tagttatgta cttgatgggg tgcctagaat gagggaaaga cctataggag 1200
atttggttgt tggtcttaag cagcttggtg ctgatgttga gtgtactctt ggcactaact 1260
gtcctcctgt tcgtgtcaat gctaatggtg gccttcccgg tggaaaggtg atcttcacat 1320
ttactctatg aattgtttgc agcagtcttt gttcatcaca gcctttgctt cacattattt 1380
catcttttag tttgttgtta tattacttga tggatcttta aaaaggaatt gggtctggtg 1440
tgaaagtgat tagcaatctt tctcgattcc ttgcagggcc gtgggcatta ctaagtgaaa 1500
cattagccta ttaaccccca aaatttttga aaaaaattta gtatatggcc ccaaaatagt 1560
ttttaaaaaa ttagaaaaac ttttaataaa tcgtctacag tcccaaaaat cttagagccg 1620
gccctgcttg tatggtttct cgattgatat attagactat gttttgaatt ttcaggtgaa 1680
gctttctgga tcgatcagta gtcagtactt gactgccctc ctcatggcag ctcctttagc 1740
tcttggagac gtggagattg agatcattga taaactgata tctgttccat atgttgaaat 1800
gacattgaag ttgatggagc gttttggtgt tagtgccgag catagtgata gctgggatcg 1860
tttctttgtc aagggcggtc agaaatacaa gtaatgagtt cttttaagtt gagagttaga 1920
ttgaagaatg aatgactgat taaccaaatg gcaaaactga ttcaggtcgc ctggtaatgc 1980
ttatgtagaa ggtgatgctt ctagtgctag ctacttcttg gctggtgctg ccattactgg 2040
tgaaactgtt actgtcgaag gttgtggaac aactagcctc caggtagttt atccactctg 2100
aatcatcaaa tattatactc cctccgtttt atgttaagtg tcattagctt ttaaattttg 2160
tttcattaaa agtgtcattt tacattttca atgcatatat taaataaatt ttccagtttt 2220
tactaattca ttaattagca aaatcaaaca aaaattatat taaataatgt aaaattcgta 2280
atttgtgtgc aaatacctta aaccttatga aacggaaacc ttatgaaaca gagggagtac 2340
taattttata ataaaatttg attagttcaa agttgtgtat aacatgtttt gtaagaatct 2400
aagctcattc tctttttatt ttttgtgatg aatcccaaag ggagatgtga aattcgcaga 2460
ggttcttgag aaaatgggat gtaaagtgtc atggacagag aacagtgtga ctgtgactgg 2520
accatcaaga gatgcttttg gaatgaggca cttgcgtgct gttgatgtca acatgaacaa 2580
aatgcctgat gtagccatga ctctagccgt tgttgctctc tttgccgatg gtccaaccac 2640
catcagagat ggtaaagcaa aaccctctct ttgaatcagc gtgttttaaa agattcatgg 2700
ttgcttaaac tctatttggt caatgtagtg gctagctgga gagttaagga gacagagagg 2760
atgattgcca tttgcacaga gcttagaaag gtaagtttcc ttttctctca tgctctctca 2820
ttcgaagtta atcgttgcat aactttttgc ggtttttttt tttgcgttca gcttggagct 2880
acagtggaag aaggttcaga ttattgtgtg ataactccac cagcaaaggt gaaaccggcg 2940
gagattgata cgtatgatga tcatagaatg gcgatggcgt tctcgcttgc agcttgtgct 3000
gatgttccag tcaccatcaa ggatcctggc tgcaccagga agactttccc tgactacttc 3060
caagtccttg aaagtatcac aaagcattaa aagacccttt cctctgatcc aaatgtgaga 3120
atctgttgct ttctctttgt tgccactgta acatttatta gaagaacaaa gtgtgtgtgt 3180
taagagtgtg tttgcttgta atgaactgag tgagatgcaa tcgttgaatc agttttgggc 3240
cttaataaag ggtttaggaa gctgcagcga gatgattgtt tttggtcgat catctttgaa 3300
aatgtgtttg tttgagtaat ttttctaggg ttgagttgat tacactaaga aacacttttt 3360
gattttctat tacacctata gacacttctt acatgtgaca cactttgttg ttggcaagca 3420
acagattgtg gacaattttg cctttaatgg aaaggacaca gttgtggatg ggtgatttgt 3480
ggacgattca tgtgtggtta ggtgatttgt ggacggatga tgtgtagatg agtgatgagt 3540
aatgtgtgaa tatgtgatgt taatgtgttt atagtagata agtggacaaa ctctctgttt 3600
tgattccata aaactataca acaatacgtg gacatggact catgttacta aaattatacc 3660
gtaaaacgtg gacacggact ctgtatctcc aatacaaaca cttggcttct tcagctcaat 3720
tgataaatta tctgcagtta aacttcaatc aagatgagaa agagatgata ttgtgaatat 3780
garscggaga gagaaatcga agaagcgttt accttttgtc ggagagtaat gaattc 3836
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gcatgcagat cttaaaggct cttttccagt c 31
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>引物
<400>3
gaattcatta ctctccgaca aaaggtaaac gc 32
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>4
gcgcaatcta gcagaatctg 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>5
tccttcttgc cgctctatct 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>6
gcgttgaaga agctggggct 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>7
acctatagga gatttggttg 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>8
actaagtgaa acattagcct 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>9
gttccatatg ttgaaatgac 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>10
tccactctga atcatcaaat 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>11
gtaagaatct aagctcattc 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>12
tcatggttgc ttaaactcta 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>13
cagcttgtgc tgatgttcca 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>14
cgatcatctt tgaaaatgtg 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>15
ctctctgttt tgattccata 20
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>引物
<400>16
cgcatcagcc tcgagcttct tcgtg 25
<210>17
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<400>17
ggtgagtgaa cgcatggcta ttcctgcat 29
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<400>18
atgcaggaat agccatgcgt tcactcacc 29
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>引物
<400>19
catttcaaca tatggaacag atatc 25
<210>20
<211>90
<212>DNA
<213>引物
<400>20
cccgggatat tggaagttaa aggaaaagag agaaagagaa atctttctgt ctaagtgtaa 60
ttaaccatgg cgcaatctag cagaatctgc 90
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>21
ggacgtggaa acagaagctg 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>22
tctcaaaccg aaagatgcag 20
<210>23
<211>31
<212>DNA
<213>引物
<400>23
ggttgaagca caatctctga agcttccatg g 31
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>引物
<400>24
gatcttgggt cattttaatg ggccttctaa c 31
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>引物
<400>25
aaataaaccc attaaccact aatgaaaaag ggat 34
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<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>26
gcggagctcg agacttttca acaaaggg 28
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<211>35
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<213>引物
<400>27
atcccgggaa gcatgcgaag gatagtggga ttgtg 35
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>28
cgcccgggat tgaatttbaa agc 23
<210>29
<211>209
<212>DNA
<213>增强子
<400>29
tctagagcag ctggcttgtg gggaccagac aaaaaaggaa tggtgcagaa ttgttaggcg 60
cacctaccaa aagcatcttt gcctttattg caaagataaa gcagattcct ctagtacaag 120
tggggaacaa aataacgtgg aaaagagctg tcctgacagc ccactcacta atgcgtatga 180
cgaacgcagt gacgaccaca aaagagctc 209
<210>30
<211>309
<212>DNA
<213>增强子
<400>30
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240
ggattgatgtgatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300
agacccttc 309
<210>31
<211>15941
<212>DNA
<213>大豆
<400>31
aaaaaatacc ttttagtaaa ataagagcgt ragatcaatc agacgttttc tctttgggac 60
ttctcattct taattgaatt gacaataact aaagtgaaac taaggctaaa atcaactcgc 120
ctagtcaagc tcgtccacaa aaataggttt ttgaaagttt accatgtcag tttcttacta 180
agtaaaaaag gatcatttgt aaggtccaac gccttaaaat gatcaccctt caaagtaaaa 240
gaatcacttg tttcacgcat aagtaagaac tacgtaggtc tgatttcctc tccaaaggag 300
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taaggtaaca caatttccac aattctagaa ataaggttgt tgtctttcga gacaaacgta 420
agaggtgcta ataccttcct caaacgtaaa tacaactccc gaacttagaa ttttcatttt 480
gaccggtttc cttcggtttt cccgacgttt tccacaaata aacgttggtg gcgactccgc 540
gcatctttcc tcctttggaa agcgcaccca tgagcctcgc cctcgctcgc ccgcgaaggg 600
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gattatcaaa gtggaagtgg tgacctacat gttggcccta ccagcttatt cgtatattta 720
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cctaaaatca ccatgagaga gaacaaagat tgagaaacct acaaccacta tgagagagaa 1200
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ggagcagttg gaattcttgg aatgacaaga tatgaaatga acataccaac cctcctcttg 1980
tttctgtttc ggtttctatg cagtattttg ttgaatggca aagtgcaagg taatatgctc 2040
ctcaacatca attaacaaat gttcatgaca tctcttacca gctccaactt ggggacgttt 2100
gacaaacacc accgtcaagt ttccttaaat gcaacattaa tgttgctcat ttcaaggagg 2160
agaatagttt tggtgtcggc atgatactcc atcaaggaag attcgtcaaa gctcactcac 2220
gttttcgaca tgggtcgaca tgggttacct gacccaaagg ctgaggctta ggcttgggtt 2280
tgcttcaagt attgatctgg gcccagacta ttggtttaca taatatcatt tttgaaaacc 2340
taacatctaa aactcaaggt tgtttagagg tgcgccattc caaaataaga ttatcctatt 2400
tgtgcatgaa tgcgaccaac tatctcctgt ttcagcatta taaagtataa acaacaaact 2460
tctttaatca agggactaaa agatattgga catacaagct aaaagtgata gaatttgaga 2520
aaacaaatat tgacaacaat attcaagagg acactaaaac ataattctca aatttttttt 2580
gtttatttaa aataaagtgg ttcattaggt agctcttgaa aaaaaaaagt gattaacatg 2640
ctagtacatg ttaaaaaaag tgaataatat tctattataa gtaaagagga ataatttatc 2700
gatgtctcat ttttgagata gttcaccgaa gccaattttt ttactttttt ctcttcaatc 2760
aattttattt tgttaatagt tgtcattgtg gatggattat aataattttg aaatgattta 2820
aaatgagata tatattaata aatttaatta attcataaat atgttactaa atataaattt 2880
catggtatac tcaggacggt tataacggaa atcaaataaa taataaaata gaataatatt 2940
aatttgcagt aaaaagaata atattaattt attctgttta cactatgtat aacgaaatta 3000
aatatattca tttaatatga ttttattttt ctttaattta aaaacatgaa ttatttgttt 3060
cttattttat taccattttg ttcacttctc aattaataaa ataaaaatat attctacaat 3120
tatagtaaaa aggtttaatt ttatataatg ttagcataca gatttttctc tattaactaa 3180
ttaattaaaa attatcctta ttttaaggaa attaaaaatt atcatatata tataagtttt 3240
aaattaatta tcttatatat gtaccaaaaa gttttaaagc aattattata aaaattaata 3300
aatttatcat ataaaataat ttataattaa attttaaatt atcaattcat taaattaaat 3360
tatttaaaat ttttgaatga taatataata attttatcct ctactaagtc ccaacgtttc 3420
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gtaaaaaata aaaaaaagtt tttcaataaa gtataaacta atttgtataa acttttagaa 3540
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tatatgataa atttattgat tttttaaaat aattatctta aaataattta aacaatgatt 3660
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ctttgggggg cctcaaaatc tcgcatcccg atgcataaaa atggaagctt tatgggaaat 4380
tttaatgtgg ggaagggaaa ttccggcgtg tttaaggttt ctgcatcggt cgccgccgca 4440
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gatagaaatg tgtgtagggt tttttaatgg gtagcaataa gcatattcaa tatctggatt 4800
gatttggacg tttctgtata aaggagtatg ctagcaatgt gttaatgtat ggcttgctaa 4860
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gcatttggct tctctattgt aaggaacaaa taatatcagt taatgtgaaa atcaatggtt 4980
gatattccaa tacattcatg atgtgttatt tatatgtacc taatattgac tgttgttttt 5040
ctccgcaatg accaagatta tttattttat cctctaaagt gactaattga gttgcttact 5100
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tgcaggtgga aatgcaaggt ctgttttttt ttttttgttc agcataatct ttgaattgtt 5640
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ttttttcttc ttctaataaa tattctttaa tttgatacat tttttaagta aaagaatata 6300
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cctgtctatt taaaaatcaa atatttgtcc tccattccct ttcccttcaa aacctcagtt 6420
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attcttgttt taaaaaacac taagttttct tttagttata ccttcccctc cttattctct 6600
ccaaagtaaa tattgtagca agtgttggtt gatccattgt gaatcttatt atcctattta 6660
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ggtctcctgg caatgctttt gttgaaggtg atgcttcaag tgccagttat ttactagctg 7020
gtgcagcaat tactggtggg actatcactg ttaatggctg tggcacaagc agtttacagg 7080
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attacagaat caaattctta agaaagacct tcaagaacaa catcaagatg tttcctgtgc 7800
aaaacaggct cacctacaaa agagtgtcta caagcacctt tacacttgga aaaaattcct 7860
taactgaaca attgccaaga gtcatgttgc aaacttgaga ttggagttga ttagatttgg 7920
tgtgtgtgag attctggaaa tgagcatgaa gttttttgca aagctcataa aatgaatgca 7980
gccaagaatc ctagatagga ttgaatttga gagagaggct tgaagtcaag ataaccgcaa 8040
ctgatcttgc tgttcccatg ctgcatagga ctcgttgatt ctaccaagat aacaatcttc 8100
tgtggtgaga atatgagtgg gaattgtcag gcaacaaaga aaatgaaggc tatgagcctt 8160
tgttaaggtg cagagagaaa acagaaaatg aagaacttgt gtattgaagg aattgaaaag 8220
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cttgatgata ggcttgattt gctgccaccg aagaagaaca ttattgttgg agagtttttc 8400
agtgattgca tcagagaaag ttacaagtgt gattggagat gaaggacttg cggtcgtcga 8460
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ccatattagg gttagctttc aagagaaaac ttatgaaact gaactgtaaa ctgttgtatt 8640
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tcattgagct tcaatgaggt ccttcaatgg tgatttttca ccatggagat gcagcggaag 8760
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ttcaccacca agagagtgtc ttggataaga agcttagaga ggaagcttca atggaggaat 8880
agaaagagag agggggaaca aaaaattgaa ggaggaaaag agggagagaa gttgaacttt 8940
gaagtgtgtc tcacaagact cattcattaa agttacaaca agtgttacac atgcttctat 9000
ttatagtcta ggtaacttcc ttgagaagct agaacttaac tacacacacc tctctaataa 9060
ctaagataac ctccttgaga aatttccttg agaagcttcc ttaagaagat tcctagagaa 9120
gctaaagctt agttacacac acctctctaa taactaagtt cacctccttg agatgagaag 9180
ctagagcctt agctacacac acccttataa tagctaaact cactctattc caaaatacat 9240
gaaaatacaa aaaagttcct actacaaaga ttactcaaaa tgtcctgaaa tacaagacta 9300
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ttcatgggaa tcctagggtc ttctttagta gctctagtcc aattttcttg gagtcttcta 9480
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tacaaaggat aatagaaaaa ctgaaactga gatatactca ttacatagaa gaattacatg 9660
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ttttatttgt ttcatgaagt tttttatagc ctttctgttt ctgttaaaag aaattggagg 9960
gtgttcataa tctatatgcc catatatatg tattgtcctg ttgtctgtgt ttctgttttc 10020
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tatattatta tccaacgatc tgatctttgt acatgatgct ggacaatcat caaagctagt 11220
ttggttacat catataatac cttttttttc ataaattatt ttttcccata atatatttat 11280
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gaagttgttg tgtttggggg gttgactctt ttaggaagag gatttgaggg aatttcgcca 360
atgggggagc agaactccgg gacaccctga gaattttgag actccgggaa ttgaagttac 420
aacaggtttg atatgagtta gagtttgtat aatagaatag taattctttt tattttttat 480
ttttattgtt tatttatcca ttattgctat ttttgtaggt cctcttggtc aggggattgc 540
caatgctgtt ggtttggccc ttgcagagaa gcacttggct gcaagataca acaagcctga 600
caatgagatt gttgaccatt acacgtaaaa ataactaaat catacacaac ttgcaagact 660
ttagttgttg gtgttttgct aatggcgttt gttttatgca ggtatgctat tctgggtgat 720
ggttgtcaaa tggagggaat tgcaaatgaa gcatgctcac ttgctggcca ctggggactg 780
gggaagctga tagcatttta tgatgacaat catatttcta ttgatggtaa cacagagatt 840
gcgttcaccg agagtgttga tagtcgtttt gagggacttg ggtggcatgt tatttgggta 900
aagaatggaa ataatggcta tgatgatatt cgtgctgcca ttaaggaagc aaaagctgtc 960
aaagacaaac ccacattaat caaggttagt ttactaattg tggcaatgat atgcatagat 1020
ttctggcttg tagttaccat aacaatcata atctgtcatg atttataggg attcttttaa 1080
actaaggtta taaacatgat atgttactaa agactgcatt gcattgtagt acctcatttg 1140
agaaactgga agttataggt gggaaatcaa aatagtaaat tatgggtcag tttattaagt 1200
gtagctggtt tgtcttttgc taactctatc atttcacagg tcacaacaac cattggttat 1260
ggttctccta acaaggctaa ctcctacagt gtgcatggaa gtgcactggg tgccaaagaa 1320
gttgatgcca ccaggcagaa ccttggatgg tcacatgagc cattccacgt gcctgaggat 1380
gtcaaaaagt atggatgatg ggtttagaga tttctttttt cctgtgacac tgctgatgtt 1440
tataatgata ctgaataaga attgcttgtc tgtccccagg cattggagtc gccacacccc 1500
tgagggtgct gcacttgaag ctgagtggaa tgctaagttt gctgagtatg aaaagaaata 1560
caaggaggaa gctgcagaat tgaaatctat tatcaatggt gaattccctg ctggttggga 1620
gaaagcactt ccggtgagta aattctaaac tcacaggttt ttcttacatg tttgtaactt 1680
ttcaaggttt ggattacata ctatccaaag ttgatcatga tttcagtttg atttggtagt 1740
atggggcttc aaaaagttat tccaaatatt aaaacctggc ttccaatttg atttcagaca 1800
tacactccag agagcccagc ggatgccacc agaaacctgt ctcaaacaaa ccttaatgcc 1860
cttgcaaagg ttcttcccgg tctgcttggt ggcagtgcag atcttgcttc ttccaacatg 1920
accttgctca aaatgttcgg ggacttccaa aaggatactc cagcagagcg taatgttaga 1980
ttcggtgtta gagaacacgg aatgggagct atctgcaacg gcattgctct tcacagccct 2040
ggactgattc catattgtgc aaccttcttt gtattcactg actacatgag aggtgccata 2100
aggctttctg cgctgtctga ggctggggtt atttatgtca tgacccatga ttcaatagga 2160
cttggagaag atgggccaac ccaccagcct attgagcacc tagcaagctt ccgggcaatg 2220
ccaaacattt tgatgcttcg tcctgccgac ggtaacsgaa acagccsgag catacaaagt 2280
ggccgtgctc aacaggaaag agaccctcca ttcttgccct atccaggcaa aaactgcccc 2340
agcttcccgg aactthcatt gaaggagttg aaaagggtgg ttacaccatt tcgggacaac 2400
tccactggca acaagcctga tgtcattttg atcggaactg gttcggaatt ggaaatcgct 2460
gccaaagctg ctgatgacct aaggaaggaa gggaaggctg ttagagttgt ttcccttgtt 2520
tcttggggaa ctttttgatg agcaatcaga agcstacaag gagagtgttt tccctgctgc 2580
tgtttcagcc agagttagca ttgaggcagg atcaacattt gggtgggaga aaattgttgg 2640
agcaaaggga aaagcaatag gcattgatcg ttttggagct agtgctccag ctggaagaat 2700
atacaaagaa tttggtatca ctaaggaagc tgttgttgct gcagctaaag agcttatcta 2760
gaacttttga tttttttttg ccttctggtt ttggttgaga gcattccatg tcatgaataa 2820
gaaaaaggtt aaatatcctt cgattgggaa tttgggattc taagtgaaga agcaacatag 2880
atcaaagaat tttgtgaact tgtaataact atttgacaat ttagttttgc actgccacat 2940
ggttaaattc aatgtttgat catatcaacc atagatgcta gtttatacta cttgtataat 3000
ttgtttcact tgcagattca ctcttagcat ttgagtgttt ggatggccgt gttttgttca 3060
ttaagaaatg ttgacatgga tagtttgttg catggtaaat tggtgattaa taccttttta 3120
agcttctttt ggcaagttgt taaaaagtgt tttgttttaa tctctagtta atctaaaaat 3180
gcctacttat tttattttga ctttcaaaac ttgtctatat gccgagtata aaaaaaactt 3240
gtctatataa gttccttatg gaaaaaggac ctacaaaata atttaaaaat gctgaatttg 3300
ttaggaagtt tgacaacttt agacattaat aattgttttt ttttcatata tataattgac 3360
tttcaaaact tgtctatata ttataaattc gttatggaaa gggcgaccac acgtaaaacg 3420
taacatgcca atctctccct agtgaactgt tattctcatt cagtttttgt aagttcacct 3480
tcaaattttc aatttttttt ttgacaaaaa tatctttgat ggaacacgtt aggggtgtaa 3540
attcaccatt catcatttca ttcattatac acaatagtct ttcataatcc aatgaaaact 3600
tgtttttgtt gttatttttt tctgaaaaat ctttataaaa taaataaaaa catttttttg 3660
ttataaattt cagttgaaat acataaccat taattctaca gagtgttaat gttgatgtaa 3720
aataaaaaaa tattggatat caaacttaat gaacagaaca aaaattacaa aattgtacaa 3780
tttaaatgat aaaaaaccaa attcacaaaa ataaaaatta aggacgaaat ttgagaaatg 3840
ataattaaaa acgattaaaa atataattaa actaaaattt attatgtaat tctttaatat 3900
atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat ataataaaag ttttacatta 3960
taattttgaa atgaagtatt tgataaacga acaacccacc cttggggttg gtgagagtga 4020
aacggagaac agtgtctccc tcacttggtc ttctgagtcg agtcctattc atcaccaacc 4080
cactcgtcaa aattgttgta tgctatgtaa ccattttgtt ttttaataaa taaaagtgtt 4140
ttgttctgct atgcactccc catcaaatac catttacttt ttttttgtct tctatcaatt 4200
tctatttagt tcctagttgc tacaacttcc agctggtgaa aaatagtcaa cagagactac 4260
aatattctaa taaaatagaa taacaaaatc aaatatattc atttaatatg attttatttt 4320
tatttaattt aaaacatgaa ttatttgttt cttatttaat taccgtttcg ttcacttctc 4380
aattaataaa ataaaaaatt tctacaatta tagaaaaagt ttagttttgt agattgttaa 4440
cataaagatt tttcctatta actaattaat taaaagtcat cttatatata agttttaaag 4500
taattatctt atatatgtac ccaaaagttt taaagcaatt attataaaaa agtaaaattt 4560
tatcatatac aataatctat aattacatga aagtataatt tttaaattat taatacgtta 4620
aaattatttt tttaaaattt gaatgatcat atagtaattt tattttatac caagtcccaa 4680
catttcctat tttattccac ttttaccaat aaatttcctc ataaacactt ataagaaaaa 4740
aagtaagtaa agaataaaat aagcttttct ataaactata aacaaatttg tataaacttt 4800
cttatattag tttttctgaa aactaatttt aaattataca taaattgaat ttactgataa 4860
ttttttattt tctttttgta taagtgtttt ttaagaaatt tgttcaaaca tatttttatg 4920
acatgtcaat gcttgagaga tataaggtga gttaaatcat aaatgattaa agaaaaataa 4980
aagaagaaaa agataattaa tttaattttt tattaacatt ctaacaaatt aacattatat 5040
aaataaaaat aatatttcaa taattggatc aataatacta ttgttcttaa acaccaaacc 5100
aaccttccta aagtcctaat ctaatccaaa agccatcatt cattttcctt ggtaggtaaa 5160
gttccaaaac ctttaccaac cttttcactc aattattttg gtgtaagcaa ttcgacatgt 5220
gttagtgtta gttggcaacc aaaaacccct ttatgtgact cactcaatcc aacaacctct 5280
cacaccacca acccccccat aactcataag gccaaaacca tttctcacaa aacccttcat 5340
tacacacatt attatcatta tcacacacac aaaaaacctc tcatttcaaa gagagagaga 5400
gatttcacag accaaattgc agaggacgac aaagttcaca acttcaagga aaatcgaaat 5460
ggcccaagtg agcagagtgc acaatcttgc tcaaagcact caaattttyg gycattcttc 5520
caayyccaac aaacycaaat cggygaattc ggtttcattg aggccacgcc tttggggksc 5580
ctcaaaatct cgcatcyygr tgmayaaaam tggaagcytt atgggaaatt ttaatgyggg 5640
gaagggaaat tccggcrtgt ttaaggtttc tgcatcsgtc gccgccgccg cagagaagcc 5700
gtcaacgtcg ccggagatcg tgttggaacc catcaaagac ttctcgggta ccatcacatt 5760
gccagggtcy aagtctctgt ccaatcgaat tttgcttctt gctgctctct ctgaggtaaa 5820
gtttatttat ttatttattt ctgtatccaa aaatgtaaat tgttagtttg ttaatttttg 5880
ttagcagtga gagtcgaact acttggcttc tttcttagtc atccaaccaa ccttatatct 5940
ccaaaattta tttattggtt ttttttgggg ttatgtggtt aggaatagga gtttgatgcg 6000
tggagtggat tttgaatatt tgattttttt tttttttgta ttattcagtg aaaatgaagc 6060
atcttgtccc atgaaagaaa tggacacgaa attaagtggc gtatgattta gaatgatgat 6120
agaaatgtgt ataggtggtt ttaatgtgta gcaataagca tattcaatat ctggattgat 6180
ttggacgttt ctgtataaag gagtatgcta gcaatgtgtt aataatgtct tgttaaaagt 6240
atggatggct aaaataatca taaaaatcga gtgggagtag tatacatatc tacaggaaat 6300
gtattaggtg aggcatttgg cttctctatt gcgagtaagg aacaagtaat ctcagttaat 6360
gtgaaaatca atggttgata ttccaataca ttcatgatgt gttatttacg ggaacgcaat 6420
attgactgtt gattttatct gcagctgaga ttatatacta tatccttcca aagaaatctt 6480
tgactcttga ttatccaagt atggttgtat taccaatttt agctctagaa gataatccct 6540
cccccaaaac acaaattaga atggtgctgc aagttccgtg ttactttcat tctattattt 6600
ttataacttt taattattta atagatgtct tgtttggcat aaactataat ttattctgtt 6660
tttttttatt cttatttagg gaacaactgt tgtagacaac ttgytgtaya gygaggatat 6720
tcattacatg cttggtgcat taaggaccct tggactgcgt gtggaagayg acmaaacaac 6780
caaacaagca attgtkgaag gctgtggggg attgtttccc actaktaarg aatctaaaga 6840
tgaaatcaat ttattccttg gaaatgctgg tactgcratg cgtcctttga cagcagctgt 6900
rgttgctgca ggtggaaatg caaggtctgt tttttgtttt gtttgttcat catgatctct 6960
gaattgttcc tcgtataact aatcacatca gactatgtgt tcttcctcca tcctgttata 7020
atctaaaaat ctcatccaga ttagtcatcc ttctttaaat gaacctttaa ttatatctat 7080
gtatttattt aacatgtaaa ttagcttgtc aagtcaaagt ctagcatata gatatactga 7140
ttacactctg aggaatgcac ctgagggtct taatcatgat ctatttcaac cttgccactt 7200
tcttctttta ttattagatc acctatcatg attactggtt tgagtctcta aatagaccat 7260
cttgatgttc aaaatatttc agctacgtac ttgatggrgt gccccgaatg agagagaggc 7320
caattgggga tttggttgct ggtcttaagc arctyggtgc agatgttgat tgctttcttg 7380
gcacaaactg tccacctgtt cgtgtaaatg ggaagggagg acttcctggc ggaaaggtat 7440
ggtttggatt tccattagaa taaggtggac taactttcct ggagcaaaat tctaatttat 7500
accctgtttc cccctcttta gaataagaca ctaagggtat gtttaggagt tgggttttgg 7560
cgagaaaggg aagggagggc aatttttttt ctaataaata ttctttaatt tgataaattt 7620
tttaaacgaa ggaatatgaa gatagattag cataacttaa tgttttaatc ttttatttat 7680
ttttataaat attatatacc tctatttaaa aacaagatat ttttcctcca ttccctttcc 7740
ctttaaaacc tcagttccaa atataccgta cttgaattat attttggaag gtgtattggt 7800
tggagacctt tccttttcag aggttatccc tcacctttat tatagccttt ctactctctt 7860
aatgagttca ttgtgcattg agtcattgaa cttcctgtga aaagaaattg tttacttttc 7920
tttatttgtt acctacatcc ttattcctgt tttaaaaaat actaagtttt cttttagtta 7980
tgccttcccc tccttattct ctccaaagaa aatataatag cgaatgttgg tttatccatt 8040
gtgaatctta ttatcctatt tcacatgcag gtgaaactgt ctggatcagt tagcagtcaa 8100
tacytractg ctttgcttat ggcagctcct ttagctcttg gygatgtgga aattgagatt 8160
gttgataaac tgatttctgt tccatatgtt gaaatgactc tgaagttgat ggagcgtttt 8220
ggagtttctg tggaacacag tggtaattgg gatargttct tggtccatgg aggtcaaaag 8280
tacaagtagg tttctatgtt ttagcattac atcacttttt agtatccaaa atgcaatgaa 8340
atcaaaactc atgttttcta tcaggtctcc tggcaatgct tttgttgaag gtgatgcttc 8400
aagtgccagt tayttmctag ctggtgcagc arttactggt ggggctatca ctgttaatgg 8460
ctgtggcaca agcagtttac aggtattcat gcttgacact attttctatt atcttttatt 8520
ttatggtcta tactgtatca ttcctaattc aacccccttc ttttctcttt cccctcactt 8580
ccaaaaaaat agagcttatc attgtattct taatagctct tgtatgtcct ttttcgtctc 8640
ttgagcagat tctaccgtga ttatcctttt tagtaaactt tttttttgtg tgtcttttaa 8700
ataattgata tcatcatatg aattcacaca tcatctctat cccttcctca ttttattata 8760
tttcattaac agtgataaag ataaaaataa attgtcaagt aaagcaagtt agcatgtcag 8820
ataatgatgc ttcaattgca aaattggtga aagcttgcac agtacattag ctttggtgac 8880
aattgtgatg tagatagcca taacctccca tgcaacttat tatgttgttt gcttaaactt 8940
cttttgcact taaacacgga ttagagagag tgaggatgaa caataataac agacacaaag 9000
cttagtttta taccacccgg cacccagtgg tgaagaccaa gcagtatgag tgagatcaat 9060
ggcagcatct gattgaagct tcttgtggta tttttggaga tgaaatccga ggcgaattag 9120
ggcatctggc tcaacaatag ccattggttc aaacttgctt ttaataaaat tgattacaga 9180
atcaaattct tgaggaagcc ttcaagaact acatcatgat gttccctgtg caaaacaggt 9240
tcaccgacaa aagagaacat ctacaagttc ctttacacat gccaaaaatt cctcaactga 9300
acaattgcca agagtcatgt tgcgaacttc aggttggagt tgacgaaatt tggtgcatgt 9360
atgattctgg aaatgagcat gaagtttttt cctaagctca taaaagtgaa tgcagccaag 9420
aaccctagat aggattgaat cggagagagg cttgaagcca agataacagc aactgatctt 9480
gctgttccca tgctgcgtag gactcattga ttctaccaag atcacaatct tctgtggtga 9540
gaaaatgagg gtgaattgtc aaccaataaa gaaaatggtg aaggctgagt cttgatgata 9600
ggcttgattt gcttgcgctg aagaagaacg ttattgttgt agagtttctc agtgattgta 9660
tgagagtaag ttacaggtgc gattggagat gacggacttg tggtgggagg agggtaagtg 9720
ttaagtggtg gaatgcgtat cagaggtggt tgcccagcca aagaagctgg ttgcggtgga 9780
ggaggtggtg gtgcagtgga agccatgggt tttgatgctt ttgagagaaa acatacgaaa 9840
ctgaactgta aacttttgta ttattgatta gctgatttgg tagtacaaga gaggaatata 9900
tatacagttt taatgtaact acctaaccaa acatgaggaa ctctccatac acagaaagac 9960
gtatacaaag gataacagac aaacagaaac ttagatatac tcatacagag aagaattaca 10020
ggatgaatct gagaatttta attgggaaac tgaggaaaat agcaagggtt tcagaattca 10080
ttttgacgat aggcaaatca tggacttaac ttagacctca agggtacgct tgggagtggg 10140
ggtttttaga gggaaaaggg aaggagggca aacttttaat tcctaataaa tattctcttt 10200
tttgattttt ttttaaataa aacaaataaa cttatagatt agcatacact taatgtccta 10260
atcttttatt tatttgcatg agtttttttc ttttatattc tttctgtttc tgttttcttt 10320
cttcagtgtc tcttgtcttt ccttaattcc ttatcaatac cttgtttatt tttgaaaact 10380
taattttcct cattttttta acttataggc tatactatag tatgtataac tattcaaata 10440
aatagtagaa aatgtttcaa atattcccca gaactgtttc agtgaacaaa gttcaagcca 10500
gaaaaaagaa gtatatcttc ttgtgaagag tagtctcaag tggttaattg tcaaattgta 10560
tcattttaga atacaaaatt agaagtggtt tgattagttt atacgaacga ttatttaaat 10620
agggttgatg atgtggttaa ttactgatca tatgtgaaga ctgtgagtcg atgaccagcc 10680
cagtgcagtc attttaaatt ccattatttt ttaatttgtg cttatgttaa actttgtcct 10740
tctttcaaag ggagatgtaa aatttgctga agttcttgaa aagatgggag ctaaggttac 10800
atggtcagag aacagtgtca cygttwctgg accrccacra gattyttctg gtcraaaagt 10860
cttgcraggc attgatgtca atatgaacaa gatgccagat gttgccatga cwcttgcygt 10920
tgtygcacta tttgctaatg gtcmmactrc yatmagagat ggtatggttt agctgtttgt 10980
ttgtgttcaa gagcttgttt taacaaattg ttttttttaa ttatggttaa tgaaattatt 11040
ataattacac taatattgaa attggatcac taaccatgtg aaatgcttga atttttagct 11100
tgaaaacttc ttttgtggac aatttttctt ttatctatgg attgtggggc atctatgttg 11160
ttcctttaag cttcgtacaa cctggtctgt gggctggtcc agtccttctt actcatgaca 11220
gtcttttgca gtaaactggt taaacttggg tgacctgttg acccacccag attggcctgt 11280
tctttttaaa taaaacttgg ctacttataa gatttcaaca tgatacttga atgatcaccc 11340
ttactctaaa ggccattatc tgttcagtta tgttcttctt cttcttatta tttttaattt 11400
atattattat ccaacgatct gatctttgaa catgatgctg gacaatcatc aaagctagtt 11460
tggttacatc atataatacc ttttttttca tatattattt ttcccatagt atatttttgt 11520
gttttttttt catacaatat tattctgaaa aaaacttgtt tcgttttttt cctggcttga 11580
atgctatttc aatgactggg ccttattatt ttctggttta ggttatacaa ctgtcctcca 11640
attgactttt gaatgcttca atagttttct tcttaatcat ggaaggcact agagtgcata 11700
ttgaatatgt tagaacatgg aaggcttaaa tatcttttta gtctttgcaa tttaacgttt 11760
ttttgctttt agtccttgca aaattataat ttttttttag tcctgactaa ttatgtttgt 11820
tttgtttttg agggcgagcc ctggtgcagc ggtaaagttg tgccttggtg acttgttggt 11880
catgggttcg aatccggaaa cagcctcttt gcatatgcaa gggtaaggct gcgtacaata 11940
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ctaaacacaa aacaaacata atttgcaagg actgaaaaac aaaaaaataa ttttgcaagg 12120
acaaaaaaac aaaaaaaaaa aacaaaattg caaggaccaa aaatatattt aaaccaacat 12180
gaaattatgg tataaaacca ttcatatgtc ttcatctaat agcttaagct tttgggatag 12240
ttggttaaca atatggtatt agagtcttat gatttttagg tggtctttga gttcaatcct 12300
tgctgctccc agttctagtt aatttctttt tggtccactt caaataaaaa gttgaattta 12360
agggtaaggc agctggacct gcgcattaat catgtgtcag gctcaaaggg cttttgtatg 12420
gggggcatgt ttggaatata atatagaatc attcatgtgg tttcacctat caaggacaac 12480
tctagttttt gtcatacttg tattattaca gtgtctaaac tagacatgat ctttttccgg 12540
aaggaaattt aacttaaaag gaacttagat gcttcttgtt ctgtgatctt tatttgttta 12600
ttttttccaa tctttttaac aattgaaagg ttttagttgt atccaatctt tttatacatt 12660
tggactatct accatatcat ttagcaaact tgtttgctgc tcagattctc ctttggacta 12720
tctaccatat catttagcaa acctgttcac tgctcagatt ctcatttatt ctttgtttcc 12780
tctatttttc agtggcaagt tggagagtta aagagactga gaggatgata gcaatctgca 12840
cagaactcag aaaggtgagt gtcttgctaa ttcctttatg gtttcgatat tactggactt 12900
tttacatctc actgacctac tctgtcttgg tatttcagct aggagcaaca gttgaagaag 12960
gtcctgatta ctgtgtgatt actccacctg agaaattgaa tgtcacagct atagacacat 13020
atgatgacca cagaatggcc atggcattct ctcttgctgc ttgtggggat gttccagtaa 13080
ccatcaagga tcctggttgc accaggaaga catttccyga ctactttgaa gtccttgaga 13140
ggttmacaaa gcactaagca ttttgtacat tgagtaggaa gagagagaga gataaatact 13200
cacaaaacag tgagtatatg catggcttgc ttttgtttct taacattccc ttgtaagaac 13260
ttgagataat ttgtattgtt ggaaagagct attgattctg ttgtatcaaa gtaatttaat 13320
ttccagtaca gacttggctc tattcctcat atgtggtggt gtacattgca tctttgcatt 13380
tgatcccatt tctattggga taggaccata cctttttttg tttattattc aagtcaaact 13440
tagcagataa tatgtggtga ccagaaaata gtctagctag caaatagacc tgtgattgca 13500
tgtttgaatt caggacttca ggacatttaa ttaatgagtg acaatgttaa aaagctcgcc 13560
aacaggagtt gacacatctg attgagtctt ctattaacac taactgtaac ttgagtttga 13620
ttatcagatt cctcctgttg gtaggtaata tgtaaatttc actatatatt taccgaggtt 13680
ggtggtctta cttgactttg aagaggtgag tgtaatttaa acttttatat caaaaaaaga 13740
ttgctaaaag cttgagtggc atgcaacaaa tagcaatgaa agaatgacta tggccttggg 13800
aaccaaatgg ccacgtacca cttttccacc aacttgagag ccctggtcct ggatgatgcc 13860
cctttttttt tttcatttct ttgacaataa agaaagttct tattcttggc aattgcaagt 13920
cgtttgtgga agtcacatga aattcaccat aggcttcatt gttcaaatcc tttagtcact 13980
aactaaaggc tggacctatg caagaatttt ggctactctt ataaatgctg tgcggcaaag 14040
actacggaaa aatataaatt attgcatatc tagaggtgag gttcattgct cccatccatt 14100
tttccaggaa ctaaaatata tataaattat taatatgata ttacattgaa aaataatatt 14160
tttcttttaa atatgtgatc ataagtttaa ttttaagtct attcatacga aaaaaatatt 14220
tattagaaaa gattaattta ttaaatggat ctcaatattt taagaaatta acttttagct 14280
ctcaaccaac agatgatttg agttaaaaaa atgtatatat aaactattgc atatctgctg 14340
atttttgttt gtaacaccaa taagtgggca ttttactaaa tccatgtgac aatgtactga 14400
atgttttaga atacagtctg gtttgataat aaaacgtgca taaagtccag cttatgttaa 14460
ctcttaattc atggaaaatg atgatatgcg aattgaaaga aagaaaacca taatgtaagt 14520
gcagttttct ctctcttttt taatattatt caatatcaga ttgcacatgg gaaggggtat 14580
tggctcatgt gggatattag tttttgtccc ttacctaaaa agagagaaag agaaaaataa 14640
caatttaaaa agagtaccac cgctaccacc tttttcgctt ttaaattttt gttctgtttt 14700
cactactctt tcatgcgttg tttgttggct tctgatagtg acgaatatga tataatgatt 14760
ttatgttggg aaaaaagtgc catgtaaatt ctagagattg aaattttagc atcaaattat 14820
ttattttatc accttttaaa atttgttgca tgtgaaagaa tttgaagctc tccaacaagg 14880
aaataacact tcaatcctta gagtcatcct ctagatccca aaagaatgtg atgtttatac 14940
acattagtat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 15000
atatatatat agggtttata ttatattaat gagtgatgta cgaggacggt ggtgacacta 15060
tatggccaaa acaagtgtaa tataattatt tttttttctc aagtattact ctatccttga 15120
atattattag tcttaaatct tcaagcacct tgtgaacgaa gcaatcttgt cc 15172
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ttttgctttt agtccttgca aaattataat ttttttttag tcctgactaa ttatgtttgt 11820
tttgtttttg agggcgagcc ctggtgcagc ggtaaagttg tgccttggtg acttgttggt 11880
catgggttcg aatccggaaa cagcctcttt gcatatgcaa gggtaaggct gcgtacaata 11940
tccctccccc ataccttcgc atagcgaaga gcctctgggc aatggggtag aaaaagaaga 12000
atgctttaga taacactttt tttgttactg ttcaaagcac tatctaaagt gctttgagga 12060
ctaaacacaa aacaaacata atttgcaagg actgaaaaac aaaaaaataa ttttgcaagg 12120
acaaaaaaac aaaaaaaaaa aacaaaattg caaggaccaa aaatatattt aaaccaacat 12180
gaaattatgg tataaaacca ttcatatgtc ttcatctaat agcttaagct tttgggatag 12240
ttggttaaca atatggtatt agagtcttat gatttttagg tggtctttga gttcaatcct 12300
tgctgctccc agttctagtt aatttctttt tggtccactt caaataaaaa gttgaattta 12360
agggtaaggc agctggacct gcgcattaat catgtgtcag gctcaaaggg cttttgtatg 12420
gggggcatgt ttggaatata atatagaatc attcatgtgg tttcacctat caaggacaac 12480
tctagttttt gtcatacttg tattattaca gtgtctaaac tagacatgat ctttttccgg 12540
aaggaaattt aacttaaaag gaacttagat gcttcttgtt ctgtgatctt tatttgttta 12600
ttttttccaa tctttttaac aattgaaagg ttttagttgt atccaatctt tttatacatt 12660
tggactatct accatatcat ttagcaaact tgtttgctgc tcagattctc ctttggacta 12720
tctaccatat catttagcaa acctgttcac tgctcagatt ctcatttatt ctttgtttcc 12780
tctatttttc agtggcaagt tggagagtta aagagactga gaggatgata gcaatctgca 12840
cagaactcag aaaggtgagt gtcttgctaa ttcctttatg gtttcgatat tactggactt 12900
tttacatctc actgacctac tctgtcttgg tatttcagct aggagcaaca gttgaagaag 12960
gtcctgatta ctgtgtgatt actccacctg agaaattgaa tgtcacagct atagacacat 13020
atgatgacca cagaatggcc atggcattct ctcttgctgc ttgtggggat gttccagtaa 13080
ccatcaagga tcctggttgc accaggaaga catttccyga ctactttgaa gtccttgaga 13140
ggttmacaaa gcactaagca ttttgtacat tgagtaggaa gagagagaga gataaatact 13200
cacaaaacag tgagtatatg catggcttgc ttttgtttct taacattccc ttgtaagaac 13260
ttgagataat ttgtattgtt ggaaagagct attgattctg ttgtatcaaa gtaatttaat 13320
ttccagtaca gacttggctc tattcctcat atgtggtggt gtacattgca tctttgcatt 13380
tgatcccatt tctattggga taggaccata cctttttttg tttattattc aagtcaaact 13440
tagcagataa tatgtggtga ccagaaaata gtctagctag caaatagacc tgtgattgca 13500
tgtttgaatt caggacttca ggacatttaa ttaatgagtg acaatgttaa aaagctcgcc 13560
aacaggagtt gacacatctg attgagtctt ctattaacac taactgtaac ttgagtttga 13620
ttatcagatt cctcctgttg gtaggtaata tgtaaatttc actatatatt taccgaggtt 13680
ggtggtctta cttgactttg aagaggtgag tgtaatttaa acttttatat caaaaaaaga 13740
ttgctaaaag cttgagtggc atgcaacaaa tagcaatgaa agaatgacta tggccttggg 13800
aaccaaatgg ccacgtacca cttttccacc aacttgagag ccctggtcct ggatgatgcc 13860
cctttttttt tttcatttct ttgacaataa agaaagttct tattcttggc aattgcaagt 13920
cgtttgtgga agtcacatga aattcaccat aggcttcatt gttcaaatcc tttagtcact 13980
aactaaaggc tggacctatg caagaatttt ggctactctt ataaatgctg tgcggcaaag 14040
actacggaaa aatataaatt attgcatatc tagaggtgag gttcattgct cccatccatt 14100
tttccaagaa ctaaaatata tataaattat taatatgata ttacattgaa aaataatatt 14160
tttcttttaa atatgtgatc ataagtttaa ttttaagtct attcatacga aaaaaatatt 14220
tattagaaaa gattaattta ttaaatggat ctcaatattt taagaaatta acttttagct 14280
ctcaaccaac agatgatttg agttaaaaaa atgtatatat aaactattgc atatctgctg 14340
atttttgttt gtaacaccaa taagtgggca ttttactaaa tccatgtgac aatgtactga 14400
atgttttaga atacagtctg gtttgataat aaaacgtgca taaagtccag cttatgttaa 14460
ctcttaattc atggaaaatg atgatatgcg aattgaaaga aagaaaacca taatgtaagt 14520
gcagttttct ctctcttttt taatattatt caatatcaga ttgcacatgg gaaggggtat 14580
tggctcatgt gggatattag tttttgtccc ttacctaaaa agagagaaag agaaaaataa 14640
caatttaaaa agagtaccac cgctaccacc tttttcgctt ttaaattttt gttctgtttt 14700
cactactctt tcatgcgttg tttgttggct tctgatagtg acgaatatga tataatgatt 14760
ttatgttggg aaaaaagtgc catgtaaatt ctagagattg aaattttagc atcaaattat 14820
ttattttatc accttttaaa atttgttgca tgtgaaagaa tttgaagctc tccaacaagg 14880
aaataacact tcaatcctta gagtcatcct ctagatccca aaagaatgtg atgtttatac 14940
acattagtat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 15000
atatatatat agggtttata ttatattaat gagtgatgta cgaggacggt ggtgacacta 15060
tatggccaaa acaagtgtaa tataattatt tttttttctc aagtattact ctatccttga 15120
atattattag tcttaaatct tcaagcacct tgtgaacgaa gcaatcttgt cc 15172
<210>37
<211>522
<212>DNA
<213>增强子
<400>37
aagcttcccg ggccggccgc agctggcttg tggggaccag acaaaaaagg aatggtgcag 60
aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct ttgcctttat tgcaaagata aagcagattc 120
ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt ggaaaagagc tgtcctgaca gcccactcac 180
taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca caaaactcga gacttttcaa caaagggtaa 240
tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag 300
tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg 360
aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg 420
aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg 480
acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcttaatt aa 522
<210>38
<211>552
<212>DNA
<213>增强子
<400>38
aagcttcccg ggccggccgc agctggcttg tggggaccag acaaaaaagg aatggtgcag 60
aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct ttgcctttat tgcaaagata aagcagattc 120
ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt ggaaaagagc tgtcctgaca gcccactcac 180
taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca caaaactcga gaacatggtg gagcacgaca 240
cacttgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga 300
cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 360
acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata 420
aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 480
ccacgaggaa catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 540
gatgttaatt aa 552
<210>39
<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>39
ctgcagggat cctggttgca ccaggaag 28
<210>40
<211>29
<212>DNA
<213>引物
<400>40
gaattcccgg gtatggtgaa tttcatgtg 29
<210>41
<211>25
<212>DNA
<213>引物
<400>41
gacttctcgg gtaccatcac attgc 25
<210>42
<211>55
<212>DNA
<213>引物
<400>42
cacctgcagc aaccacagct gctgtcaaag aacgcattgc aataccagca tttcc 55
<210>43
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>43
aatttaatta attcataaat atgttac 27
<210>44
<211>73
<212>DNA
<213>引物
<400>44
ggtcttctcc ttcttagttc tcaactactt gttcttctgc tgccagattt caattttcct 60
taaagttgtg aac 73
<210>45
<211>72
<212>DNA
<213>引物
<400>45
atctggcagc agaagaacaa gtagttgaga actaagaagg agaagaccat ggcccaagtg 60
agcagagtgc ac 72
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>46
ggcaatgtga tggatcccga gaag 24
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>47
gcgccatggc ggcatcggtt tccaggg 27
<210>48
<211>33
<212>DNA
<213>引物
<400>48
gcgggtacct cagacaagca cctgagctgc agc 33
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>引物
<400>49
gcggcatgcc caacaatggc tcgtc 25
<210>50
<211>28
<212>DNA
<213>引物
<400>50
gcggatcctt atttcttcag ttcagcca 28
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X为不是S或T的任意氨基酸
<400>51
Ala Leu Leu Met Xaa Ala Pro Leu Ala
1 5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X为不是V的任意氨基酸
<400>52
Glu Ile Glu Ile Xaa Asp Lys Leu
1 5
<210>53
<211>7
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X为V或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X为K或S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X为不是V的任意氨基酸
<400>53
Phe Gly Xaa Xaa Xaa Glu His
1 5
<210>54
<211>7
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X为K或R
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X为不是R的任意氨基酸
<400>54
Ala Leu Xaa Xaa Leu Gly Leu
1 5
<210>55
<211>15
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X为任意氨基酸，但不是T(和/或位置9上的氨基酸不为E)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X为不是E的任意氨基酸(和/或位置6上的氨基酸为不是T的
任意氨基酸)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(12)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>X为I或V
<400>55
Gly Leu Xaa Val Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Val
1 5 10 15
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X为不是K的任意氨基酸(和/或位置9上的氨基酸为不是T的任意氨基酸)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X为L或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为K或N
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X为不是T的任意氨基酸(和/或位置5上的氨基酸为不是K的任意氨基酸)
<400>56
Ile Thr Pro Pro Xaa Lys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210>57
<211>8
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>X为不是N或L的任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X为D或N
<400>57
Thr Ile Xaa Xaa Pro Gly Cys Thr
1 5
<210>58
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为D或N
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为不是R的任意氨基 酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(10)
<223>X为任意氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为K或R
<400>58
Xaa Tyr Phe Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5 10
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为I或L或Q
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>X为S或G
<400>59
Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa
1 5 10
<210>60
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为I或L或Q
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<400>60
Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Glu
1 5 10
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为I或L或Q
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>X为S或G
<400>61
Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa
1 5 10
<210>62
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>X为S或G
<400>62
Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Xaa
1 5 10
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<400>63
Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Glu
1 5 10
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X为I或L或Q
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<400>64
Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Glu
1 5 10
<210>65
<211>12
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X为I或V
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X为V或A或T
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>X为S或G
<400>65
Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Xaa
1 5 10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>基元
<400>66
Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu
1 5 10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>基元
<400>67
Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu
1 5 10
<210>68
<211>18
<212>PRT
<213>基元
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X为A或V
<400>68
Lys Xaa Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro
1 5 10 15
Val Glu
<210>69
<211>14
<212>PRT
<213>基元
<400>69
Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val
1 5 10
<210>70
<211>14
<212>PRT
<213>基元
<400>70
Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val
1 5 10