扩增多个基因/基因片段的方法 本发明涉及生物工程技术，具体属于一种扩增多个基因/基因片段的方法。
体外基因扩增技术也称聚合酶链反应(PCR)，是80年代中期由Mullis发明的一种新的分子生物技术(美国专利4,965,188)。该技术是在实验室的试管内，将所要研究的一个基因或一个基因片段在数小时内扩增成百万倍至千百万倍。采用一种耐热的脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(Taq酶)一对与目的DNA片段两端互补的引物及其它核酸扩增原料，在变性、退火、延伸三个阶段反复循环下，目的基因即按指数倍(2n)扩增。该技术是分子生物学技术的一项革命性创举，并在生命科学的各个领域广泛使用。该技术应用时，将Taq酶、一对引物、核酸扩增原料(dNTP)、Mg2+等置于一个溶液中，并利用热循环仪实施扩增。但是，当要扩增多个基因或基因片段时，由于每个目的片段的引物和扩增产物全都集中在一个溶液中，互相之间有干扰，使得结果不准确。故以往要扩增某个样本中的多个基因时，采用地是将样本分为多份，分别置于不同的扩增溶液中进行。这样，当使用该方法分析某个样本中多个基因或基因片段，尤其是对成百上千个基因时，就非常耗时费力。尤其当某些稀有样本，由于样本量非常少，不足以分为多份进行扩增，难以实现分析多个基因或基因片段。
本发明的目的在于克服现有扩增技术中存在的缺陷，提供一种可在一个扩增溶液中同时扩增样品中多个基因或基因片段的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种扩增多个基因/基因片段的方法，其特点是：分别将欲扩增的多个基因/基因片段的每对引物中的一个定点固化在固相支持物上，另一个则放入扩增溶液中，反应时将该固化有多个基因/基因片段引物的固相支持物浸没于该扩增溶液中，利用多聚酶链反应进行基因/基因片段的扩增。
上述的扩增多个基因/基因片段的方法，其中，所述定点固相化在固相支持物上的引物是先合成后再对其进行化学修饰或增加一段连接臂。
上述的扩增多个基因/基因片段的方法，其中，对所述合成后的引物化学修饰或增加连接臂是在其5’端进行。其中，所述5’端修饰的引物为一磷酸基因的引物。
上述的扩增多个基因/基因片段的方法，其中，所述引物的5’端与固相支持物共价结合。
上述的扩增多个基因/基因片段的方法，其中，所述固相支持物是指各种膜材料、玻璃材料、塑料材料或硅基材料。其中，尤以聚苯乙烯材料为佳。
本发明采用了将引物对中的一个固相化在固相支持物上，这样可以使所有的扩增产物都结合在固相支持物上，多个基因或基因片段的扩增产物不会互相干扰。多对引物之间的干扰也大为减少，从而使在一个扩增溶液中扩增多个基因得以实现。本发明可广泛应用于基因微阵列检测技术、基因芯片的制造或生产基因诊断仪器等领域。
实施时，首先将要扩增的目的基因片段的引物对设计好。设计引物时最好避免引物之间形成互补或发夹式结构的序列，同时要求这些引物的退火温度越接近越佳，不宜超过10℃。引物合成的方法没有限制，通常采用基因合成仪化学合成的方法取得。合成好的引物要将上下游引物分别放置，每对引物中挑选一个引物，上、下游引物不限，将其固相化在固相支持物上，另一个引物将放在扩增溶液中。固相支持物没有特殊的限制，只须能与引物牢固结合，通常可选用各种膜材料、玻璃材料、塑料材料或硅基材料等。引物与固相支持物的结合方法没有限制，通常包括非特异吸附，各种方法导致的共价结合，或利用电荷的吸附等，吸附得越牢越好。引物与固相物结合时不能将引物3’端的化学基团与固相物共价结合，否则将影响扩增。为了提高扩增效率，通常将引物的5’端与固相支持物上的某些化学基关共价结合。为了便于共价结合或者使引物在溶液中有一定的自由活动度，也可将引物的5’端进行各种化学修饰或接上各种连接臂。多个引物在固相支持物上的定位可以通过手工或仪器辅助来进行，此类方法属已有技术，故不赘述。
基因扩增时，将样本与扩增原料、耐热DNA聚合酶和未固化的对应引物及扩增缓冲液组成扩增溶液，将已定点固化了多个引物的固相支持物浸没在溶液中。扩增热循环参数与普通扩增参数相比没有特殊限制，视扩增效果来作适当调整。为了便于后续的检测，扩增时可在扩增原料中掺入标记物。标记物是指用后续方面能检测的一种化学物质。通常有放射性同位素标记物、荧光标记物、生物素标记物、卵白素标记物、地高辛标记物、酶标记物。扩增后将固相支持物取出，然后作适当的漂洗，漂洗的目的是去除一些非特异性的信号。漂洗的溶液没有特殊限制，但该溶液不能将固化在支持物上的引物和产物洗下。检测的目的基因或基因片段的方法可以多种多样。若在扩增时已掺人了标记物，则用相应的方法检测标记物即可。也可以再进行一次序列特异的杂交方法来检测。所谓序列特异的杂交指的是利用核酸杂交的原理，设计能与已扩增片段特异性结合的核酸探针，再利用核酸杂交的方法检测。检测时观察信号的方法可以是多样的，通常有肉眼观察、显微镜观察或成像或计算机辅助扫描分析方法。
以下结合实例对本发明作进一步描述，但本发明不限于此例：
在同一反应溶液中同时检测生殖道常感染的病原体，包括淋球菌、衣原体和乳头状瘤病毒，三种目的基因片段扩增引物如下： 引物序列 淋球菌 L1 5’GTTTGGCTGGTTGATTCAAG3’ L2 5’GCAAGATTTCCGATTTGGCG3’ 衣原体 Y1 5’GTGGATAGTCTCAACCCTAT3’ Y2 5’TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3’ 乳头瘤病毒 H1 5’GCMCAGGGWCATAAYAATGG3’ H2 5’CGTCCMARRGGAWACTGATC3’
上表中，乳头瘤病毒序列中的R=A+G,M=A+C,W=A+T,Y=C+T，将上述3对引物中的L1、Y1、H1三个引物定点点在一张0.5cm×1cm长方形的聚苯乙烯片上，该三个引物合成时，在5’端修饰一个磷酸根基团。点样前，应先将聚苯乙烯片进行处理，处理过程如下：将聚苯乙烯片置于5％高锰酸钾1.2当量的硫酸溶液中，60℃30分钟；再置于6当量盐酸溶液中，25℃20分钟；取出用双蒸水漂洗五次，漂洗时温度25℃。处理完毕后，将5’磷酸标记的3个引物(浓度为各100mmol/L)，分别置于100mM吗啉磺酸乙烷(PH6.0)缓冲液(该缓冲液含0.1％碳化二亚胺，10mM N-甲基-1,3-丙二胺)手工定点点样，点样后置于保温湿盒内25℃2小时，取出后用含0.05％曲通X-100的生理盐水洗五遍。最后用双蒸水洗5遍。
扩增液体积为150μl，扩增缓冲液的组成如下：
1×PCR缓冲液(含Mg2+)
dCTP 300μmol/L
dATP 300μmol/L
dGTP 300μmol/L
dTTP 150μmol/L
生物素标记dUTP 150μmol/L
三个对引物中非固化的引物各 500μmol/L
Taq酶 5u
样本DNA 20μl
样本为外生殖器分泌物及脱落上皮，取适量样本置于细胞裂解液中(10mmol/L Tris-HCl PH7.4；10mmol/L EDTA；0.4％SDS；1.0mg/ml蛋白酶)37℃过夜，然后95℃煮10分钟，取20μl作样本。扩增热循环参数为95℃1分钟，54℃3分钟，72℃1分钟，共30个循环。扩增时将上述聚苯乙烯片浸没于反应液中，扩增后取出，置于漂洗液(10mmol/L的磷酸缓冲液含0.5％的曲通X-100)中漂洗3次。下一步为显色步骤，同一般的免疫组织化学通用方法，过程如下：将聚苯乙烯片置于过氧化物酶标的卵白素溶液中30分钟，取出后用漂洗液漂洗3次，最后置于DAB底物中显示，肉眼或显微镜观察结果，扣除背景后，有显色的为阳性，未显色的为阴性，从而判断有否感染上述三种病原体。