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本发明将在下文实施例中进一步阐明，这些实施例绝非意欲限制
本发明。

在实施例中，参考了所示附图：

                       实施例

实施例1
鼠模型中针对环子孢子衍生多肽的免疫应答的升高
材料和方法

1.肽的合成和分析

此实施例中所用的所有肽，如Atherton等人所述(肽的合成，第
2部分，生物有机化学(Bioorg.Chem.)8：350-351，1979)，使用
固相F-moc化学法化学合成。用于合成的化学药品和溶剂购自Bachem
Feinchemikallien(Buddendorf，瑞士)、Novabiochem(Lufelfingen，
瑞士)、和Fluka(Buchs，瑞士)。

9-mer肽PbCS 245-253对应于经鉴定的CTL表位(Romero
等人，自然(Nature)341：323-326，1989)。覆盖伯格氏鼠疟原虫
ANKA株(Lanar，分子和生化寄生虫学(Mol.Bioch.Paras.)39：151
-153，1990)环子孢子蛋白C端区域的多肽PbCS 242-310如先前
关于恶性疟原虫类似物的详细描述(Roggero等人，分子免疫学(Mol.
Immunol.)32：1301-1309，1995)获得。简而言之，在对-烷氧基苯
甲醇树脂(Wang树脂)上制备多肽，取代程度为0.4mmol/g。使用
10倍过量的F-moc氨基酸衍生物和30分钟的偶联时间。通过大小排
阻层析(交联葡聚糖Sephadex 025，Pharmacia，瑞典)与RP-HPLC
(W-Porex 5 C4，250×10mm，Phenomenex，Rancho Palos Verdes，
美国；使用溶于0.1％TFA/H2O的10-50％CH3CN梯度，40min，
流速3ml/min)的组合，纯化粗制多肽。

通过大小排阻层析纯化重叠10个残基且包含序列PbCS 233-312
的20-mer肽B11-B17(表1)。通过RP-HPLC(C18分析柱)分
析所有肽的纯度。根据Knecht和Chang(分析化学(Anal.Chem.)
58：2375-2379，1986)的方法测定经纯化肽的氨基酸组成，通过质
谱法在LDI 1700 Mass Monitor(Linear Scientific Inc.，Reno，NV，
美国)或Voyager-DE(PerSeptive Byosystem，Framingham，MA，
美国)上确定分子量。

2.PbCS 242-310的还原和氧化

通过用100mol过量DTT于37℃温育36小时处理经HPLC纯化的
多肽，获得PbCS 242-310的还原形式。通过大小排阻层析除去过量
DTT后，将一部分材料溶解于0.1M CH3COONH4(pH8.0)，并置于
空气中氧化10天。通过Ellman反应和通过向一份肽溶液中加入1000mol
过量N-乙基马来酰亚胺(NEM)，确定肽的完全还原或氧化。在后一
种情况中，于4℃温育1小时后，氧化形式的质谱没有检测到多肽MW
的增加，而还原形式展示相当于加入4个NEM分子的MW增加。

3.免疫

4-5周龄雌性BALB/c小鼠购自HarIan(Zeist，NL)。用50μg
还原态或氧化态多肽(溶于PBS并在不完全弗氏佐剂IFA中乳化)对
小鼠进行尾基皮下注射。对于短肽PbCS 245-253，与100μg通用辅
助肽P30(Renggli等人，免疫学通讯(Immunol.Let.)46：199-205，
1995)一起注射了4μg。2-3周后，动物接受了加强免疫剂量的免疫
原。肽加强免疫后7-10天，对小鼠采血，以评价特异性抗体的产生。
随后，处死动物用于增殖、CTL、或ELISPOT测定，或者暴露于携
带子孢子的蚊子。

4.寄生虫攻击

通过循环式传播至实验室饲养的冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)
或斯氏按蚊(A.stephensi)产生伯格氏鼠疟原虫(ANKA品系；克隆
1，Dr.Walliker，爱丁堡，或克隆Dr.P.H.Lambert，WHO，日内瓦)
子孢子。麻醉小鼠并暴露于受感染的蚊子。将小鼠单独暴露至预先确
定的首次用于实验的、年龄符合的BALB/c小鼠获得完全感染所需被
咬次数。寄生虫攻击后，由第5天至第14天通过吉姆萨(Giemsa)
染色血涂片定期检查寄生虫血症。如果受到攻击后14天没有检测到寄
生虫，则认为小鼠受到保护。

5.体内T细胞耗贫

使用杂交瘤H35(CD8特异性大鼠IgG2b)(Golstein等人，免
疫学综述(Immunol.Rev.)68：5-42，1982)和GK1.5(CD4特异
性大鼠IgG2b)(Dialynae等人，免疫学杂志(J.Immunol.)131：2445
-2451，1983)作为抗体来源。在第0天进行攻击。第-3、-2、和-1
天注射1mg CD4特异性抗体(相同方案用于对照大鼠Ig)。第-2和
+2天注射0.5mg CD9特异性抗体。

在伯格氏鼠疟原虫肝阶段完全发展所需时间内，耗贫＞95％(Meis
等人，美国热带医学和卫生学杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)37：506
-510，1987)。使用CD4特异性FITC标记的(ref.1300 024，Boehinger
Mannheim，德国)和CD8特异性PE标记的(ref.1271 237，Boehringer
Mannheim，德国)外周血淋巴细胞(PBL)或脾细胞的FACS(Becton
Dickinson)分析来检验耗贫。

6.ELISPOT测定法

将硝酸纤维素ELISPOT平板在湿润室中于4℃用含100μg/ml
IFN-γ特异性抗体OIE703B2(Slade和Langhorne，免疫生物学
(Immunobiology)179：353，1989)的PBS溶液包被过夜。通过加
入含10％FCS的DMEM于37℃温育2小时进行饱和步骤。然后将
由经免疫小鼠引流淋巴结分离得到的免疫细胞在平板中与100,000个/
孔进行或未进行短肽PbCS 245-253脉冲的经照射P815细胞于37℃
共培养24小时。然后除去细胞，并加入以1μg/ml浓度溶于含1％BSA
的PBS的生物素化IFN-γ特异性二抗(ANI)(Slade和Langhorne，
免疫生物学(Immunobiology)179：353，1989)，于37℃温育2小
时。清洗后，加入在含5％FCS的PBS中稀释的链霉亲和素-碱性
磷酸酶缀合物，于37℃温育1小时，通过加入BCIP/NBT底物揭示免
疫复合物的存在。
结果

1.针对完全还原的PbCS 242-310 C端肽的免疫学应答

用溶于IFA的肽PbCS 242-310免疫BALB/c小鼠2次。第二次注
射后7-10天评价肽特异性抗体的存在。通过ELISA检测到高滴度的
肽特异性抗体(1∶300,000)，并通过IFAT测定法对空气干燥的伯格
氏鼠疟原虫子孢子证明了与天然CS蛋白的交叉反应性(1∶25,000)。
既然识别受到加入的竞争剂PbCS 242-310肽的抑制，则其是特异性的。

为了评价CTL应答，在体外用众所周知的CTL表位PbCS 245
-253、肽PbCS 242-310、和覆盖完整C端序列的重叠肽B11-B17
再刺激脾和LN免疫细胞。在用肽245-253和243-262再刺激的经
免疫小鼠的脾和淋巴结中检测到高水平的细胞毒性，而肽233-252和
242-310诱导的水平较低(图1，表1)。
表1
研究中所用的肽
编码
  序列
 B11
 233-252
 B12
 243-262
 B13
 253-272
 B14
 263-282
 B15
 273-292
 B16
 283-302
 B17
 293-312
 PbCS 245-253
 245-253
 PbCS 242-310
 242-310

正如通过形成IFN-γ斑点的细胞数目测定的，细胞毒活性相当于
在用最佳9肽PbCS 245-253免疫的小鼠中获得的(图1A)。使用表
达Kd、Dd、或Ld MHCI型分子的经转染L细胞，确定了CTL应答
的Kd限制性(图2)。

2.用PbCS 242-310肽(溶于IFA)免疫赋予暴露于携带寄生虫
的蚊子的BALB/c小鼠以依赖CD8+的保护作用

肽加强免疫后7-10天，将用50μgPbCS 242-310肽(溶于IFA)
尾基皮下免疫2次的BALB/c小鼠进行寄生虫攻击。在PbCS 242-310
肽免疫小鼠中获得特异性保护的重要水平(表2，实验A)。
表2
实验
    免疫
  治疗
    保护/暴露
  ％保护
  A
           IFA
  抗CD4
    2/9
    22
    还原的PbCS 242-310
  抗CD8
    12/20
    60
    还原的PbCS 242-310
    3/20
    15
    还原的PbCS 242-310
    12/20
    60
  B
           IFA
    1/7
    14
    氧化的PbCS 242-310
    6/7
    84
  C
           IFA
    2/8
    25
    还原的PbCS 242-310
    4/8
    50
    氧化的PbCS 242-310
    8/8
    100

为了表征保护作用的机制，在体内进行T细胞耗贫。显然，CD4+
T细胞耗贫不显著改变观察到的保护作用。相反，通过同种型匹配的
CD8特异性抗体的CD8+T细胞耗贫阻止肽诱导的体内保护作用，因
为观察到保护作用的基线水平(表2，实验A)。

3.氧化的PbCS 242-310 C端肽的免疫学特性

通过将水溶液(pH8.0)于室温暴露于空气10天，将完全还原的
C端肽进行完全氧化。然后将该制剂的免疫学特性与完全还原的材料
就CTL应答和保护能力的方面进行比较。当在抗体滴度和T细胞增
殖中没有性质上的差异时，用氧化的材料在3次不同实验中获得的
IFN-γELISPOT数目一致高于完全还原的肽的观察结果(图3B)。
相似的，用氧化的材料获得的保护程度一致高于还原的分子的观察结
果(表2，实验B、C)。

在此实施例中，注射覆盖CS蛋白C端区域的长的合成多肽赋予
针对伯格氏鼠疟原虫的依赖CD8+的保护作用。有趣的是，在两种情况
中在经免疫小鼠中都引发了相似程度的针对肽PbCS 245-253的CTL
应答。事实上，在用短的PbCS 245-253 CTL肽或长的PbCS 242-
310肽免疫的小鼠中，通过ELISPOT测定的CTL频率是相似的。既
然已知注射CTL表位后没有观察到保护作用，本实验指出寄生虫特异
性T辅助细胞及肽PbCS 242-310和天然CS蛋白特异性抗体在抗寄
生虫免疫中同样发挥作用。

已知T辅助细胞和抗体能够独立提供针对疟疾红细胞外阶段的保
护作用。此实验显示肽特异性抗体同样具有识别伯格氏鼠疟原虫子孢
子上的天然蛋白质的能力，由此假设它们能够在体内中和子孢子。这
导致受感染肝细胞数目的减少和保护作用，由CD8+T细胞介导作为肝
阶段间平衡改变的结果，CD8+T细胞支持后者。

除了产生抗体，注射肽PbCS 242-310同样诱导Th1细胞增殖(数
据未显示)，但是保护作用似乎不依赖CD4+T细胞。此处，通过为特
异性CTL或B细胞提供帮助，CD4+T细胞可能在肽特异性免疫应答
中发挥决定性作用。

这些结果证明，当在IFA中注射时，长的多肽是有效的免疫原。
此处，肽PbCS 242-310免疫不仅产生广泛的免疫应答，而且提供针
对子孢子诱导的感染的依赖CD8+的保护作用。特别且出乎意料的是，
氧化的材料诱导较大数目的CTL前体，并导致较好程度的针对子孢子
攻击的保护作用。

该实验的数据是在进行中的I期人试验中使用恶性疟原虫氧化的
CS末端片段的基础。获得的结果显示，在人体内同样获得了相似抗体、
T细胞增殖、和CTL应答(参照实施例2)。
实施例2
人体内针对恶性疟原虫环子孢子蛋白C端氧化的片段的免疫应答

1.序言

评价对应于恶性疟原虫NF54株环子孢子蛋白C末端的合成肽Pf
CS 282-383作为潜在的疟疾疫苗；该研究随指示其能够在多种动物
模型中引发抗体、淋巴细胞增殖、和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，
以及保护免受疟疾感染的临床前研究而启动。当在存在佐剂的条件下
注射时，将评估设计成开放式的、非随机的、以确定肽的安全性为目
的之I期临床试验。

2.肽的表征

合成、纯化、并将肽无菌分装于适于每次测试剂量的玻璃瓶中。
制剂的品质达到了用于人的GLP产品的标准。

3.结果

如图4和5所示，用溶于MontanideTM ISA-720的100μg抗原免
疫首次进行实验的志愿者后，获得了抗体应答和T细胞增殖。相似的，
免疫后观察到依赖CD8的IFN-γ生成(表3)。

表3概括了实验结果，其中在免疫前、第二次免疫后2或3个月、
和第三次免疫后3个月，评价了PfCS NF54(334-342)的HLA-A*
0201表位的特异性CD8应答。具体而言，通过ELISPOT，使用斑点
计数的不同方法，平行的、在视觉上、在2台不同的ELISPOT读数
器(AID 1.2和BioSys)中，计算产生IFN-γ的细胞。取决于计数方
法，获得了不同的结果。
表3
第二次和第三次免疫前后HLA-A*0201志愿者体内的CD8特异性应
答
PfCS 334-342
免疫前***
第二次免疫后
第三次免疫后
CD8频率*
平均应答±sd
  134±165
    845±974
  2046±2433
阳性应答范围
     -
  [1017；1542]
  [967；7567]
应答者**
好的应答者
    0/8
      2/8
      5/8
中等应答者
    4/8
      5/8
      2/8
不应答者
    4/8
      1/8
      1/8

*特异性CD8细胞/106个CD8；8名HLA-A*0201志愿者的平均
值和好的应答者体内的应答范围

**当计数方法分别给出所有阳性或阴性应答时，8名志愿者确定
为好的应答者或不应答者；当不一致时，确定为中等应答者

***冷冻细胞的分析；在其它时间点，用新鲜细胞进行分析

总之，该实施例提供了证据证明，长的合成多肽代表了产生能够
刺激免疫系统多个方面的疫苗的有价值的替代物。